DE19734800A1

DE19734800A1 - Detection of environmental toxins in soil, composts and substrates

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Publication number: DE19734800A1
Application number: DE19734800A
Authority: DE
Inventors: Heide Prof Dr Schnabl; Peter Dr Helfrich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-08-12
Filing date: 1997-08-12
Publication date: 1999-02-18

Abstract

Detection of environmental toxins in soil, composts and substrates comprises: (a) preparing extracts from a soil, compost or substrate sample; (b) concentrating the extract; (c) adding a sample of the concentrated extract to an cell organelle-containing unit, and (d) measuring the physiological parameters using a bio-sensor and comparing the results to standard toxin-free controls.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum sehr sensitiven Nachweis von ökotoxiko logisch wirksamen Schadstoffen in Böden, Komposten und Substraten, wie bei spielsweise Lebensmitteln, Kosmetika etc., mittels pflanzlicher Zellsysteme. Der Nachweis beruht auf der Sensitivität dieser Zellsysteme in Bezug auf den Eingriff der Schadstoffe in die Physiologie dieser Zellsysteme, wobei die verursachten Än derungen einiger physiologischer Parameter im Vergleich zu standardisierten schad stofffreien Kontrollen gemessen werden und so als biologische Indikatoren für be sagte Schadstoffe dienen.The invention relates to a method for the very sensitive detection of ecotoxicity logically effective pollutants in soils, composts and substrates, such as for example food, cosmetics etc., by means of plant cell systems. Of the Detection is based on the sensitivity of these cell systems to the intervention of the pollutants in the physiology of these cell systems, the caused changes changes in some physiological parameters compared to standardized damage substance-free controls are measured and thus as biological indicators for be said pollutants serve.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens können Kontaminationen mit sehr unter schiedlichen Schadstoffen, insbesondere Herbiziden, Pestiziden, Fungiziden und Schwermetallen aber auch organischen Säuren, etc. in sehr niedrigen Konzentratio nen festgestellt werden, ohne daß besondere zusätzliche Anreicherungsverfahren notwendig sind.By means of the method according to the invention, contamination can be very low various pollutants, especially herbicides, pesticides, fungicides and Heavy metals but also organic acids, etc. in very low concentrations NEN can be determined without special additional enrichment procedures are necessary.

Die Kontamination und Anreicherung von Böden mit ökotoxikologisch wirksamen Schadstoffen stellen ein immer größeres Problem dar. Solche Schadstoffe werden insbesondere durch Land- und Forstwirtschaft und Industrie als Ergebnis von Pro duktionsprozessen sowie damit in Verbindung stehender, unzureichend gesicherter Abfall- und Mülldeponien unkontrolliert in die Böden eingebracht. Oftmals ist man sich über die Quantität und Qualität derartiger Kontaminationen nicht im Klaren. Besonders problematisch ist die Situation bei Komposten anzusehen, die quasi als ein Konzentrat von umgesetzten ehemaligen schadstoffbelasteten Pflanzenteilen an gesehen werden können.The contamination and enrichment of soils with ecotoxicologically effective Pollutants are an increasing problem. Such pollutants are especially by agriculture and forestry and industry as a result of Pro production processes and related, insufficiently secured Waste and garbage dumps brought into the soil in an uncontrolled manner. Often you are are not clear about the quantity and quality of such contaminations. The situation with composts that are quasi as a concentrate of converted former parts of the plant contaminated with pollutants can be seen.

Durch die Nahrungskette können solche Schadstoffe auch in Lebensmittel in ge sundheitlich bedenklichen Konzentrationen gelangen. Pflanzliche und tierische Sub stanzen sind aber auch Grundlage von Kosmetika und sogar Arzneimitteln. Die rechtzeitige Feststellung von Schadstoffen und ihrer toxischen Metabolite in mög lichst geringen Konzentrationen in Böden, Komposten und Substraten stellen also eine große Herausforderung an die zur Verwendung kommenden Nachweismetho den dar.Through the food chain, such pollutants can also be found in foods in ge concentrations that are harmful to health. Vegetable and animal sub Punching is also the basis of cosmetics and even medicines. The timely detection of pollutants and their toxic metabolites in poss So low concentrations in soils, composts and substrates a great challenge to the detection method used that.

Der Nachweis der Schadstoffe mittels chemisch-analytischer Methoden erweist sich angesichts der großen Anzahl der verschiedenartigen nachzuweisenden Wirkstoffe und ihrer meist unbekannten Metabolite oft als zu wenig sensitiv, methodisch sehr aufwendig und teuer und damit wirtschaftlich wenig rentabel.The detection of the pollutants by means of chemical-analytical methods proves itself given the large number of different active substances to be detected and their mostly unknown metabolites often as not sensitive enough, very methodically complex and expensive and therefore economically unprofitable.

Biologische Testsysteme, die in Zusammenhang mit solchen Nachweismethoden in der Umweltanalytik in den letzten Jahren entwickelt wurden, gewinnen hingegen immer mehr an Bedeutung. Diese Systeme beruhen auf der Detektierung in der Re gel sensitiver Wirkung von Schadstoffen auf lebende Organismen oder deren biolo gischen Einheiten, wie Zellen oder subzelluläre Strukturen.Biological test systems used in connection with such detection methods environmental analytics developed in recent years are gaining more and more important. These systems are based on detection in the Re gel-sensitive effect of pollutants on living organisms or their biolo units, such as cells or subcellular structures.

So können beispielsweise Änderungen in den Sauerstoffbilanzen, sowie der Vor gänge, die unmittelbar mit dem Elektronentransport in Zusammenhang stehen Auf schluß über die Art und die Menge der Schadstoffbelastung geben. Die Änderungen werden beispielsweise über Messung von Photosyntheserate bzw. photosyntheti schen oder anderweitigen Elektronentransport, Atmung und Enzymaktivitäten mit tels bekannter Meßmethoden (z. B. Sauerstoffelektrode, Fluoreszensmessung, etc.) ermittelt.For example, changes in the oxygen balance, as well as the pre corridors that are directly related to electron transport conclude about the type and amount of pollution. The changes are, for example, by measuring photosynthesis rate or photosynthesis or other electron transport, breathing and enzyme activities known measuring methods (e.g. oxygen electrode, fluorescence measurement, etc.) determined.

Bei Verwendung ganzer Organismen lassen sich die bekannten Methoden nicht oder nur schlecht standardisieren.The known methods cannot be used when using whole organisms or standardize poorly.

Pflanzliche Zellen, insbesondere pflanzliche Zellorganellen und deren Substrukturen haben sich oftmals als effizienter erwiesen. So können wasserlösliche Herbizide mittels ganzer Protoplasten über deren Sauerstoffverbrauch in Wasserproben nach gewiesen werden, allerdings nur mit einer noch unbefriedigenden unteren Nach weisgrenze von etwa 0.5 µg/l. Plant cells, especially plant cell organelles and their substructures have often proven to be more efficient. So can water-soluble herbicides using whole protoplasts to determine their oxygen consumption in water samples be pointed out, but only with a still unsatisfactory lower post white limit of about 0.5 µg / l.

Zelluläre Substrukturen sind in der Regel besser geeignet. So werden in der DE 34 12 023 A1 und der DE 44 20 093 Verfahren zum Nachweis von Schadstof fen in (Trink-)Wasser- bzw. Gewässerproben beschrieben, welche aus Chloropla sten höherer Pflanzen isolierte Thylakoidmembranen einsetzen. Allerdings besteht hier zumeist das Problem, daß bei der Präparation die für die zu messende physio logische Wirkung notwendigen Faktoren und Substanzen ausgewaschen werden, was zunächst wiederum eine unbefriedigende Sensitivität des Tests zur Folge hat. Durch die Zugabe entsprechend geeigneter Mediatoren kann dieser Nachteil, wie in den oben angegebenen Patentanmeldungen beschrieben, wieder ausgeglichen wer den.Cellular substructures are usually more suitable. So in the DE 34 12 023 A1 and DE 44 20 093 methods for the detection of pollutants fen described in (drinking) water or water samples, which are from Chloropla use taller plants with isolated thylakoid membranes. However, there is here mostly the problem that the preparation for the physio to be measured necessary factors and substances are washed out, which in turn results in an unsatisfactory sensitivity of the test. By adding appropriately suitable mediators, this disadvantage, as in described above patent applications, compensated for who the.

Die für diese Zwecke geeigneten Methoden des Standes der Technik weisen also entweder eine zu hohe Nachweisgrenze auf und/oder beschränken sich auf den Nachweis spezieller Schadstoffgruppen oder auf den Nachweis von Schadstoffen ausschließlich in einfacher zu handhabenden Wasser bzw. Gewässerproben.The methods of the prior art which are suitable for these purposes therefore have either a detection limit that is too high and / or is limited to the Detection of special groups of pollutants or on the detection of pollutants only in easier-to-use water or water samples.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen sehr sensitiven Nachweis von Schadstoffen eines breiten Wirkungs- und Substanzspektrums, welche aus kontaminierten Böden, Komposten und anderweitigen festen Substraten stammen, ohne Einsatz zusätzlicher Anreicherungsverfahren zur Verfügung zu stellen. Insbe sondere ist es auch Aufgabe der Erfindung, ein effektives Extraktions- und Aufrei nigungsverfahren dieser Schadstoffe aus den festen Substraten, bzw. Böden bereit zustellen, welches erst Voraussetzung für einen solchen Nachweis ist. Dieses Ver fahren ist im Hinblick auf die Empfindlichkeit der zu verwendenden biologischen Einheiten, die möglichst während des Tests physiologisch intakt bleiben sollten, sehr sorgfältig auszuwählen. Andrerseits sollte das Isolierungs- und Aufreinigungs verfahren möglichst vollständig alle in wäßrige Lösungen extrahierbare Schadstoffe liefern können.It is therefore an object of the present invention to provide very sensitive detection of pollutants of a broad spectrum of effects and substances, which from contaminated soils, composts and other solid substrates, to be made available without the use of additional enrichment processes. In particular in particular, it is also an object of the invention to provide effective extraction and tearing Cleaning process of these pollutants from the solid substrates or soils ready to deliver, which is only a prerequisite for such proof. This ver driving is in terms of the sensitivity of the biological to be used Units that should remain physiologically intact during the test if possible, to choose very carefully. On the other hand, the isolation and purification should process as completely as possible all pollutants extractable in aqueous solutions can deliver.

Gegenstand der Erfindung ist so ein Verfahren zum Nachweis von Schadstoffen in umweltbelasteten Böden, Komposten und Substraten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man (i) aus einer Boden-, Kompost- oder Substratprobe einen wäßrigen Extrakt herstellt, (ii) besagten Extrakt aufreinigt, (iii) eine Probe dieses Extraktes einer biologischen Einheit, bestehend im wesentlichen aus Zellorganellen oder deren Bestandteilen gibt, und (iv) mittels einer biosensorischen Meßapparatur die physiologischen Parameter im Vergleich zu einer standardisierten, schadstofffreien Kontrolle mißt.The invention thus relates to a method for the detection of pollutants in polluted soils, composts and substrates, which is characterized is that (i) an aqueous sample from a soil, compost or substrate sample Produces extract, (ii) purifies said extract, (iii) a sample of this extract a biological unit consisting essentially of cell organelles or their components, and (iv) by means of a biosensory measuring apparatus physiological parameters compared to a standardized, pollutant-free Control measures.

Gegenstand sind insbesondere Verfahren, bei denen die biologische Einheit aus Thylakoidmembranen, Protoplasten oder Mitochondrien besteht.The subject in particular is a process in which the biological unit consists of Thylakoid membranes, protoplasts or mitochondria exist.

Dabei kann die biologische Einheit aus nur einer der drei genannten subzellulären Strukturen bestehen. Die Auswahl richtet sich dabei nach der Art des in der Probe erwartenden Schadstoffes oder Schadstoffgemisches.The biological unit can consist of only one of the three subcellular ones mentioned Structures exist. The selection depends on the type of sample expected pollutant or pollutant mixture.

Für Schadstoffe, die vor allem eine Hemmwirkung auf den photosynthetischen Elektronentransport der Photosystemapparate I und II ausüben sind vor allem Thy lakoidmembranen geeignet.For pollutants that primarily inhibit photosynthetic Electron transport of photosystem apparatuses I and II are mainly thy lakoid membranes suitable.

Schadstoffe, die vorwiegend die Atmungskette und Fettsäuresynthese beeinflussen können mit Hilfe von Mitochondrien nachgewiesen werden.Pollutants that mainly affect the respiratory chain and fatty acid synthesis can be detected with the help of mitochondria.

Schadstoffe, die vorwiegend Aminosäure- bzw. Enzymsynthesen betreffen, lassen sich mit Protoplasten detektieren. Eine biologische Einheit kann aber auch erfin dungsgemäß aus einem Gemisch von zwei oder allen genannten subzellulären Strukturen aufgebaut sein.Leave pollutants that mainly concern amino acid or enzyme synthesis detect yourself with protoplasts. A biological unit can also be invented in accordance with a mixture of two or all of the subcellulars mentioned Structures.

Letztlich können auch, insbesondere dann, wenn mit verschiedenartigen Schadstof fen in den Proben zu rechnen ist, mehrere biologische Einheiten, die jeweils aus ei ner subzellulären Struktur bestehen, einzeln oder hintereinander geschaltet, zum Einsatz kommen. Ultimately, especially when using different types of pollutants If the samples are to be counted, several biological units, each consisting of egg ner subcellular structure exist, individually or in series, for Come into play.

Die Veränderungen in der jeweiligen biologischen Einheit aufgrund der physiologi schen Wirkung der Schadstoffe werden mit geeigneten, an sich bekannten biosenso rischen Meßapparaturen gemessen. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um Meß apparaturen, die den Sauerstoffverbrauch oder Fluoreszenseigenschaften betreffen. Die Fluoreszensmessung ist dabei ausschließlich für die Vorgänge in den Thyla koidmembranen einsetzbar.The changes in the respective biological unit due to the physiological The effects of the pollutants are measured using suitable, known biosenso measuring devices. This is preferably measuring equipment that affects oxygen consumption or fluorescence properties. The fluorescence measurement is only for the processes in the thyla koid membranes can be used.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein entsprechendes Verfahren, das mittels einer biosensorischen Meßapparatur den Sauerstoffverbrauch bzw. die Sauerstoffpro duktion sowie den photosynthetischen Elektronentransport durch Fluoreszensmes sung bestimmt.The invention thus relates to a corresponding method, which by means of a biosensory measuring apparatus the oxygen consumption or the oxygen pro production and photosynthetic electron transport by fluorescence measurements solution.

Erfindungsgemäß besteht eine biologische Einheit aus den entsprechenden subzel lulären Strukturen in Form einer wäßrigen Suspension. Unter subzellulären Struktu ren sind prinzipiell alle für diese Zwecke geeigneten Bestandteile von Zellen und de ren Unterstrukturen gemeint, insbesondere also Chloroplasten, Protoplasten, Mito chondrien, Thylakoide.According to the invention, a biological unit consists of the corresponding subzel lular structures in the form of an aqueous suspension. Under subcellular structure Ren are in principle all suitable components of cells for this purpose and de Ren substructures meant, in particular chloroplasts, protoplasts, mito chondria, thylakoids.

Die subzellulären Strukturen können aber auch in Form von Immobilisaten, die nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden können, vorliegen. Dabei sind die entsprechenden subzellulären Strukturen in bzw. an Trägermaterialien fixiert. Als Trägermaterialien sind alle für diese Zwecke bekannten Materialien geeignet, die die Messungen der Fluoreszenz und des Sauerstoffverbrauchs mittels einer Sau erstoffelektrode zulassen, beispielsweise Agar oder entsprechende Polymerisations gele.The subcellular structures can also be in the form of immobilizates can be prepared by methods known per se. Are there the corresponding subcellular structures are fixed in or on carrier materials. All materials known for this purpose are suitable as carrier materials, the measurements of fluorescence and oxygen consumption using a sow Allow electrode, for example agar or corresponding polymerization gel.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein entsprechendes Verfahren, bei dem die biologische Einheit in Form einer im wesentlichen wäßrigen Suspension oder in immobilisierter Form eingesetzt wird. The invention thus relates to a corresponding method in which the biological unit in the form of an essentially aqueous suspension or in immobilized form is used.

Als besonders vorteilhaft hat sich gezeigt, daß die ausgewählte biologische Einheit in lyophilisierter Form sowohl bei der Messung in Suspension als auch im Immobili sat eingesetzt wird. Lyophilisate subzellulärer Strukturen haben den Vorteil, daß sie länger physiologisch wirksam bleiben und daher gut aufbewahrt werden können. Es erübrigt sich so, daß für jede neue Schadstoffbestimmung frische Zellen gewonnen und aufbereitet werden müssen. Überdies konnte überraschend gezeigt werden, daß die Sensitivität der so gewonnenen biologischen Einheit gegenüber der angewand ten Meßmethodik erfindungsgemäß oft höher ist als bei frisch aufbereiteten oder tiefgefrorenem Material. Die erfindungsgemäßen Lyophilisate können nach im Stand der Technik bekannten Methoden gewonnen werden.It has been shown to be particularly advantageous that the selected biological unit in lyophilized form both when measuring in suspension and in immobili sat is used. Lyophilisates of subcellular structures have the advantage that they remain physiologically effective longer and can therefore be stored well. It it is superfluous that fresh cells are obtained for each new pollutant determination and have to be processed. Furthermore, it was surprisingly shown that the sensitivity of the biological unit thus obtained to the applied ten measurement methodology according to the invention is often higher than that of freshly prepared or frozen material. The lyophilisates according to the invention can be im Methods known in the art can be obtained.

Alternativ kann die biologische Einheit nach ihrer Isolierung bei ca. -20°C einge froren und über einen Zeitraum von ca. vier Wochen aufbewahrt werden, ohne daß ein größerer Aktivitätsverlust gegenüber dem frisch verwendetem Material festzu stellen ist.Alternatively, the biological unit can be turned on at approx. -20 ° C after isolation frozen and kept for a period of about four weeks without a greater loss of activity compared to the freshly used material pose is.

Ein wesentlicher Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, die Schadstoffe in der richtigen und geeigneten Weise aus den festen Proben aufzube reiten und für die Reaktion mit der biologischen Einheit bereitzustellen.An essential step of the method according to the invention is that Remove pollutants from solid samples in the correct and appropriate manner ride and prepare for reaction with the biological entity.

Dabei hat sich überraschenderweise das qualitative und quantitative Herauslösen bzw. Extrahieren aus den genannten festen Proben als Problem erwiesen, das erfin dungsgemäß gelöst werden mußte.Surprisingly, the qualitative and quantitative extraction or extracting from the solid samples mentioned proved a problem that invented had to be solved properly.

Es wurde nun gefunden, daß die in Struktur und Wirkung unterschiedlichsten Wirk- bzw. Schadstoffe, mit denen Böden und insbesondere Komposte kontaminiert sein können, mit bestimmten, im wesentlichen wäßrigen komplexbildenden Puffersyste men herausgelöst werden können.It has now been found that the most diverse active or Pollutants with which soils and in particular composts are contaminated can, with certain, essentially aqueous complex-forming buffer systems men can be extracted.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein entsprechendes Verfahren, das sich dadurch auszeichnet, daß man die Boden-, Kompost- oder Substratprobe in einem wäßrigen komplexbildenden Puffersystem, welches bei einem pH-Wert zwischen 4 und 7 puffert, aufnimmt, extrahiert, ultrazentrifugiert und den erhaltenen klaren Überstand direkt zu der biologischen Einheit gibt, in welcher die durch die Schadstoffe verur sachten Veränderungen gemessen werden.The invention thus relates to a corresponding method, which is characterized by characterized in that the soil, compost or substrate sample in an aqueous complex-forming buffer system, which at a pH between 4 and 7 buffer, absorb, extract, ultracentrifuged and the clear supernatant obtained directly to the biological unit in which the pollutants gentle changes can be measured.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich die Verwendung von Thylakoidmembra nen, Protoplasten und Mitochondrien in dem oben und unten spezifizierten erfin dungsgemäßen Verfahren, bzw. die entsprechende Verwendung zum Nachweis von Herbiziden, Pestiziden, Fungiziden, Schwermetallen und anderen Umweltschad stoffen.Finally, the invention relates to the use of thylakoid membrane protoplasts and mitochondria in the inventions specified above and below method according to the invention, or the corresponding use for the detection of Herbicides, pesticides, fungicides, heavy metals and other environmental damage fabrics.

Unter dem Begriff "Substrat" werden erfindungsgemäß alle festen, halbfesten, fließbaren aber nicht flüssigen Verbindungen oder Gemische, welche nicht Böden oder Komposte sind, verstanden. Beispiele hierfür sind Kosmetika, Arzneimittel, Lebensmittel sowie Hilfs- und Zusatzstoffe für die genannten Bereiche.According to the invention, the term “substrate” includes all solid, semi-solid, flowable but not liquid compounds or mixtures which are not soils or composts are understood. Examples include cosmetics, pharmaceuticals, Food as well as auxiliaries and additives for the areas mentioned.

Unter komplexbildenden Puffersystemen werden erfindungsgemäß physiologische Pufferlösungen verstanden, welche Komplexe mit anderen Substanzen zu bilden vermögen, zum Beispiel Chelat-Komplexe, EDTA-haltige Puffersysteme, Rin ger'sche Lösung, Citratpuffer oder Clathratbildner wie Huminstoffe. Derartige Puf fersysteme sind nicht nur besonders vorteilhaft in Bezug auf die Fähigkeit, die ent sprechenden Schadstoffe gut herauszulösen, sondern sie besitzen eine besonders schonende Wirkung auf die physiologisch aktiven biologischen Systeme und Ein heiten. Ohne diese Puffersysteme ist zudem die Nachweisgrenze, ermittelt durch die verwendeten biologischen Einheiten, deutlich höher.According to the invention, complex-forming buffer systems include physiological ones Buffer solutions understood which complexes to form with other substances assets, for example chelate complexes, EDTA-containing buffer systems, Rin ger'sche solution, citrate buffer or clathrate formers such as humic substances. Such puf heel systems are not only particularly advantageous in terms of the ability that ent speak out harmful pollutants, but they have a special gentle effect on the physiologically active biological systems and a units. Without these buffer systems, the detection limit is also determined by the biological units used, significantly higher.

Die Nachweisgrenze des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt je nach verwendeter biologischer Einheit und zu messendem Schadstoff zwischen 0.05 und 0.5 µg/l, vorzugsweise zwischen 0.1 und 0.5 µg/l. Bei der Verwendung von Thylakoiden wird erfindungsgemäß ein Elektronenakzeptor (Mediator), wie beispielsweise Fla vin-Mononukleotid (FMN) hinzugesetzt, der den Elektronentransport zwischen PS II und PS I ermöglicht. The detection limit of the method according to the invention depends on the method used biological unit and pollutant to be measured between 0.05 and 0.5 µg / l, preferably between 0.1 and 0.5 µg / l. When using thylakoids According to the invention, an electron acceptor (mediator) such as Fla vin mononucleotide (FMN) is added, which controls the electron transport between PS II and PS I enables.

Mittels des Biosensors der Erfindung können die verschiedenartigsten Schadstoffe gemessen werden, insbesondere Herbizide und Pestizide, die zum einen wasserlös lich sind und zum anderen eine signifikante meßbare Schädigung der biologischen Einheit des Biosensors bewirken. Im folgenden sind einige Beispiele aufgeführt:A wide variety of pollutants can be detected by means of the biosensor of the invention are measured, especially herbicides and pesticides, which are water-soluble are significant and measurable damage to the biological Unit of the biosensor. Here are some examples:

Schadstoffe, welche vorzugsweise mit Thylakoidmembranen als biologische Einheit gemessen werden können:
Herbizide mit Hemmwirkung auf den Elektronentransport am Photosystem II aus der Klasse der Triazine (z. B. Atrazin, Simazin, Terbutylazin), Triazindione (z. B. Metribuzin) oder der Klasse der substituierten Harnstoffderivate (Diuron, Isoprotu ron), der Anilide, Biscarbamate, Uracile oder Heterocyclen (z. B. Tribunil, Bro macil);
Herbizide mit Hemmwirkung auf den Elektronentransport am Photosystem I aus der Klasse der Bipyridine (z. B. Paraquat);
Herbizide mit Entkopplungswirkung des Elektronentransports, z. B. PCP; Herbizide mit Chlorose-Wirkung, wie z. B. Amitrol.Pollutants, which can preferably be measured with thylakoid membranes as a biological unit:
Herbicides with an inhibitory effect on electron transport on Photosystem II from the class of triazines (e.g. atrazine, simazine, terbutylazine), triazinediones (e.g. metribuzin) or the class of substituted urea derivatives (diuron, isoproturon), the anilides, Biscarbamates, uracils or heterocycles (e.g. tribunil, bro macil);
Herbicides with an inhibitory effect on electron transport on photosystem I from the class of the bipyridines (for example paraquat);
Herbicides with decoupling effects of electron transport, e.g. B. PCP; Herbicides with a chlorosis effect, such as. B. Amitrol.

Schadstoffe, welche vorzugsweise mit Protoplasten als biologischer Einheit gemes sen werden können:
Wirkung auf Aminosäuresynthese z. B. durch Methioninsulfoximin;
Wirkung auf die Acetolactat-Synthase (ALS) durch Sulfonylharnstoffe, wie z. B. Amidosulfuron oder Chlorsulfuron;
Hemmwirkung auf die Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-synthase (EPSPS) durch beispielsweise Glyphosat;
Hemmwirkung auf die Histidin-Biosynthese durch z. B. Amitrol.Pollutants, which can preferably be measured with protoplasts as a biological unit:
Effect on amino acid synthesis e.g. B. by methionine sulfoximine;
Effect on acetolactate synthase (ALS) by sulfonylureas, such as. B. amidosulfuron or chlorosulfuron;
Inhibitory effect on enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) by, for example, glyphosate;
Inhibitory effect on histidine biosynthesis by e.g. B. Amitrol.

Schadstoffe, welche vorzugsweise mit Protoplasten und/oder Mitochondrien als biologischer Einheit gemessen werden können:
Wirkung auf Mikrotubuli (z. B. Dinitroaniline, wie Trifuralin);
Wirkung auf die Mitose (Carbamate, Phosphoramide, Pyridine);
Wirkung auf die Cellulose-Synthese;
Wirkung auf die Fettsäuresynthese (z. B. durch Aryloxypropionsäuren, Cyclohexa none, Acetyl-CoA-Carboxylasen);
Auxin-Herbizide, beispielsweise Phenoxycarbonsäuren oder heterocyclische Car bonsäuren, wie Picloram)
Pestizidwirkung durch substituierte Phenole und Anilide.Pollutants, which can preferably be measured with protoplasts and / or mitochondria as a biological unit:
Effect on microtubules (e.g. dinitroanilines such as trifuralin);
Effects on mitosis (carbamates, phosphoramides, pyridines);
Effect on cellulose synthesis;
Effect on fatty acid synthesis (e.g. by aryloxypropionic acids, cyclohexa none, acetyl-CoA carboxylases);
Auxin herbicides, for example phenoxycarboxylic acids or heterocyclic carboxylic acids, such as picloram)
Substitution of pesticides by substituted phenols and anilides.

Weitere Herbizide, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfaßt werden können, sind der gängigen Fachliteratur zu entnehmen (z. B. Herbizide, B. Hock et al., 1995, Georg Thieme Verlag).Other herbicides which are detected by means of the method according to the invention can be found in the current specialist literature (e.g. herbicides, B. Hock et al., 1995, Georg Thieme Verlag).

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern:The following examples are intended to explain the invention further:

example 1

Eine Probe (ca. 10 g) des Bodens, Substrats, Komposts wurde sorgfältig gesiebt (Maschenweite 7-12 mm) und bei ca. 40°C für 10 bis 15 Stunden bis zur Ge wichtskonstanz getrocknet.A sample (approx. 10 g) of the soil, substrate, compost was carefully sieved (Mesh size 7-12 mm) and at approx. 40 ° C for 10 to 15 hours to Ge constant weight dried.

5 g der so vorbereiteten Probe wurden nun in 50 ml eines komplexierenden Puffers, beispielsweise Citratpuffer (aus Trinatriumcitrat und Citronensäure) aufgenommen. Der Puffer wurde durch Mischen von 40 ml deionisiertes Wasser, 40 ml Citratpuffer (20 mM, pH 4 bzw. pH 6).5 g of the sample prepared in this way were then placed in 50 ml of a complexing buffer, for example citrate buffer (from trisodium citrate and citric acid) added. The buffer was made by mixing 40 ml of deionized water, 40 ml of citrate buffer (20 mM, pH 4 or pH 6).

Die suspendierte Probe wurde ca. 10-24 Stunden über Kopf geschüttelt und an schließend bei zunächst 1.700 g für 30 Minuten und dann 30 Minuten bei ca. 22.000 g zentrifugiert.The suspended sample was shaken overhead for about 10-24 hours and turned on closing at 1,700 g for 30 minutes and then 30 minutes at approx. 22,000 g centrifuged.

Der so erhaltene Überstand wurde ohne weiteres Anreicherungsverfahren für die Messung eingesetzt.The supernatant thus obtained was used for the Measurement used.

Als eine von zahlreichen Alternativen wurde ein entsprechender EDTA-haltiger Puffer (10-100 mM EDTA) eingesetzt.Corresponding EDTA was one of numerous alternatives Buffer (10-100 mM EDTA) used.

Als weitere Alternative wurde ein entsprechender Puffer, der einen Chlathratbildner (Huminstoffe) enthält verwendet. As a further alternative there was a corresponding buffer, the chlathrate former Contains (humic substances).

Example 2

Thylakoidmembranen wurden aus ca. 3 Wochen alten Bohnenpflanzen isoliert, die unter Kurztagbedingungen (9 Stunden Licht, 15 Stunden Dunkelperiode, 20°C) zuvor angezogen wurden. Die Isolierung erfolgte nach einem Verfahren von Cohen und Baxter (Plant Physiol. 93, 1005 (1990)). Ein osmotischer Aufschluß der Chlo roplasten in destilliertem Wasser wurde zwischen den Reinigungsschritten einge fügt. Da bei der Isolierung der Thylakoide die meisten für den Elektronentransport verantwortlichen löslichen Stoffe (z. B. NADP, Ferredoxin, Oxidoreduktasen) aus gewaschen werden, wurde Flavin-Mononukleotid als Mediator hinzugefügt, der ei nen starken lichtabhängigen Elektronenfluß an den Thylakoidmembranen hervor ruft, welcher wiederum später durch die Schadstoffwirkung gehemmt wird.Thylakoid membranes were isolated from bean plants that were about 3 weeks old under short day conditions (9 hours light, 15 hours dark period, 20 ° C) were previously dressed. The isolation was carried out using a Cohen method and Baxter (Plant Physiol. 93, 1005 (1990)). An osmotic outcrop of the Chlo Plastics in distilled water were put in between the cleaning steps adds. Since the isolation of the thylakoids most for the electron transport responsible soluble substances (e.g. NADP, ferredoxin, oxidoreductases) washed, flavin mononucleotide was added as a mediator, the egg strong light-dependent electron flow on the thylakoid membranes calls, which in turn is inhibited later by the pollutant effect.

Protoplasten wurden nach einem Verfahren von Schnabl (Planta 152, 307 (1981)) isoliert und aufgereinigt.Protoplasts were prepared using a Schnabl method (Planta 152, 307 (1981)) isolated and cleaned.

Mitochondrien wurden nach einem Verfahren von Douce (aus "Mitochondria in Higher Plants", Kap. 2.II.C, 125 (1992) gewonnen.Mitochondria were developed according to a procedure by Douce (from "Mitochondria in Higher Plants ", Chap. 2.II.C, 125 (1992).

Example 3

Der photosynthetische Elektronentransport durch Thylakoidmembranen wurde so wohl mit der Fluoreszenzmessung als auch mit der Sauerstoffmessung verfolgt.The photosynthetic electron transport through thylakoid membranes was like this probably followed with the fluorescence measurement as well as with the oxygen measurement.

Die Fluoreszenzmessung erfolgte nach einer Methodik von Schreiber und Bilger (Progress in Botany 54, 151 (1993), Springer Verlag). Die Einwirkzeit der Licht blitze betrug zwei Minuten, die eigentliche Messung nur eine Minute. Die Fluores zenzmessung erfolgte mit einem handelsüblichen Fluorometer.The fluorescence measurement was carried out using a method from Schreiber and Bilger (Progress in Botany 54, 151 (1993), Springer Verlag). The exposure time of the light flashes were two minutes, the actual measurement only one minute. The fluores The zenz measurement was carried out with a commercially available fluorometer.

Die Sauerstoffbestimmung erfolgte mit einer handelsüblichen Sauerstoffelektrode. Das Meßverfahren beruht auf der Tatsache, daß ein intakter Elektronentransport in der jeweiligen biologischen Einheit unter Lichteinwirkung einen hohen Sauerstoff verbrauch erzeugt, der durch die Wirkung von Schadstoffen gemindert wird. Die zunächst abgedunkelte Probe (10 min) wurde dann einer Lichtphase von 5 min (150 W Halogenlampe) ausgesetzt. The oxygen was determined using a commercially available oxygen electrode. The measuring method is based on the fact that an intact electron transport in the respective biological unit under the influence of light a high oxygen generated consumption that is reduced by the action of pollutants. The initially darkened sample (10 min) was then exposed to a light phase of 5 min (150 W halogen lamp) exposed.

Als Meßmedium diente ein Puffer aus 250 mmol/l K₂HPO₄/KH₂PO₄, 50 mmol/l NaCl, 12.5 mmol/l NH₄Cl, pH 7.8). Im Falle der Verwendung von Thylakoiden enthielt dieses Medium zusätzlich 30 mg/l FMN. Diese Lösung wurde im Verhältnis 1 : 4 mit bidestilliertem Wasser versetzt.A buffer of 250 mmol / l K ₂ HPO ₄ / KH ₂ PO ₄ , 50 mmol / l NaCl, 12.5 mmol / l NH ₄ Cl, pH 7.8 was used as the measuring medium. If thylakoids were used, this medium contained an additional 30 mg / l FMN. This solution was mixed with bidistilled water in a ratio of 1: 4.

Für jede Messung wurden bei einem Meßvolumen von 0.8 bis 1.0 ml etwa 20-30 µl Thylakoidsuspension an biologischer Einheit (entspricht einem Chlorophyllgehalt 15-25 µg) eingesetzt.For each measurement, about 20-30 µl was used for a measurement volume of 0.8 to 1.0 ml Thylakoids suspension in a biological unit (corresponds to a chlorophyll content 15-25 µg) used.

Example 4 (i) Fluorescence measurement on chloroplast thylakoids

Als eine besonders geeignete Meßgröße erwies sich der Fluoreszenz-Parameter "Yield". Yield = (Fm' - Ft)/Fm' = ΔF/Fm' (Schreiber und Bilger, Progress in Botany 54, 151 (1993), Springer Verlag). Dabei wird bei lichtadaptiertem Chloro phyll die Differenz der maximalen Fluoreszenzausbeute nach sättigendem Lichtblitz (Fm') zur Grundausbeute beim Meßlicht (Ft) bezogen auf Fm' gemessen.The fluorescence parameter proved to be a particularly suitable measurement variable "Yield". Yield = (Fm '- Ft) / Fm' = ΔF / Fm '(Schreiber and Bilger, Progress in Botany 54, 151 (1993), Springer Verlag). Thereby, with light-adapted chloro phyll the difference of the maximum fluorescence yield after saturating flash of light (Fm ') measured for the basic yield of the measuring light (Ft) in relation to Fm'.

Yield-Kontrolle:
0,450 = 100%
Yield-Schadstoffprobe:
0,405 = ca. 10%.Yield control:
0.450 = 100%
Yield pollutant sample:
0.405 = approx. 10%.

Die Probe zeigt eine Hemmung des photosynthetischen Elektronentransports (PET) 10%.The sample shows an inhibition of photosynthetic electron transport (PET) 10%.

(ii) Oxygen measurement on chloroplast thylakoids

Sauerstoffverbrauch (µmol O₂/h/mg Clorophyll) der lyophilisierten Chloropla sten-Thylakoide im Licht. Die Chlorophyll-Bestimmung erfolgte nach Arnon (Plant. Physiol. 24, 1 (1949)).Oxygen consumption (µmol O ₂ / h / mg chlorophyll) of the lyophilized chloroplast thylakoids in the light. The chlorophyll was determined according to Arnon (Plant. Physiol. 24, 1 (1949)).

Kontrolle:
-635 (µmol O₂/h/mg Clorophyll)
Probe:
-375 (µmol O₂/h/mg Clorophyll).Control:
-635 (µmol O ₂ / h / mg chlorophyll)
Sample:
-375 (µmol O ₂ / h / mg chlorophyll).

Die Beeinflussung der biologischen Einheit wird als prozentualer Anteil der Kon trolle (100%) erfaßt.The influence on the biological unit is expressed as a percentage of the con trolls (100%) recorded.

Geringerer Sauerstoffverbrauch im Licht zeigt eine Schädigung der biologischen Einheit an. Lower oxygen consumption in the light shows damage to the biological Unit.

(iii) Oxygen measurement on protoplasts in the dark phase

Kontrolle:
-4,1 (µmol O₂/h/mg Clorophyll)
Probe 1:
-5.0 (µmol O₂/h/mg Clorophyll)
Probe 2:
-4,0 (µmol O₂/h/mg Clorophyll).Control:
-4.1 (µmol O ₂ / h / mg chlorophyll)
Sample 1:
-5.0 (µmol O ₂ / h / mg chlorophyll)
Sample 2:
-4.0 (µmol O ₂ / h / mg chlorophyll).

Höherer Sauerstoffverbrauch im Dunkeln zeigt eine Schädigung der biologischen Einheit an.Higher oxygen consumption in the dark shows damage to the biological Unit.

Sauerstoffproduktion in der anschließenden Lichtphase:
Oxygen production in the subsequent light phase:

Kontrolle:
12,0 (µmol O₂/h/mg Clorophyll)
Probe 1:
8,5 (µmol O₂/h/mg Clorophyll)
Probe 2:
9,2 (µmol O₂/h/mg Clorophyll).Control:
12.0 (µmol O ₂ / h / mg chlorophyll)
Sample 1:
8.5 (µmol O ₂ / h / mg chlorophyll)
Sample 2:
9.2 (µmol O ₂ / h / mg chlorophyll).

Geringerer Sauerstoffverbrauch im Licht zeigt eine Schädigung der biologischen Einheiten.Lower oxygen consumption in the light shows damage to the biological Units.

(iv) Mitochondrial oxygen consumption

Kontrolle:
-15,6 (µmol O₂/h/mg Clorophyll)
Probe:
-10,5 (µmol O₂/h/mg Clorophyll).Control:
-15.6 (µmol O ₂ / h / mg chlorophyll)
Sample:
-10.5 (µmol O ₂ / h / mg chlorophyll).

Geringerer Sauerstoffverbrauch zeigt eine Schädigung der biologischen Einheit an.Lower oxygen consumption indicates damage to the biological unit.

Claims

1. A method for the detection of pollutants in polluted soils, composts and substrates, characterized in that

(i) produces an aqueous extract from a soil, compost or substrate sample,
(ii) purifies said extract,
(iii) gives a sample of this extract to a biological unit consisting essentially of cell organelles or their components, and
(iv) using a biosensory measuring device to measure the physiological parameters in comparison to a standardized, pollutant-free control.

2. The method according to claim 1, characterized in that the biological unit consists essentially of thylakoid membranes.

3. The method according to claim 1, characterized in that the biological unit consists essentially of protoplasts.

4. The method according to claim 1, characterized in that the biological unit consists essentially of mitochondria.

5. The method according to claim 2, characterized in that by means of the biosensori cal measuring apparatus of oxygen consumption or oxygen production and the photosynthetic electron transport is determined by fluorescence measurement becomes.

6. The method according to claim 3 or 4, characterized in that by means of the bio sensory measuring apparatus of oxygen consumption or oxygen production is determined.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the biological unit in the form of an essentially aqueous suspension or in immobilized form is used.

8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the Soil, compost or substrate sample in an aqueous complex-forming puff system that buffers at a pH between 4 and 7, extra hiert, ultracentrifugiert and the clear supernatant obtained directly to the biologi unity.

9. Use of thylakoid membranes, protoplasts and mitochondria in one Method of claims 1 to 8.

10. Use according to claim 9 for the detection of herbicides, pesticides and Heavy metals.

11. Use according to claim 10 for the detection of said pollutants without any enrichment process from a concentration of 0.1-0.5 µg / l depending on Pollutant can be detected.