DE19718016A1

DE19718016A1 - Verfahren zur optischen Detektion von Analytmolekülen in einem natürlichen biologischen Medium

Info

Publication number: DE19718016A1
Application number: DE19718016A
Authority: DE
Inventors: Karl-Heinz Prof Dr Drexhage; Juergen Prof Dr Wolfrum
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-04-29
Filing date: 1997-04-29
Publication date: 1998-11-05
Also published as: ATE308749T1; DE59813161D1; EP0979402A1; EP0979402B1; US6384914B1; WO1998049542A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur opti schen Detektion von Analytmolekülen in einem natürlichen biologischen Medium.

Die optische Detektion einzelner Moleküle wurde erstmals in Applied Optics, Band 15 (1976) S. 2965, beschrieben. In den Folgejahren wurde diese Detektionstechnik verbessert bis hin zur Detektion einzelner Fluorophore, d. h. einzelner fluoreszierender chemischer Gruppen (Chemical Physics Let ters, Band 174 (1990) S. 553).

Bisher war es jedoch nicht möglich, einzelne Moleküle in natürlichen biologischen Medien zu detektieren. Solche Medi en zeigen bei Anregung mit Licht eine starke Hintergrundlu mineszenz (Analytical Chemistry Band 68 (1996) S. 2270). Die Lumineszenz resultiert daraus, daß in natürlichen biologi schen Medien Puffersubstanzen, Enzyme und andere Makromole küle enthaltenen sind. Besonders stark ist diese Lumineszenz bei Blutplasma mit seinen ca. 100 verschiedenen Proteinen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit welchem auch einzelne oder we nige Analytmoleküle in einem natürlichen biologischen Medium detektiert werden können.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist das gattungsgemäße Verfah ren dadurch gekennzeichnet,
daß die Analytmoleküle mit mindestens einem Fluoreszenz farbstoff markiert werden;
daß aus einem Beobachtungsvolumen im natürlichen biolo gischen Medium Einzelphotonen aufgenommen werden, um ein zeitkorreliertes Einzelphotonen-Zählen durchzuführen und Zeitinformationen für die Einzelphotonen zu gewinnen;
daß mindestens zwei Muster vorgegeben werden, wobei ein erstes Muster von dem mindestens einen Fluoreszenzfarbstoff erwartete Zeitinformationen und ein zweites Muster von dem natürlichen biologischen Medium erwartete Zeitinformationen beschreibt;
daß ein Vergleichsmodell durch eine gewichtete Addition der Muster gebildet wird;
daß das Vergleichsmodell durch Variation der Wichtungs faktoren an die gewonnenen Zeitinformationen angepaßt wird;
daß die Werte der Wichtungsfaktoren für eine optimierte Übereinstimmung des Vergleichsmodells mit den gewonnenen Zeitinformationen bestimmt werden; und
daß das Vorhandensein mindestens eines Analytmoleküls dann angenommen wird, wenn der bestimmte Wert des Wichtungs faktors für das erste Muster eine vorgegebene Schwelle über schreitet.

Das Markieren der Analytmoleküle mit Fluoreszenzfarb stoffen macht auch nicht-fluoreszierende Analytmoleküle de tektierbar.

Die durch zeitkorreliertes Einzelphotonen-Zählen aufge nommenen Zeitinformationen können für jedes vorgegebene Zeitintervall in Form einer Abklingkurve dargestellt werden. Die Abklingkurve zeigt den Verlauf des Fluoreszenzzerfalls bzw. des zeitlichen Abklingens der Lumineszenz einer im Beobachtungsvolumen befindlichen Probe. Das natürliche bio logische Medium hat in der Regel eine kurze Lumineszenz abklingzeit. Für unverdünntes Blutplasma beträgt die Ab klingzeit bei einer Anregung mit Licht einer Wellenlänge von 637 nm (1 nm = 1 Nanometer = 10⁻⁹ m) und einer Detektion der Photonen im Wellenlängenbereich von 650 bis 700 nm etwa 300 ps (1 ps = 1 Pikosekunde = 10⁻¹² sec). Wählt man zur Markie rung Fluoreszenzfarbstoffe aus, die eine wesentlich längere Fluoreszenzlebensdauer haben, z. B. 4 ns (1 ns = 1 Nanose kunde = 10⁻⁹ sec), so läßt sich feststellen, wie stark die Fluoreszenzfarbstoffe zur Anklingkurve beigetragen haben.

Mathematisch läßt sich dies dadurch realisieren, daß be kannte Abklingkurven, sog. Muster, für die Hintergrundlumi neszenz des natürlichen biologischen Mediums und der zur Markierung verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe, nach Multipli kation mit Wichtungsfaktoren, addiert werden. Daraus wird ein Vergleichsmodell gewonnen. Die Wichtungsfaktoren werden sodann variiert, und die Werte der Wichtungsfaktoren für eine optimierte Übereinstimmung des Vergleichsmodells mit den gewonnenen Zeitinformationen werden bestimmt.

Die nach Optimierung gewonnenen Werte für die Wichtungs faktoren geben Aufschluß darüber, wie groß der Anteil der von den Fluoreszenzfarbstoffen ausgehenden Photonen an den detektierten Photonen ist. Ist dieser Anteil groß bzw. über schreitet er eine vorgegebene Schwelle, so liegen mit hoher Wahrscheinlichkeit einzelne oder allenfalls wenige Analyt moleküle im Beobachtungsvolumen vor.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht daher eine hohe Diskriminierung zwischen der Fluoreszenz der Fluores zenzfarbstoffe und der Hintergrundlumineszenz des natürli chen biologischen Mediums. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, die von einem markierten Analyt molekül ausgehenden ca. 100 Photonen, die beim Durchgang des Analytmoleküls durch das Beobachtungsvolumen detektiert wer den können, gegen einen Hintergrund von ca. 20 000 Photonen pro Sekunde zu diskriminieren. Diese Diskriminierung ist Voraussetzung für die reproduzierbare Detektion einzelner Analytmoleküle im natürlichen biologischen Medium.

In einer Weiterbildung der Erfindung wird ausgenutzt, daß die Hintergrundlumineszenz von natürlichen biologischen Medien, und insbesondere diejenige von Blutplasma, deutlich abnimmt, wenn für das zeitkorrelierte Einzelphotonen-Zählen Anregungslicht mit einer Wellenlänge größer als 600 nm ver wendet wird. Besonders geeignet hierfür sind die Wellenlän gen zwischen 630 und 670 nm. Da die Fluoreszenz der Farb stoffe stets rotverschoben ist, wird ein zur Detektion ver wendeter Wellenlängenbereich stets langwelliger als die Wel lenlänge der Anregung sein. Detektiert man vorzugsweise Pho tonen, deren Wellenlänge zwischen 10 und 60 nm länger als die jeweilige Anregungswellenlänge ist, so erreicht man eine bevorzugte Detektion der Photonen der Fluoreszenzfarbstoffe und eine verbesserte Diskriminierung zwischen Hintergrund und gewünschtem Signal für die Detektion einzelner Analyt moleküle.

Für das zeitkorrelierte Einzelphotonen-Zählen werden in üblicher Weise eine gepulste Lichtquelle, eine optische Meß anordnung und ein Detektor, verbunden mit einer Detektions elektronik, verwendet, um den zeitlichen Abstand zwischen dem Detektionszeitpunkt eines Photons und dem Zeitpunkt des Anregungspulses detektieren zu können. In einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird als Quelle für das Anre gungslicht ein Diodenlaser verwendet. Diodenlaser sind sehr kostengünstig, sehr klein und erzeugen Licht bei der ge wünschten Wellenlängen im Bereich von 630 bis 670 nm.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird ein natürliches biologisches Medium mit einer Mehrzahl von verschiedenen Analytmolekülen untersucht. Die verschiedenen Analytmoleküle werden spezifisch mit verschiedenen Fluores zenzfarbstoffen mit jeweils unterschiedlichem Fluoreszenz abklingverhalten, z. B. unterschiedlichen Fluoreszenzlebens dauern, markiert.

Die Abklingkurven für vorgegebene Zeitintervalle werden im Falle von monoexponentiellen Fluoreszenzabklingkurven in der Weise modelliert, daß die Fluoreszenzlebensdauer als zu sätzlich anzupassende Variable behandelt wird. Beschreibt man die aufgenommenen Zeitinformationen durch ein solches Modell und bestimmt durch Anpassung die Werte für die Wich tungsfaktoren und die Fluoreszenzlebensdauer, so erlauben einerseits die Wichtungsfaktoren festzustellen, ob ein ein zelnes oder wenige Analytmoleküle im Beobachtungsvolumen vorliegt. Die Bestimmung der optimal passenden Fluoreszenz lebensdauer erlaubt jedoch zusätzlich, eine Aussage über die Art des verwendeten Fluoreszenzfarbstoffs zu machen. Insbe sondere kann dabei festgestellt werden, welche aus einer An zahl von verschiedenen zur Markierung verwendeten Fluores zenzfarbstoffen detektiert wurde. Dies erlaubt eine Identi fizierung der spezifisch mit den Farbstoffen gekoppelten Analytmoleküle.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungs beispielen mit Bezug auf die Zeichnung näher erläutert. In der Zeichnung zeigt:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Anord nung für zeitkorreliertes Einzelphoto nen-Zählen;

Fig. 2 eine Kurve, die die Ergebnisse von Messungen mittels zeitkorreliertem Einzelphotonen-Zäh len für unverzögertes Streulicht (gestrichelt) und für unverdünntes Blut plasma (ausgezogen) darstellt;

Fig. 3 Histogramme von Messungen mittels zeitkorre liertem Einzelphotonen-Zählen an einer un verdünnten Blutplasmaprobe, die unter schiedlich markierte Antikörper enthält;

Fig. 4A eine Kurve, die die Anzahl der in 10 ms Zeiteinheiten detektierten Photonen in Ab hängigkeit von der Zeit darstellt;

Fig. 4B eine Kurve, die den relativen Anteil der auf Fluoreszenz der Fluoreszenzfarbstoffe zu rückführbaren Photonen pro Zeiteinheit für die der Fig. 4A zugrundeliegenden Zeitinfor mationen darstellt; und

Fig. 5 eine Häufigkeitsverteilung von bestimmten Fluoreszenzlebensdauern für die Farbstoffe Cy5 und JA169.

Die betrachteten natürlichen biologischen Medien sind insbesondere Gewebeproben und unverdünntes Blutplasma bzw. -serum. Die Medien werden ohne vorherige Aufreinigungs schritte untersucht, weshalb sie als natürlich bezeichnet werden. In den folgenden Ausführungsbeispielen wird als na türliches biologisches Medium beispielhaft unverdünntes Blutplasma betrachtet.

Die zu detektierenden Analytmoleküle sind insbesondere Biomoleküle, wie Nukleinsäuren, Proteine, Peptide, Hormone, Porphyrine und Antikörper, aber auch Antigene, Haptene und Tumormarker, sowie toxische Substanzen, Umweltgifte, Pesti zide oder pharmazeutische Wirkstoffe wie Alkaloide. In den folgenden Ausführungsbeispielen werden als Analytmoleküle stets Tumormarker betrachtet.

Tumormarker sind in der Regel nur schwach fluoreszenz fähig. Um sie detektieren zu können, werden sie mit Fluores zenzfarbstoffen markiert.

Unverdünntes Blutplasma zeigt bei Anregung mit Licht eine starke Lumineszenz mit Wellenlängen oberhalb von 700 nm. Um dennoch einzelne Tumormarker in unverdünntem Blut plasma detektieren zu können, müssen verschiedene Maßnahmen ergriffen werden, um diesen Hintergrund zurücktreten zu las sen. Eine der Maßnahmen besteht darin, daß zur Anregung Licht mit einer Wellenlänge größer als 600 nm verwendet wird. Ferner wird nur Licht einer Wellenlänge im Bereich kleiner 700 nm, insbesondere zwischen 650 und 700 nm detek tiert. Durch diese erste Maßnahme erreicht man bereits eine starke Reduzierung der Hintergrundlumineszenz des unverdünn ten Blutplasmas.

Ferner werden die Tumormarker mit Farbstoffen markiert, die eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute in Blutplasma auf weisen. Diese Farbstoffe müssen bei den Anregungswellenlän gen oberhalb von 600 nm absorbieren. Besonders vorteilhaft sind Fluoreszenzfarbstoffe mit einem Absorptionsmaximum im Bereich von 620 bis 670 nm, deren Fluoreszenz um 10 bis 60 nm rotverschoben ist und deren Fluoreszenzquantenausbeute mehr als 10% beträgt. Derartige Fluoreszenzfarbstoffe sind in den Patentschriften DE 42 10 970 und WO 93/10189 beschrie ben. Einer der beschriebenen und hier verwendeten Farbstoffe trägt die Bezeichnung JA169. Ferner ist der kommerziell er hältliche Farbstoff Cy5 geeignet. Im beschriebenen Ausfüh rungsbeispiel werden diese beiden Farbstoffe zur Markierung der Tumormarker verwendet.

Neben den beschriebenen spektralen Eigenschaften zeigt unverdünntes Blutplasma bei einer Anregung mit Licht von 637 nm und einer Detektion der Photonen im Wellenlängenbe reich von 650 bis 700 nm eine Lumineszenzabklingzeit von ca. 300 ps. Um die Hintergrundlumineszenz von unverdünntem Blut plasma deutlich von der Fluoreszenz der markierten Tumor marker bzw. Farbstoff zu unterscheiden, sollten daher die zur Markierung verwendeten Farbstoffe Fluoreszenzlebensdau ern aufweisen, die sich deutlich von den genannten 300 ps des unverdünnten Blutplasmas unterscheiden. Die erwähnten Farbstoffe Cy5 und JA169 haben Fluoreszenzlebensdauern von 1,7 ns bzw. 2,7 ns. Diese Fluoreszenzlebensdauern unter scheiden sich hinreichend von den genannten 300 ps. Auch aus diesem Grunde sind die beiden genannten Farbstoffe zur De tektion von einzelnen Tumormarkern in unverdünntem Blut plasma besonders geeignet.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Lebensdauerunterschiede zu einer weiteren Diskriminierung des Hintergrundsignals gegenüber dem Fluoreszenzsignal der markierten Tumormarker genutzt.

Im betrachteten Ausführungsbeispiel werden die zu detek tierenden Tumormarker auf die folgende Weise markiert. Dem Blutplasma werden zu den Tumormarkern passende monoklonale Antikörper zugesetzt. An die monoklonalen Antikörper sind Farbstoffmoleküle gekoppelt, d. h. die monoklonalen Antikör per sind z. B. mit Cy5 oder JA169 markiert. Die monoklonalen Antikörper sind in der Lage, über eine Antikörper-Antigen-Re aktion selektiv an die Tumormarker und nicht an die son stigen Proteine des Blutplasmas zu binden. Dadurch sind auch die Farbstoffmoleküle mit den Tumormarkern gekoppelt, die Tumormarker also mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert.

Zur optischen Detektion der Tumormarker wird in einem Beobachtungsvolumen des Blutplasmas, in dem die markierten Tumormarker gelöst sind, eine Messung mit der Technik des zeitkorrelierten Einzelphotonen-Zählens durchgeführt.

Als Lichtquelle zur Anregung dienen modulierte Licht quellen. Besonders geeignet sind gepulste Lasersysteme, die Pulse mit einer Pulslänge kleiner als 1 ns bei einer Repeti tionsrate von mehr als 10 MHz liefern. Die Anregungslaser können dabei Festkörperlaser, Farbstofflaser, Ionenlaser, Gaslaser, vorzugsweise jedoch Diodenlaser sein.

Der Einsatz gepulster Lichtquellen ermöglicht u. a. eine Trennung zwischen unverzögertem Streulicht aus dem natürli chen biologischen Medium und dem verzögerten Fluoreszenz licht der Farbstoffe.

Die vorzugsweise eingesetzten Diodenlaser emittieren in dem gewünschten Wellenlängenbereich oberhalb von 600 nm. Ty pische Wellenlängen für Diodenlaser liegen zwischen 620 und 670 nm. Der hier eingesetzte Diodenlaser emittiert bei einer Wellenlänge von 637 nm. Seine Pulslänge liegt unterhalb von 500 ps und seine Repetitionsrate beträgt 30 MHz. Seine mitt lere Leistung beträgt 0,5 mW.

Im folgenden wird auf Fig. 1 Bezug genommen. Der Licht strahl des Diodenlasers 1 wird über eine Linse 2 und einen dichroitischen Strahlteiler 3 in ein Mikroskopobjektiv 4 eingekoppelt. Das Mikroskopobjektiv 4 weist eine starke Ver größerung und eine hohe numerische Apertur auf. Mit Hilfe des Mikroskopobjektivs wird der Laserstrahl in das Beobach tungsvolumen fokussiert.

Durch die Fokussierung des Laserstrahle ist das Beobach tungsvolumen auf wenige Femtoliter begrenzt. Bei einer Kon zentration von 10⁻⁹ oder weniger Mol Tumormarker pro Liter Blutplasma befindet sich im Mittel weniger als ein Tumor marker im Beobachtungsvolumen. Die Wahrscheinlichkeit, daß sich mehr als ein Tumormarker im Beobachtungsvolumen befin det, ist entsprechend geringer.

Die Zeit, die ein Tumormarkermolekül benötigt, um durch das Beobachtungsvolumen zu diffundieren, d. h. die Verweil- bzw. Meßzeit, beträgt zwischen Bruchteilen einer 1 ms bis einige ms. Während des Aufenthaltes des fluoreszenzmarkier ten Tumormarkers im Beobachtungsvolumen kann der an den Tu mormarker gekoppelte Fluoreszenzfarbstoff in Abhängigkeit von seinem Extinktionskoeffizienten bei der Anregungswellen länge Licht absorbieren. Das absorbierte Licht wird in Ab hängigkeit von der Fluoreszenzquantenausbeute und -lebens dauer, der Triplettausbeute und -lebensdauer und der Photo stabilität der Fluoreszenzfarbstoffe in Form von Photonen wieder emittiert. Während der Meßzeit durchlaufen die Fluo reszenzfarbstoffe mehrere solcher Anregungs- und Emissions zyklen.

Die emittierten Photonen werden wieder mit Hilfe des Mi kroskopobjektivs 4 gesammelt.

Die von den Fluoreszenzfarbstoffen emittierten und vom Mikroskopobjektiv 4 gesammelten Photonen passieren den dichroitischen Strahlteiler 3, der so ausgebildet ist, daß er das rotverschobene Fluoreszenzlicht transmittiert. Hinter dem dichroitischen Strahlteiler befindet sich ein Spektral filter 5, in der Regel ein Interferenzfilter, der so ausge bildet ist, daß er die Emissionswellenlänge der Fluoreszenz farbstoffe möglichst verlustfrei transmittiert und alle an deren Wellenlängen möglichst blockt. Aus der spektralen Trennung der Lumineszenz des Blutplasmas und des in der Wel lenlänge nicht verschobenen Streulichts von der Fluoreszenz der Farbstoffe mit Hilfe des dichroitischen Strahlteilers und des Interferenzfilters resultiert eine weitere Reduzie rung der unerwünschten Hintergrundlumineszenz und somit eine Verbesserung der Diskriminierung zwischen dem Signal der fluoreszenzmarkierten Tumormarker und des Blutplasmas.

Hinter dem Spektralfilter 5 befindet sich eine Loch blende 6 mit einem Durchmesser von 50 bis 200 µm, vorzugs weise mit einem Durchmesser von 100 µm. Auf diese Lochblende wird das Beobachtungsvolumen abgebildet. Es ergibt sich da mit eine räumliche Einengung des beobachteten Volumens auf den Fokus des Laserstrahls im Blutplasma. Eine solche Anord nung wird als konfokales Auflicht- bzw. Epifluoreszenz-Mi kroskop bezeichnet.

Hinter der Lochblende 6 befindet sich ein Detektor 7. Der Detektor muß so ausgebildet sein, daß er einzelne Photo nen mit hoher zeitlicher Auflösung detektieren kann. Dazu sind Photomultiplier und Avalanche-Photodioden geeignet. Be sonders geeignet für die Detektion von Photonen bei Wellen längen zwischen 650 und 700 nm sind Avalanche-Photodioden auf Silizium-Halbleiter-Basis. Die Quanteneffizienz dieser Avalanche-Photodioden beträgt in dem genannten Spektralbe reich zwischen 650 und 700 nm bis zu 70%. Ferner weisen Avalanche-Photodioden eine sehr geringe Dunkelzählrate von unter 60 Pulsen pro Sekunde auf. Sie sind daher hoch emp findlich bei einem sehr geringen Hintergrundrauschen.

Mit den für zeitkorreliertes Einzelphotonen-Zählen übli chen Mitteln 8 wird der zeitliche Abstand zwischen dem Zeit punkt der Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe durch einen Im puls des Diodenlasers 1 und dem Zeitpunkt der Detektion eines Photons an der Avalanche-Photodiode 7 bestimmt. Für jedes detektierte Photon wird die so bestimmte Zeitinforma tion mit Hilfe eines Vielkanal-Analysators 9 in einen Zeit kanal einsortiert. Diese Einsortierung kann sowohl unmittel bar als auch erst bei einer nachfolgenden Auswertung gesche hen.

Da die Fluoreszenzfarbstoffe, die an die Tumormarker ge koppelt sind, während des Durchtritts der Tumormarker durch das Beobachtungsvolumen mehrere Anregungs- und Emissionszy klen durchlaufen, kommt es bei einem Durchtritt eines Tumor markermoleküls durch das Beobachtungsvolumen zu einem Schau er von Photonen, der vom Detektor detektiert wird. Die An zahl der pro Durchtritt eines Tumormarkermoleküls durch das Beobachtungsvolumen detektierbaren Photonen beträgt einige 100. Diese Photonen können in Zeitintervallen von jeweils z. B. 10 ms gesammelt werden.

Alternativ dazu kann bei jedem Photon außer dem zeitli chen Abstand zwischen Anregungs- und Detektionszeitpunkt ferner der absolute Detektionszeitpunkt bestimmt werden. Ein Aufsummieren der Zeitinformationen erfolgt dann vorzugsweise in Zeitintervallen, die an den Durchtritt eines Tumormarker moleküls durch das Beobachtungsvolumen angepaßt wurden.

In Fig. 2 ist auf der X-Achse der zeitliche Abstand zwi schen der Anregung durch ein Anregungspuls des Lasers 1 und dem Zeitpunkt der Detektion eines Photons durch den Detektor 7 aufgetragen. Auf der Y-Achse ist die Anzahl der in einen Zeitkanal einsortierten Detektionsereignisse, hier als "Counts" bezeichnet, aufgetragen. Die Breite eines typischen Zeitkanals beträgt 50 ps.

In Fig. 2 zeigt die gestrichelte Linie eine durch zeit korreliertes Einzelphotonen-Zählen mit der beschriebenen An ordnung aufgenommene Abklingkurve für eine Lösung, die das Anregungslicht unverzögert streut. Diese sogenannte Instru mentenfunktion spiegelt die maximale zeitliche Auflösung wieder, die sich aus der Breite der Anregungspulse und dem zeitlichen Auflösungsvermögen des Detektors 7 und der ange schlossenen Einrichtungen 9 ergibt. Jede aufgenommene Ab klingkurve, z. B. der Fluoreszenzfarbstoffe, kann nicht in ihrer möglicherweise reinen exponentiellen Gestalt beobach tet werden, sondern wird stets beobachtet als Ergebnis einer Faltung mit der Instrumentenfunktion. Eine Rekonstruktion der reinen exponentiellen Abklingfunktion ist durch eine Entfaltung der gemessenen Abklingkurve möglich.

In Fig. 2 zeigt die ausgezogene Linie eine durch zeit korreliertes Einzelphotonen-Zählen mit der beschriebenen An ordnung gemessene Abklingkurve für Blutplasma. Die Abkling kurve des Blutplasmas zeigt bei Anregung mit Licht bei 637 nm und einer Detektion der Photonen im Bereich von 650 bis 700 nm eine Abklingdauer von ca. 300 ps.

In Fig. 3 sind, wie in Fig. 2, auf der X-Achse wieder der zeitliche Abstand in ns zwischen Anregungspuls und De tektion eines Photons und auf der Y-Achse die Counts aufge tragen, während auf der Z-Achse die während der Messung ver strichene Zeit in ms aufgetragen ist. Die gewonnen Zeit informationen wurde für jeweils 10 ms aufsummiert und als Abklingkurve dargestellt. Wie erwähnt, enthält das Blut plasma beispielhaft zwei unterschiedlich markierte Antikör per in einer Konzentration von 10^-11 Mol pro Liter. Während die ersten 20 ms in Fig. 3 die reine Hintergrundlumineszenz der Blutplasmaprobe zeigen, wandert nach ca. 30 ms ein Cy5 markierter Antikörper in das Beobachtungsvolumen. Nach 80 ms wandert ein JA169 markierter Antikörper in das Beobachtungs volumen.

Man sieht, daß sich in Fig. 3 die Abklingkurven des Blutplasmas, des Cy5 markierten Antikörpers und des JA169 markierten Antikörpers insbesondere darin unterscheiden, daß die charakteristische Abklingdauer unterschiedlich lang ist. Die Abklingdauer von JA169 beträgt 2,7 ns und ist von den drei betrachteten Abklingzeiten deutlich als die längste zu erkennen.

Fig. 4A zeigt die Anzahl der pro Zeiteinheit von 10 ms detektierten Photonen (Counts oder Zählrate) in Abhängigkeit von der während der Messung verstrichenen Zeit in ms. Aus dem reinen Blutplasma werden ca. 200 Photonen pro 10 ms de tektiert. Während des Durchtritts eines farbstoffmarkierten Tumormarkermoleküls erhöht sich die Zählrate, wie es in Fig. 4A bei ca. 400 und ca. 900 ms zu erkennen ist.

Im folgenden wird beschrieben, wie eine sichere Detek tion einzelner farbstoffmarkierter Tumormarkermoleküle er reicht werden kann.

Um aus den für vorgegebene Zeitintervalle gewonnen Ab klingkurven erschließen zu können, ob in dem betrachteten Zeitintervall im Beobachtungsvolumen ein Analytmolekül, hier also ein Tumormarker, vorhanden war, kann dem nachfolgend beschriebenen Verfahren ein Schritt vorangestellt werden, in dem die Abklingkurven mit Hilfe der Instrumentenfunktion entfaltet werden. Alles nachfolgend gesagte kann sich somit entweder auf entfaltete Abklingkurven oder nicht-entfaltete Abklingkurven beziehen.

Zunächst werden mindestens zwei Muster vorgegeben, wobei ein erstes Muster den erwarteten Verlauf der Abklingkurve für die zur Markierung verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe wiedergibt und ein zweites Muster den erwarteten zeitlichen Verlauf der Abklingkurve für die Hintergrundlumineszenz des natürlichen biologischen Mediums, hier also des unverdünnten Blutplasmas, wiedergibt. Im folgenden wird das Muster für die Fluoreszenzfarbstoffe als p₁(i) bezeichnet und das Muster für das unverdünnte Blutplasma als p₂(i). Dabei be zeichnet i das i-te mikroskopische Zeitintervall, d. h. die z. B. 50 ps breiten Zeitkanäle der x-Achse der Darstellung der Abklingkurven gemäß Fig. 2.

Die Muster können sowohl direkt aus Eichmessungen gewon nen werden, als auch auf der Basis der durch Eichmessungen gewonnenen Informationen erstellt werden. Im ersten Fall werden die Muster eine konkret vorgegebene Menge von Zahlen sein, die aus den Eichmessungen, ggf. nach Glättung und Nor mierung auf 1, gewonnen wurden. Im zweiten Fall werden die Muster mit Hilfe einer mathematischen Funktion gewonnen, z. B. einem exponentiellen Abfall, aus der konkrete Werte für die p₁(i) oder p₂(i) berechnet werden können.

Vorteilhafterweise werden die Muster auf eins normiert, d. h.

wobei über alle mikroskopische Zeitkanäle i summiert wird.

Um ein Modell zu erhalten, das mit den gewonnenen Ab klingkurven verglichen werden kann, werden die vorgegebenen Muster p₁(i) und p₂(i) gewichtet addiert, d. h. addiert, nachdem sie mit Wichtungsfaktoren A₁ und A₂ multipliziert wurden:

p(i) = A₁p₁(i) + A₂p₂(i) (2).

p(i) ist somit das Modell, das mit den gewonnenen Ab klingkurven verglichen wird.

In einem Anpassungstest kann das Vergleichsmodell durch Variation der Wichtungsfaktoren A₁ und A₂ an die gewonnenen Abklingkurven angepaßt werden.

Als Anpassungstest eignen sich insbesondere der Test der kleinsten quadratischen Abweichung und ein informations theoretischer Test, der auf der minimalen Kullback-Leibler Diskriminierungsinformation als Abstandsmaß basiert. Erste rer ist einfach zu handhaben, und letzterer hat eine beson ders geringe statistische Fehlerrate.

Durch einen Anpassungstest können die Werte der Wich tungsfaktoren für eine optimale Übereinstimmung des Ver gleichsmodell mit den gewonnenen Abklingkurven bestimmt wer den. Das Vorhandensein mindestens eines Tumormarkers wird dann angenommen, wenn der Wichtungsfaktor A₁ eine vorgege bene Schwelle überschreitet. Diese Schwelle muß in Abhängig keit von den konkreten experimentellen Gegebenheiten und der gewünschten Sicherheit der Detektion vorgegeben werden.

Vorzugsweise wird das Muster p(i) durch eine normierte Form der Wichtungsfaktoren ausgedrückt:

p(i) = N (ap₁(i) + (1-a) p₂(i)) (3)

dabei ist

a gibt somit denjenigen relativen Anteil der detektier ten Photonen an, der auf Fluoreszenz der Fluoreszenzfarb stoffe zurückgeführt werden kann. N ist die gesamte Anzahl der detektierten Photonen, die zum Erstellen der gewonnenen Abklingfunktionen verwendet wurden. Wird, wie im vorliegen den Ausführungsbeispiel, die Abklingkurve jeweils für ein Zeitintervall von 10 ms erstellt, so stellt N die Anzahl der in dem vorgegebenen Zeitintervall von 10 ms detektierten Photonen dar.

Das so dargestellte Muster p₁(i) ist somit automatisch in seiner Gesamtamplitude auf die Gesamtzahl der im vorgege benen Zeitintervall detektierten Photonen normiert, wie es aus Gl. (5) unter Verwendung von Gl. (3) und Gl. (1) deut lich wird:

Dieses Modell wird durch Variation des relativen Anteils a an die gewonnene Abklingkurve angepaßt. Dadurch wird der Wert für den relativen Anteil a für eine optimale Überein stimmung des so dargestellten Vergleichsmodells mit der ge wonnenen Abklingkurve bestimmt. Überschreitet der relative Anteil a eine vorgegebene Schwelle, so wird das Vorhanden sein mindestens eines Tumormarkers im Beobachtungsvolumen angenommen. Als geeignet hat sich eine Schwelle von 0,3 er wiesen.

Die Unterscheidung zwischen einem an den Tumormarker ge bundenen Farbstoff-markierten Antikörper und einem ungebun denen Farbstoff-markierten Antikörper kann z. B. mit Hilfe der Verweildauer im Beobachtungsvolumen geschehen.

Ebenso kann über eine Korrelationsfunktion in bekannter Weise die Diffusionskonstante des detektierten Moleküls er mittelt werden. Eine Erhöhung der Diffusionskonstante weist dabei auf einen gebundenen Zustand des markierten Antikör pers und damit auf die Detektion eines Tumormarkermoleküls hin.

Ferner kann die Bindung von mit Farbstoffen markierten Antikörpern an Analytmoleküle bzw. Tumormarker auf die fol gende Weise festgestellt werden.

Die Antikörper werden mit zwei verschiedenen Farbstoff molekülen markiert. Die Farbstoffmoleküle unterscheiden sich dabei in ihrer Fluoreszenzlebensdauer. Der erste Farbstoff habe eine Fluoreszenzlebensdauer von τ₁₁ und der zweite von τ₁₂.

In der Regel weisen Antigene, hier also die Tumormarker, mehr als eine Bindungsstelle für Antikörper auf. Teilweise werden ca. 100 Antikörper an einem Antigen gebunden. Durch die Bindung von mehr als einem Farbstoff-markierten Anti körper an einen Tumormarker entsteht ein Komplex aus Tumor marker und mehr als einem Farbstoff-markierten Antikörper. Je mehr Farbstoff-markierte Antikörper am Tumormarker gebun den sind, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, daß die beiden verschiedenen Farbstoffe im Komplex vorhanden sind.

Die Bindung der Farbstoff-markierten Antikörper an einen Tumormarker und damit das Vorliegen eines Tumormarkers kann sodann dadurch festgestellt werden, daß sowohl Farbstoffmo leküle mit der Fluoreszenzlebensdauer τ₁₁ als auch solche mit τ₁₂ gleichzeitig im Beobachtungsvolumen nachgewiesen werden. Ungebundene Farbstoff-markierte Antikörper liegen mit hoher Wahrscheinlichkeit einzeln im Beobachtungsvolumen vor und nicht gleichzeitig mit anderen Farbstoff-markierten Antikör pern.

Mathematisch läßt sich dies dadurch quantifizieren, daß als erstes Muster, d. h. dasjenige für die Fluoreszenzab klingkurve der Farbstoffe, eine Überlagerung der Abkling kurven für beide Fluoreszenzlebensdauern τ₁₁ und τ₁₂ vorgege ben wird. Die relativen Anteile der einzelnen Lebensdauern am ersten Muster könnten dabei z. B. 50% betragen. Um ein quantitatives Kriterium für das Vorliegen eines Komplexes im Beobachtungsvolumen zu haben, wird dann wieder der dem er sten Muster zugehörige relative Anteil a betrachtet. Über schreitet er den Wert von 0,3, so liegt mit hoher Wahr scheinlichkeit ein Tumormarker im Beobachtungsvolumen vor.

Ebenso könnte man zur quantitativen Erfassung das Ver gleichsmodell aus drei Mustern aufbauen, einem ersten ent sprechend einer Fluoreszenzabklingkurve mit der Fluoreszenz lebensdauer τ₁₁, dem genannten zweiten Muster für das Blut plasma und einem dritten Muster entsprechend einer Fluores zenzabklingkurve mit der Fluoreszenzlebensdauer τ₁₂. Es wird dann sowohl der relative Anteil für τ₁₁ als auch derjenige für τ₁₂ bestimmt. Ein Kriterium für das Vorliegen eines Tu mormarkers im Beobachtungsvolumen ist dann beispielsweise, daß die Summe der relativen Anteile für τ₁₁ und τ₁₂ größer als 0,3 ist und zusätzlich jeder einzelne relative Anteil größer als 0,1 ist.

Die Antikörpermoleküle können bei diesem Verfahren auch mit mehr als zwei verschiedenen Farbstoffmolekülen markiert werden, zu denen entsprechende Muster und Vergleichsmodelle vorgegeben werden.

Außer durch Eichmessungen können die Muster p₁(i) und p₂(i), wie oben erwähnt, auch durch geeignete mathematische Modelle beschrieben werden, die aus Informationen aufgebaut werden, die in Eichmessungen gewonnen wurden. Typischerweise beobachtet man, daß die Fluoreszenz von Fluoreszenzfarbstof fen sich durch einen monoexponentiellen Verlauf beschreiben läßt. Das Muster p₁(i) kann in entfalteter Form somit durch Gl. (6) beschrieben werden:

solange Δt(i) als klein gegenüber der Fluoreszenzlebens dauer τ₁ angenommen werden kann. Dabei ist Δt(i) die zeit liche Dauer eines mikroskopischen Zeitintervalls, im be trachteten Ausführungsbeispiel 50 ps, und τ₁ die Fluores zenzlebensdauer der zur Markierung der Tumormarkermoleküle verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe. Für Cy5 beträgt τ₁ 1,7 ns und für JA169 2,7 ns. t(i) ist der mikroskopische Zeitpunkt, an dem das i-te mikroskopische Zeitintervall beginnt.

In der Regel haben alle mikroskopischen Zeitintervalle Δ t(i) die gleiche zeitliche Dauer Δt so daß gilt:

Δt(i) = Δt und t(i) = iΔt (7).

Werden die mikroskopischen Zeitintervalle bzw. -kanäle i nicht von Kanal 0 sondern von Kanal 1 an gezählt, so muß ggf. i durch (i-1) ersetzt werden.

Unter diesen Bedingungen erhält man als Muster für einen monoexponentiellen Zerfall die folgende Darstellung:

Das Muster p₁(i), wie es in Gl. (6) bzw. (8) dargestellt ist, kann dazu verwendet werden, mit einem aus einer Eich messung gewonnenen und entfalteten Muster p₂(i) gewichtet addiert zu werden. Das durch diese gewichtete Addition ge wonnene Modell kann dann mit den gewonnenen und entfalteten Abklingkurven verglichen werden, um den relativen Anteil a zu gewinnen.

Ebenso kann das durch Gl. (6) bzw. (8) gewonnene Muster p₁(i) mit der Instrumentenfunktion gefaltet werden. Danach kann es mit einem nicht-entfalteten und aus einer Eichmes sung gewonnenen Muster p₂(i) gewichtet addiert werden. Das sich ergebende p(i) kann mit einer nicht-entfalteten gewon nenen Abklingkurve verglichen werden.

Ebenso kann die Abklingkurve für das unverdünnte Blut plasma durch einen monoexponentiellen Zerfall gemäß Gl. (9) beschrieben werden:

wobei τ₂ die effektive Lumineszenzabklingzeit des unver dünnten Blutplasmas ist, die bei Anregung mit Licht bei 637 nm und einer Detektion der Photonen im Bereich von 650 bis 700 nm ca. 300 ps beträgt.

Werden beide Muster p₁(i) und p₂(i) durch monoexponenti elle Verläufe der Abklingkurven beschrieben, so spricht man von einem biexponentiellen Modell.

Fig. 4B zeigt den für verschiedene Zeitintervalle von jeweils 10 ms während einer Messung bestimmten relativen An teil a. Vergleicht man die Fig. 4A und 4B, so sieht man, daß eine Betrachtung des relativen Anteils a eine deutliche Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses gegenüber Fig. 4A bewirkt. Ferner erkennt man in Fig. 4B zusätzlich, daß bei ca. 100 ms ein weiterer Tumormarker durch das Beobach tungsvolumen trat. Dies konnte in Fig. 4A nicht verläßlich erkannt werden. In Fig. 4A wurde lediglich die Anzahl der pro 10 ms detektierten Photonen betrachtet. Das Betrachten des relativen Anteils a wird dadurch möglich, daß die ein zelnen Photonen zeitkorreliert detektiert werden und somit die in den unterschiedlichen Abklingzeiten enthaltene Infor mation genutzt werden kann.

Im folgenden wird ein zweites Ausführungsbeispiel be schrieben, daß neben der Detektion einzelner Tumormarkermo leküle auch eine Identifizierung verschiedener Tumormarker bzw. Analytmoleküle erlaubt. Es wird also ein unverdünntes Blutplasma untersucht, in dem verschiedene Tumormarker ge löst sind.

In diesem zweiten Ausführungsbeispiel werden die zu de tektierenden verschiedenen Tumormarker auf die folgende Weise markiert. Dem Blutplasma werden verschiedene, zu den verschiedenen Tumormarkern passende monoklonale Antikörper zugesetzt. An die monoklonalen Antikörper sind jeweils ver schiedene Farbstoffmoleküle gekoppelt. Ein monoklonaler An tikörper ist z. B. mit Cy5 und ein anderer mit JA169 mar kiert. Eine solche Markierung kann während einer Vorberei tung der monoklonalen Antikörper erfolgen.

Die zur spezifischen Markierung ausgewählten Fluores zenzfarbstoffe müssen dabei jeweils ein unterschiedliches Fluoreszenzabklingverhalten zeigen, da dieses zur Identifi zierung genutzt wird.

Die verschiedenen monoklonalen Antikörper sind, wie be schrieben, in der Lage, über eine Antikörper-Antigen-Reak tion spezifisch an die verschiedenen Tumormarker zu binden. Dadurch sind auch die verschiedenen Farbstoffmoleküle spezi fisch mit den Tumormarkern gekoppelt.

In Fig. 3 ist erkennbar, daß das Antikörpermolekül, das sich bei 30 ms im Beobachtungsvolumen befindet, mit Cy5 mar kiert ist, während das Antikörpermolekül, das sich bei 80 ms im Beobachtungsvolumen befindet, mit JAI69 markiert ist, da die Abklingkurve bei 30 ms schneller als die bei 80 ms ab fällt, also eine kürzere Fluoreszenzlebensdauer aufweist. Die Tumormarker sind somit im Prinzip aufgrund der Fluores zenzlebensdauer der spezifisch mit ihnen verbundenen Fluo reszenzfarbstoffe identifizierbar.

Zum Identifizieren der verschiedenen Tumormarker über das unterschiedliche Fluoreszenzabklingverhalten der Farb stoffe, wird für jeden zur Markierung verwendeten Farbstoff ein erstes Muster vorgegeben. Sodann wird für jeden Farb stoff dieses Muster mit dem vorgegebenen zweiten Muster für das Blutplasma gewichtet addiert, um jeweils zugehörige Ver gleichsmodelle zu erhalten. Durch Variation der Wichtungs faktoren wird die Übereinstimmung zwischen dem jeweiligen Vergleichsmodell und den gewonnenen Zeitinformationen opti miert.

Dasjenige Vergleichsmodell, das die beste Übereinstim mung mit den gewonnenen Zeitinformationen aufweist, wird als das zutreffende Vergleichsmodell angesehen. Das zum Erstel len dieses Vergleichsmodells verwendete erste Muster eines Farbstoff gibt Aufschluß über das Vorliegen dieses Farb stoffs im Beobachtungsvolumen. Dieses, wiederum, gibt - auf grund der spezifischen Markierung der Tumormarker - Auf schluß darüber, welcher Tumormarker detektiert wurde.

In einer Weiterbildung des zweiten Ausführungsbeispiels werden die verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt, daß sie einen monoexponentiellen zeitlichen Verlauf der Fluoreszenz erwarten lassen. Das erste Muster p₁(i) wird durch Gl. (6) bzw. (8) beschrieben. Die Fluoreszenzlebens dauer τ₁ wird als zusätzliche Variable zur Anpassung des Vergleichsmusters an die gewonnene Abklingkurve verwendet.

Man erhält somit einerseits den relativen Anteil a und andererseits die optimal passende Fluoreszenzlebensdauer τ₁ als Ergebnis einer Anpassung zwischen Vergleichsmodell und gewonnener Abklingkurve. Der relative Anteil a ermöglicht die Detektion der Tumormarkermoleküle, während die gewonnene Fluoreszenzlebensdauer τ₁ deren Identifizierung erlaubt.

Auch in diesem Ausführungsbeispiel können als Muster p₂(i) für das Blutplasma sowohl durch Eichmessung gewonnene Muster als auch aus einem monoexponentiellen Modell gewon nene Muster verwendet werden. Im letzteren Fall wird eine Lumineszenzabklingzeit von 300 ps des Blutplasmas angenom men.

Ferner können auch in diesem Ausführungsbeispiel die Muster bzw. Abklingkurven entfaltet oder nicht-entfaltet ausgewertet werden.

Fig. 5 zeigt die Häufigkeit von Fluoreszenzlebensdauern in ns, wie sie mit Hilfe des soeben beschriebenen Verfahrens für die zur Markierung verwendeten Farbstoffe Cy5 und JA169 bestimmt wurden. Man sieht, das die für Cy5 und JA169 be stimmten Fluoreszenzlebensdauern um ihren Mittelwert von 1,7 bzw. 2,7 ns zentriert sind und mit hinreichender Verläß lichkeit erkannt werden können.

Wird in einem dritten Ausführungsbeispiel das Ver gleichsmuster durch die einfache Gl. (10) beschrieben:

so zeigt ein Vergleich mit den Gleichungen (3), (6) und (8), daß gilt:

Als Kriterium für das Vorhandensein eines Tumormarkers im Beobachtungsvolumen wird in diesem Ausführungsbeispiel das Überschreiten einer Schwelle durch das normierte Produkt des Wichtungsfaktors B₁ mit der bestimmten Fluoreszenzle bensdauer τ₁ herangezogen. Dieses normierte Produkt ist de finiert als:

Man erkennt aus Gl. (13) mit Hilfe von Gl. (11), daß dieses normierte Produkt gleich dem relativen Anteil a ist:

Im Rahmen des Erfindungsgedankens sind zahlreiche Ab wandlungen möglich. Es ist beispielsweise nicht unumgäng lich, die gewonnenen Zeitinformationen für vorgegebene Zeit intervalle zu Abklingkurven zusammenzufassen oder als solche darzustellen. Vielmehr kann mit Hilfe entsprechenden mathe matischen Modellen mit den für jedes detektierte Photon ge wonnene Zeitinformationen direkt gerechnet werden. Die Muster werden in einem solchen Fall passend ausgebildet und bilden nicht notwendigerweise Abklingkurven.

Auch können für die Muster p₁(i) und p₂(i) nicht nur mo noexponentielle Modelle sondern auch ein mehrexponentielle oder sonstige Modelle verwendet werden. Vorzugsweise werden diese Modelle keine weiteren Variablen enthalten. Es ist je doch auch denkbar, daß diese Modelle weitere Variablen, etwa die Gewichte einzelner Exponentialkomponenten, enthalten.

Ferner können außer den erwähnten Farbstoffen Cy5 und JA169 auch andere Farbstoffe zur Markierung verwendet wer den.

Schließlich können außer der beschriebenen biochemischen spezifischen Antikörper-Antigen-Reaktion auch andere, z. B. kovalente Wege der Markierung beschritten werden, oder es wird eine Hybridisierung zwischen DNS-Strängen ausgenutzt.

Claims

1. Verfahren zur optischen Detektion von Analytmolekülen in einem natürlichen biologischen Medium, dadurch gekennzeichnet,
daß die Analytmoleküle mit mindestens einem Fluoreszenz farbstoff markiert werden;
daß aus einem Beobachtungsvolumen im natürlichen biolo gischen Medium Einzelphotonen aufgenommen werden, um ein zeitkorreliertes Einzelphotonen-Zählen durchzuführen und Zeitinformationen für die Einzelphotonen zu gewinnen;
daß mindestens zwei Muster vorgegeben werden, wobei ein erstes Muster von dem mindestens einen Fluoreszenzfarbstoff erwartete Zeitinformationen und ein zweites Muster von dem natürlichen biologischen Medium erwartete Zeitinformationen beschreibt;
daß ein Vergleichsmodell durch eine gewichtete Addition der Muster gebildet wird;
daß das Vergleichsmodell durch Variation der Wichtungs faktoren an die gewonnenen Zeitinformationen angepaßt wird;
daß die Werte der Wichtungsfaktoren für eine optimierte Übereinstimmung des Vergleichsmodells mit den gewonnenen Zeitinformationen bestimmt werden; und
daß das Vorhandensein mindestens eines Analytmoleküls dann angenommen wird, wenn der bestimmte Wert des Wichtungs faktors für das erste Muster eine vorgegebene Schwelle über schreitet.

2. Verfahren nach der Anspruch 1, dadurch gekennzeich net,
daß zum Markieren der Analytmoleküle Fluoreszenzfarb stoffe mit einer Rotverschiebung zwischen 10 und 60 nm ver wendet werden;
daß Anregungslicht mit einer Wellenlänge zwischen 630 und 670 nm verwendet wird; und
daß die Detektion auf Photonen mit einer zwischen 10 und 60 nm längeren Wellenlänge als das jeweilige Anregungslicht konzentriert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Lichtquelle (1) für das Anregungslicht ein Diodenla ser verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei Untersuchung eines natürlichen bio logischen Mediums mit einer Mehrzahl von verschiedenen Ana lytmolekülen

a) verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe mit jeweils unter schiedlichen Fluoreszenzlebensdauern zum spezifischen Mar kieren der verschiedenen Analytmoleküle verwendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, ferner dadurch gekenn zeichnet, daß

b) jeder der verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe so ge wählt wird, daß er einen monoexponentiellen zeitlichen Ver lauf der Fluoreszenz erwarten läßt;
c) aus diesem Fluoreszenzverlauf das erste Muster gewon nen wird;
d) der Wert der Fluoreszenzlebensdauer für das erste Muster für eine optimierte Übereinstimmung des Vergleichsmo dells mit den gewonnenen Zeitinformationen bestimmt wird, indem das erste Muster in Abhängigkeit von der Fluoreszenz lebensdauer variiert wird; und daß
e) jedes Analytmolekül mittels der in Schritt d) opti miert gewählten Fluoreszenzlebensdauer für das erste Muster identifiziert wird.