DE10145823A1

DE10145823A1 - Verfahren zur Auswertung intensitätsschwacher, zeitaufgelöster Fluoreszenzbilder

Info

Publication number: DE10145823A1
Application number: DE2001145823
Authority: DE
Inventors: Dietrich Schweitzer; Martin Hammer; Roswitha Anders; Achim Kolb
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Heidelberg Engineering GmbH
Priority date: 2001-09-13
Filing date: 2001-09-13
Publication date: 2003-04-10
Anticipated expiration: 2021-09-14
Also published as: DE10145823B4

Abstract

Aufgabe war es, die zweidimensionale Verteilung verschiedener Fluorophore auch für den Fall extrem schwacher Fluoreszenzsignale zu bestimmen. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird das zeitabhängige Fluoreszenzverhalten für jeden Ort durch ein multiexponentielles Abklingverhalten approximiert, wobei die Abklingzeiten Konstanten sind und nur die präexponentiellen Faktoren bestimmt werden. Die dabei zu verwendenden Abklingzeitkonstanten werden von zu untersuchenden Objekten bestimmt, indem eine multiexponentielle Approximation zusammengefaßter Bildbereiche erfolgt. Die relativen Anteile einzelner Fluorophore an der Gesamtfluoreszenz werden jeweils aus dem Produkt aus präexponentiellem Faktor und Abklingzeitkonstante eines Fluorophors dividiert durch die Summe aller Produkte aus präexponentiellen Faktoren und Abklingzeitkonstanten ermittelt. DOLLAR A Anwendungen ergeben sich insbesondere bei Auswertung der Bilder zeitaufgelöster Autofluoreszenz von biologischem Gewebe, wie vom Hintergrund des lebenden Auges.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auswertung intensitätsschwacher, zeitaufgelöster Fluoreszenzbilder, insbesondere zur Auswertung der Bildern zeitaufgelöster Autofluoreszenz von biologischem Gewebe, wie des lebenden Auges.

Es ist bekannt, zur Analyse von biologischem Gewebe, insbesondere zur Bewertung des Stoffwechselzustandes von Zellen, die Autofluoreszenz des biologischen Gewebes auszunutzen. Dazu ist eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Fluorophoren sowie die Bestimmung der örtlichen Verteilung der Fluorophore im Gewebe erforderlich.

Eine selektive Anregung der Fluorophore ist für Untersuchungen des Augenhintergrundes im Allgemeinen nicht möglich, da die Transmission der Okularmedien keine Anregung des Augenhintergrundes im Bereich kürzer als 400 nm zulässt, in dem sich die Anregungsspektren der zu erwartenden bekannten Fluorophore deutlich unterscheiden. Neben Anregungs- und Fluoreszenzspektren sind die Fluoreszenzabklingzeiten Merkmale zur Charakterisierung von Fluorophoren.

In der Offenlegungsschrift DE 199 20 158 A1 "Verfahren und Anordnung zur Bestimmung von Fluorophoren an Objekten, insbesondere am lebenden Augenhintergrund" wurde gezeigt, wie eine 2-dimensionale Messung der zeitaufgelösten Autofluoreszenz am lebenden Augenhintergrund realisierbar ist. Bedingt durch die maximal zulässige Exposition des Auges entsprechend American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z 136.1-2000, den geringen Quantenwirkungsgrad der inneren Fluorophore und durch die begrenzte Fixationsfähigkeit des Auges sind allerdings nur wenige hundert Photonen detektierbar, aus denen das zeitabhängige Verhalten der Autofluoreszenz nach Pulsanregung zu bestimmen ist. Wie von Köllner gezeigt (Köllner M, Wolfrum J: "How many photons are necessary for fluorescence - lifetime measurements?", Chemical Physics Letters, 1992, 200), kann aus diesen Photonenzahlen nur ein monoexponentieller Abfall der Fluoreszenz mit akzeptablem Fehler bestimmt werden. Obwohl die Bestimmung von Bereichen mit unterschiedlichem Verhalten der dynamischen Autofluoreszenz aus extrem schwachen Signalen einen wesentlichen Fortschritt darstellt, besteht für diagnostische Zwecke das entscheidende Interesse an einer Unterscheidung und Darstellung der 2-dimensionalen Verteilung der Fluorophore.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zu Bestimmung der 2- dimensionalen Verteilung verschiedener Fluorophore auch für den Fall extrem schwacher Signale anzugeben.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass zur Bestimmung der örtlichen Verteilung der Fluorophore eine Approximation des intensitätsschwachen zeitaufgelösten Fluoreszenzsignals durch eine multiexponentielle Abklingfunktion

erfolgt, in der die Abklingzeitkonstanten τ_i fest sind, B der Untergrund des Fluoreszenzsignals ist sowie die präexponentiellen Faktoren α_i an jedem Ort des zeitaufgelösten Fluoreszenzbildes berechnet werden und dass daraus die relativen Anteile einzelner Fluorophore an der Gesamtfluoreszenz F_G jeweils als Produkt aus präexponentiellem Faktor α_i und Abklingzeitkonstante τ_i eines Fluorophors F₁ dividiert durch die Summe aller Produkte aus präexponentiellen Faktoren α_i und Abklingzeiten τ_i nach der Beziehung

berechnet werden.

Im Allgemeinen sind die in einem Gewebe messtechnisch nachweisbaren Fluorophore sowie deren Abklingzeiten nicht bekannt. Besteht allerdings die Vermutung, welche Fluorophore im Gewebe enthalten sein könnten, so ist es möglich, unter Verwendung der Fluoreszenzabklingzeiten aus der Literatur für jeden Ort im Fluoreszenzbild die vorgenannte multiexponentielle Approximation mit konstanten Fluoreszenzabklingzeiten vorzunehmen.

Anderenfalls werden die Abklingzeitkonstanten τ_i berechnet, beispielsweise indem das gesamte Fluoreszenzbild oder zumindest jeweils ein Bereich dessen mit gleichem bzw. ähnlichem Abklingzeitverhalten zu einem Gesamtfluoreszenzsignal

über die Koordinaten x, y des detektierten Fluoreszenzbild-Bereiches zusammengefasst wird und eine Approximation dieses Gesamtfluoreszenzsignals F_G(t) durch die multiexponentiale Beziehung

erfolgt, in welcher B_G den Untergrund für das Gesamtfluoreszenzsignal F_G(t) darstellt und die präexponentiellen Faktoren α_i für die Berechnung der Abklingzeitkonstanten τ_i ohne Relevanz sind. Wesentlich ist für dieses Vorgehen, dass die Abklingzeitkonstanten der vorhandenen Fluorophore auch in größeren Bildbereichen gleich bleiben und Unterschiede in der örtlichen Verteilung der Fluorophore durch Veränderungen der präexponentiellen Faktoren bewirkt werden.

Um Fluoreszenzbild-Bereiche mit jeweils gleichem bzw. ähnlichem Abklingzeitverhalten zu dem besagten Gesamtfluoreszenzsignal F_G(t) zusammenzufassen, werden diese durch eine an sich bekannte monoexponentielle Approximation des örtlich aufgelösten zeitabhängigen Verhaltens der Fluoreszenz bestimmt.

Um absolute Werte für die örtliche Verteilung von Fluorophoren zu erhalten, sind die Ausleuchtung des detektierten Fluoreszenzbildes und der Einfluss von absorbierenden Substanzen zu berücksichtigen. Eine vorteilhafte Lösung besteht darin, dass das Fluoreszenzbild oder die Bilder der relativen Verteilung der Fluorophore durch ein simultan gemessenes Reflexionsbild dividiert werden.

Die vorgeschlagene Lösung zur Bestimmung der 2-dimensionalen Verteilung von Fluorophoren ist nicht auf die Anwendung am Hintergrund des lebenden Auges beschränkt. Sie kann für alle Bestimmungen der örtlichen Verteilung von Fluorophoren eingesetzt werden, bei denen die Auswertung von schwachen Fluoreszenzsignalen zu keinem hinreichenden Ergebnis führt.

Die vorteilhafte Anwendung der Erfindung soll an einem Ausführungsbeispiel beschrieben werden. Die zeitaufgelöste Autofluoreszenz des lebenden menschlichen Augenhintergrundes wird mit Hilfe der in der DE 199 20 158 A1 beschriebenen Anordnung gemessen.

Auf Grund der Begrenzung durch die maximal zulässige Exposition und die Fixationsunruhe des Augenhintergrundes beträgt die detektierte Photonenzahl als Summe über alle Zeitkanäle pro Pixel nur wenige hundert Photonen. Die zeitaufgelöste Autofluoreszenz wird in einem Feld von 20° bei einer örtlichen Auflösung von 50 × 50 µm² detektiert. Wird das Abklingzeitverhalten der Fluoreszenz auf an sich bekannte Weise monoexponentiell approximiert, so können Bereiche gleicher oder ähnlicher Abklingzeit bestimmt werden. Eine detailliertere Unterscheidung der örtlichen Verteilung verschiedener Fluorophore und die Bestimmung von deren am Augenhintergrund wirksamen Konzentration-Schichtdicken-Produktes erfordert die Bestimmung multiexponentieller Abklingzeitkonstanten und der zugehörigen präexponentiellen Faktoren. Eine höhere Photonenzahl ist Voraussetzung für die Anwendbarkeit einer mulitexponentiellen Approximation zur Bestimmung mehrerer Zeitkonstanten.

Wesentlich ist, dass die Abklingzeitkonstanten der vorhandenen Fluorophore gleich bleiben und Unterschiede in der örtlichen Verteilung der Fluorophore durch Veränderungen der präexponentiellen Faktoren bewirkt werden.

Um eine möglichst hohe Zahl von Photonen zu erreichen, wird in einem 1. Schritt das zeitaufgelöste Fluoreszenzsignal für das gesamte Fluoreszenzbild, mindestens aber für einen Bildbereich zu einem Gesamtfluoreszenzsignal F_G(t) mit

über die Koordinaten x, y des detektierten Bildes der zeitaufgelösten Autofluoreszenz zusammengefasst. Vorteilhaft ist dabei, wenn Bereiche mit ähnlichem Abklingzeitverhalten zuvor in einer an sich bekannten ortsaufgelösten monoexponentiellen Approximation der zeitaufgelösten Autofluoreszenz erkannt werden.

Das Gesamtfluoreszenzsignal F_G(t) enthält in der Summe aller Zeitkanäle ausreichend viele Photonen, so dass in einem 2. Schritt eine multiexponentielle Approximation (Fit) zur Bestimmung der Abklingzeiten ausgeführt wird:

Die präexponentiellen Faktoren α_i sind bei dieser Rechnung ohne Bedeutung. B_G ist der Untergrund für das Gesamtfluoreszenzsignal F_G(t). Werden beispielsweise bereits 10 × 10 Pixel zusammengefasst, welche jeweils ca. 600 Photonen als Summe in allen Zeitkanälen enthalten, so entsteht eine Messkurve aus 60.000 Photonen, für die eine multiexponentielle Approximation des Abklingverhaltens Parameter mit vertretbarem Fehler liefert. Detektierte Zeitkonstanten sind beispielsweise 400 ps, 1,2 ns und 3 ns.

In einem 3. Schritt wird das ortsaufgelöste zeitabhängige Fluoreszenzverhalten durch einen multiexponentiellen Fit approximiert, wobei die Abklingzeitkonstanten aus Schritt 2 übernommen werden und unverändert bleiben:

mit τ_i = konstant und B als der Untergrund des ortsaufgelösten Fluoreszenzsignals.

Ergebnis dieser Rechnung ist die Bestimmung der präexponentiellen Faktoren α_i an jedem Ort des auszuwertenden Bildes der zeitaufgelösten Autofluoreszenz.

In einem 4. Schritt werden die relativen Anteile der einzelnen Fluorophore berechnet und als Bild des untersuchten Augenhintergrundes dargestellt. Für den Fall, dass der Abstand zwischen zwei Anregungspulsen viel größer als die Zeitkonstanten der Fluoreszenz ist, entspricht der relative Anteil eines Fluorophors F₁ an der Gesamtfluoreszenz F_G dem Ausdruck

Dabei sind τ_i die in Schritt 2 bestimmten Zeitkonstanten und a_i die im Schritt 3 bestimmten präexponentiellen Faktoren.

Um absolute Werte für die örtliche Verteilung von Fluorophoren zu erhalten, sind die Ausleuchtung des detektierten Bildes und der Einfluss von absorbierenden Substanzen zu berücksichtigen. Eine vorteilhafte Lösung besteht darin, dass das Fluoreszenzbild oder die Bilder der relativen Verteilung der Fluorophore durch ein simultan gemessenes Reflexionsbild dividiert werden.

Claims

1. Verfahren zur Auswertung intensitätsschwacher, zeitaufgelöster Fluoreszenzbilder, insbesondere zur Auswertung der Bilder zeitaufgelöster Autofluoreszenz von biologischem Gewebe, wie des lebenden Auges, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der örtlichen Verteilung der Fluorophore eine Approximation des intensitätsschwachen zeitaufgelösten Fluoreszenzsignals durch eine multiexponentielle Abklingfunktion

erfolgt, in der die Abklingzeitkonstanten τ_i fest sind, B der Untergrund des Fluoreszenzsignals ist und die präexponentiellen Faktoren α_i an jedem Ort des zeitaufgelösten Fluoreszenzbildes berechnet werden und dass daraus die relativen Anteile einzelner Fluorophore an der Gesamtfluoreszenz F_G jeweils als Produkt aus präexponentiellem Faktor α_i und Abklingzeitkonstante τ_i eines Fluorophors F₁ dividiert durch die Summe aller Produkte aus präexponentiellen Faktoren α_i und Abklingzeiten τ_i nach der Beziehung

berechnet werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Abklingzeitkonstanten τ_i berechnet werden, beispielsweise indem das gesamte Fluoreszenzbild oder zumindest jeweils ein Bereich dessen mit gleichem bzw. ähnlichem Abklingzeitverhalten zu einem Gesamtfluoreszenzsignal

über die Koordinaten x, y des detektierten Fluoreszenzbild-Bereiches zusammengefasst wird und eine Approximation dieses Gesamtfluoreszenzsignals F_G(t) durch die multiexponentielle Beziehung

erfolgt, in welcher B_G den Untergrund für das Gesamtfluoreszenzsignal F_G(t) darstellt und die präexponentiellen Faktoren α_i für die Berechnung der Abklingzeitkonstanten τ_i ohne Relevanz sind.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass beispielsweise aus der Literatur vorgegebene Abklingzeitkonstanten τ_i für angenommene Fluorophore des Fluoreszenzbildes verwendet werden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bereiche gleichen oder ähnlichen Abklingzeitverhaltens durch eine an sich bekannte monoexponentielle Approximation des örtlich aufgelösten zeitabhängigen Verhaltens der Fluoreszenz bestimmt werden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der absoluten Verteilung der Fluorophore aus den örtlichen Verteilungen des Produktes τ_i.α_i oder ihren relativen Verteilungen eine Korrektur der Anregungsintensität vorgenommen wird, indem diese Fluoreszenzbilder durch simultan zur Fluoreszenzmessung aufgenommene Reflexionsbilder dividiert werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der absoluten Verteilung der Fluorophore aus ihren relativen Verteilungen eine Korrektur der Anregungsintensität vorgenommen wird, indem die Bilder der relativen Verteilung der Fluorophore durch die Ausleuchtung der Messanordnung repräsentierende Reflexionsbilder dividiert werden, die an einem Weißstandard gemessen sind.