DE19822452C2 - Verfahren zur Bestimmung der Dichte lumineszierender Moleküle an einer Oberfläche, Verwendung des Verfahrens zur Bestimmung von Adsorptions- und Bindungskinetiken und Gleichgewichts- und Bindungskonstanten von Molekülen an einer Oberfläche durch Lumineszenz-Messungen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung der Dichte lumineszierender Moleküle an einer Oberfläche, Verwendung des Verfahrens zur Bestimmung von Adsorptions- und Bindungskinetiken und Gleichgewichts- und Bindungskonstanten von Molekülen an einer Oberfläche durch Lumineszenz-Messungen und Vorrichtung zur Durchführung des VerfahrensInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der
Dichte lumineszierender Moleküle an einer Oberfläche gemäß
Patentanspruch 1, die Verwendung des Verfahrens zur
Bestimmung von Adsorptions- und Bindungskinetiken und
Gleichgewichts- und Bindungskonstanten von Molekülen an einer
Oberfläche durch Lumineszenz-Messungen gemäß Patentanspruch 9
und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß
Patentanspruch 10.
Die Lumineszenzanalyse, insbesondere die Fluoreszenzanalyse,
hat sich sowohl zur Visualisierung wie auch zur
Konzentrationsbestimmung verschiedenster Analyte in der
Umwelt-, chemischen und biochemischen Analytik,
Lebensmittelchemie und medizinischen Diagnostik etabliert. Der
Anwendungsbereich der Lumineszenzanalyse war jedoch lange auf
einen relativ hohen Konzentrationsbereich beschränkt, d. h. der
dynamische Meßbereich war klein.
Andererseits ist in den letzten Jahren versucht worden, die
Empfindlichkeit der Lumineszenzanalyse durch eine Verringerung
des Detektionsvolumens zu erhöhen. Hierbei stand die
Verwendung konfokaler Techniken im Vordergrund, mit der sich
das Detektionsvolumen bis hinab auf Femtoliter verringern ließ
(siehe z. B. R. Rigler, Ü. Mets, J. Widengren, P. Kask, in "Eur.
Biophys. J.", 22, 1993, S. 169-175). Sogar der Nachweis einzelner
Moleküle wurde so möglich. Jedoch tritt bei geringer
Konzentration nur selten ein Molekül in das Detektionsvolumen
ein, so daß die Meßdauer bei kleinen Konzentrationen so groß
ist, daß das Verfahren für praktische Fragestellungen nicht
anwendbar ist.
J. J. Macklin et al. ("Science", Vol. 272, 1996, S. 255-258) beschreiben ein
Spektroskopie-Verfahren an einzelnen Molekülen, bei dem eine
Oberfläche abgerastert wird, um so die Moleküle schnell zur
weiteren, spektroskopischen Analyse lokalisieren zu können. Ein
solches Verfahren könnte zwar bei geringen Analyt-
Konzentrationen, bei denen pro Meßpunkt maximal nur einige
wenige Moleküle detektiert werden, auch zur
Konzentrationsbestimmung dienen, wäre, jedoch bei hohen Analyt-
Konzentrationen im Vergleich zu klassischen Ein-Punkt-
Meßverfahren, d. h. Verfahren ohne Abrastern vieler Meßpunkte,
langsam und damit insbesondere für Screening-Verfahren bei der
Suche nach pharmazeutischen Wirkstoffen mit u. U. Tausenden von
Proben nicht geeignet.
Daher ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine
Vorrichtung bereitzustellen, um Analyt-Konzentrationen in
einem weiten Konzentrationsbereich schnell nachzuweisen.
Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, Adsorptions- und
Bindungskinetiken und Gleichgewichts- bzw. Bindungskonstanten
zu bestimmen.
Die erste Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur
Bestimmung der Dichte lumineszierender Moleküle an einer
Oberfläche mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst.
In der Abb. 1 ist:
1 Laserstrahl
2 für das gewählte Licht transparente Oberfläche
3 fokussierende Optik
4 adsorbierte oder gebundene Moleküle
2 für das gewählte Licht transparente Oberfläche
3 fokussierende Optik
4 adsorbierte oder gebundene Moleküle
Die Anregungslichtquelle, der Detektor und
weitere, optische Elemente sind nicht dargestellt. Die von mit
dem Laserstrahl angeregten Molekülen emittierten Photonen
werden mit einem Detektor aufgenommen (Abb. 2, 3). Abb. 2
zeigt die Signale, die beim Abrastern detektiert werden, wobei
an einem Meßpunkt 1 Sekunde gemessen wurde. Die Zeit während
der Bewegung zum nächsten Meßpunkt ist auf der Zeitachse nicht
dargestellt. An jedem Mepunkt findet man Signale. Abb. 3 stellt
eine Messung bei wesentlich geringerer Moleküldichte auf der
Oberfläche dar. Die Zahl der Moleküle in einem Meßpunkt ist
geringer (geringere Signalhöhe); außerdem treten die Signale
weniger häufig auf. Die Aufnahme der Photonen wird nach der
Detektion von N Photonen abgebrochen, wobei:
N = 1/(S2) + 2,
wobei
S der relative Fehler der Konzentrationsbestimmung ist. N
kann hierbei die Zahl aller detektierten Photonen oder aller
detektierten Photonen abzüglich der Untergrundphotonen sein;
ist die Dichte der lumineszierenden Moleküle auf der
Oberfläche so klein, daß Flächenbereiche auftreten, in denen
sich kein Molekül befindet, so muß das Untergrundsignal
abgezogen werden.
Bei gewöhnlichen Substanzmengenbestimmungen wird die Zahl der
detektierten Fluoreszenzphotonen N innerhalb einer gegebenen
Meßzeit t bestimmt und auf der Grundlage von N dann eine
Abschätzung der Substanzmenge Q gemacht. Erfindungsgemäß soll
im Gegensatz dazu die Zeit t bestimmt werden, in welcher eine
gegebene Zahl von Fluoreszenzphotonen N gemessen wird, das
heißt, nach Messung von N Photonen wird die Messung
abgebrochen und über die Meßzeit dann die Substanzmenge
abgeschätzt. Die Zahl der Fluoreszenzphotonen N soll hierbei
durch den relativen Fehler der Messung, der vorbestimmt ist,
gegeben sein. Die Abhängigkeit der jeweiligen Zahl der
Fluoreszenzphotonen N von dem relativen Fehler der Messung
ergibt sich wie folgt.
Es sei angenommen, daß die Wahrscheinlichkeit, für eine
tatsächliche Substanzmenge q in einer Zeiteinheit ein Photon
zu detektieren, gleich κq ist, wobei κ eine Konstante ist, in
welche die Laserintensität, der Absorptionsquerschnitt, die
Fluoreszenzquanteneffizienz und die Detektionseffizienz
eingehen. Es soll nun abgeschätzt werden, mit welcher
Genauigkeit eine solche Susbtanzmengenbestimmung durchgeführt
werden kann.
Die Wahrscheinlichkeit PN-1(t), für eine Substanzmenge q in
einer gegebenen Zeit t genau N - 1 Photonen detektiert zu haben,
ist durch die folgende Poissonverteilung gegeben:
Somit ist die Wahrscheinlichkeitsdichte πN(t), im Zeitintervall
{t, t + dt} das N-te Photon zu detektieren, durch:
πN(t) = κqPN-1(t)
gegeben.
Wenn man für eine gemessene Zeit t die Substanzmenge über die
Beziehung:
Q = (N - 1)/(κt)
bestimmt, so ist die entsprechende
Wahrscheinlichkeitsverteilung P(Q) gegeben durch [D. T.
Gillespie "A theorem for physicists in the theory of random
variables" Am. J. Phys., 51 (6), 1983, Seiten 520-533]:
Das k-te Moment dieser Verteilung ist (k < N - 1):
Mittelwert und Standardabweichung sind damit gegeben durch:
Der relative Fehler der Konzentrationsbestimmung ist S = σQ/q.
Folglich gilt für die zum Erreichen einer bestimmten
Genauigkeit der Konzentrationsbestimmung erforderliche Zahl Photonen:
N = 1/(S2) + 2.
Somit läßt sich die Genauigkeit der
Messung durch die Festlegung der Zahl der zu messenden
Photonen festlegen. Für einen relativen Meßfehler von 1%
genügt z. B. die Messung von ca. N = 104 Fluoreszenzphotonen.
Der Vorteil dieses Verfahrens ist, daß nicht immer die gesamte
Oberfläche abgerastert werden muß, sondern, daß die Meßzeit
von der Dichte der lumineszierenden Moleküle abhängt; bei hohen
Konzentrationen ist die erforderliche Zahl an detektierten
Photonen schon sehr schnell erreicht, während nur bei sehr
geringen Dichten die gesamte Oberfläche abgerastert werden
muß. Als Meßzeit wird nur die Zeit verstanden, während der der
Detektor Photonen detektieren kann. Die Meßzeit soll
vorzugsweise an einem Meßpunkt nicht größer sein als Photonen
von dem Molekül bzw. den Molekülen erwartet werden können. Ist
die Meßzeit größer als diese Zeit (z. B. aufgrund der
Photozerstörung), verschlechtert sich das Signal-zu-Rausch-
Verhältnis.
Da die Zahl der detektierten Lumineszenzphotonen, die von
einem Molekül emittiert werden, von der Dauer der Detektion
abhängt, ist eine Kalibrierung für die Bestimmung der Dichte
erforderlich.
Es können die lumineszierenden Moleküle selbst
den Analyten darstellen, oder die lumineszierenden Moleküle
binden an den Analyten und dienen so als Marker für den
indirekten Nachweis. Beispiel für einen solchen, indirekten
Nachweis des Analyten ist beispielsweise das Binden eines
Farbstoff-markierten Antikörpers an ein Antigen. Die
Konzentration der lumineszierenden Moleküle in Lösung läßt
sich über Kalibriermessungen zur Dichte der lumineszierenden
Moleküle an der Oberfläche in Beziehung setzen.
Es werden bevorzugt Fluorophore als Lumineszenz
marker verwendet. Diese Fluorophore können
sowohl über ihre Farbe (d. h. der Wellenlänge der emittierten
Photonen) wie auch über ihre Fluoreszenzlebensdauer detektiert
werden (z. B. S. Seeger et al., "Ber. Bunsenges. Phys. Chem.", 97, 1993,
S. 1542-1548). Beispielsweise kann der Farbstoff Cy5
verwendet werden. Die Wahl der jeweils
verwendeten, lumineszierenden Moleküle hängt
jedoch in erster Linie von dem verwendeten Laserlicht wie auch
von dem verwendeten Einzelmoleküldetektor ab.
Der verwendbare Einzelmoleküldetektor soll
bei gegebenem Detektionsvolumen,
gegebener Wellenlänge und Leistung des Laserstrahles und
gegebenem, lumineszierendem Molelül die Detektion eines
einzelnen, lumineszierenden Moleküls erlauben. Die Anforderungen
an die Empfindlichkeit des Einzelmoleküldetektors steigen
hierbei mit zunehmendem Detektionsvolumen und sinkender
Leistung des Laserstrahls. Es ist daher insbesondere
bevorzugt, das Detektionsvolumen zu minimieren, indem man den
Laserstrahl beugungsbegrenzt fokussiert.
Der Einzelmoleküldetektor umfaßt eine Abbildungsoptik, eine
Einheit, die bei Auftreffen von Photonen ein elektrisches
Signal erzeugt, sowie einen Computer samt Software zur
Auswertung der elektrischen Signale. Hierfür wird eine
kommerziell erhältliche Computer-Einsteckkarte verwendet, die
die Zahl der detektierten Fluoreszenzphotonen pro Zeiteinheit
zählt. Für eine zeitaufgelöste Messung im Nanosekundenbereich
wird eine schnelle, elektronische Korrelatorkarte verwendet
(z. B. Digital Time 70, SL Microtest, Jena oder SPC-300,
Picoquant). Die Abbildungsoptik ermöglicht vorzugsweise eine
zu dem Fokus des Laserstrahles konfokale Abbildung der
emittierten Photonen auf die Einheit zur Erzeugung eines
elektrischen Signals. Diese Einheit ist vorzugsweise eine
Photodiode, insbesondere bevorzugt eine Einzelphotonenzähl-
Avalanche-Photodiode. Alternativ kann auch ein Photomultiplier
oder eine verstärkte CCD-Kamera verwendet werden. Insbesondere
wird bevorzugt, den verwendeten
Einzelmoleküldetektor derart einzurichten, daß die Detektion
erst nach einer bestimmten Zeit nach der Anregung durch den
Laser beginnt ("Gating").
Weiterhin ist es möglich, zeitaufgelöste Messungen im
Nanosekundenbereich durchzuführen. Hierbei ist neben einer
schnellen Elektronik eine gepulste oder modulierte Lichtquelle
und ein schneller Detektor erforderlich.
Durch die zeitabhängige Detektion der Fluoreszenzphotonen ist
eine Unterscheidung zwischen an der Oberfläche gebundenen
Molekülen und farbstoffmarkierten Molekülen, die sich frei in
der überstehenden Lösung befinden, möglich. Dabei wird
berücksichtigt, daß freie Farbstoffe bzw. farbstoffmarkierte
Moleküle gewöhnlicherweise Diffusionskonstanten im Bereich von
10-5 bis 10-6 cm2/s aufweisen, was bei freier Diffusion zu
Durchgangszeiten durch das konfokale Volumen von etwa 100 ms,
beim Durchtritt durch das Detektionsvolumen nicht durch das
Zentrum, sondern in Randbereichen, noch kürzer, führt, wogegen
die an der Oberfläche fixierten Moleküle beliebig lange
(praktisch bis zur Photozerstörung) im Detektionsvolumen
verweilen. Somit werden Bindungsereignisse zwischen
immobilisierten Rezeptormolekülen und Liganden bzw.
immobiliserten Liganden und Rezeptormolekülen nachgewiesen,
ohne daß nichtgebundene, farbstoffmarkierte Moleküle aus der
überstehenden Lösung entfernt werden müssen. Signale, die kurz
auftreten, werden dabei frei beweglichen Molekülen zugeordnet,
während Signale, die lange auftreten, z. B. länger als 100 ms,
an der Oberfläche gebundenen Molekülen zugeordnet werden.
Zur Anregung des Lumineszenzmarkers wird Laserlicht mit einer
Wellenlänge von 600 nm und mehr bevorzugt, um das Auftreten
von Streulicht und Autofluoreszenz zu minimieren. Insbesondere
sind Halbleiterlaser und Helium-Neon-Laser in diesem
Wellenlängenbereich aus Kostengründen für das beschriebene
Verfahren bevorzugt. Der Strahl dieses Laserlichtes wird über
die Oberfläche gerastert.
Die Rastervorrichtung ist beliebig,
sofern sie in Zeitabständen die Position des Laserstrahles um
einen definierten Abstand verändert. Rastervorrichtungen, wie
sie in herkömmlichen Laser-Scanning-Mikroskopen verwendet
werden, sowie kommerziell erhältliche x, y-Verschiebetische
sind auch im hier beschriebenen Verfahren geeignet. Die Meßzeit
pro Meßpunkt beträgt vorzugsweise 1 ms bis 1 s. Die Meßkarte
gibt die Zahl der detektierten Fluoreszenzphotonen je
Zeitintervall, vorzugsweise 1 ms, an das Steuerprogramm
weiter, welches bei Erreichen der vorbestimmten Photonenzahl
den Meßvorgang abbricht, die bis dahin verflossene Meßzeit und
die Meßdaten abspeichert.
Hierbei lassen sich prinzipiell drei unterschiedliche
Meßbereiche unterscheiden.
Bei hohen Analytkonzentrationen kann die erwünschte
Photonenzahl schon bei einem einzelnen Meßpunkt erreicht
werden. Über die Signalintensität, d. h. die Anzahl der
detektierten Photonen, läßt sich so direkt die Konzentration
des Analyten bestimmen. Die Signalintensität ist in diesem
Bereich der Analytkonzentration proportional. Bei einer
Rastereinrichtung, die 100 × 100 Meßpunkte anfährt, führt
das Abstoppen der Messung schon nach dem ersten Meßpunkt bei
ausreichender Meßgenauigkeit zu einer 10000-fachen
Beschleunigung des Meßverfahrens.
Bei mittleren Analytkonzentrationen sind zunehmend mehr
Meßpunkte zum Erreichen der gewünschten Meßgenauigkeit
erforderlich. Pro Meßpunkt wird die Anzahl der detektierten
Photonen integriert und ein Durchschnittswert über alle
Meßpunkte gebildet, um so die Konzentration in der gewünschten
Genauigkeit zu bestimmen. Die erwünschte Meßgenauigkeit wäre
in diesem Bereich nicht ohne Messungen an verschiedenen
Meßpunkten möglich. Würden Messungen lediglich an demselben
Meßpunkt mehrfach wiederholt werden, so verschlechterte sich
das Signal-Rausch-Verhältnis u. a. aufgrund der Photozerstörung
der lumineszierenden Moleküle.
Wird die Konzentration des Analyten weiter erniedrigt, so wird
schließlich ein dritter Meßbereich erreicht, bei dem nicht
mehr an jedem Meßpunkt Moleküle detektiert werden. Hier kann
dann die durchschnittliche Anzahl der detektierten Moleküle
pro Meßpunkt weniger als 1 betragen. Die Signalhöhe an den
Meßpunkten mit Signal ist im Rahmen statistischer Schwankungen
konstant. Die Konzentration der Moleküle an der Oberfläche ist
in diesem Bereich dem Verhältnis aus der Anzahl der Meßpunkte
mit Signal zu der Gesamtanzahl der Meßpunkte annähernd
proportional. Meßpunkte mit Signal werden durch das Setzen
einer Signalschwelle für die Fluoreszenzintensität von
Meßpunkten ohne Signal, d. h. ausschließlich Untergrundsignal,
unterschieden.
Die drei Meßbereiche können mehr als 8 Größenordnungen
umfassen.
Eine weitere Steigerung der Empfindlichkeit des
Verfahrens läßt sich dadurch erreichen, daß
die Oberfläche des Trägers, die abgerastert wird, derart
ausgewählt wird, daß an ihr der Analyt bzw. das
lumineszierende Molekül leicht gebunden wird. Dies kann durch
Ausnutzung ionischer oder hydrophober Wechselwirkungen
zwischen der Oberfläche und dem Analyten bzw. dem
lumineszierenden Molekül erreicht werden. Insbesondere ist es
jedoch bevorzugt, daß die lumineszierenden Moleküle durch eine
Affinitätsreaktion selektiv an der Oberfläche gebunden werden.
Bei einer solchen Affinitätsreaktion wird das lumineszierende
Molekül bzw. der Analyt über ein Fangmolekül an der Oberfläche
immobilisiert.
Bevorzugte Fangmoleküle sind an der Oberfläche
immobilisierte Proteine oder Nukleinsäuren, die das
lumineszierende Molekül bzw. den Analyten selektiv zu binden
vermögen. Bevorzugte Proteine sind Antikörper, die
entsprechende Antigene binden. Ein weiteres,
bevorzugt verwendetes Protein ist (Strept-)Avidin, welches das
mit Biotin derivatisierte, lumineszierende Molekül bzw. den so
derivatisierten Analyten sehr selektiv zu binden vermag.
Bevorzugt verwendete Nukleinsäuren sind
insbesondere DNS-Oligomere, die spezifisch bestimmte DNS-
Abschnitte binden.
Insbesondere wird es bevorzugt, die
Fangmoleküle kovalent an die Oberfläche zu binden. In einer
besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Fangmoleüle
über einen Langmuir-Blodgett-Film, vorzugsweise einem
Langmuir-Blodgett-Film eines Cellulosederivates, auf der
Oberfläche immobilisiert. Insbesondere bevorzugt ist es, die
Oberfläche zunächst mit 1 bis 8 Monolagen Aminoalkyltrimethyl
silylethercellulose (ATMSC) und anschließend 1 bis 8 Monolagen
Trimethylsilylethercellulosecinnammoat (TMSCC) zu beschichten.
Für die kovalente Ankopplung der Fangmoleküle werden dann die
Cinnamoyl-Gruppen des TMSCC zu Aldehyd-Gruppen oxidiert.
Die zweite Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch
die Verwendung des Verfahrens gemäß Patentanspruch 9
gelöst.
Das Gleichgewicht der Adsorption bzw. der Bindung an die
Oberfläche ist dann erreicht, wenn an mindestens zwei
aufeinanderfolgenden Meßunkten die im Rahmen statistischer
Schwankungen gleiche Zahl Photonen detektiert werden. Dazu
wird die zu bindende bzw. adsorbierende Substanz in Lösung
über eine entsprechend präparierte Oberfläche gegeben und das
Abrastern der Oberfläche mit dem Fluoreszenzdetektor
eingeleitet. Die Zeit, zu welcher ein jeweiliger Spot beim
Abrastern vermessen wurde, wird dann gegen die im Spot
detektierte Fluoreszenz aufgetragen. Dies gilt für
Konzentrationen der Substanz in der Lösung, die zu einer
Dichte an der Oberfläche nach der Adsorption bzw. Bindung
führt, bei der mehrere Moleküle in einem Meßpunkt gebunden
bzw. adsorbiert sind. Hierbei können auch die Signale mehrerer
Meßpunkte zusammengefaßt werden und einem Zeitintervall
zugeordnet werden, z. B. 5 Sekunden. Es werden dann 5 Sekunden
lang mehrere Meßpunkte abgerastert, die Zahl der detektierten
Photonen gegebenenfalls nach der Subtraktion von Untergrundsignal
zusammengefaßt und in einem Signal-Zeit-Diagramm aufgetragen.
Dies wird nun in 5 Sekunden dauernden Intervallen fortgesetzt
und die mit der Zeit ansteigende Photonenzahl aufgetragen.
Eine weitere Möglichkeit ist die Messung der Zeit zwischen der
Detektion von Lumineszenzphotonen, die mit zunehmender
Adsorption bzw. Bindung an der Oberfläche kleiner wird, da die
Moleküldichte mit der Zeit zunimmt.
Es sei zum Beispiel die Vermessung einer einfachen
Bindungskinetik der Art:
angenommen, wobei x(t) die mittlere Konzentration der zur Zeit t
gebundenen Moleküle, c die als konstant angenommene
Konzentration der freien Moleküle in Lösung, s0 die Gesamtzahl
der freien Bindungsstellen auf der Oberfläche und k+, k- die zu
bestimmenden Bindungs- bzw. Ablösungskonstanten sind. Durch
Vermessung des zeitlichen Verlaufs (über die Zuordnung Zeit-
Spot) der zu x(t) proportional angenommenen
Fluoreszenzintensität der Spots kann damit direkt die Größe:
k+c + k-
bestimmt werden, ohne Kenntnis von s0 haben zu müssen.
Nimmt man darüber hinaus dieselbe Messung bei verschiedenen
Werten von c vor, so lassen sich außerdem die Konstanten k+ und
k- getrennt bestimmen.
Durch die Kenntnis von k+ und k- kann die
Gleichgewichtskonstante bzw. Bindungskonstante des
beobachteten Vorgangs errechnet werden.
Die Erfindung stellt zudem gemäß Anspruch 10 eine Vorrichtung zur Durchführung des
Verfahrens nach einem der Patentansprüche 1-8 bereit,
umfassend einen Laser, einen Einzelmoleküldetektor, eine
Rastereinrichtung und ein Mittel zum Abbrechen der Messung
nach Detektion einer vorherbestimmten Anzahl Photonen.
Es werden gemäß dem bei F. Löscher et al. ("Proc. SPIE", 3199, 1997, Seiten 2-11)
beschriebenen Verfahren Huhn-anti-c-Aktin-Immunglobulin G auf
einem Objektträger immobilisiert. Nach Waschen mit Phosphat-
Puffer PBS wird mit einer c-Aktin-haltigen Lösung etwa
15 Minuten inkubiert und nach einem weiteren Waschschritt mit PBS
eine Lösung eines polyklonalen Huhn-anti-c-Aktin-IgY-
Antikörpers, der zuvor nach Standardverfahren mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Cy5 markiert wurde, zugegeben. Nach
weiteren 15 Minuten wird die Oberfläche mit einem konfokalen
Detektor abgerastert, wobei Aregung und Detektion durch das
Deckglas hindurch geschieht.
Die Zeit, die benötigt wird, bis ausreichend Photonen (z. B.
10000) detektiert werden, wird gemessen. Nach geeigneter
Kalibrierung, also der Messung dieser Zeit als Funktion der
Konzentration, läßt sich die Kozentration an c-Aktin bestimmen.
Auf eine Glasplatte, auf der wie im Ausführungsbeispiel 1
Ziege-anti-Maus-Antikörper immobilisiert wurden, wird eine
Lösung von 10-12 mol/l Maus-anti-Hase-Antikörper, die zuvor mit
Cy5-Fluoreszenzfarbstoffen markiert wurden, zugegeben und
sofort begonnen, die Oberfläche mit einem konfokalen
Laserraster-Detektor abzurastern. Die Zahl der detektierten
Photonen wird gegen die Zeit aufgetragen. Aufgrund der
zunehmenden Dichte der fluoreszierenden Moleküle auf der
Oberfläche nimmt die registrierte Zahl der Fluoreszenzphotonen
mit der Zeit zu (Abb. 4).
Claims (10)
1. Verfahren zur Bestimmung der Dichte lumineszierender
Moleküle an einer Oberfläche, bei dem die Oberfläche mit
einem Laserstrahl abgerastert wird, die von mit dem
Laserstrahl angeregten Molekülen emittierten Photonen mit
einem Einzelphotonenzähler aufgenommen werden, die Aufnahme
der Photonen nach Detektion von N Photonen abgebrochen wird,
mit:
N = 1/(S2) + 2,
wobei S der Fehler bei der Bestimmung der Dichte ist und die Dichte lumineszierender Moleküle an der Oberfläche durch Vergleich mit einer Kalibriermessreihe ermittelt wird.
N = 1/(S2) + 2,
wobei S der Fehler bei der Bestimmung der Dichte ist und die Dichte lumineszierender Moleküle an der Oberfläche durch Vergleich mit einer Kalibriermessreihe ermittelt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die lumineszierenden Moleküle fluoreszierende Marker für einen
Analyten darstellen.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass der Einzelphotonenzähler eine Avalanche-
Photodiode ist.
4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß an der Oberfläche gebundene
Moleküle aufgrund der längeren Detektionszeit der
Lumineszenzphotonen von frei in der Lösung diffundierenden
Molekülen unterschieden werden.
5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die lumineszierenden Moleküle
durch eine Affinitätsreaktion selektiv an der Oberfläche
gebunden werden.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
die lumineszierenden Moleküle durch an der Oberfläche
immobilisierte Proteine, organische Moleküle oder
Nukleinsäuren selektiv gebunden werden.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
die Proteine, organischen Moleküle oder Nukleinsäuren kovalent
an der Oberfläche immobilisiert sind.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
die Proteine oder Nukleinsäuren kovalent über einen Langmuir-
Blodgett-Film an der Oberfläche immobilisiert sind.
9. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1-8
zur Bestimmung der Adsorptionskinetik oder der
Bindungskinetik lumineszierender Moleküle an einer
Oberfläche, bei dem die Oberfläche mit einem Laserstrahl
während des Ablaufs der Reaktion abgerastert wird und die
von mit dem Laserstrahl angeregten Molekülen emittierten Photonen mit
einem Detektor aufgenommen werden.
10. Vorrichtung zur Bestimmung der Dichte lumineszierender
Moleküle an einer Oberfläche zur Durchführung des Verfahrens
gemäß einem der Ansprüche 1-8, umfassend einen Laser, einen
Detektor, eine Rastereinrichtung und ein Mittel zum Abbrechen
der Messung nach Detektion einer vorherbestimmten Anzahl
Photonen.
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| WO2009105815A1 (en) * | 2008-02-25 | 2009-09-03 | The University Of Melbourne | A method of fabricating a single photon source |
| JP5678045B2 (ja) | 2009-06-08 | 2015-02-25 | シンギュレックス・インコーポレイテッド | 高感度バイオマーカーパネル |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4320970A (en) * | 1975-11-24 | 1982-03-23 | Dowben Robert M | Photon counting fluorimeter |
| DE3206407A1 (de) * | 1982-02-23 | 1983-09-01 | Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH, 8000 München | Einrichtung zum quantitativen nachweis biochemischer reaktionen |
| DE3025022C2 (de) * | 1980-07-02 | 1985-07-04 | Wang, Wei-Kung, T'ai-pei | Verfahren zur Bestimmung biologischer Teilchen durch induzierte Signale |
| DE3614359A1 (de) * | 1985-07-26 | 1987-02-05 | Jenoptik Jena Gmbh | Anordnung zur bildlichen darstellung und analyse von fluoreszenzsignalen |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8910880D0 (en) * | 1989-05-11 | 1989-06-28 | Amersham Int Plc | Sequencing method |
| US5547839A (en) * | 1989-06-07 | 1996-08-20 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection |
| JP2575270B2 (ja) * | 1992-11-10 | 1997-01-22 | 浜松ホトニクス株式会社 | 核酸の塩基配列決定方法、単一分子検出方法、その装置及び試料の作成方法 |
| EP0836090A1 (de) * | 1996-10-12 | 1998-04-15 | Evotec BioSystems GmbH | Probenanalyseverfahren durch Bestimmung der spezifischen Helligkeitsverteilung von Teilchen |
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-
1999
- 1999-04-22 WO PCT/EP1999/002622 patent/WO1999054497A1/de not_active Ceased
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4320970A (en) * | 1975-11-24 | 1982-03-23 | Dowben Robert M | Photon counting fluorimeter |
| DE3025022C2 (de) * | 1980-07-02 | 1985-07-04 | Wang, Wei-Kung, T'ai-pei | Verfahren zur Bestimmung biologischer Teilchen durch induzierte Signale |
| DE3206407A1 (de) * | 1982-02-23 | 1983-09-01 | Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH, 8000 München | Einrichtung zum quantitativen nachweis biochemischer reaktionen |
| DE3614359A1 (de) * | 1985-07-26 | 1987-02-05 | Jenoptik Jena Gmbh | Anordnung zur bildlichen darstellung und analyse von fluoreszenzsignalen |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Am. J. Phys., 51, 1983, S. 520-532 * |
| Ber. Bunsenges. Phys. Chem.,97,1993,S.1542-1548 * |
| Eur Biophys J., 22, 1993, S. 169-175 * |
| Proc. SPIE 3199, 1997, S. 2-11 * |
| Science, Vol. 272, 1996, S. 255-258 * |
Also Published As
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