DE1959039A1 - Verfahren zur Gewinnung von Peruvosid - Google Patents

Description

E. M e r C k . 21. Noyember 1969

Aktiengesellschaft ■ * '
Darmstadt

Verfahren zur Gewinnung von Peruvosid

[ Peruvosid ist ein pflanzliches Glykosid, das insbesondere in der Apocynacee Thevetia peruviana (Pers.) IC. Schum. (Synonym: ■ ' ■

\ Thevetia neriifolia Juss.) enthalten ist«, Die Verbindung wurde

erstmals beschrieben in J. Sei. Industr, Research (India), 17 B, 331 (1958)· Peruvosid ist cardiotonisch wirksam (vgl. z. B. [ Arch, int, pharmacodyn. 7j6, 412 - 425 (i960)). Im Vergleich zu

anderen Ilerzglykosiden zeichnet sich Peruvosid insbesondere j durch die relativ geringe Beeinflussung der Herzfrequenz und des ! Reizbildungs- und Reizleitungssystems aus (vgl· E· Schorscher, ; S. Sommer, Α·Ι·Ν· Wild und A. Block "Untersuchungen über die ) Wirkung von Peruvosid" auf die Herzfunktionen im Tierversuch", Arzneimittelforschung 1968, Heft 12)· Es vereint in sich die Hauptvorzüge von Digitoxin und Strophanthin: Hohe Reserptionsquote und gleichzeitig hohe Abklingquote. Es ist leicht steuerbar, wirkungssicher und gut verträglich.

Zur Gewinnung des Peruvosids 'ist.bisher ein in dem indischen ' Patent 66 196 beschriebenes Verfahren bekannt geworden» Nach

• diesem Verfahren entfettet man zerkleinerte Samenkerne der f Thevetia peruviana in üblicher Weise, fermentiert anschließend, extrahiert das entstandene Glykosidgemisch und trennt hieraus das Peruvosid chromatographisch ab· ·

.- Ein wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß man ein entfettetes Samenkernpulver als Ausgangsmaterial verwenden muß. Schon zur Gewinnung dieses Ausgangsmaterials sind mehrere Arbeitsgänge erforderlich: die Samenkerne müssen aus* den Früchten isoliert, zerkleinert, zur gründlichen Entfettung mehrmals mit Petrolather extrahiert und wieder getrocknet werden·

109830/1609

Ferner ist nachteilig, daß dieses Verfahren nur eine geringe Ausbeute ·* etwa 0,4 #, bezogen auf das fettfreie Samenkernpulver . an Peruvosid liefert· Bezogen auf die Menge der Früchte der Thevetia peruviana, die dazu verarbeitet werden muß, beträgt die Ausbeute nur 0,03 - 0,04 #« Diese Ausbeuten an Peruvosid sind, wie aus Helvetica Chimica Acta, Band 45, Seiten 938 - 943 (1962) hervorgeht, nicht immer reproduzierbar«

Es wurde nun gefunden, daß Peruvosid bedeutend einfacher und in reproduzierbar besserer Ausbeute als bisher gewonnen werden kann, wenn man peruvosidhaltiges Pflanzenmaterial ohne vorhergehende Entfettung in den Fermentierungsprozeß einsetzt·

Gegenstand der Vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Gewinnung von Peruvosid durch Fermentierung von peruvosid— haltigem Pflanzenmaterial, Extraktion der gebildeten Glykoside aus dem fermentierten*Material und chromatographische Abtrennung des Peruvosids aus dem extrahierten Glykosidgemisch, dadurch gekennzeichnet, daß in den Fermentierungsprozeß nicht entfettetes peruvosidhaltiges Pflanzenmaterial, insbesondere Früchte und/oder Samenkerne der Apoeynacee Thevetia peruviana (Pers.) K. Schum«, eingesetzt werden· Ferner umfaßt der Gegenstand der vorliegenden Erfindung Peruvosid, das nach dem vorstehend definierten Verfahren gewonnen wurde.

Der einfache Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens und die mit diesem Verfahren erzielten relativ hohen Ausbeuten sind als überraschend anzusehen, da bisher bei der technischen wie auch bei der laboratoriumsmäßigen Gewinnung von Sekundärglykosiden aus Samen und Früchten das Pflanzenmaterial stets vor der Fermen— tierung entfettet werden mußte. (Vgl· z. B. Rangaswami und Rao, Ind. Pat. 66 196 (1958); Helfenberger und Reichstein, HeIv. ciiim· Acta, 31., 1470 (1948); Frärejaque und Hasenfratz, üoapt· Rend· ' 222. 642, 815 (1946)). Zwar lassen sich Drogen, die kein oder nur sehr wenig (insbesondere weniger als 5 fi) Fett enthalten,

109830/1609

ζ. Β· Blatter, Zweige oder Y/urzein, verständlicherweise, ohne vorherige.Entfettung zur Fermentierung einsetzen. Wie aus den ' oben angegebenen Literaturstellen zu ersehen ist, herrschte bisher jedoch die Ansicht, daß die Fermentierung der Glykoside in fetthaltigen Drogen, z. B· Samen oder Früchten, die bis zu 65 $> Fett enthalten, ohne vorhergehende Entfettung nicht oder doch nur sehr langsam angreifen würde. Es war demnach nicht vorauszusehen, daß die Fermentierung nach dem Verfahren zur Peruvosidgewinnung nach der vorliegenden Erfindung in nicht entfetteten Samen oder Früchten sogar besser verläuft als nach vorausgehender Entfettung entsprechend dem bekannten Verfahren·

Ein Hauptvorteil des Verfahrens nach der Erfindung besteht darin, daß die nach dem bekannten Verfahren erforderliche mehrfache Trocknung der Droge wegfällt· Abgesehen von dem hierdurch eingesparten Aufwand an Arbeitszeit und Trockenvorrichtungen wirkt sich diese Einsparung" im vorliegenden Fall besonders dadurch günstig aus, daß das oxydationsempfindliche Peruvosid nicht mehr über längere Zeit der Luft ausgesetzt wird· Hierdurch wird die Bildung von störenden Oxydationsprodukten, die bei der nachfolgenden chromatographischen Trennung die Aufarbeitung erschweren, weitgehend unterbunden· Außerdem braucht nach dem Verfahren der Erfindung das Ausgangsmaterial nur einmal zerkleinert zu werden, im Gegensatz zu dem vorbekannten Verfahren, bei dem mehrmals gemahlen werden muß. .

Ferner war bei dem alten Verfahren nachteilig, daß für die Entfettung eine größere Menge Petroläther erforderlich" war, die bei der Trocknung der entfetteten Droge verloren ging. Bei dem Verfahren nach der Erfindung ist demgegenüber nur eine geringere Menge Petroläther für eine gegebenenfalls nach der Fermentierung durchgeführte Entfettung erforderlich, wobei dieser Petroläther durch Regenerieren wieder zurückgewonnen werden kann·

109830/1609

Der gesamte Arbeitsprozeß wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren durch die im Ausgargsmaterial enthaltene Ölmenge viel weniger belastet als bei tiou vorbekannten Verfahren, da der weitaus größte Teil des Öls im Verfahren der vorliegenden Erfindung in der fermentierten Droge zurückbleibt und nach der Extraktion demnach ohne besondere Maßnahmen, von den Glykosiden abgetrennt ist·

Insgesamt bringt das neue Verfahren im Vergleich zu dem bekannten Verfahren eine erhebliche Einsparung an Arbeitszeit und Apparaturen unter gleichzeitiger Erhöhung der Ausbeute an reinem Peruvosid. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Peruvosid aus den Früchten der Thevetia peruviana in Ausbeuten von 0,1 0,12 # (bezogen auf die Menge der eingesetzten Früchte) erhalten. Die Ausbeute ist damit zwei- bis viermal so hoch wie die nach dem Verfahren des indischen Patents 66 196 erzielte Ausbeute·

Im einzelnen wird das neue Verfahren wie folgt durchgeführt:

Bevorzugtes Ausgangsmaterial für das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung sind die stark-fetthaltigen Früchte bzw. Samen von peruvosidhaltigen Pflanzen, insbesondere von Thevetia peruviana·

Das peruvosidhaltige, nicht entfettete Pflanzenmaterial wird zerkleinert, z. B. durch Vermählen, und anschließend in an sich bekannter Weise nach Zusatz von V/asser fermentiert». Für die Fermentation wird das Gemisch im allgemeinen bis zu mehreren Tagen, vorzugsweise etwa 5 Tage, bei 30 - 60°C, vorzugsweise bei 45 - So C, stehengelassen. Die in dem Ausgangsmaterial enthaltenen Enzyme spalten während dieser Zeit die Glukose aus den Priinärglykosiden vollständig ab« ZwookmUßjgerwoise wird da η Forineiitatjonsgemjsoli durch iiblicho ZmsHizc liefen SchimmelIiI !dung /ieräohütist. BeJapieisweißie lcami eim* inorte F3iifiK3,«rli«;j t, v.₍ B, ein iliUun^cr Kohlemvasfiorfitofi wie ¹J¹OJuOl, JyJn] oder '

-S-

siedender Petroläther, oder aber auch eine ausreichende Menge eines Konservierungsmittels wie p~Hydroxybenzoesäure-methylester zugesetzt werden. Insbeson lore wird Toluol zur Verhütung der Schimmelbildung angewandt.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden dem Fermentationsgemisch inerte Zusatzstoffe, die die Filtriereigenschaften des gesamten Gemisches verbessern und die selbst keine Extraktiv-. stoffe bei der auf die Fermentation folgenden Extraktion abgeben, zugesetzt. Beispielsweise kommen als inerte Zusatzstoffe lockere anorganische inerte Verbindungen, wie Asbest, Vermiculit oder entsprechende organische inerte Stoffe wie Getreidespreu, zerkleinertes Stroh oder gegebenenfalls auch Kunststoffe in sehr lockerer Form, z. B. Polystyrol, in Frage, Die Verwendung dieser lockeren Zusatzstoffe ist besonders bei Verwendung von Samen als Ausgangsmaterial empfehlenswert. Beispielsweise hat es sich als vorteilhaft erwiesen,"bei Verwendung von Samen der Thevetia peruviana als Ausgangsmaterial dem Fermentationsgemisch etwa 25 - 40 #, bei Verwendung von Früchten dieser Droge etwa 5 - 20 ^cjo lockere inerte Zusatzstoffe zuzusetzen. Bevorzugt wird als Zusatzstoff Getreidespreu verwendet.

Bei der vorstehend beschriebenen bevorzugt angewandten Ausführungsform wird die Fermentation durch die im Pflanzenmaterial schon enthaltenen Enzyme bewirkt. Zur Beschleunigung der Fermentation können dem Pflanzenmaterial gegebenenfalls auch glukoseabspaltende Enzyme, z. B. Cellulase oder Schneckenenzym, zugesetzt werden.

Anschließend an die Fermentation wird das erhaltene Gemisch zur Abtrennung der gebildeten Sekundärglykoside in Üblicher Weise mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert. Als Lösungsmittel sind vorzugsweise niedere Alkohole, z. B. Methanol, Aethanol oder Isopropanol, oder Aceton anzuwenden. Besonders bevorzugt sind als Extraktionsmittel Aoeton und Methanol wegen ihres niedrigen Siedepunktes· Beide Lösungsmittel können bei niedriger Temperatur, d. h. unter Bedingungen, die für die empfindlichen Glykoside

109830/1609

schonender sind, als das ia den bekannten Verfahren für die Extraktion verwendete Aetha.no 1 aus dem Gemisch wieder entfernt werden. Die Extraktion kam kontinuierlich, z. Ii. nach dem Gegenstromverfahren, oder diskontinuierlich durchgeführt werden. Bei diskontinuierlicher Extraktion sind die Glykoside aus dem Fermentationsgemisch im allgemeinen nach 6 -* 8 Auszügen vollständig abgetrennt. Für die weitere Aufarbeitung empfiehlt sich ein Ein« engen der Extrakte, vorzugsweise unter vermindertem Druck bei geeigneter Temperatur, z. B. bei Anwendung von Aceton oder Methanol bei ca. 30 - 40°G.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die eingeengten Extrakte durch Mischen mit einem unpolaren, organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. mit Petroläther oder Tetrachlorkohlenstoff, entfettet. Grundsätzlich sind für die Entfettung diejenigen Lösungsmittel geeignet, die Peruvosid nicht lösen, in denen jedoch Fette gut löslich sind.

Zur weiteren Isolierung der Glykoside wird der vorzugsweise eingeengte und vorzugsweise entfettete Extrakt des Glykosidgemisches anschließend mit einem polaren, ,mit V/asser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert. Vorzugsweise werden als Extraktionsmittel hierbei z. B. Essigester oder polare niedrige Chlorkohlenwasserstoffe wie Chloroform oder Dichlormethan verwendet» Besonders geeignet sind derartige Lösungsmittel mit niedrigerem Siedepunkt, z. B, mit Siedepunkt <8O°G. Bevorzugte Extraktionsmittel sind Essigester und Chloroform. Gegebenenfalls können auch Gemische der vorstehend genannten Lösungsmittel eingesetzt werden.

Das erhaltene Glykosidgemiseh wird zur Isolierung des Peruvosids in üblicher Weise chromatographisch getrennt. Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, die in der vorausgehenden Stufe enthaltenen Extrakte des Glykosidgemisches einzuengen» Danach kasan man diese eingeengte Glykosidlösung direkt jsur cferomatcgraphischen Trennung einsetzen. Man kann sie jedoch auch mit einem Fällungs-

109830/1609

mittel versetzen und das £;uf diese V/eise ausgefällte Glykosidgemisch anschließend der chroiuutographischen Auftrennung zuführen» Die Einengung der Extrakte tfird zweckmäßigerweise unter vermindertem Druck bei geeigneter Temperatur, z. B. bei 4=0 - 45 C, durchgeführt. Man kann beispielsweise auf l/lO - l/5O des ursprünglichen Volumens einengen. Der Extrakt kann vor der Konzentration in üblicher Weise getrocknet werden, z, B. mit Hilfe eines gebräuchlichen Trockenmittel, wie Calciumchlorid, Natriumsulfat oder Magnesiumsulfat. Die Trocknung ist jedoch nicht in allen Fällen erforderlich, da eventuell im Extrakt enthaltene geringe Wassermengen im allgemeinen beim Einengen des Extrakts zusammen mit dem Extraktionsmittel azeotrop abdestillieren. Das nach dem Einengen erhaltene Konzentrat wird dann zweckmäßigerweise unter Rühren, mit einer zur vollständigen Fällung ausreichenden, beispielsweise mit der etwa 2 - 5fachen Menge des Fällungsmittels versetzt· Als Fällungsmittel werden unpolare organische Lösungsmittel verwendet, in denen Peruvosid nicht löslich ist. Beispielsweise kommen hierfür Petroläther oder Tetrachlorkohlenstoff in Frage. Bevorzugtes Fällungsmittel ist Petroläther« Im allgemeinen ist die Fällung nach mehreren Stunden, beispielsweise nach etwa 10 - 20 Stunden, vollständig. Das nach der Fällung erhaltene Rohglykosidgemisch fällt, sofern von Früchten der Thevetia peruviana ausgegangen wurde, in einer Ausbeute von etwa 1 ^c,<>, sofern von den entsprechenden Samen ausgegangen \mrde, in einer Ausbeute von etwa 4 ^c/o, jeweils bezogen auf das nicht entfettete Pflanzenmaterial, an.

Der für die Fällung verwendete Petroläther kann gleichzeitig auch · als Entfettungsmittel dienen, ohne daß ein gesonderter Arbeitsgang für die Entfettung nach der Fermentation durchgeführt wird. Dies ist nur bei dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung möglich, da hier in dem nach der Fermentation erhaltenen Glykosidextrakt nur noch eine relativ geringe Menge Öl enthalten ist« Das Öl wird in diesem Fall bei der Fällung des Glykosidgemisches vor der im folgenden näher beschriebenen chromatographischen Abtrennung des Peruvosids vom Glykosidgemisch abgetrennt.

109830/1609

Die nachfolgende chromatograpliisehe Abtrennung des Rohglykosidgemisches.wird in üblicher Weise säulenchromatographisch durchgeführt, Als Sorptionsmitte* kommen die in der Chromatographie üblicherweise angewandten inerten Substanzen wie Aluminiumoxid, Kieselgur, Kieselgel, Magnesvamsilikate oder Calciumphosphate, in Frage· Bevorzugtes Sorptionsmittel ist Kieselgel·

Durch Anwendung geeigneter Lösungsinittelgeinische, beispielsweise der oben im einzelnen genannten polaren, nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, erzielt man eine Abtrennung des Peruvosids von den unerwünschten anderen Glykosiden, z. B· von Neriifolin· Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, für die chromatographische Auftrennung das gleiche Lösungsmittel zu verwenden, wie in der vorhergehenden 2. Stufe der Extraktion des Rohglykosid— gemisches, also vorzugsweise Essigester, Dichlormethan oder Chloroform. Wegen der besonderen Empfindlichkeit des Peruvosids gegen Oxydation wird"die chromatographische Auftrennung zweckmäßigerweise unter Inertgasatmosphäre, z. B. unter Stickstoff, durchgeführt·

Dabei geht man in an sich bekannter Weise so vor, daß man zunächst mit weniger polaren Lösungsmitteln oder Lösungsmitteige— . mischen die weniger polaren Begleitglykoside (Cerberin, Neriifolin, Acetylperuvosid) abtrennt und dann das Peruvosid mit einem stärker polaren Lösungsmittelgemisch eluiert·

Die reines Peruvosid enthaltenden Fraktionen werden zweckmäßigerweise unter Inertgasatmosphäre, vorzugsweise unter Stickstoff oder Kohlendioxid, bis zur Sirupkonsistenz eingeengt. Der Rückstand wird, vorteilhafterweise ebenfalls unter Inertgas, in üblicher Weise umkristallisiert.

Die folgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung·

1 09830/ 1 609

Beispiel 1

2 kg gemahlene Früchte von Thevetia peruviana werden mit iOO g Getreidespreu gemischt und uit 900 ml Wasser von ca, 6O⁰C angefeuchtet. Das Gemisch wird mit 20 ml Toluol versetzt und in einem verschlossenen Gefäß 5 Tage bei 45 - 55⁰C gehalten. Das so fermentierte Material wird sechsmal mit je 1200 ml Aceton extrahiert. Die Extrakte werden bei 30⁰C unter vermindertem Druck eingeengt, bis etwa 600 ml dunkelgefärbtes wäßriges Konzentrat zurückbleiben. Dieses wird mit der gleichen Volumenmenge Petroläther ausgeschüttelt. Die organische Phase wird nach Rückgewinnung des Petroläthers verworfen. Das so entfettete wäßrige Konzentrat wird sechs*- % mal mit je 500 ml Dichlormethan extrahiert· Die Dichlormethanphasen werden über Natriumsulfat getrocknet, vereinigt und auf ca* 100 ml eingeengt» Der Rückstand wird.in 250 ml Petroläther eingerührt. Das abgeschiedene Kristallisat wird nach Stehen über Nacht abgesaugt,
getrocknet.

abgesaugt, mit Petroläther gewaschen und im Vakuum bei ca. 40°C

Das erhaltene Rohglykosidgemisch (21 g) wird in Chloroform/ Methanol gelöst und über Kieselgel in üblicher Weise chromatographisch aufgetrennt. Man erhält nach Abtrennen von einer geringen Restmenge öl und Fett und von zusammen 15,5 g Cerberin, Acetylperuvosid und Neriifolin insgesamt 2,2 g reines Peruvosid· Fp. 160 - 163⁰C, fqj ²² - 70°. (C =1,3 in CH₃OH). Die erhaltene Menge Peruvosid entspricht einer Ausbeute von 0,11 fo, bezogen auf die eingesetzte Menge Früchte von Thevetia peruviana.

Beispiel 2

1 kg gemahlene Samenkerne von Thevetia peruviana werden mit 300 g Getreidespreu gemischt und mit 500 ml Wasser von 60⁰C angefeuchtet. Nach Zusatz von 10 ml Toluol bleibt das Gemisch in einem versohlossenen Gefäß 5 Tage lang bei 45 - 55⁰C stehen. Nach dieser

109830/1609

Zeit wird die feuchte Droge Ginal alt je 500 ml Methanol extrahiert. Di'e Extrakte werden, iia Vakuum bei ca, 3O°C so weit eingeengt.} bis noch ca_e 800 ml wäßriges Konzentrat vorhanden sind. Aus dieser wäßrigen Phase viertlet! die Glykoside ohne vorherige Entfettung mit dreimal je 300 ml und dreimal je 100 ml Chloroform extrahiert« Die Chloroform-Phasen werden im Vakuum bei ca. 40 C bis auf ca, 200 snl eingeengte Dieses Konzentrat versetzt man zur Fällung des Roh-Glykosidgemisclies mit 500 ml Petroläther. Nach Stellen über Nacht saugt man das abgeschiedene Kristallisat ab, wäscht es.mit Petroläther und trocknet es im Vakuum bei 40°G. Ausbeute an Eohglykosidi 46,9 g* Daraus erhält man nach üblicher chroEiatographischer Trennung 5,1 g reines Peruvosid vom Fp. 161 ~ 164°G. Das entspricht einer Ausbeute von 0,51 #, berechnet auf die nicht entfetteten Samenkerne der Thevetia peruviana.

109830/1609

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1· Verfahren zur Gewinnung von Peruvosid durch Fermentierung von peruvosidhaltigem Pflanzenmaterial, Extraktion des gebildeten Glykosidgemisches aus dem fermentierten Material und chromatographische Abtrennung des Peruvosids aus dem Glykosidgemisch, dadurch gekennzeichnet, daß in den Fermentierungsprozeß nicht entfettetes peruvosidhaltiges Pflanzenmaterial, insbesondere Früchte und/oder Samenkerne der Apocynacee Thevetia peruviana (Pers.) K* Schunu, eingesetzt werden*

   2· Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß zur Extraktion des nach der Fermentation des Pflanzenmaterials gebildeten Glykosidgemischs niedere Alkohole, insbesondere Methanol, oder Aceton verwendet werden.

   3· Verfahren nach Anspruch i und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der nach der Fermentation erhaltene, vorzugsweise eingeengte Extrakt des Glykosidgemischs durch Mischen mit einem unpolaren organischen, mit Wasser nicht' mischbaren Lösungsmittel, insbesondere mit Tetrachlorkohlenstoff oder Petroläther, entfettet wird. .

   '4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß der .nach der Fermentation erhaltene, vorzugsweise eingeengte und entfettete Extrakt des Glykosidgemischs zur weiteren Abtrennung der Glykoside mit einem polaren organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise mit polaren niederen Chlorkohlenwasserstoffen, insbesondere Dichlormethan oder Chloroform, extrahiert wird.

   109830/1609

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der erhaltene Extrakt des Glylcosidgemischs in dem polaren, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel eingeengt und mit einem Fällungsmittel, insbesondere mit Petroläther, gemischt wird.

   6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß das in dem isolierten Glykosidgemisch enthaltene Peruvosid unter Sauerstoffausschluß, Vorzugspreise unter S tickst off atmosphäre, chromatographisch, vorzugsweise an Kieselgel, getrennt und gegebenenfalls anschließend in üblicher Weise, vorzugsweise durch Umkristallisieren, weiter gereinigt wird«

   7. Peruvosid, hergestellt nach dem Verfahren der Ansprüche 1-6.

   109830/1609