DE1961983C - Substrat fur die Bestimmung der Lipase Aktivität und Verfahren zur Her stellung des Substrats - Google Patents
Substrat fur die Bestimmung der Lipase Aktivität und Verfahren zur Her stellung des SubstratsInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Substrat zur Bestimmung
der Lipase-Aktivität, bestehend aus schutzkollo;'-haltigem
Olivenöl, sowie ein Verfahren zur Herstellung
dieses Substrats.
Das Enzym Lipase spaltet Fette in Fettsäuren un-:
Diglyzeride:
CH2O-CO-R
CHO-CO-R + H„O
CH2O — CO — R
e^ CH _ O —COR + RCOOH
CH2- O — COR
Die Diglyzeride werden weiter abgebaut zu Monoglyzeriden
und schließlich zu Glyzerin.
In der klinischen und pharmazeutischen Chemie, der Biochemie und der Lebensmittelchemie ist die Lipasebestimmung
von Interesse. Bekannt ist hierfür ein Verfahren, bei welchem die aus Fetten freigesetzten
Fettsäuren titriert werden. Hierbei wird zuerst Olivenöl mit einer Gummiarabicum-Lösung emulgiert und die
Emulsion mit einer Natrium-desoxycholat-Lösung vermischt. Die erhaltene Mischung wird mit Natronlauge
bekannter Konzentration auf pH 9 eingestellt. Nach Zusatz einer Lipaseprobe wird weitere Natronlauge
zudosiert, so daß der pH-Wert auf 9 gehalten wird. Aus der in der Zeiteinheit verbrauchten NaOH-Menge
kann die Lipase-Aktivität errechnet werden, jjas Substrat Olivenöl bietet den Vorteil der Spezifität;
bei Verwendung wasserlöslicher Glyzerinester ist nämlich nicht zu unterscheiden, ob die hydrolytische
Spaltung durch Lipase oder durch Esterase bewirkt wird.
Ein wesentlicher Nachteil des bekannten Verfahrens liegt darin, daß die Ölemulsion nicht lange stabil bleibt
und deshalb stets frisch bereitet werden muß. Der Emulgiergrad ist außerdem abhängig von der Herstellungsmethode
und kann deshalb variieren. Da die gemessene Lipase-Aktivität jedoch vom Verteilungsgrad der Öltröpfchen in der Emulsion abhängt, ist eine
Standardisierung nur schwer zu erreichen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die beschriebenen Nachteile durch ein vorgefertigtes
Trockensubstrat, welches nach Mischen mit Wasser eine Substratemulsion ergibt, die unmittelbar zum Test
eingesetzt werden kann, beseitigt werden können.
Das erfindungsgemäße Substrat für die Bestimmung der Lipase-Aktivität, bestehend aus schutzkolloidhaitigem
Olivenöl, isi. dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat als eine bei Wasseizugabe eine Emulsion bildende
Festsubstanz ausgebildet ist, die aus 1 Volumteil Olivenöl und 0,3 Gewichtsteile organischer Schutzkolloide
besteht.
AIf organisches Schutzkolioid werden vorzugsweise Dextran, Mannit, Serumalbumin, Gummiarabicum
oder/und Polyvinylpyrrolidon verwendet. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn das Substrat Olivenöl und
Schutzkolloid im Volumen- zu Gewichtsverhältnis von etv/a 1: 1 enthält.
Das erfindungsgemäße Substrat kann in Form eines Pulvtrs, als Granulat oder tablettenartig gepreßt vorliegen.
Bei Einhaltung der angegebenen Grenzen zeichnet es sich dadurch aus, daß es beim Mischen mit
Wasser unmittelbar eine Emulsion bildet, deren Tröpfchengröße bei Einhaltung konstanter Bedingungen
allein von der Tröpfchengröße der zur Herstellung des Substrats verwendeten Olivenölemulsion bestimmt
wird.
Außer den angegebenen essentiellen Bestandteilen
Olivenöl und Schutzkolloidsubstanz enthält das erfindungsgemäße Substrat zweckmäßig noch Emulgator
oder/und Aktivator. Beispiele für geeignete Emulgatoren sind z. B. Taurocholat und Natriumdesoxycholat.
Als Aktivator eignet sich z. B. Natriumchlorid. Besonders bevorzugt enthält das erfindungsgemäße
Substrat als Schutzkolloid Gummiarabicum zusammen mit einer kleiner· Menge Serumalbunvn.
Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung des erllndungsgemäßen Substrats besteht aus 1 Volumteil
Olivenöl, 0,7 bis 1,2 Gewichtsteilen Gummiarabicum, 0.1 bis 0,2 Gewichtsteilen Natriumdesoxycholat, 0,01
bis 0,03 Gewichtsteilen Serumalbumin und 0,01 bis 0,03 Gewichtsteilen Natriumchlorid.
Es ist völlig überraschend, daß es möglich ist, aus Olivenöl und einem Schutzkolloid in den angegebenen
Verhältnissen eine Festsubstanz herzustellen, die ohne Veränderung lange Zt. !agerfähig isi und jederzeit
durch einfaches Zugeben von Wasser wieder zu einer Emulsion bestimmter Tröpfchengröße rekonstituiert
werden kanu.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des neuen Substrats zur Bestimmung der Lipase-Aktivität
besteht darin, daß Olivenöl, Schutzkolloid und gegebenenfalls Emulgator oder/und Aktivator in
Wasser emulgiert bzw. gelöst werden und die erhaltene Emulsion lyophilisiert wird. Vorzugsweise wird vor der
Lyophilisierung auf einen pH-Wert im Bereich von 8 bis 10 eingestellt.
Die Herstellung der Emulsion erfolgt zweckmäßig mittels Ultra; -hall oder durch mechanische Einwirkung.
Vorzugsweise wird auf -ine mittlere Tröpfchengröße
von veniger als 3/t emulgiert.
Das erfindungsgemäße Substr t schafft die Möglichkeit, die für die Lipasebestimmung benötigte Ölemulsion
jederzeit in der gewünschten Menge und im gewünschten Verteilungsgrad der Öltröpfchen herzustellen,
ohne daß jeweils die ölemulsion durch umständliches Emulgieren des Olivenöls frisch zubereitet
werden muß. Außerdem ermöglicht es eine Standardisierung der Bestimmung, was die Exaktheit und Reproduzierbarkeit
der Bestimmung wesentlich verbessert.
Außer zur Bestimmung der Lipase-Aktivitäl kann das erfindungsgemäße Substrat auch zur Herstellung
von Fettinfusionslösungen verwendet werden.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung weiter. Beispiel
I ml Olivenöl (neutralisiert mit 0,In NaOH;
3,3% v/v)
825 mg Gummiarabicum (2,75% w/v)
160 mg Natriumdesoxycholat (0,533% w/v)
2C mg Serumalbumin (0,067% w/v)
18,7 mg NaCI (0,062% w/v)
ίο werden mit Wasser auf 30 ml aufgefüllt.
160 mg Natriumdesoxycholat (0,533% w/v)
2C mg Serumalbumin (0,067% w/v)
18,7 mg NaCI (0,062% w/v)
ίο werden mit Wasser auf 30 ml aufgefüllt.
Nach Lösen von Gummiarabicum, Desoxycholat. Serumalbumin und Natriumchlorid wird die Mischung
mit Hilfe von Ultraschall homogenisiert, bis der mittlere Durchmesser der Fetttröpfchen etwa 2 μ. beträgt
(Meßmikrosk'jp).
Die milchig aussehende Emulsion wird tiefgefroren und durch Gefriertrocknen entwässert, wobei ein
weißes Trockenpräparat entsteht. Die erhaltene Substratmenge reicht aus für eine Bestimmung im Makrotest
nach G. Marchis-Mouren, L. Sarda und P. Desnuellein Arch. Biochem. Biophys. 83,
S. 309 (1959) bzw. 150 Bestimmungen im Mikro.est nach V.P. D ο I e, J. of clinical Investigation 35, S. 150
bis 154 (1956).
Zur Ausführung einer Lipasebestimmung wird das obige Substrat mit 30 ml Wasser versetzt, kurz aufgeschüttelt
oder mit dem Magnetrührer gerührt und ist dann gebrauchsfertig. Die Fetttröpfchen im rekonstituierten
Reagens haben zu 90% eine Größe von 3 μ. Versuche haben gezeigt, daß an Stelle von Gummiarabicum
auch andere Schutzkolloide wie verschiedene Dextransorten (z. B. T 70, T 20, T 250), Mannit,
Serumalbumin, Polyvinylpyrrolidon verwendet werden ' können.
Emulgator, Serumalbumin und Aktivator können auch weggelassen werden. Di-; Tröpfchengröße ist in
diesem Falle jedoch nach der Rekonstitution nicht so fein wie in der beschriebenen Ausführungsform.
Bei einer Abänderung des oben beschriebenen Verfahrens wird die Emulsion vor dem Gefriertrocknen
durch Zugabe von Lauge, vorzugsweise Natronlauge, auf einen pH-Wert zwischen 8 und 10, vorzugsweise
von etwa 9, eingestellt.
Claims (12)
1. Substrat für die Bestimmung der Lipase-Aktivität,
bestehend aus schutzkolloidhalugem Olivenöl, dadurch gekennzeichnet,
daß das Substrat als eine bei Wasserzugabe eine Emulsion bildende Festsubstanz ausgebildet ist, die
aus 1 Volumteil Olivenöl und 0,3 Gewichtsteile organischer Schutzkolloid besteht.
2. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Schutzkolloid Dextran, Mannit,
Serumalbumin, Gummiarabicum oder/und Polyvinylpyrrolidon enthält.
3. Substrat nach Anspruch 1 oder 2. dadurch gekennzeichnet, daß es Olivenöl und Schutzkolloid
im Gewichtsverhältnis von etwa 1 : 1 enthält.
4. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen
Emulgator enthält.
5. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als
Schutzkolloid Gummiarabicum und eine kleine Menge Serumalbumin enthält.
6. Substrat nach einem der vorhergehenden An-Sprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Aktivator enthält.
7. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es aus
1 Volumteil Olivenöl, 0,7 bis 1,2 Gewichtsteilen Gummiarabicum, 0,1 bis 0.2 Gewichtsteilen Natriumdesoxycholat,
0,01 bis 0,03 Gewichlsteilen Serumalbumin und 0,01 bis 0,03 Gewichtsteilen Natriumchlorid besteht.
8. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form
von Pulver oder Tabletten vorliegt.
9. Verfahren zur Herstellung des Substrats nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet. d:iß
Olivenöl, Schutzkolloid und gegebenenfalls Emulgator und Aktivator in Wasser emulgiert bzw. ^-
löst werden und die Emulsion lyophilisiert wir-J.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß vor der Lyophilisierung auf ein ·:ι
pH-Wert im Bereich von 8 bis 10 gestellt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadur.
gekennzeichnet, daß mit Ultraschall oder mech.-.-nisch
emulgiert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9 bis 11, dadu ■·-.·;-.
gekennzeichnet, daß auf eine mittlere Tröpfchen:- größe von weniger als 3 μ emulgiert wird.
Priority Applications (9)
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|---|---|---|---|
| DE19691961983 DE1961983C (de) | 1969-12-10 | Substrat fur die Bestimmung der Lipase Aktivität und Verfahren zur Her stellung des Substrats | |
| ZA707714A ZA707714B (en) | 1969-12-10 | 1970-11-16 | Reagent for the determination of lipase activity |
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| IL35789A IL35789A (en) | 1969-12-10 | 1970-12-03 | Reagent for the determination of lipase activities and process for the preparation thereof |
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Publications (3)
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|---|---|
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| DE1961983B2 DE1961983B2 (de) | 1972-08-31 |
| DE1961983C true DE1961983C (de) | 1973-04-05 |
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