DE19644422A1

DE19644422A1 - Verwendung von Terpenen zur immunsuppressiven, antileukämischen und antiretroviralen Therapie

Info

Publication number: DE19644422A1
Application number: DE19644422A
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr Schulz; Andre Dr Med Falana
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1996-10-25
Publication date: 1998-04-30
Anticipated expiration: 2016-10-26
Also published as: DE19644422C2

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Terpenen, insbesondere effektiver Konzentrationen von monozyklischen und azyklischen Monoterpen-, azyklischen Sesquiterpen- und azyklischen Diterpenverbindungen und ihrer Analoga, zur immunsuppressiven, antileukämischen und antiretroviralen Therapie.

Die Bekämpfung von Viruskrankheiten einerseits und Autoimmunkrankheiten andererseits ist noch immer eine der zentralen medizinischen Herausforderungen unserer Zeit. Für verschiedenste Anwendungen besteht ein starkes Bedürfnis für die Entwicklung dauerhaft wirksamer Immunsuppressiva, sowie antileukämisch und antiretroviral wirkender Therapeutika.

Bekannt ist zur immunsuppressiven Therapie z. B. die Verwendung von Cyclosporin A, das intrazellulär an Cyclophillin bindet. Der Komplex aus Cyclosporin A und Cyclophillin interferiert mit der Calcineurinfunktion.

Andere Immunsuppressiva wie das Methotrexat und das Azathioprim blockieren unspezifisch die Proliferation aller Zellen einschließlich der T-Zellen. Obwohl die Verwendung von Cyclosporin A große Fortschritte bei der Beherrschung von Transplantatabstoßungsreaktionen gebracht hat, ist der gegenwärtige Stand immunsuppressiver und antiviraler Therapien als unzureichend einzuschätzen.

Dieses Problem wird durch die erfindungsgemäße Verwendung von Terpenen gelöst.

Die Erfindung offenbart die Verwendung von Terpenen, insbesondere von monozyklischen und azyklischen Monoterpen-, und azyklischen Sesquiterpen- und azyklischen Diterpenverbindungen und von deren Analoga, zur immunsuppressiven, antileukämischen und antiretroviralen Therapie.

Terpene sind organische Verbindungen, die aus Multiplen der C-5 Isopreneinheit (2-methyl-1,3-butadien) zusammengesetzt sind. Terpene die zwei Isopreneinheiten enthalten werden Monoterpene, drei Isopreneinheiten enthaltende Sesquiterpene und jene, die vier Isopreneinheiten enthalten, werden als Diterpene bezeichnet. Diese Terpene können eine oder mehrere Ringstrukturen (aus 6 C-Atomen bestehend) aufweisen oder in linearer Form (azyklisch) vorliegen.

Gegenstand dieser Erfindung sind Terpene und bevorzugt monozyklische und azyklische Monoterpen-, azyklische Sesquiterpen- und azyklischen Diterpenverbindungen und Derivate, weiter vorzugsweise entsprechend den Formeln I bis IV der Ansprüche. Die beanspruchten Terpenverbindungen sollen alle pharmakologisch gleichwirkenden Formen umfassen. Dabei ist dem Fachmann bekannt, welche Derivate hier in Frage kommen können, und es kann ihm zugemutet werden, die Wirksamkeit konkreter einzelner Verbindungen zu testen.

Die Position der in den Formeln angegebenen Reste kann gegebenenfalls vertauscht sein. Im Falle von Mehrfachsubstitutionen ist dem Fachmann bekannt, welche Substituenten gleichzeitig und an welchen Positionen im Molekül sinnvollerweise vorliegen können. Der Fachmann hat für diese Auswahl insofern genügend Anleitung, als die Terpene sowie auch zahlreiche Derivate seit langem gut untersucht und bekannt sind (s. u.).

Zu den bevorzugt zu verwendenden Derivaten gehören Terpenalkohole, -aldehyde, -thiole, -ketone, -ester, -oxide, -epoxide und -ether sowie Alkyl-, Alkenyl-, Alkynyl, Alkoxy-, Zykloalkoxy, Mercaptoalkyl-, Amino-, Aminoalkyl-, Karboxylderivate.

Mit der Bezeichnung "niederer Alkylrest" sind in den Formeln Alkylgruppen von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen gemeint. Beispiele von niederen Alkylgruppen umfassen Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, sek.- und tert.-Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Cycloheptyl-, 2-Methylcyclopropyl-, sowie Cyclopropylmethylreste und dergleichen.

Mit "niederem Alkoxyrest" sind Alkoxygruppen von 1 bis 8 Kohlenstoffatomen mit gerader, verzweigter oder cyclischer Konfiguration gemeint. Beispiele von niederen Alkoxygruppen umfassen Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy-, Isopropoxy-, Cyclopropyloxy-, Cyclohexyloxyreste und dergleichen.

Mit "niederem Alkenylrest" sind Alkenylgruppen von 2 bis 8 Kohlenstoffatomen gemeint. Beispiele von niederen Alkenylgruppen umfassen Vinyl-, Allyl-, Isopropenyl-, Pentenyl-, Hexenyl-, Heptenyl-, Octenyl-, Cyclopropenyl-, Cyclobutenyl-, Cyclopentenyl-, Cyclohexenyl-, 1-Propenyl, 2-Butenyl, 2-Methyl-2-butenyl und dergleichen. Mit "niederem Alkinylrest" sind in ganz entsprechender Weise den vorstehenden Gruppen entsprechende Alkingruppen gemeint. Weitere ähnliche Reste sind als entsprechend definiert zu verstehen.

Die Terpenstrukturen enthalten bevorzugt eine oder mehrere Doppelbindungen, wie insbesondere in den Formeln I bis IV in den Ansprüchen gekennzeichnet. Im Falle, daß der Rest R¹ in Formeln I bis IV eine Ketogruppe ist, ersetzt die dadurch zustandekommende Doppelbindung die optionelle (Gerüst-)Doppelbindung zum Carbonyl-Kohlenstoff.

Physiologisch im Säugetierorganismus vorkommende Isoprenoide liegen in Form von Pyrophosphaten vor (z. B.: Geranyl-Pyrophosphat, Farnesyl-Pyrophosphat, Geranylgeranyl-Pyrophosphat). Diese Pyrophosphate sind jedoch im Organismus instabil und nicht in der Lage die Zellmembran zu überwinden.

Bevorzugt werden daher weiterhin Terpensulfate, -phosphate, -phosphorothioate, -phosphorodithioate sowie Ester der selben verwendet. Bevorzugte azyklische Monoterpene sind Geraniol, Geranial, Geranylsäure und β-Myrcen, bevorzugte monozyklische Monoterpene sind Perillaalkohol, Perillasäure und Limonen, bevorzugte azyklische Sesquiterpene sind Farnesol, Farnesal und Nerolidol, bevorzugte azyklische Diterpene sind Gernanylgeraniol und Phytol.

Terpene sind Naturprodukte und als solche in unterschiedlichen Strukturen in einer Vielzahl von essentieller Pflanzenölen enthalten. Aus diesen essentiellen ölen können die gewünschten Terpenverbindungen mit einfachen Verfahren isoliert werden z. B.: EP-A-0363971. Analoga und Derivate sind nach dem Fachmann bekannten chemischen Verfahren herzustellen (Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, Mark et al. eds., 22: 709-762, 1982). Eine Anzahl weiterer Derivate kann durch mikrobielle Transformation hergestellt werden (Abraham, et al., Enzymes in organic synthesis, Pitman ed. pp. 146-160, 1985).

Bestimmte therapeutische Wirkungen der Terpene waren bereits bekannt.

Einige monozyklische Monoterpene wie z. B. Limonen und Perillaalkohol haben in Tiermodellen der experimentellen Karzinogenese chemopräventive und chemotherapeutische Wirkungen gezeigt (Wattenberg, et al. Cancer Res. 45, 1-5, 1985). Chemopräventive Wirkungen sind auch für das azyklische Sesquiterpene Nerolidol nachgewiesen worden (Wattenberg and Coccia, Carcinongenesis 12, 115-117, 1991). Auch antitumorale Wirkungen verschiedener Terpenverbindungen sind bekannt, z. B. aus WO 94/20080. Immunsuppressive Eigenschaften waren jedoch bislang nicht bekannt.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Substanzen der erfindungsgemäßen Substanzklasse die T-Zellaktivierung und Interleukin-2-Produktion blockieren. Die Effekte der erfindungsgemäßen Terpenverbindungen waren selektiv: IL-6 und TGF-β Produktion waren nicht gehemmt. Dieser immunsuppressive Effekt beruht auf der Hemmung der posttranslationalen Isoprenylierung kleiner GTP-bindender Proteine einschließlich der Ras Onkoproteine (p21^ras).

Weiterhin wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Terpenverbindungen eine Erniedrigung membrangebundenen p21^ras induzieren. p21^ras hat die Funktion eines molekularen Schalters im Signalweg des Antigenrezeptors der T-Lymphozyten (Izquierdo-Pastor et al., Immunol. Today, 16, 159-65, 1995). Nach Stimulation des T-Zellrezeptors wird Ras aktiviert, d. h. von der GDP- in die GTP-gebundene Form überführt. Ras-GTP stößt den MAP-Ki nasen (mitogen activated protein kinase) Signalweg an. Dieser Signalweg besteht aus einer Kaskade von Proteinkinasen, welche eine vielfache Verstärkung des Signals bewirken. Im Ergebnis dieses Signalweges werden im Zellkern lokalisierte Transkriptionsfaktoren aktiviert (Izquierdo-Pastor et al., Immunol. Today, 16, 159-65, 1995). In T-Zellen wird spezifisch der sogenannte NFAT (nuclear factor of activated T cells) aktiviert, welcher wiederum die Transkription des IL-2 stimuliert. Die Expression von IL-2 und des IL-2 Rezeptors ist Ausdruck des Überganges der T-Zellen vom ruhenden in den aktivierten Zustand. Das von Antigen-stimulierten T-Lymphozyten freigesetzte IL-2 fungiert als ein interzelluläres Signalmolekül und bewirkt die Aktivierung weiterer T-Zellen und anderer Immunzellen.

Das IL-2 ist somit ein zentrales Element in der Auseinandersetzung der Immunabwehr mit Fremdantigenen.

Es gibt jedoch eine Reihe von klinischen Zuständen, die mit einer Überaktivierung des IL-2/IL-2 Rezeptorsystems in Verbindung stehen. Zu diesen gehören die Transplantatabstoßung, eine Anzahl von Autoimmunkrankheiten und bestimmte hämatologische Neoplasien (Waldmann, Immunol. Today 14, 264-271, 1993).

In T-Lymphozyten, die mit den erfindungsgemäßen Substanzen behandelt wurden, ist der Gehalt an membrangebundenen aktivierbaren Ras Proteinen vermindert. Nach Antigenstimulation kann nun keine ausreichende Stimulierung der MAP-Kinasen erfolgen, so daß die NFAT-vermittelte IL-2 Expression vermindert ist. Die erfindungsgemäßen Terpenverbindungen wirken somit immunsuppressiv.

Nach Antigenbeladung HIV-infizierter T-Zellen binden die über den Ras/MAP-Kinasenweg aktivierten Transkriptionsfaktoren nicht nur am Promotor des IL-2 Gens sondern auch an den LTRs (long terminal repeat) des Virusgenoms. Auf diese Weise kommt es zu Neusynthese infektiöser Viruspartikel und somit zur Aktivierung latenter Virusinfektionen. In T-Zellen, die mit den erfindungsgemäßen Terpenverbindungen behandelt wurden, ist die Aktivierung Ras-abhängiger Transkriptionsfaktoren und somit auch das Voranschreiten der retroviralen Infektion blockiert. Die erfindungsgemäße Substanzklasse besitzt somit antivirale Aktivität.

An der Aktivierung der frühen Transkriptionfaktoren einschließlich des NFAT und anschließender IL-2 Expression ist neben dem Ras/MAP-Kinasenweg noch die Ca2+/Calmodulin abhängige Proteinphosphatase Calcineurin beteiligt. Dabei wirken der Ras-abhängige und der Calcineurin-abhängige Weg in synergistischer Weise zusammen.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der Terpene ist die Wirkstoffkonzentration jeweils so zu wählen, daß die Interleukin-2-Produktion in T-Lymphozyten und/oder die Ras Onkogenexpression in humanen Zellen signifikant vermindert wird.

Die Therapie nach der vorliegenden Erfindung ist angezeigt bei Krankheitsbildern, die mit abnormer Aktivierung des IL-2/IL-2-Rezeptorsystems einhergehen. Eine solche Therapie ist weiterhin angezeigt bei Krankheitsbildern, die einer Verminderung membrangebundener Ras Proteine bedürfen.

Zu diesen Krankheiten, die in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen, gehören Transplantatabstoßungsreaktionen wie die "host versus graft reaction" und die "graft versus host reaction", ein Anzahl von Autoimmunkrankheiten wie Rheumatoid Arthritis, Lupus erythematodes, aplastische Anämie, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, Morbus Crohn, Sarkoidose, Sklerodermie, nicht-infektiöse Uveitis, chronisch-aktive Hepatitis und tropische spastische Paraparese, ausgewählte hämatologische Tumore wie kutanes T Zell Lymphom, adulte T Zell Leukämie, Haarzell Leukämie, akute und chronische granulozytäre Leukämie und Morbus Hodgkin sowie retrovirale Infektionen wie HTLV I, HTLV II, HIV-1 und HIV-2 Infektion.

Die erfindungsgemäßen Substanzen können in einer Reihe von Applikationsarten: oral, subkutan, intramuskulär, intravenös, intrathekal oder topisch verabreicht werden. Bevorzugte Applikationsform ist oral. Die verabreichte Dosis liegt dabei im Bereich von 0,01 bis 2 g/kg/Tag. Die bevorzugte Dosis liegt im Bereich von 0,02 bis 0,2 g/kg/Tag. Diese Dosis kann als eine einzelne tägliche Applikation oder geteilt in zwei, drei oder mehreren Aliquoten pro Tag verabreicht werden. Angenehmer Geschmack und Geruch erlauben ihre Applikation in unverdünnter oder in mit Flüssigkeiten oder Nahrung gemischter Form. Alternativ dazu können die erfindungsgemäßen Substanzen auch als Sirup, Kapsel, Gel oder in einer anderen konventionellen Form oraler Medikation verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen Substanzen können weiterhin zu Infusionslösungen zugesetzt werden und zweckmäßig als Dauerinfusion verwendet werden.

Zur Unterstützung der Behandlung von Transplantatabstoßungsreaktionen oder Autoimmunkrankheiten kann vorteilhafterweise zu den erfindungsgemäßen Substanzen ein Therapeutikum aus der Gruppe der Immunsuppressiva wie z. B. Cyclosporin A, FK506, Rapamycin, Glukocorticoide, Methotrexat, Azathioprim, 6-Mercaptopurin, Cyclophosphamid, Gold, Monoklonale Anti-CD3, Anti-CD4 und Anti-Tac Antikörper zugesetzt sein.

Zur Unterstützung der Behandlung von hämatologischen Tumoren kann vorteilhafterweise zu den erfindungsgemäßen Substanzen ein Therapeutikum aus der Gruppe der Zytostatika wie z. B. Cyclophosphamid, Vincristin, Doxorubicin, Methotrexat, Adriamycin, VP-16, VM-26, Bleomycin, Cytosin-Arabinosid und Glukocorticoide zugesetzt sein.

Zur Unterstützung der Behandlung von Virusinfektionen kann vorteilhafterweise zu den erfindungsgemäßen Substanzen ein Therapeutikum aus der Gruppe der Virostatika wie z. B. Azidothymidin und Dideoxyinosin zugesetzt sein.

Weiterhin kann ein pharmazeutisch akzeptabler Carrier der erfindungsgemäßen Substanzklasse zugesetzt werden. Der Carrier muß pharmazeutisch akzeptabel im Sinne von kompatibel mit den anderen Ingredientien und pharmakologisch akzeptabel im Sinne von verträglich für den Empfänger sein.

Die medizinischen Zubereitungsformen können fest oder flüssig sein. Pharmazeutisch akzeptable Carrier sind u. a. Füllstoffe, Spreng-, Binde-, Netz-, Stabilisierungs-, Gleit-, Emulgier-, Süß-, Geschmacksmittel und ähnliche. Zu diesen Zusatzmitteln gehören z. B. Melantinlösungen, Pektinlösungen, Milchzucker, Kochsalz, Talkum, Stärke, Borsäure, Paraffinöl, Paraffine, Stearinsäure und deren Derivate, Kakaobutter, Gummi, Sirupe, Süßholzextrakte, Hefeextrakte, Honig, Glycerin, Kieselgur, Kaolin, Magnesiumoxid, Bienenwachs und pflanzliche Öle. Bei flüssigen Zubereitungsformen können Wasser, Glycerin, Zucker- oder Alkohollösungen oder Mischungen solcher als Träger und Hilfsstoffe verwendet werden.

Topische Formulierungen bestehen aus den aktiven Substanzen, welche gelöst oder suspendiert in ein oder mehreren Fluiden, z. B. Mineralöl, Petroleum, polyhydroxylierte Alkohole, oder einer anderen Basis, vorliegen. Zu diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen gehören Lösungen, salben, Pasten, Gel, Lotionen, die speziell für die topische Anwendung auf der Haut adaptiert wurden. Die topischen Zusammensetzungen beinhalten zwischen 0,1 bis 15%, bevorzugt 0,1 bis 10% und am bevorzugtesten 0,1 bis 5% des Wirkstoffes. Die pharmazeutischen Formulierungen sind sowohl für veterinär- als auch humanmedizinische Anwendungen geeignet.

Die nachfolgenden, in den Figuren und Tabellen, dargestellten Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung. Es zeigen:

Fig. 1 Die Hemmung der IL-2 Produktion durch Perillasäure.

Fig. 2 Effekte von Monoterpenen auf die Zytokinproduktion.

Fig. 3 Hemmung der Lymphozytenproliferation durch Perillasäure.

Fig. 4 Hemmung der [³H]Mevalonatinkorporation in Proteine durch Monoterpene.

Fig. 5 Depletion von membrangebundenen Ras Proteinen durch Perillasäure. Beispiel 1 - Hemmung der IL-2 Produktion durch Monoterpene
Beispiel 2 - Hemmung der Lymphozytenproliferation durch Monoterpene
Beispiel 3 - Hemmund der Proteinisoprenylierung durch Monoterpene
Beispiel 4 - Depletion von membrangebundenem p21^ras durch Perillasäure

Beispiel 1 Vorbereitung des experimentellen Modells

Mononukleare Zellen wurden aus peripheren Blut von gesunden Spendern durch Ficoll-Visotrast Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Monozyten und B-Zellen wurden mittels Passage durch Nylonwollsäulen (Polysciences, Warrington, PA) abgereichert. Die daraus resultierende T-Zellpopulation war zu 90% rein. Mononukleäre Zellen oder T-Zellen wurden in 96-Well Platten in einer Dichte von 10⁵ Zellen/Well in 0,1 ml serum-freien CG Medium (Vitromex, Vilshofen, Deutschland) kultiviert. Humane T-Lymphom-Zellen H9, histiozytäre Lymphom Zellen U937 und EBV-transformierte B Zellen LAZ 509 wurden von American Type Tissue Collection bezogen und wie oben in CG-Medium kultiviert.

Analyse der Effekte von Monoterpenen auf die Zytokinproduktion

Mononukleäre Zellen wurden eingesät, mit 2 µg/ml PWM stimuliert, und mit d-Limonen oder Perillasäure in Konzentrationen von 0, 100, 500 oder 2500 µM behandelt. Die Produktion von Interleukin-2, Interleukin-6, Interleukin-10 und Transforming Growth Factor-β (TGF-β) wurde nach 4, 24, 48 und 72 Stunden mit Hilfe kommerziell erhältlicher Enzymimmunassays (R & D Systems, Minnealapolis, USA) bestimmt. Die Ergebnisse in Fig. 1 zeigen, daß Perillasäure eine dosisabhängige Hemmung der IL-2 Produktion nach 48 h induzierte. Dabei führte die Behandlung von mononuklearen Zellen mit 100, 500 und 2500 µM Perillasäure zu einer Verminderung der IL-2 Produktion auf 85%, 55% und 25% des Kontrollniveaus. Die Untersuchung der Effekte von Monoterpenen auf das Muster der PWM-sti mulierten Zytokinproduktion in mononuklearen Zellen zeigte, eine selektive Hemmung der IL-2 und IL-10 Produktion. Die Produktion von IL-6 und TGF-β war nicht beeinflußt. Diese Ergebnisse deuten auf eine bevorzugte Hemmung T-Zell-generierter Zytokine hin.

Beispiel 2

Die Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben kultiviert und mit Monoterpenen in Konzentrationen von 4 bis 2500 µM behandelt. Nach 90 h wurden die Zellen mit 0,2 µCi [³H]Thymidin pro Well versetzt und für weitere 6 h inkubiert. Anschließend wurden die Zellen auf Glasfaserfiltern geerntet, und der Einbau von Radioaktivität wurde mit Hilfe eines Flüssigkeitsszintillationszählers bestimmt. Die Ergebnisse in Fig. 3 zeigen, daß Perillasäure die Proliferation sowohl von mononuklearen Zellen und T-Zellen als auch von einer Anzahl von B-, T- und monozytären Zellinien hemmt. Das Ausmaß der Hemmung war dabei ähnlich mit 50%igen inhibitorischen Konzentrationen innerhalb eines schmalen Bereichs von 200 bis 400 µM. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß sich normale und transformierte Zellen nicht wesentlich in ihrer Sensitivität gegenüber der zytostatischen Aktivität von Perillasäure unterscheiden. Der Vergleich verschiedener Monoterpene zeigte, daß Perillylalkohol die Lymphozytenproliferation in stärkerem Maße hemmte als Perillasäure oder Limonen.

Beispiel 3

H9 Zellen wurden in 48-Well Platten in einer Dichte von 2.5 × 10⁵ Zellen/Well in 1 ml Medium eingesät. Am Tag 1 erhielten die Zellen 25 µm Compactin um die endogene Mevalonsäuresynthese zu blockieren. Nach 12 h wurden die Zellen mit Monoterpenen in Konzentrationen zwischen 500 und 5000 µM für weitere 6 h behandelt. Während dieser Zeit wurden dem Medium 200 µCi/ml [³H]Mevalonsäure zugesetzt und die Inkorporation von [³H ]Mevalonsäureprodukten bestimmt. Dazu wurden die Zellen zweimal in kaltem PBS gewaschen, in SDS-Probenpuffer lysiert und gleiche Proteinmengen (100 Mg) elektrophoretisch aufgetrennt (12% SDS-PAGE). Das Gel wurde in fluorographischem Enhancer getränkt, getrocknet und gegenüber Röntgenfilm bei -80°C für 5-15 Tage exponiert. Fig. 4A zeigt die dosisabhängige Hemmung der Proteinisoprenylierung durch Perillasäure. Dabei erniedrigte Perillasäure selektiv die Inkorporation von [³H]Mevalonsäure in 21 bis 26 kDa Proteine und Proteinen an der Lauffront aber nicht in 46 kDa Proteine. Quantitative Bestimmung ergab das 500 bzw. 2500 µM Perillasäure die Proteinisoprenylierung auf 70 bzw. 25% des Kontrollniveaus verminderte. Der Vergleich verschiedener Monoterpene (Fig. 4B) ergab, daß ähnlich wie bei der Hemmung der Zellproliferation Perillylalkohol potenter als Limonen und Perillasäure auch in Bezug auf die Hemmung der Proteinisoprenylierung ist.

Beispiel 4

H9 Zellen wurden in einer Dichte von 2,5 × 10⁵ Zellen/ml in 40 ml in 75 cm² Kulturflaschen eingesät. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit 0, 500 oder 2500 µM Perillasäure für 48 h behandelt. Anschließend wurden die Zellen zweimal in kaltem PBS gewaschen und in Lysispuffer (10 mM Hepes, pH 7.4, 100 mM KCl, 3 mM NaCl, 1 mM ATP, 3.5 mM MgCl₂, 1 mM PMSF, 1 µM Pepstatin, 2 µg/ml Aprotinin, 0.34 M Sucrose) aufgenommen. Die Zellen wurden mit Hilfe von Ultraschall aufgeschlossen und das Homogenat für 10 min mit 1000 × g bei 4°C zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde dann mit 100,000 × g bei 4°C für 60 min zentrifugiert. Die pelletierten Membranen wurden in Lysispuffer resuspendiert, und gleiche Proteinmengen (20 µg) von jeder Probe wurden elektrophoretisch aufgetrennt. Das resultierende Gel wurde auf Nitrozellulose geblottet, und Ras Proteine wurden mit dem Ras-11-Antikörper (Oncogene Science, Uniondale, NY) detektiert. Das Blot wurde dann mit dem Enhanced Chemiluminescence Kit (Amersham) entwickelt. Das Ergebnis in Fig. 5 zeigt, daß die Perillasäurebehandlung der H9 Zellen zu einer dosisabhängigen Erniedrigung des Gehaltes an membrangebundenen Ras Proteinen führt. Zytosolisches p21^ras war weder in den Kontrollen noch in Perillasäure-be handelten Zellen detektierbar.

Claims

1. Verwendung von Terpenen, einzeln oder in Kombination, zur immunsuppressiven, antileukämischen und antiretroviralen Therapie.

2. Verwendung von Terpenen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Terpene monozyklische und azyklische Monoterpen-, azyklische Sesquiterpen- und azyklische Daterpenverbindungen, einzeln oder in Kombination, sind.

3. Verwendung von Terpenen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnete daß die monozyklischen Monoterpene solche der Formel I sind,
die azyklischen Monotepene solche der Formel II,
die azyklischen Sesquiterpene solche der Formel III,
und die azyklischer Diterpene solche der Formel IV,
wobei die Reste folgende Bedeutung haben:

- R¹ - ist H, O (Keto-), OH, SH, CHO oder CN,
- eine niedere Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxy-, Cycloalkoxy, Carboxyl-, Mercaptoalkyl-, Hydroxyalkyl-, Amino-, Aminoalkyl-, CH₂OR⁸-, COOR⁸-, SO₃R⁸-, CONR⁸R⁹- oder SO₂NR⁸R⁹-Gruppe,
wobei R⁸ und R⁹ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl-, oder Alkenyl- sind,
- eine COOM- oder SO₃M-Gruppe,
wobei M ein Alkalimatallatom oder ein Kation ist,
- oder eine CH₂R¹⁰-Gruppe,
wobei R¹⁰ ein Halogen, eine SO₃R¹¹-, PO₃R¹²-, eine Phosphorothioatgruppe der Formel
oder eine Phosphorodithioatgruppe der Formel
ist,
wobei R¹¹ ein Halogen, eine Amino- oder niedere Alkyl-Gruppe, R¹² ein Halogen oder eine niedere Alkyl-Gruppe, R¹³ und R¹⁴ jeweils voneinander unabhängig ein Wasserstoff oder eine niedere Alkyl-Gruppe ist,
- R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷:
- sind jeweils unabhängig voneinander H, O (Keto-), OH, SH, CHO, COOH, Halogen, eine niedere Alkyl- oder Alkenyl-Grup pe, wobei zusätzlich
- in den dargestellten Formeln I-IV jeweils H an höchstens drei Positionen im Molekül durch ein Halogen, eine Hydroxy- oder Methylgruppe substituiert sein kann,
- die gestrichelten Linien optionale Doppelbindungen darstellen, von denen mindestens eine vorhanden ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Position des Restes 1 mit der Position von einem der Reste R² bis R⁷ vertauscht ist.

5. Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz in einer Konzentration verwendet wird, die die Interleukin-2-Produktion in T-Lymphozyten und/oder die Ras Onkogenexpression in humanen Zellen signifikant vermindert.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, Transplantatabstoßungsreaktionen, malignen Lymphomen und retroviralen Infektionen.

7. Verwendung nach Anspruch 6 bei folgenden Krankheiten:

- zur Behandlung der Rheumatoid Arthritis, des Lupus
- erythematodes, aplastischer Anämie, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, Morbus Crohn, Sarkoidose, Sklerodermie, nicht infektiöser Uveitis, chronisch-aktiver Hepatitis, tropischer spastischer Paraparese;
- zur Behandlung und Prävention der Organtransplantatabstoßung und der "graft versus host reaction"
- zur Behandlung und Prävention des kutanen T-Zell-Lymphoms, adulter T-Zell-Leukämie, Haarzell-Leukämie, akuter und chronischer granulozytärer Leukämie und Morbus Hodgkin;
- zur Behandlung der HTLV I, HTLV II, HIV-1 und HIV-2 Infektion.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz oder die Substanzen oral, subkutan, intramuskulär, intravenös, intrathekal oder topisch appliziert wird/werden, vorzugsweise in Anwesenheit üblicher galenischer Hilfs- und Zusatzstoffe.

9. Verwendung nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß die effektive Dosis 0,01 bis 2 g/kg/Tag beträgt.

10. Verwendung nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß die effektive Dosis 0,02 bis 0,2 g/kg/Tag beträgt.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das azyklische Monoterpen aus der Gruppe Geraniol, Geranial, Geranylsäure und β-Myrcen ausgewählt wird.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das monozyklische Monoterpen aus der Gruppe Perillaalkohol, Perillasäure und Limonen ausgewählt wird.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das azyklische Sesquiterpen aus der Gruppe Farnesol, Farnesal und Nerolidol ausgewählt wird.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das azyklische Diterpen aus der Gruppe Gernanylgeraniol und Phytol ausgewählt wird.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 14, insbesondere zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten und Transplantatabstoßungsreaktionen, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz(en) mit einem Immunsuppressivum aus der Gruppe Cyclosporin A, FK506, Rapamycin, Glukocorticoide, Methotrexat, Azathioprim, 6-Mercaptopurin, Cyclophosphamid, Gold, monoklonale Anti-CD3, Anti-CD4 und Anti-Tac Antikörper kombiniert wird/werden.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 14, insbesondere zur Behandlung und Prävention von malignen Lymphomen, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz(en) nach Formeln I-IV mit einen Zytostatikum aus der Gruppe Cyclophosphamid, Vincristin, Doxorubicin, Methotrexat, Adriamycin, VP-16, VM-26, Bleomycin, Cytosinarabinosid und Glukocorticoide kombiniert wird/werden.

17. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 14, insbesondere zur Behandlung und Prävention bei retroviralen Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz(en) nach Formeln I-IV mit einen Virostatikum aus der Gruppe Azidothymidin und Dideoxyinosin kombiniert wird/werden.