DE69714681T2

DE69714681T2 - Verfahren zur Herstellung von Sophorolipiden durch zyklische Fermentation mit Zuführung von Fettsäureestern oder Ölen

Info

Publication number: DE69714681T2
Application number: DE69714681T
Authority: DE
Inventors: Bernard Chaussepied; Remy Marchal; Michel Warzywoda
Original assignee: IFP Energies Nouvelles IFPEN
Current assignee: Sophor Sa Rueil-Malmaison Fr
Priority date: 1996-10-18
Filing date: 1997-10-14
Publication date: 2002-12-05
Anticipated expiration: 2017-10-15
Also published as: US5879913A; FR2754829A1; FR2754829B1; EP0837140A1; DE69714681D1; EP0837140B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur zyklischen Kultivierung bzw. Fermentation mit Substratzufuhr (cyclic fed batch culture) zur Herstellung einer Zusammensetzung von Sophorolipiden.
Die Sophorolipide werden z. B. bei der Kosmetologie als Antiradikalreagens und Antielastizitätsreagens verwendet (WO 95/34282). Sie können auch als co-tensidaktives Mittel in einem Bodenreinigungs- bzw. Bodensanierungsverfahren verwendet werden (EP-A 605 308).
Es ist in den Patenten US 3205150, US 3312684 und EP-B-516803 erwähnt worden, dass eine Menge von Sophorolipiden durch ein Fermentationsverfahren hergestellt worden ist, indem eine Candida bombicola-Kultur eingesetzt wurde.
Die Sophorolipide werden als ein Gemisch von Verbindungen angesehen, die durch die Formeln (1) und (2) dargestellt sind, in der R¹ Wasserstoff oder die Acetylgruppe darstellt und R² Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen darstellt oder R² ebenso gut Wasserstoff oder eine Methylgruppe darstellt, während R³ eine ungesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 13 oder 17 Kohlenstoffatomen ist.
Diese Verbindungen sind als Reinigungsreagenzien und als Emulsionsmittel verwendbar und sie weisen exzellente hygroskopische und Hydrophileigenschaften aufgrund des Sophoroseteils von jeden dieser Moleküle und hydrophobe Eigenschaften auf, die von den Fettsäureteilen kommen.
Die Herstellung von Sophorolipiden wird im allgemeinen in Gegenwart eines Substrats wie in dem Patent US 3205150 beschrieben durchgeführt. Zum Beispiel können dieses Substrat Kohlenwasserstoffe, gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, Ester von Glyceride einschließenden Säuren und Pflanzenöle wie Sojaöl sein.
Die Substratversorgung besteht darin, diskontinuierlich (batch) mit Zeitintervallen von 12 bis 24 Stunden die Einspritzung einer Menge von etwa 2 Gew.-% pro anfänglichem Reaktionsvolumen für jede Zugabe durchzuführen. Die Substratversorgung wird vorteilhafter kontinuierlich (fed batch) durchgeführt, wie im Falle des europäischen Patentes der Anmelderin EP-B 516803.
Struktur der Sophorolipide
(1) Säureformen
(2): Lactonformen
Die diskontinuierlichen Fermentationsverfahren mit diskontinuierlicher Substratversorgung (batch) oder kontinuierlicher Substratversorgung (fed batch) weisen die klassischen Nachteile der diskontinuierlichen Fermentation auf. So erzwingt im industriellen Maßstab der kontinuierliche Einsatz einer Reihe von diskontinuierlichen Vorgängen (im batch oder im fed batch) zahlreiche Todzeiten beim Betrieb der Anlagen aufgrund der Reinigung und der Sterilisierung des Fermentors, die zwischen jeder Kultur wiederholt werden müssen. Gleichermaßen muss man jedes Mal die Vermehrung des Erzeugerstammes nach seinem Aufbewahrungszustand, zum Beispiel in einem Agarröhrchen bis zum Erzeugerfermentor durch eine Animpfungskette durchführen, was die fortschreitende Kultur des Mikroorganismus in Fermentoren wachsender Umfänge impliziert. Dieser Vorkulturvorgang kann mehrere Tage in Anspruch nehmen.
Um diese Nachteile und diese Zwänge zu vermeiden, greift man gewöhnlich auf die kontinuierliche Kultur zurück, bei der man den Reaktor mit Kulturmedium und Substrat bei äquivalentem Durchsatz versorgt und die Fermentationsmischung bzw. - würze bei einem äquivalenten Durchsatz abzieht. Das Reaktionsvolumen ist daher konstant. Klassisch wird die kontinuierliche Kultur gemäß dem Chemostatmodus (hinterlegte Marke) durchgeführt (Wang et al. 1979, Continuous culture. In Fermentation and enzyme technology, John Wiley & Sons (eds), S. 98-137). Eine Ernährung des Kulturmediums liegt in begrenzender Weise derart vor, dass die stationäre Konzentration des Mikroorganismus in dem Fermentor geregelt wird und ein stabiler Betrieb des Systems erhalten wird. Wenn man Metaboliten (wie z. B. Ethanol) erzeugen will, verwendet man im allgemeinen zwei oder mehrere in Reihe angeordnete Fermentoren (Bi- oder Multistufensystem). Im ersten wird das Wachstum des Mikroorganismus (erste Fermentationsstufe) mit einem Medium durchgeführt, das ein Ernährungselement umfasst, welches begrenzend ist (Stickstoff, Phosphor), während die Ausscheidung von Metaboliten in dem zweiten Reaktor durchgeführt wird, in den die Fermentationsmischung der ersten Stufe eingelassen wird. Man hat in wirklich unerwarteter Weise beobachtet, dass der unter diesen Erzeugungsbedingungen platzierte Stamm fortschreitend und schnell seine Ausscheidungseigenschaften verlor und dass die Produktivität viel niedriger als jene beim fed batch beobachtete war.
Es ist ebenfalls in Chem. Abstr. Vol. 122, Nr. 15, 10. April 1995, Nr. 185450 ein Fermentationsverfahren bezüglich der Erzeugung von Sophorolipiden, sogenannte "self cycling fermentation (SCF)" untersucht worden, bei dem am Ende eines Zeitraums, der der Wachstumszeit des Stammes entspricht, die Hälfte der erhaltenen Fermentationsmischung abgezogen wird, die man durch frisches Medium ersetzt (siehe J. Ferment. Bio Eng. 1995, 79(2), S. 146, Spalte 1, 1. 11 vor dem Ende, in Verbindung mit dem Chem. Abstr. Dokument).
Es ist bekannt die Zyklendauer nach der Wachstumsperiode des Stammes (Verdopplungszeit) von etwa 2 Stunden derart zu verlängern, dass jeder neue Zyklus 6 Stunden kaum überschreitet. So vorgehend erhält man sicher die Produktionskapazität des Stammes, aber die Produktion von Sophorolipiden ist sehr gering und deren Gewinnung ist daher schwierig, wenigstens deren Extrahieren durch Lösungsmittel, was das Verfahren verkompliziert und noch kostspieliger macht.
Andere Dokumente wie Chem. Abstr., Vol. 119, Nr. 3, 19. Juli 1993, Nr. 26744, die Patentanmeldung FR-A-2 670 798 und FR-A-2 692 593 beschreiben ein Herstellungsverfahren im fed batch von Sophorolipiden, welches einen Fermentationszyklus umfasst.
Schließlich betreffen die Patentanmeldungen DD-A-252 002 und DD-A-254 959 zyklische Fermentationsverfahren zur Erzeugung von Protein, Steroiden und Antibiotika durch Pilze und Bakterien, wobei diese Verfahren weder eine Herstellung von Glycolipiden beschreiben noch nahe legen, welcher sehr verschieden von den vorgenannten Produkten ausgehend von Hefen sind.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, die oben genannten Nachteile zu vermeiden. Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, die Produktivität des Systems unter Erhalt von den möglichst saubersten Sophorolipiden derart zu verbessern, dass eine Stufe zur Extraktion der erhaltenen Produkte durch Lösungsmittel vermieden wird. Ein anderes Ziel ist es, die Produktionsdauer von Sophorolipiden in den Fermentationsversuchen zu erhöhen, welche die Dauer von diskontinuierlichen Versuchen (im batch oder fed batch) überschreiten, d. h. mehr als 180 Stunden unter Sicherstellung erhöhter Produktivitäten.
Man hat ein Herstellungsverfahren von Sophorolipiden entdeckt, das es ermöglicht, die Herstellungsdauer und die Volumenproduktivität von Sophorolipiden zu verlängern. Dieses Verfahren setzt eine spezielle Hefekulturtechnik ein, die zyklische Fermentation (Moser A. 1985. Special cultivation techniques. In Biotechnology Vol. 2, Rehm HJ und Reed G (eds), S. 311-347).
Genauer betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Sophorolipidzusammensetzung, das die Fermentation in einer Reaktionszone unter aeroben Bedingungen von einem Candida bombicola- oder Candida-apicola-Stamm in einem Medium umfasst, das eine Stickstoffquelle und ein Substrat enthält. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es einen ersten Kultivierungs- bzw. Fermentationszyklus des Stammes und eine Herstellungsstufe einer Kultivierungsmischung bzw. Fermentationswürze, welche Sophorolipide enthält, mittels einer Substratversorgung des Stammes in der Reaktionszone umfasst. Das Verfahren ist im übrigen dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einmal die folgenden Stufen durchgeführt werden:
a) ein Teil der Fermentationsmischung wird abgezogen;
b) zu dem verbleibenden Teil der Mischung wird ein mineralisches stickstoffhaltiges Milieu zugegeben, um ein zweites Reaktionsmilieu bzw. -medium zu bilden;
c) ein neuer Fermentationszyklus wird ausgehend von dem zweiten Medium durchgeführt und eine andere Fermentationsmischung wird erzeugt.
Die Dauer dieser ersten und neuen Fermentationszyklen ist wenigstens 30 Stunden. Man gewinnt schließlich die Sophorolipide der Mischung der Stufen (a) und (c).
Es ist unter diesen Bedingungen bemerkt worden, dass die Produktivität der Kultivierung bzw. Fermentation unter Erhalt einer beträchtlichen Produktreinheit verbessert wurde, d. h. in Gegenwart einer substantiellen Fettsäuremenge, was daher keine spätere Fraktionierung erforderte, um sie zu entfernen.
Dieser Vorteil ist ebenso ausgeprägt wie, dass die Versorgung der neuen Fermentationszyklen kontinuierlich durchgeführt wird.
Man hat im übrigen einen beträchtlichen Gewinn für die Animpfungskette festgestellt, da man die Fermentationssequenz (Stufen (a) bis (c)) mehrmals, z. B. siebenmal wiederholen kann, ohne, dass die Produktivität an Sophorolipiden wesentlich beeinträchtigt wird.
Die Dauer jedes Fermentationszyklus wird im allgemeinen wenigstens 30 Stunden, vorzugsweise wenigstens 70 Stunden, z. B. 80 bis 130 Stunden sein, um einerseits es dem Stamm zu ermöglichen, sich ausreichend zu vervielfachen, und andererseits eine für eine gute Dekantierung ausreichende Sophorolipidakkumulierung zu ermöglichen.
Gemäß einem vorteilhaften Merkmal des Verfahrens kann man z. B. durch Dekantierung die erzeugte Fermentationsmischung trennen und eine von wenigstens einem Teil der Sophorolipide, auf dem die folgenden Stufen (a) bis (c) durchgeführt werden, befreite Fermentationsmischung gewinnen.
Man verbessert so die Reinheit der Produkte, d. h., dass die aus der Substrathydrolyse resultierende Fettsäuremenge derart ist, dass keine spätere Fraktionierung nötig ist, um sie zu entfernen.
Nach einem anderen Merkmal kann man, nachdem ein Teil der Mischung abgezogen worden ist, diesen abgezogenen Teil der Mischung durch eine im wesentlichen gleiche Menge mineralischen Milieus ersetzen.
Vorteilhaft kann man eine Menge der Mischung derart abziehen, dass wenigstens 5 Gew.-%, vorteilhaft 15 bis 45% und vorzugsweise 20 bis 40% der Mischung in der Reaktionszone verbleiben.
Nach einem anderen Merkmal des Verfahrens kann man jeden Fermentationszyklus unterbrechen, wenn sich die Produktivität an Sophorolipiden während dieses Zyklus vermindert. Vorzugsweise unterbricht man vor 140 Stunden Fermentation und spezieller nach einem Zeitraum zwischen 70 und 120 Stunden.
Man stoppt im allgemeinen den letzten Fermentationszyklus, d. h. die Fermentation wenn die über die ersten 24 Produktionsstunden dieses letzten Zyklus berechnete Produktivität an Sophorolipiden 70% der Produktivität des ersten berechneten Zyklus bei der gleichen Produktionsperiode erreicht.
Nach einem insbesondere vorteilhaften Merkmal der Erfindung, dass es ermöglicht die Gegenwart von Fettsäuren in der erhaltenen Mischung zu minimieren, kann man die Substratrestkonzentration in der Reaktionszone während jedes Fermentationszyklus auf einen Wert regeln, der 18 Gramm pro Liter anfänglichen Reaktionsvolumens nicht überschreitet, während man die Reaktionszone mit Substrat versorgt.
Es ist bei der Versorgung des Stammes, welche im wesentlichen kontinuierlich ist, bei einem Versorgungsdurchsatz zwischen 0,01 und 4 Gramm pro Stunde und pro Liter anfänglichen Reaktionsvolumens, wo man diese Restkonzentration an Substrat am besten regeln kann und die besten Ergebnisse bezüglich der Reinheit erhalten kann.
Eine diskontinuierliche Zufuhr durch kleine Zugaben, im allgemeinen unter 10 g/l ist dennoch nicht auszuschließen.
Das allgemein verwendete Substrat ist wenigstens ein tierisches Öl, wenigstens ein Pflanzenöl und/oder wenigstens ein Ester dieses Öls, wobei das Öl oder dieser Ester eine lineare aliphatische Kette von 10 bis 20 Kohlenstoffatomen einschließt.
Mit dem Stamm Candida bombicola CBS 6009 wurden hervorragende Ergebnisse bezüglich Wachstum und Sophorolipidproduktion erhalten. Das allgemein gewählte Kulturmedium sowie das bei der Stufe (b) geeignete mineralische Medium können einen Zucker, z. B. Glucose enthalten.
Die Erfindung wird im Hinblick auf die folgenden Beispiele besser verstanden:

BEISPIEL 1 (gemäß der Erfindung) Zyklische Kultur mit kontinuierlicher Zufuhr und ohne Dekantierung der Mischung.

Der Stamm C. bombicola CBS 6009 wird verwendet, um ein Kulturmedium anzuimpfen, das unabhängig von Glucose als Substrat vorgesehen ist. Das Substrat wird kontinuierlich vom Anfang der Kultur an zugegeben. Es handelt sich um den Ethylester von Raps.
Die Zusammensetzung des verwendeten Kulturmediums ist die folgende:
Glucose 100 g·l&supmin;¹
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 4 g·l&supmin;¹
KH&sub2;PO&sub4; 1 g·l&supmin;¹
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,5 g·l&supmin;¹
Getrocknete Macerierungsflüssigkeit von Mais 5 g·l&supmin;¹
Glucose und MgSO&sub4;, 7H&sub2;O werden in einem Laborfermentor von 4 Litern Kapazität in Lösung in 1620 ml Wasser sterilisiert, während KH&sub2;PO&sub4;, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; und getrocknete Macerierungsflüssigkeit von Mais getrennt in einem Erlenmeyer-Kolben in Lösung in 180 ml Wasser sterilisiert werden. Die Sterilisierung dieser beiden Lösungen wird im Autoklaven bei der Temperatur von 120ºC in 30 Minuten durchgeführt und das Kulturmilieu wird nach Abkühlung der beiden Lösungen rekonstituiert. Es wird mit 200 ml einer in einem Fernbach-Kolben hergestellten Vorkultur mit dem gleichen Medium wie dem Fermentationsmedium angeimpft, aber versetzt mit 10 ml Ethylester von Raps. Dieser Kolben wird durch etwa 1 g einer Gefrierprobe des Stammes C. bombicola angeimpft. Sie wird unter Schütteln bei der Temperatur von 25ºC inkubiert. Sie liefert nach 24 Stunden die Fermentorvorkultur.
Die Produktionsfermentation wird in einem Fermentor von vier Litern Kapazität auf einem Anfangsreaktionsvolumen von zwei Litern durchgeführt. Das Rühren des Milieus wird mit einer RAYNERI-Turbine (hinterlegte Marke) erhalten, deren Rotationsgeschwindigkeit 1000 Umdrehungen pro Minute ist. Die Belüftung wird bei 0,5 Vol/Vol/Minute Luft unter Atmosphärendruck festgelegt. Nach Autoacidifizierung des Kulturmediums wird der pH bei einem konstanten Wert von 3,5 dank einer 4N Sodalösung gehalten.
Bei der Fermentation fährt man mit täglichen Glucosezugaben in einer Rate von 100 g in fester Form zu Zeiten von 24, 48 und 72 Stunden fort. Die Versorgung an Rapsethylester wird vom Anfang der Kultur an mit einer peristaltischen Pumpe durchgeführt, deren Versorgungsgeschwindigkeit auf 2,1 g pro Stunde festgelegt wird. Man verfolgt durch Probenentnahmen die Sophorolipidproduktion, was man durch das Göbbert et al. Verfahren dosiert (Biotechnol. Lett. 1984, 6. 225-230). Die Herstellung, welche nach der Wachstumsphase beginnt, wächst mit Zugabe des Rapsethylesters an. Nach 96 Stunden Kultur zieht man einen Teil der fermentierten Mischung derart ab, dass lediglich ein Liter der Mischung in dem Fermentor belassen wird. Man vervollständigt diese auf zwei Liter mit einem Liter frischen Medium, das Glucose bei einer Konzentration von 100 g·l&supmin;¹ enthält. Man verwirklicht einen zweiten Fermentationszyklus mit einer Dauer von 96 Stunden bei demselben Rapsesterdurchsatz. Man führt dann den gleichen Vorgang des Abziehens und des Auffüllens bis zum Ende des vorgenannten Zyklus durch. Man verwirklicht so insgesamt sieben Fermentationszyklen von 96 Stunden. Man hat daher zu der Kultur 500 g Glucose zum ersten Zyklus und 400 g zu jedem der folgenden Zyklen geliefert. Die Rapsethylesterzufuhr liegt bei 201,6 g für jeden Zyklus.
Die Sophorolipide werden ausgehend von verschiedenen Entnahmen gewonnen, die an jedem Zyklusende durchgeführt werden, sowie auf der Endentnahme, bestehend aus der Gesamtheit der Endfermentationssmischung. Über jede Entnahme lässt man die Sophorolipide in einer Stunde dekantieren und man gewinnt sie. Man bringt sie unter einem Rühren mit 1,5 Liter destilliertem Wasser bei einer Temperatur von 45ºC wieder in Suspension und man lässt sie erneut in vier Stunden dekantieren. Man führt ein zweites Waschen bei 45ºC unter Bedingungen durch die identisch zu dem ersten sind. Man gewinnt so aus dem zweiten Waschen eine Probe von hydratisierten Sophorolipiden, von der man den Wassergehalt durch die Karl-Fisher-Methode, dem Sophorolipidanhydridgehalt durch die Methode von Göbbert et al. (Biotechnol. Lett. 1984, 6, 225-230) und den Gehalt an Fettsäuren durch die Methode von Davila et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992, 38, 6-11) misst. Die Fettsäuren bilden daher die Hauptverunreinigung des Produkts. Man schließt aus diesen Messungen auf die Volumenproduktivitäten im Verhältnis zum Anfangsvolumen (2 l) und die Masseausbeuten im Verhältnis zu den beiden zugegebenen Kohlenstoffquellen, der Glucose und dem Rapsethylester (Tabelle 1). Tabelle 1: Leistungsfähigkeiten des Fermentationszyklus mit kontinuierlicher Esterzufuhr ohne Dekantierung des Produkts.
Dieses Beispiel zeigt, dass der Einsatz der Fermentation gemäß der Erfindung es ermöglicht, die Produktion von Sophorolipiden in wenigstens 672 Stunden Kultur aufrechtzuerhalten. Die mittlere Volumenproduktivität über die Versuchsdauer ist 1,38 g·l&supmin;¹·h&supmin;¹ und die mittlere Masseausbeute ist 0,43. Die Leistungsfähigkeiten des ersten Zyklus sind geringer als das Mittel aufgrund der Tatsache, dass die Wachstumszeit des Stammes dort länger ist; jene des Endzyklus sind im Gegenzug höher aufgrund der Tatsache, dass man die Gesamtheit des in dem Fermentor enthaltenen Gemischs gewinnt.

BEISPIEL 2 (vergleichend): Diskontinuierlich oder "fed batch" versorgte Kultur ohne Dekantierung des Produkts

Man kultiviert in der gleichen Fermentationsanlage den Stamm gemäß dem Modus einer diskontinuierlich versorgten Kultur. Die Versorgung mit Rapsester wird bei 2,1 g pro Stunde konstant gehalten. Man geht zu den täglichen Zugaben von Glucose von 100 g zu Zeiten von 24, 48, 72, 96, 120, 144 Stunden über. Nach 144 Stunden Kultur verlangsamt sich die Assimilationsgeschwindigkeit der Glucose fortschreitend, Man hält die Fermentation nach 192 Stunden an, da die Sophorolipidproduktion zum Erliegen gekommen ist. Die Leistungsfähigkeiten des Versuchs sind die folgenden (Tabelle 2): Tabelle 2: Leistungsfähigkeiten der diskontinuierlich versorgten (fed batch) Fermentation
Dieses Beispiel zeigt, dass die Kultur des Stamms gemäß dem diskontinuierlich versorgten oder "fed batch" Modus es nicht ermöglicht, die Sophorolipidexkretion oberhalb einer Kulturdauer, die im wesentlichen gleich 190 Stunden ist, aufrecht zu erhalten.

BEISPIEL 3 (vergleichend): Kontinuierliche Kultur im Mehrstufenchemostat

Man verwendet eine Anlage mit fünf in reihe arbeitenden Fermentoren. Der erste hat ein Nutzvolumen von 0,44 Liter, während die anderen vier ein Nutzvolumen von 2 Liter haben. Man versorgt den ersten mit Rapsethylester im Verhältnis von 2,1 g pro Stunde. Man pflanzt den Stamm in dem ersten Reaktor in 24 Stunden (Wachstumsdauer) fort, dann setzt man die kontinuierliche Mehrstufenkultur an, in dem man den ersten Reaktor mit einem Fluss von frischen Medium (bei 100 g·l&supmin;¹ Glucose) von 44 ml·h&supmin;¹ versorgt. Man gewinnt bei der Temperatur von 4ºC in Zeiträumen von 96 Stunden die aus dem letzten Fermentor austretende Mischung. Die Leistungsfähigkeiten des Versuchs im Mehrstufenchemostat sind in der Tabelle 3 angezeigt. Tabelle 3: Leistungsfähigkeiten der kontinuierlichen Kultur im Mehrstufenchemostat
Dieses Beispiel zeigt, dass, wenn man den Stamm kontinuierlich gemäß dem Chemostatmodus kultiviert, jener sich in dem Kulturmedium hält aber fortschreitend seine Sophorolipidexkretionsfähigkeit verliert.

BEISPIEL 4: Zyklische Kultur mit diskontinuierlicher Versorgung und ohne Dekantierung des Produkts

Man wiederholt das Beispiel 1, indem man die kontinuierliche Rapsesterzugabe durch punktuelle Esterzugaben am Anfang jedes Zyklus von gleich 201,6 g ersetzt. Die Leistungsfähigkeiten dieses Versuchs sind in der Tabelle 4 zusammengestellt. Tabelle 4: Leistungsfähigkeiten der zyklischen Fermentation mit diskontinuierlicher Versorgung an Ester und ohne Dekantierung des Produkts.
Dieses Beispiel zeigt, dass die zyklische Kultur mit diskontinuierlicher Versorgung an Rapsethylester mehr Sophorolipide erzeugt als bei fed batch aber weniger Sophorolipide als bei zyklischer Kultur mit kontinuierlicher Versorgung und ohne Dekantierung des Produkts. Darüber hinaus schließen die gewonnenen Sophorolipide mehr Verunreinigungen ein als im Fall der zyklischen Kultur mit kontinuierlicher Rapsesterversorgung.

BEISPIEL 5: (gemäß der Erfindung) Zyklische Kultur mit kontinuierlicher Versorgung und Dekantierung der Sophorolipide

Man wiederholt das Beispiel 1, in den man jeden Zyklus folgendermaßen modifiziert:
Bevor man zur Gewinnung der Fermentationsmischung übergeht, lässt man in einer oder zwei Minuten diese dekantieren. Dann gewinnt man die Gesamtheit der dekantierten Sophorolipide und einen Teil der Fermentationsmischung derart, dass in dem Fermentor lediglich ein Liter von Sophorolipiden befreiter Mischung gelassen wird. Die Ergebnisse des Versuchs sind in der Tabelle 5 zusammengestellt. Tabelle 5: Leistungsfähigkeiten bei der zyklischen Fermentation mit kontinuierlicher Esterversorgung mit Dekantierung des Produkts
Dieses Beispiel zeigt, dass gemäß der Erfindung der Einsatz einer Dekantierung der Sophorolipide und deren Gewinnung am Ende jedes Zyklus es ermöglicht, ein kaum durch Fettsäuren kontaminiertes Produkt zu erhalten. Die Produktivität und die Ausbeute der durchgeführten Fermentation sind unter diesen Bedingungen höher als im Fall der zyklischen Kultur mit kontinuierlicher Versorgung ohne Dekantierung des Produkts.

BEISPIEL 6: Zyklische Kultur mit diskontinuierlicher Versorgung und Dekantierung der Sophorolipide

Man wiederholt das Beispiel 4, indem man am Ende jedes Dekantierungszyklus zur Dekantierung und zur Gewinnung der erzeugten Sophorolipide übergeht. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der Tabelle 6 angezeigt. Tabelle 6: Leistungsfähigkeiten der zyklischen Fermentation mit diskontinuierlicher Esterversorgung und mit Dekantierung des Produkts
Dieses Beispiel zeigt, dass die Produktivität und die Ausbeute der zyklischen Fermentation mit diskontinuierlicher Versorgung und Dekantierung der Sophorolipide erhöht sind. Die Reinheit der Sophorolipide ist hingegen weniger gut, was aufeinanderfolgende Extraktionen durch Lösungsmittel, vorzugsweise warm, erfordert, um ein Reinheitsniveau zu erreichen, das vergleichbar von jedem des Produkts des Beispiels 5 ist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung von Sophorolipiden, das die Fermentation eines Candida ombicola- oder Candida-apicola-Stammes in einer Reaktionszone unter aeroben Kulturbedingungen in einem Medium umfasst, das eine Stickstoffquelle und ein Substrat enthält, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen ersten Fermentationszyklus umfasst, der eine Wachstumsstufe des Stammes und eine Stufe der Herstellung einer Sophorolipide enthaltenden Fermentationsmischung mittels einer Substratversorgung des Stammes in einer Reaktionszone umfasst, wobei das Verfahren im übrigen dadurch gekennzeichnet ist, dass wenigstens einmal die folgenden Stufen durchgeführt werden:

a. ein Teil der Fermentationsmischung wird abgezogen;

b. zu dem verbleibenden Teil der Mischung wird ein mineralisches stickstoffhaltiges Medium gegeben, um ein zweites Medium zu bilden;

c. ein neuer Fermentationszyklus wird ausgehend von dem zweiten Medium durchgeführt und eine andere Fermentationsmischung wird erzeugt;

wobei die Dauer der ersten und neuen Fermentationszyklen wenigstens 30 Stunden, vorzugsweise wenigstens 70 Stunden beträgt, wobei das Verfahren zusätzlich dadurch gekennzeichnet ist, dass die Sophorolipide der Mischung der Stufen (a) und (c) gewonnen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die erzeugte Fermentationsmischung getrennt wird und eine wenigstens teilweise von den Sophorolipiden befreite Fermentationsmischung gewonnen wird, auf der die Stufen (a) bis (c) durchgeführt werden.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem zu dem verbleibenden Teil der Mischung mineralisches Medium in einer Menge zugegeben wird, die im wesentlichen gleich der entnommenen Menge ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem eine Menge an Mischung derart abgezogen wird, dass wenigstens 5 Gew.-% und vorzugsweise 20 bis 40% der Mischung in der Reaktionszone verbleiben.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem jeder Fermentationszyklus unterbrochen wird, wenn die Produktivität an Sophorolipiden während des Zyklus abnimmt, und vorzugsweise vor 140 Stunden Fermentation und insbesondere nach einem Zeitraum zwischen 70 und 120 Stunden unterbrochen wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem der letzte Fermentationszyklus gestoppt wird, wenn die über die ersten 24 Produktionsstunden errechnete Produktivität an Sophorolipiden dieses letzten Zyklus 70% der Produktivität des ersten im gleichen Produktionszeitraum berechneten Zyklus erreicht.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die Restkonzentration an Substrat in der Reaktionszone während jedes Fermentationszyklus bei einem Wert, der 18 Gramm pro Liter anfänglichen Reaktionsvolumens nicht überschreitet, beibehalten wird während die Reaktionszone mit Substrat versorgt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das im allgemeinen verwendete Substrat wenigstens ein tierisches Öl, wenigstens ein pflanzliches Öl und/oder wenigstens ein Ester dieses Öles ist, wobei das Öl oder der Ester eine lineare aliphatische Kette von 10 bis 24 Kohlenstoffatomen enthält.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem das mineralische Medium der Stufe (b) und das Kulturmedium Zucker enthalten.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem der Candidabombicola-Stamm CBS 6009 ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem man den Stamm in im wesentlichen kontinuierlicher Weise bei einem Versorgungsdurchsatz zwischen 0,01 und 4 g pro Stunde und pro Liter anfänglichen Reaktionsvolumens mit Substrat versorgt.