DE19619084A1 - Verfahren zur Herstellung von Poly-ß-hydroxybuttersäure und Copolymeren - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Poly-ß-hydroxybuttersäure und CopolymerenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur
biotechnologischen Herstellung von Poly-β-
hydroxybuttersäure (PHB) oder Copolymeren, das im
großtechnischen Maßstab effektiv arbeitet und unter
Produktionsbedingungen einfach zu handhaben ist, da
keine sterilen Fermentationsbedingungen gewährleistet
werden müssen.
Verfahren zur mikrobiellen Gewinnung von Poly-β-
hydroxybuttersäure sind bekannt. Die am häufigsten
eingesetzten Substrate sind Kohlenhydrate, bevorzugt
Glucose und Saccharose. Weiterhin werden auch Alkohole,
besonders Methanol, als Kohlenstoffquelle genutzt. Die
am meisten eingesetzten Bakterien sind Alcaligenes
eutrophus und Alcaligenes latus.
Ein Beispiel für die mikrobielle Produktion von PHB aus
Methanol ist in EP 0 015 669 A2 gegeben. Beispiele für
die Gewinnung von Copolymeren sind in EP 0 304 293 A2
und EP 069 497 A2 dargestellt, wobei beispielsweise
Glucose/Propionsäure als Substratgemische eingesetzt
werden.
Ein Verfahren zur Gewinnung von PHB mit einem guten
Ertragskoeffizienten ist in EP 0 149 744 A1 mit
Saccharose als Substrat beschrieben.
Nachteilig an diesen Verfahren ist, daß sie steril
durchgeführt werden müssen, da Kontaminationen die
Prozesse negativ beeinflussen, und dadurch das
gewünschte Fermentationsziel in Frage gestellt wird.
Außerdem werden keine Ergebnisse bezüglich hoher
Molekulargewichte der produzierten Poly-β-
hydroxybuttersäure dargelegt.
Experimentelle Arbeiten im Schüttelkolbenmaßstab
beschreiben den Einsatz von reinem Methan als Substrat
zur Herstellung von PHB mit den Bakterienstämmen
Methylosinus sporium 12, Methylosinus trichosporium
OB3B und Methylocystis parvus OBBP. Bei
Biomassekonzentrationen von 2 g/l werden nach einer
langen Kultivierungszeit von 180 h PHB-Gehalte in der
Biomasse bis zu 70% erreicht (J.A. ASENJO et al., J.
Ferment. Technol. 64 (1986), 271-278 und J.A. ASENJO et
al., Biotechnol. Bioengin. Symp. 15 (1985), 225-234).
Eine andere Literaturstelle beschäftigt sich mit der
Bildung von PHB aus Methan, um die Biodegradation von
Trichlorethylen zu stimulieren. Im Schüttelkolben und
im Bioreaktor werden in der Biomasse bis zu 50% PHB
nach Kultivierungszeiten von 120 h akkumuliert (T.
TAYLOR et al., Biotechnol. Bioengin. 49 (1996), 161-
171).
Auch diese Verfahren besitzen den Nachteil, daß sie
steril durchgeführt werden müssen. Daneben sind
derartig lange Kultivierungszeiten ökonomisch nicht
vertretbar.
Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein im
großtechnischen Maßstab effektiv arbeitendes Verfahren
zur Herstellung von Poly-β-hydroxybuttersäure (PHB) und
Copolymeren zu entwickeln, das mit billigen Substraten
arbeitet, unter Produktionsbedingungen einfach zu
handhaben ist, bei ökonomisch vertretbaren
Kultivierungszeiten zu einer guten Anreicherung von PHB
in der Biomasse führt und die Herstellung von PHB mit
hohen Molekulargewichten erlaubt.
Die Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 und den dazugehörigen
Unteransprüchen 2 bis 8 gelöst. Erfindungsgemäß werden
als einzige Kohlenstoffquelle reines Methan, Erdgas,
gereinigtes Bio- oder Deponiegas oder auch methanarme
Erdgase eingesetzt und der Prozeß unsteril, entweder in
diskontinuierlicher oder kontinuierlicher Fahrweise,
durchgeführt, wobei der Wachstumsprozeß stets
kontinuierlich geführt wird.
Die Kultivierung erfolgt in einem Temperaturbereich von
20-42°C, vorzugsweise von 32-38°C bei pH-Werten von
5,2-6,8, vorzugsweise von 5,5-6,0, bei Drücken bis
zu 0,6 MPa und einem Gelöstsauerstoffgehalt von 0,5 -
90% des Sättigungswertes der ruft.
Als methanotropher Bakterienstamm wird vorzugsweise der
Stamm Methylocystis spec. ZIMET B 502 eingesetzt.
Dieser Stamm wird erstmalig in DD 1 48 465 beschrieben.
Der Stamm wurde in der ZIMET-Hinterlegungsstelle Jena
unter der Nummer ZIMET B 502 hinterlegt und in die
Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM) überführt.
Es ist jedoch erfindungsgemäß auch möglich, eine andere
methanotrophe Bakterienkultur einzusetzen, die unter
unsterilen Bedienungen kultiviert werden kann und mit
methanenthaltenden Gasen als einziger Kohlenstoffquelle
eine gute Anreicherung von PHB in der Biomasse
(mindestens 40%) gewährleistet.
Als methanenthaltendes Gas können im erfindungsgemäßen
Verfahren zur Herstellung von PHB sowohl reines Methan
als auch Bio- oder Deponiegas eingesetzt werden.
Letztere müssen je nach Qualität einer Reinigung zur
Entfernung von Schwefelverbindungen und Kohlendioxid
unterzogen werden.
Erfindungsgemäß wird zur Herstellung von Copolymeren
enthaltend β-Hydroxybuttersäure- und
β-Hydroxyvaleriansäure-Einheiten, Erdgas, vorzugsweise
mit einem Gehalt an Methanhomologen wie Ethan, Propan,
Butan von < 15%, eingesetzt. Die erfindungsgemäß
erhaltenen Copolymere weisen bis zu 50% PHB und bis zu
10% Polyhydroxyvaleriansäure (PHV) auf.
Methanenthaltendes Gas und sauerstoffenthaltendes Gas
werden im Gemisch eingeblasen, wobei das
Begasungsgemisch zwischen 15% bis 50% Methan enthält,
vorzugsweise ca. 20%.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens werden Wachstums- und
Produktbildungsprozeß alternierend durchgeführt. Der
Wachstumsprozeß erfolgt bei Durchflußraten D =
0,1-0,2 h-1, vorzugsweise bei 0,13-0,15 h-1, der
Produktbildungsprozeß bei D = 0,04-0,05 h-1 oder
diskontinuierlich. Der Produktbildungsprozeß wird
unmittelbar aus dem Wachstumsprozeß gestartet, nachdem
die Ammoniumstickstoffdosierung auf 10% des Bedarfs
reduziert wird. Nach einer Produktbildungsphase von
6-10 h, vorzugsweise 8 h, wird ein Teil des
Fermentorinhaltes, vorzugsweise 50%, geerntet und der
verbleibende Rest mit Nährlösung aufgefüllt. Nach
ausreichender Ammoniumstickstoffzugabe setzt sofort
wieder das Wachstum ein, und nach Erreichen der
ursprünglichen Biomassekonzentration kann nach 12-20
h, vorzugsweise 16-17 h, wieder der Produkt
bildungsprozeß gestartet werden. Auf diese Weise kann
PHB ohne Unterbrechung durch zyklische Wachstums- und
Produktbildungsprozesse über Monate erzeugt werden.
Desweiteren kann in einer bevorzugten Variante, um die
Biomassekonzentration im Wachstumsprozeß weiter zu
erhöhen, ein Teil der Biomasse nach Mikrofiltration in
den Fermentor zurückgeführt werden.
Ökonomisch besonders vorteilhaft ist es, wenn
Nährmedium und/oder Begasungsgemisch im Kreislauf
geführt werden, d. h., wieder in den Prozeß eingespeist
werden.
Die Gewinnung der PHB bzw. der Copolymere aus der
Biomasse erfolgt mit Standardextraktionsmethoden, z. B.
durch Vorextraktion mit Methanol (Feststoff-
Lösungsmittelverhältnis 1 : 5), anschließende Extraktion
mit 1,2-Dichlorethan (Feststoff-Lösungsmittelverhältnis
1 : 10, Temperatur 83°C, 4stufig, Extraktionsdauer 15
min.) und nachfolgende Ausfällung mit Aceton (4-8°C,
Lösungsmittel-Lösungsmittelverhältnis 1 : 1), wobei es
für den Fachmann kein Problem darstellt, diese Methoden
entsprechend zu modifizieren und zu optimieren.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bei
Kultivierungszeiten von ca. 10 h PHB-Gehalte in der
Biomasse von mindestens 35% und ein Gehalt an
Copolymeren bis zu 10% erreicht. Die Molekulargewichte
der erfindungsgemäß hergestellten Poly-β-
hydroxybuttersäure liegen zwischen 1,2-1,6 Mio. Das
erfindungsgemäße Verfahren ist leicht handhabbar, da es
unter unsterilen Bedingungen arbeitet, die Substrate
stellen billige Rohstoffe dar.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die
Verwendung von Erdgas mit einem Gehalt von
Methanhomologen unter 15% zur biotechnologischen
Herstellung von Copolymeren enthaltend
β-Hydroxybuttersäure- und β-Hydroxyvaleriansäure-
Einheiten sowie die Verwendung des Bakterienstammes
Methylocystis spec. ZIMET B 502 zur biotechnologischen
Herstellung von Poly-β-Hydroxybuttersäure und
Copolymeren.
Nachfolgend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen
näher erläutert, ohne sie jedoch darauf einzuschränken.
In einen Rührfermentor werden 4 kg vorgezüchtetes Impf
material einer methanotrophen Mischkultur mit der
Hauptkomponente Methylocystis spec. ZIMET B 502 (< 90%
bezogen auf Biomasse, 10% Begleitflora) mit einer
Konzentration von 28 g/l eingesetzt. Die Zusammen
setzung der Nährlösung ist pro Liter Wasser folgende:
| H₃PO₄ (80%ig)|0,028 ml | |
| KH₂PO₄ | 35 mg |
| MgSO₄ * 7 H₂O | 25 mg |
| CuSO₄ * 5 H₂O | 0,785 mg |
| MnSO₄ * H₂O | 1,389 mg |
| FeSO₄ * 7 H₂O | 1,678 mg |
| ZnCl₂ | 0,322 mg |
| CoSO₄ * 7 H₂O | 0,036 mg |
| NiSO₄ * 7 H₂O | 0,109 mg |
| Al₂(SO₄)₃ * 18 H₂O | 0,186 mg |
| Ca(NO₃)₂ * 4 H₂O | 0,883 mg |
| Na₂MoO₄ * 2 H₂O | 0,041 mg |
| H₃BO₃ | 1,286 mg |
| CrCl₃ * 6 H₂O | 0,077 mg. |
Diese Salze sind ausreichend für einen Zuwachs von 1 g
Biomassetrockensubstanz, die Stickstoffversorgung der
Bakterien erfolgt mit einer 2%igen Ammoniaklösung über
die pH-Regelung. Ein Überschuß an Nähr- und
Spurensalzen wird ständig in Abhängigkeit von der
Biomassekonzentration geschaffen. Die Temperatur wird
auf 38°C, der pH-Wert auf 5,7 und eine Durchflußrate
von 0,17 h-1 eingestellt. Das Begasungsgemisch enthält
20% Methan, die Begasung beträgt 600 l/h,
Rührerdrehzahl und Druck werden automatisch so
geregelt, daß die Konzentration des Gelöstsauerstoffes
bei 0,5% der Sättigung liegt.
Nach 3 h wird der Produktbildungsprozeß gestartet,
indem eine Durchflußrate von 0,04 h-1 und eine
Limitation von Ammoniumstickstoff eingestellt werden.
Dies geschieht dadurch, daß die pH-Regelung mit
Natronlauge, bei Bedarf auch mit verdünnter
Schwefelsäure, erfolgt und nur 10% des
Ammoniumstickstoffbedarfs über die Nährlösung dosiert
werden. Alle anderen Parameter werden konstant
gehalten. Um die Konzentration pO₂=0,5% einhalten zu
können, werden außer der automatischen Druck-
/Drehzahlregelung die Gasmengen sukzessive erniedrigt.
Am Start betrug die Biomassenkonzentration 28,9 g/l der
PHB-Gehalt 1,5%. Nach 8 h Versuchszeit wird eine
Biomassekonzentration von 39,1 g/l mit einem PHB-Gehalt
von 44,2% erreicht.
Die Aufarbeitung der Biomasse erfolgt durch
Gefriertrocknung und Standardextraktionsmethoden. Das
Molekulargewicht der PHB beträgt 1,6 Mio.
In einen 10fach größeren Rührfennentor werden 40 kg
vorgezüchtetes Impfmaterial der gleichen Kultur wie in
Beispiel 1 mit einer Biomassekonzentration von 20 g/l
eingesetzt. Alle Parameter werden wie in Beispiel 1
beschrieben eingestellt, nur wird der Prozeß als batch
geführt. Nach 2 h Versuchsdauer wurde der
Produktbildungsprozeß gestartet, der pH-Wert wurde auf
6,5 angehoben, auf Natronlauge umgestellt und somit
kein Ammoniumstickstoff mehr dosiert. Zu diesem
Zeitpunkt betrugen die Biomassekonzentration 22,2 g/l
und der PHB-Gehalt 2,5%. Die anfängliche Begasung von
4.800 l/h wurde ebenso wie Druck und Rührerdrehzahl
reduziert, so daß die Gelöstsauerstoffkonzentration bei
0,5% der Sättigung gehalten wurde. Unter diesen
diskontinuierlichen Bedingungen wurden nach 8 h eine
Biomassekonzentration von 33,2 g/l mit einem PHB-Gehalt
von 43,0% erreicht. Das Molekulargewicht der PHB
beträgt 1,2 Mio.
In einen Rührfermentor werden 40 kg vorgezüchtetes
Impfmaterial der Kultur wie in Beispiel 1 eingesetzt.
Der Prozeß für Wachstum und Produktbildung wird unter
den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchge
führt, nur wird die Gelöstsauerstoffkonzentration bei
90% Sättigung gehalten. Die Begasung wurde auf 4.200
l/h eingestellt. Beim Start des Produktbildungsprozes
ses beträgt die Biomassekonzentration 20,1 g/l, der
PHB-Gehalt liegt bei 4,8%. Nach 8 h wird eine Biomasse
konzentration von 22,4 g/l erreicht, der PHB-Gehalt der
Biomasse beträgt 33,9%, als Molekulargewicht wurden 1,6
Mio. ermittelt.
In einen Rührfermentor werden 4 kg vorgezüchtetes
Impfmaterial der Kultur aus Beispiel 1 eingesetzt. Alle
Parameter werden wie in Beispiel 1 beschrieben
eingestellt, nur wurde der Prozeß als batch geführt.
Eine weitere Veränderung gegenüber Beispiel 1 bestand
darin, daß das Begasungsgemisch aus 25% Erdgas und 75%
Luft bestand. Das Erdgas hatte folgende
Zusammensetzung: 77,6% Methan, 7,4% Ethan, 5,0% Propan,
2,0% Butan, 7,5% Stickstoff, 0,5% Kohlendioxid. Nach 4
h Fermentation unter Wachstumsbedingungen wird der
Produktbildungsprozeß gestartet, indem die
Stickstoffquelle entzogen wird. Am Startpunkt betrug
die Biomassekonzentration 19,6 g/l mit einem PHB-Gehalt
von 3,8%. Nach 10 h batch-Prozeß wurde eine
Biomassekonzentration von 27,9 g/l mit einem Gehalt an
PHB von 37,5% und einem Gehalt an PHV
(Polyhydroxyvaleriansäure) von 9,4% erreicht.
In eine Rührfermentor werden 4 kg vorgezüchtetes Impf
material der Kultur aus Beispiel 1 eingesetzt, die Pa
rameter werden ebenfalls wie in Beispiel 1 eingestellt.
Nach 2 h Kultivierungszeit wird der Produktbildungs
prozeß durch Entzug der Ammoniumstickstoffquelle ge
startet, lediglich 10% des Stickstoffbedarfs werden mit
der Nährlösung mit D=0,04 h-1 dosiert. Zum Startpunkt
beträgt die Biomassekonzentration 22,1 g/l, der PHB-Ge
halt 4,6%. Nach 7 h Versuchszeit hat die Biomasse
konzentration auf 28,5 g/l zugenommen, der PHB-Gehalt
beträgt 39,8%. Zu diesem Zeitpunkt werden 50% des Fer
mentorinhaltes geerntet und die Kultur mit einer Nähr
lösung aufgefüllt, die für eine Zuwachs von 2 g/l
Biomasse berechnet ist. Gleichzeitig wird die
pH-Regelung wieder mit einer 2%igen Ammoniaklösung vor
genommen und eine Verdünnungsrate von 0,12 h-1 ein
gestellt. Das Nährsalzangebot wird sukzessive an die
Zunahme der Biomassekonzentration angepaßt. Die Kultur
schaltet sofort wieder auf Wachstum und nach 15 h
kontinuierlicher Fahrweise wird eine Biomasse
konzentration von 19,1 g/l sowie ein PHB-Gehalt von
5,6% ermittelt. Anschließend wird wieder der Produkt
bildungsprozeß initiiert, indem wiederum die Stick
stoffquelle bis auf 10% des Bedarfs reduziert und die
Durchflußrate auf 0,04 h-1 gesenkt wird. Während einer
Versuchsphase von 8 h vergrößert sich die Biomasse
konzentration auf 24,3 g/l mit einem PHB-Gehalt von
42,3%. Es werden wiederum 50% des Fermentorinhaltes ge
erntet und die gleiche Prozedur wie beim 1. Zyklus
durchgeführt. Während des Wachstumprozesses wird die
Gelöstsauerstoffkonzentration bei 0,5-15%, während des
PHB-Bildungsprozesses bei 0,5-5% gehalten.
Die Zyklen können beliebig lange wiederholt werden,
wenn eingehalten wird, daß beispielsweise bei einer
Verdünnung um 50% bei der gegebenen Durchflußrate die
Wachstumsphase die doppelte Zeit der
Produktbildungsphase beträgt.
Claims (10)
1. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von
Poly-β-Hydroxybuttersäure (PHB) oder Copolymeren,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein methanotropher Bakterienstamm mit einem
methanenthaltenden Gas als einziger Kohlenstoff
quelle in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und
eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases unter
unsterilen Bedingungen kultiviert wird, wobei der
Wachstumsprozeß kontinuierlich und der Produkt
bildungsprozeß kontinuierlich oder diskontinuier
lich geführt werden, und aus der erhaltenen
Biomasse die PHB oder die Copolymere auf an sich
übliche Weise durch Extraktion gewonnen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß als methanotropher Bakterienstamm der Stamm
Methylocystis spec. ZIMET B 502 eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Kultivierung im Temperaturbereich von 20
bis 42°C, bei pH-Werten von 5,2 bis 6,8, bei
Drücken bis zu 0,6 MPa und einem
Gelöstsauerstoffgehalt von 0,5 bis 90% des
Sättigungswertes der Luft durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß zur Erhöhung der Biomassekonzentration im
Wachstumsprozeß ein Teil der Biomasse nach
Mikrofiltration in den Fermentor zurückgeführt
wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß Wachstums- und Produktbildungsprozeß
alternierend durchgeführt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Nährmedium und/oder das Begasungsgemisch
aus methanenthaltendem und sauerstoffenthaltendem
Gas wieder in das Verfahren zurückgeführt werden.
7. Verfahren zur Herstellung von PHB nach einem der
Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß als methanenthaltendes Gas reines Methan,
gereinigtes Biogas oder gereinigtes Deponiegas
eingesetzt werden.
8. Verfahren zur Herstellung von Copolymeren aus Poly
hydroxybuttersäure und Polyhydroxyvaleriansäure
nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß als methanenthaltendes Gas Erdgas mit einem
Gehalt an Methanhomologen unter 15% eingesetzt
wird.
9. Verwendung von Erdgas mit einem Gehalt an
Methanhomologen unter 15% zur biotechnologischen
Herstellung von Copolymeren enthaltend
β-Hydroxybuttersäure- und β-Hydroxyvaleriansäure-
Einheiten.
10. Verwendung des Bakterienstammes Methylocystis spec.
ZIMET B 502 zur biotechnologischen Herstellung von
Poly-β-hydroxybuttersäure und Copolymeren.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998051814A1 (de) * | 1997-05-14 | 1998-11-19 | Ufz-Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle Gmbh | Verfahren zur effizienten stofflichen und energetischen nutzung von biogas sowie anlage zur durchführung des verfahrens |
| DE19721243A1 (de) * | 1997-05-14 | 1998-11-19 | Ufz Leipzighalle Gmbh | Anlage zur Erzeugung und Nutzung von Biogas sowie Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Poly-beta-hydroxybuttersäure |
| DE19840691C2 (de) * | 1998-08-24 | 2003-12-24 | Wolfgang Tentscher | Verwendung eines CO2-haltigen Abgases als Kohlenstoffquelle für Pflanzen |
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| DE10013514C2 (de) | 2000-03-14 | 2002-06-27 | Ufz Leipzighalle Gmbh | Verfahren zur Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten (PHA) oder deren Copolymeren |
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| EP0015669A2 (de) * | 1979-02-21 | 1980-09-17 | Imperial Chemical Industries Plc | Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Poly-(beta-hydroxybuttersäure) und dabei verwendete Mikroorganismen |
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-
1996
- 1996-04-30 DE DE1996119084 patent/DE19619084C2/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19619084C2 (de) | 1998-08-06 |
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