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DE1961983A1 - Reagens zur Bestimmung der Lipase-Aktivitaet - Google Patents

Reagens zur Bestimmung der Lipase-Aktivitaet

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DE1961983A1
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Germany
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reagent
olive oil
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protective colloid
reagent according
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DE19691961983
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DE1961983C (de
DE1961983B2 (de
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Alexander Dr Rer Nat Hagen
Gerhard Dr Rer Nat Michal
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Roche Diagnostics GmbH
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Boehringer Mannheim GmbH
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Publication of DE1961983C publication Critical patent/DE1961983C/de
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/16—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using titration

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  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Weickmann, I "61983
Dipl.-Ing. H..Weickmann, D1PL.-PHYS. Dr. K. Fincke Dipl.-Inc. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
8 MÜNCHEN S6, DEN HZW POSTFACH 860 820
int. Nr. 1659 möhlstrasse 22, rufnummer 433921/22
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH., Mannheim
Reagens zur Bestimmung der Lipase-Aktivität
Die Erfindung betriffx ein Reagens zur Bestimmung der Mpase-Aktivität sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Reagens.
Das Enzym Idpase spaltet Fette in Fettsäuren und Diglysoride: CH9O-CC-R CH0OH
OH 0-CO-R + H2O ü±üS2ä* CH-O-COR + RCOOH CH2O-CO-R CH2-O-COS
Die Diglyzeride werden weiter abgebaut zu Monoglyzeriden und schließlich zu Glyzerin.
In der klinischen und pharmaseutisehen Chemie, der Biochemie und der Lebensmittelchemie ist die Lipasebestimmiing von Interet^e. Bekannt ist hierfür ein Verfahren, bei welchem die aus Fetten freigesetzten fettsäuren titriert werden. Hierboi v/ird zuerst Olivenöl iuit einer G^mmiarabicum-Löaung emulgisrt xma. die Emulsion min; einer Natriiim-desoxycholat-Lösunn; ■"■ß.rm:'schfc. Die einhalten β Ilicchung v/ivci mit Hatronlaußs bekainitor Konzentration auf ρίί 9 eingestellt. Nach Znsata einer Liipasefn obe wird v/ettore Uai.con.1 auge k,adosiert, so daß der pH-Wert nut 9
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gehalten wird. Aus der in der Zeiteinheit verbrauchten ITaOH-Menge kann die Lipase-Aktivität errechnet werden. Das Substrat Olivenöl bietet den Vorteil der Spezifität; bei Verwendung wasserlöslicher Glyzerinester ist nämlich nicht zu unterscheiden, ob die hydrolytische Spaltung durch Lipase oder durch »
Esterasen bewirkt wird.
Ein wesentlicher Nachteil des bekannten Verfahrens liegt darin, daß die Ölemulsion nicht lange stabil bleibt und deshalb stets frisch bereitet werden muß. Der Emulgiergrad ist außerdem abhängig von der Herstellungsmethode und kann deshalb variieren. Da die gemessene Lipase-Aktivität jedoch vom Verteilungsgrad der Öltröpfchen in der Emulsion abhängt, ist eine Standardisierung nur schwer zu erreichen.
Die beschriebenen Nachteile werden erfindungsgemäß beseitigt durch die Schaffung eines vorgefertigten Trockenreagens, welches nach Mischen mit Wasser eine Substra+emulsion ergibt, die unmittelbar zum Test eingesetzt werden kann.
Das erfindungsgemäße Reagens zur Bestimmung der Lipase unter Verwendung von Olivenöl als Substrat ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Pestsubstanz, die Olivenöl und mindestens 0,3 Gew.-Teile, bezogen auf 1 Vol.-Teil Olivenöl, eines organischen Schutzkolloids enthält, welche bei Wasserzugabe eine Emulsion bildet.
Als organisches Schutzkolloid werden vorzugsweise Dextran, Mannit, Serumalbumin , Gummiarabicum oder/und Polyvinylpyrrolidon verwendet. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn das Reagens Olivenöl und Schutzkolloid im Volumen-zu Gewichtsverhältnis von etwa 1:1 enthält.
Das erfindungsgemäße Reagens kann in Form eines Pulvers, a.ls . Granulat oder tablettenartig gepreßt vorliegen. Bei Einhaltung der angegebenen Grenzen zeichnet es sich dadurch aus, daß es
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ORIGINAL
beim Mischen mit Wasser unmittelbar eine Emulsion bildet, deren Tröpfchengröße bei Einhaltung konstanter Bedingungen allein von der Tröpfchengröße der zur Herstellung des Reagens verwendeten Olivenölemulsion bestimmt wird.
Außer den angegebenen essentiellen Bestandteilen Olivenöl und Schutzkolloidsubstanz enthält das erfindungsgemäße Reagens zweckmäßig noch Emulgator oder/und Aktivator. Beispiele für geeignete Emulgatoren sind z.B. Taurocholat und Natriumdesoxycholat. Als Aktivator eignet sich z.B. Natriumchlorid. Besonders bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Reagens als Schutzkolloid Gummiarabicum zusammen mit einer kleinen Menge .Serumalbumin
Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Reagens besteht aus 1 Vol.-Teil Olivenöl, 0,7 bis 1,2 Gew.-Teilen Gummiarabicum, 0,1 bis 0,2 Gew.-Teilen Natriumdesoxycholat, 0,01 bis 0,03 Gew.-Teilen Serumalbumin and 0,01 bis 0,03 Gew,-Teilen Natriumchlorid.
Es ist völlig überraschend, daß es möglich ist, aus Olivenöl und einem Schutzkolloid in den angegebenen Verhältnissen eine Eestsubstanz herzustellen, die ohne Veränderung lange Zeit lagerfähig ist und jederzeit durch einfaches Zugeben von Wasser wieder zu einer Emulsion bestimmter Tröpfchengröße rekonstituiert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des neuen Reagens zur Bestimmung der Lipase besteht darin, daß Olivenöl, Schutzkolloid und gegebenenfalls Emulgator oder/und Aktivator in Wasser emulgiert bzw. gelöst werden und die erhaltene Emulsion lyophilisiert wird. Vorzugsweise wird vor der Lyophilisierung auf einen pH-7/ert im Bereich von 8 bis 10 eingestellt.
Die Herstellung dör Emulsion erfolgt zweckmäßig mittels Ultraschall oder durch mechanische Einwirkung. Vorzugsweise wird auf
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•»AD OHtGlNAL
Pr-
eine mittlere Tröpfchengröße von weniger als 3 μ emulgiert.
Das erfindungsgemäße Reagens schafft die Möglichkeit, die für die Lipasebestimmung benötigte Ölemulsion jederzeit in der ge--: wünschten Menge und im gewünschten Verteilungsgrad der öltröpfchen herzustellen, ohne daß jeweils die Ölemulsion durch ■umständliches Emulgieren des Olivenöls frisch zubereitet werden muß. Außerdem ermöglicht es eine Standardisierung der Bestim-; mung, was die Exaktheit und Reproduzierbarkeit der Bestimmung wesentlich verbessert. ' . ·
Außer zur Bestimmung der Lipase-Aktivität kann das erfin- ' dungsgemäße Reagens auch zur Herstellung von Fettinfusionslösungen verwendet werden.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung weiter. Beispiel
1 ml Olivenöl (neutralisiert mit O,1n NaOH; 3,~~3 ?° v/v)
825 mg Gummiarabicum (2,75 $> w/v)
160 mg Natriumdesoxycholat (0,533 % w/v)
20 mg 'Serumalbumin (0,067 # w/v) 18,7 mg ITaCl (0,062 # w/v) ;
werden mit Wasser auf 30 ml aufgefüllt.
Nach lösen von Guramiarabicum, Desoxycholat, Serumalbumin und Natriumchlorid \νχτ& die Mischung mit Hilfe von Ultraschall homogenisiert, bis der mittlere Durchmesser der JPetttröpfchen etwa 2 μ beträgt (Meßmikroskop).
Die milchig aussehende Emulsion wird tiefgefroren und durch Gefriertrocknen entwäsüert, wobei ein woißes Troc.'cenpräparat entsteht. Die erhaltene Reagenar.enge reicht aus für eine Bestimmung im Makrotest nach G.MarcJiis-Mnuron, L.Sarda und
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BAD ORIGINAL
P.Desnuelle in Arch. Biochem. Biophys. 83, 309 (1959) bzw. 150 Bestimmungen im Mikrotest nach Y.P.Dole, J. of clinical Investigation ,35, 150 bis 154 (1956).
Zur Ausführung einer LipasebeStimmung wird das obige Reagens mit 30 ml Wasser versetzt, kurz aufgeschüttelt oder mit dem Magnetrührer gerührt und ist dann gebrauchsfertig. Die Petttröpfchen im rekonstituierten Reagens haben zu 90 $ eine Größe von 3 μ.
Versuche haben gezeigt, daß anstelle von Gummiarabicum auch andere Schutzkolloide wie verschiedene Dextransorten (z.B. T 70, T 20, T 25Ο), Mannit, Serumalbumin , Polyvinylpyrrolidon verwendet werden können.
Emulgator, Serumalbumin und Aktivator können auch weggelassen werden. Die Tröpfchengröße ist in diesem Falle jedoch nach der Rekonstitution nicht so fein wie in der beschriebenen Ausführungsform.
Bei einer Abänderung des oben beschriebenen Verfahrens wird die Emulsion vor dem Gefriertrocknen durch Zugabe von Lauge, vorzugsweise Natronlauge, auf einen pH-Wert zwischen 8 und 10, vorzugsweise von etwa 9, eingestellt.
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Claims (12)

  1. Patentansprüche
    Reagens zur Bestimmung der Lipase unter Verwendung von Olivenöl als»Substrat, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Pestsubstanz, die Olivenöl und mindestens 0,3 Gew.-Teile, bezogen auf 1 Vol.-Teil des Olivenöls, eines organischen ■Schutzkolloids enthält, welche bei Y/asserzugabe eine Emulsion bildet.
  2. 2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Schutzkolloid Dextran, Mannit, Serumalbumin , Gummiarabicum oder/und Polyvinylpyrrolidon enthält.
  3. 3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es Olivenöl und Schutzkolloid im Gewichtsverhältnis von etwa 1:1 enthält.
  4. 4. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3i dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Emulgator enthält.
  5. 5. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Schutzkolloid Gummiarabicum und eine kleine Menga Serumalbumin enthält.
  6. 6. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Aktivator anthält.
  7. 7. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es aus 1 Vol.-Teil Olivenöl, 0,7 bis 1,2 Gew.-Teilen Gummiarabicum, 0,1 bis 0,2 Gew.-Teilen Nabriumdesoxycholat, 0,01 bis 0,03 Gew.-Teilen Seruraalbumin und 0,01 bis 0,03 Gew.-Teilen Natriumchlorid besteht.
    BAD ORIGINAL 109829/067 7
  8. 8. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche in Form von Pulver oder Tablette.
  9. 9. Verfahren zur Herstellung des Reagens. ;näch Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Olivenöl, Schutzkolloid und gegebenenfalls Emulgator und Aktivator in Wasser emulgiert bzw. gelöst werden und die Emulsion lyophilisiert wird.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Lyophilisierung auf einen pH-Wert im Bereich von 8 bis 10 gestellt wird.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß mit Ultraschall oder mechanisch emulgiert wird.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß auf eine mittlere Tröpfchengröße von weniger als 3 μ emulgiert wird.
    109829/0677 ^^^0000^ copy
    bad or'ginal
DE19691961983 1969-12-10 1969-12-10 Substrat fur die Bestimmung der Lipase Aktivität und Verfahren zur Her stellung des Substrats Expired DE1961983C (de)

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IL35789A IL35789A (en) 1969-12-10 1970-12-03 Reagent for the determination of lipase activities and process for the preparation thereof
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GB5830370A GB1319411A (en) 1969-12-10 1970-12-08 Reagent for the determination of lipase activity
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