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DE1617815C - Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin

Info

Publication number
DE1617815C
DE1617815C DE19671617815 DE1617815A DE1617815C DE 1617815 C DE1617815 C DE 1617815C DE 19671617815 DE19671617815 DE 19671617815 DE 1617815 A DE1617815 A DE 1617815A DE 1617815 C DE1617815 C DE 1617815C
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
brown
streptomyces
yellow
tetracycline
color
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE19671617815
Other languages
English (en)
Other versions
DE1617815A1 (de
Inventor
Riccardo; Canevazzi Graziana; Grein Arpad Dipl.-Landw.; Tintinelli Romano; Mailand Barchielli (Italien)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Italia SRL
Original Assignee
Farmaceutici Italia SpA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Farmaceutici Italia SpA filed Critical Farmaceutici Italia SpA
Publication of DE1617815A1 publication Critical patent/DE1617815A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE1617815C publication Critical patent/DE1617815C/de
Expired legal-status Critical Current

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Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin.
Das Antibiotikum Tetracyclin, dessen Herstellung und dessen chemische, physikalische und biologische Eigenschaften sind in der Literatur hinlänglich beschrieben (W a k s m a η S. Α., »The Actinomycetes«, Bd. Ill, 1962, S. 389).
Aus der deutschen Auslegeschrift 1 198 487 ist es bereits bekannt, Tetracyclin durch aerobe Züchtung einer Streptomycesart in einem Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält, herzustellen, wobei man die Züchtung zwischen 20 und 40° C innerhalb von 20 bis 200 Stunden bei einem pH-Wert zwischen 6 und 8 durchfuhrt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin durch Züchtung eines Stammes von Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 22 bis 35° C während eines Zeitraumes von 72 bis 168 Stunden bei einem pH-Wert von 6,0 bis 7,2 und Aufarbeitung des Reaktionsgemisches in üblicher Weise, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Stamm Streptomyces avellaneus IMI 126840 (IMRU 3911) verwendet.
Die Anwesenheit von Chlorionen im Fermentationsmedium beeinflußt das Verfahren nicht in der Weise, daß dabei Chlortetracyclin gebildet wird, auch sind die Ausbeuten an Tetracyclin hier höher als beim Verfahren der deutschen Auslegeschrift 1 198 487. Der neue Mikroorganismus, welcher Tetracyclin produziert, wurde aus einer Erdprobe aus Grotte di Caudano (Cuneo/Itauen) isoliert und zeigt folgende morphologische, kultur- und biochemische Eigenschaften :
Morphologische Eigenschaften
Das vegetative Mycel zeigt bei gewöhnlichen Kulturmedien Hyphen, die 0,9 bis 1,1 μ dick sind, mehr oder weniger lang und stark verzweigt. Aus diesen werden Hyphen gebildet, die dicker als 1,2 bis 1,5 μ sind und nicht sehr lang sind, gerade, im allgemeinen in fächerartigen Bündeln angeordnet, sympodisch verzweigt; in einem bestimmten Moment werden diese Konidien tragenden Hyphen zu Konidien mit glatter Oberfläche, die wie ein kleines Faß aussehen oder eine etwa zylindrische Form mit einem Durchmesser von 1,2 bis 1,5 χ 1,4 bis 1,7 μ besitzen. Zunächst sind diese
ίο Konidien in Ketten mit 5 bis 15 Einheiten pro Kette angeordnet, später trennen sie sich.
Kultur- und biochemische Eigenschaften
In Tabelle I sind die Kultureigenschaften mit den jeweiligen Medien angegeben, wobei der Mikroorganismus bei 28° C gezüchtet wurde und die Beobachtungen am 5., 15. und 25. Tag nach der
20: Beimpfung in Propierrohren und in Petrischalen durchgeführt wurden. .
Der Stamm wächst ziemlich langsam auf synthetischen oder organischen Agarkulturmedien und bildet auf synthetischen Medien ein vegetatives Mycel, das immer aus einer Patina besteht, die durch das Zusammenfließen von einzelnen, nicht sehr erhabenen Kolonien gebildet wurde, und das strohgelb bis gelborangebraun gefärbt ist. An den organischen Medien wird eine Patina gebildet, die durch das Zusammenfließen von ziemlich erhabenen, domartig geformten Kolonien gebildet wird, wobei die Farbe von Gelb bis ziemlich Dunkelkastanienbraun schwankt, gelegentlich mit einem rotbraunen Farbton. Das Luftmycel auf synthetischem Medium ist im allgemeinen spärlich oder überhaupt nicht vorhanden. Das Aussehen ist glatt, und die Farbe schwankt von Weiß bis Beige mit schwach kastanienbraunem Farbton.
Auf organischen Medien wächst im allgemeinen das Luftmycel ziemlich reichlich, mit einem glatten Aussehen und einer Farbe von Hellkastanienbraun bis Kastanienbraun.
Streptomyces avellaneus IMI 126840 (IMRU 3911) entwickelt sich nicht in Milch, und diese bleibt unverändert, der Stamm hydrolysiert Gelatine nicht, reduziert nicht Nitrate zu Nitriten, produziert keinen Schwefelwasserstoff, produziert keine Tyrosinase und auch nicht Melanin. Stärke wird gut hydrolysiert, Glukose wird verwertet, ebenso Saccharose und Maltose für das Wachstum, während 1-Arabinose, d-Xylose, Mescinosit, d-Mannose, d-Fructose, Rhamnose und Raffinose nicht verwertet werden.
Der Stamm bildet keine löslichen Pigmente, bildet keine Sclerotien in fester Kultur und wächst nicht bei 5O0C. In flüssiger Kultur, die belüftet ist, wird das Antibiotikum Tetracyclin gebildet.
Tabelle I
Kultureigenschaften von Streptomyces avellaneus IMI 126840 (IMRU 3911)
Medium Wachstum Luflmycel ■ Vegetatives Mycel
Bennets Agar (I) gut: kleine zusammen
fließende Kolonien in
schwach erhöhter Patina
gut: wächst in kurzer
und spärlicher Patina,
Farbe hell chamoisbraun
Farbe Zitronengelb bis
Hellkastanienbraun;
Rückseite analog, nur
abgeschwächtere Farbe
Fortsetzung
Medium Wachstum Luftmycel fehlt Vegetatives Mycel
Czapeks Agar (I) kleine zusammen farblos, Rückseite fast
fließende Kolonien in strohgelb
spärlicher Patina, fast
durchsichtig fehlt
Asparagin-Glucose- gut: kleine zusammen Farbe Strohgelb bis
Agar (1) fließende Kolonien in Hellkastanienbraun,
schwach erhöhter Patina spärlich; in kurzer und Rückseite analog gefärbt
Glycerin-Glycin-Agar (1) schwach: zusammen spärlicher Patina, etwas von farblos bis kasta
fließende Kolonien in pulvrig, weiße Farbe niengelber bis hell
schwach erhöhter Patina mit schwach chamois- kastanienbrauner Farbe,
braunem Farbton Rückseite strohgelb
fehlt
Emersons Agar (I) gut: kleine zusammen von Orange bis Kasta
fließende Kolonien in nienbraun mit leicht
gefalteter Patina gut: in kurzer und rötlichen Farbtönen
Stärke und Salze Agar (2) gut: kleine zusammen spärlicher pulvriger Farbe von Strohgelb bis
fließende Kolonien in Patina, Farbe Weiß bis Hellkastanienbraun,
glatter Patina Chamoisbraun, mit hell Rückseite strohgelb
weinrosa Farbton
spärlich, in kurzer und
Kartoffel-Agar (4) gut: kleine zusammen spärlicher Patina, Farbe von Orangegelb
fließende Kolonien in pulvrig, weißliche Farbe bis Hellkastanienbraun
schwach gefalteter mit chamoisbraunen mit analoger, abge
Patina Farbtönen schwächter Farbe an
gut von Weißbraun bis der Rückseite
Hafer-Agar (3) gut: kleine zusammen Hellchamois Farbe von Strohgelb bis
fließende Kolonien in Hellkastanienbraun,
glatter Patina spärlich, weiß mit Rückseite analog gefärbt
Glycerin-Asparagin- spärlich: kleine zusam chamoisbraunen Farb von Strohgelb mit leicht
Agar (1) menfließende Kolonien tönen, kurzes und grünlichen Farbtönen,
in glatter Patina spärliches Wachstum orange und hellbraune,
fehlt kastanienbraune Farbe
Hefe-Glucoseextrakt- gut: kleine zusammen Farbe von Gelborange
Agar (1) fließende Kolonien in bis Kastanienbraun
schwach gefalteter
Patina
(1) Waksman, S.A., »The Actinomycetes« Bd. II, The William and Wirlkins Company, 1961; S. 328 bis 334.
(2) Pr id ham, T. G., Anderson, P., Foley, C, Linden felser, L. Α., Hesseltine, C. M. und Benedict, R. B., »Antibiotic Annual 1956—1957«, S. 947 bis 953.
(3) B a Id a cc i, E., Giolitti, G., Küster, E. und S cot ti , T., Journal of Microbiology, 2, S. 39, 1961.
(4) 200 g gekochte Kartoffeln werden durch ein Sieb filtriert, und es werden 20 g Glukose und 20 g Agar zugesetzt; dann wird auf ein Volumen von 1 1 aufgefüllt und 20 Minuten lang bei 1200C sterilisiert.
Identifizierung des Stammes
Die Eigenschaften, die der geprüfte und vorher beschriebene Mikroorganismus zeigt, erlauben es, ihn dem Stamm Streptomyces Waksman et Henrici (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe, 1957, S. 744 bis 745) zuzuordnen.
Streptomyces avellaneus IMI 126840 (IMRU 3911) gehört zur Gruppe »Rectus flexibilis« von P r i d h a m und Mitarbeitern (Appl. Microbiol., 6, 1958, S. 52), da er gerade Sporenträger bildet. Die Gruppe ist in sechs »Serien« unterteilt, die durch die Farbe des Luftmycels gekennzeichnet sind: Weiß, Olivbraun, Gelb, Blau, Rot, Grau.
Der vorliegende Mikroorganismus zeigt ein Luftmycel mit typischer haselnußbrauner Färbung und kann offensichtlich keiner dieser Serien und daher auch nicht einer der angegebenen Spezies zugezählt werden.
Streptomyces avellaneus IMI 126840 (IMRU 3911) gehört somit auch zur Gruppe II von Baldacci,
»Vegetatives Mycel gefärbt; Entwicklung auf Agar im allgemeinen reichlich, wesentlich (cremig, mit Pallets usw.); mäßige und manchmal teilweise Sporenbildung« (Journal of Microbiology, 6, 1958, S. 10).
Diese Gruppe ist in »Serien« geteilt, die durch verschiedene Farbkombinationen des vegetativen und Luftmycels gekennzeichnet sind. Keine dieser Kombinationen entspricht dem vorliegenden Mikroorganismus, der durch ein vegetatives, orangebraunes Mycel und ein haselnußbraunes Luftmycel gekennzeichnet ist.
Außerdem gehört Streptomyces avellaneus IMI 126840 (IMRU 3911) zur Gruppe der melanin-negativen Serien von Waksman (The Actinomycetes, Bd. II, 1961, S. 117). Die Serien dieser Gruppe sind gekennzeichnet durch verschiedene Kombinationen folgender Eigenschaften:
Farbe des Luftmycels, Farbe des vegetativen Mycels und Bildung von Spiralen.
Keine dieser Kombinationen entspricht der.des vorliegenden Mikroorganismus, der durch ein haselnußbraunes Luftmycel, ein orangebraunes vegetatives
Mycel und die Abwesenheit von Spiralen gekennzeichnet ist.
In Tabelle II ist ein Vergleich zwischen den Eigenschaften des Streptomyces avellaneus IMI 126840 (IMRU 3911) und den Eigenschaften anderer Streptomyceten, die Tetracyclin produzieren, angegeben: Aus diesem Vergleich ergibt sich offensichtlich, warum Streptomyces avellaneus IMI 126840 (IMRU 3911)
mit keinem der bekannten Mikroorganismen identifizierbar ist.
Es ist anzunehmen, daß der vorliegende Mikroorganismus zur einer von den bekannten Arten verschiedenen Abart gehört; es wird daher angenommen, daß er eine neue Art darstellt, und er wurde durch den Namen Streptomyces avellaneus IMI126840 (IMRU 3911) gekennzeichnet.
Tabelle II
Vergleich zwischen Streptomyces avellaneus IMI 126840 (IMRU 3911) und den anderen Tetracyclin produzierenden Arten
Streptomyces avellaneus Streptomyces aureofaciens Streptomyces cp. 3054 Mutant
IMI 126840 (IMRU 3911) Mutant, cp. 11843 ATCC von S. aureofaciens
Sporophoren gerade Sektion RF gerade Sektion RF gerade Sektion RF
Sporen zylindrisch oval oval oder zylindrisch
1,2 bis 1,5 x 1,4 bis 1,7 μ 0,5 bis 1,6 x 0,5 bis 1,6 μ 1 X 1,5 μ
Vegetatives Mycel Farbe von Lichtgelb bis von Gelblich bis Orange von Weißrosa bis
Lichtkastanienbraun, gelb, Rückseite von Gelb Lachsrosa; Rückseite
Rückseite von Stroh bis Braun Chamoisbraunoliv
gelb bis Kastanienbraun
Luftmycel von Weiß bis Hell von Weiß bis Grau von Weiß bis Gelb;
haselnußbraun watteartig oder pulvrig
Lösliche Pigmente fehlt gelegentlich anwesend fehlt
von Zitronengelb bis
Dunkelbraun
Stärke + + +
Gelatine +
Nitrate +
Tyrosin Eigenschaft nicht fest Eigenschaft nicht fest
gestellt gestellt
Melanin Eigenschaft nicht fest Eigenschaft nicht fest
gestellt gestellt
Schwefelwasserstoff Eigenschaft nicht fest
gestellt
Galaktose Eigenschaft fehlt + Eigenschaft nicht fest
gestellt
Mannit Eigenschaft nicht fest
gestellt
Milch ±
Fortsetzung
Streptomyces sT. U. V 8,
Mutation v. S. aureofaciens
Streptomyces sT. 11652 ATCC Streptomyces
verticillatus sT. AB 929
Sporophoren Alte Kulturen sind schwarz offene Spiralen doppeltquirlig ohne
mit kleinen weißen Mycel- RA Sektion Spiralen
flecken. Sie bestehen aus BV Sektion
einer bestimmten Anzahl
Sporen von Einheiten in kurzen zylindrisch zylindrisch
Ketten mit einer Länge 0,99 bis 1,32 x 0,66 μ 0,6 bis 0,8 x 1,9 bii 2,5 μ
von 0,5 bis 4,5 μ
Vegetatives Mycel von farblos bis Gelb glatt, von Gelb bis Weiß mit weißer
Orange oder Rot oder Rückseite
Olivbräunlich
Luftmycel von Weißlich bis Grau von Weiß bis Maus Olivgrün mit weiß
und Schwarzgrau grauen Farbtönen
Lösliche Pigmente manchmal von Braun Dunkelbraun, Rot oder fehlt
bis Grün Braunschwarz
Fortsetzung
Streptomyces sT. U. V 8.
Mutation v. S. aureofaeiens
Streptomyces sT. 11652 ATCC Streptomyces
verticillatus sT. AB 929
+
Stärke nicht beschrieben + ±
Gelatine nicht beschrieben + +
Nitrate nicht beschrieben nicht beschrieben
Tyrosin nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Melanin nicht beschrieben nicht beschrieben +
Schwefelwasserstoff nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Galaktose nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Mannit nicht beschrieben nicht beschrieben +
Milch nicht beschrieben
Fortsetzung
Streptomyces sT. CDSD, Streptomyces sT. 88 Streptomyces
3,4 Mutation v. S. aureofaeiens Ist. Antibiot. Polonia fuscofaciens sT. 12061 ATCC
Sporophoren mit Endhaken gerade RF Sektion nicht beschrieben
RA Sektion
Sporen nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Vegetatives Mycel nicht beschrieben nicht beschrieben von farblos bis Braun
Rückseite Bräunlich
mit Rottönen
Luftmycel Weiß Rötlich oder Orange fehlt fast, Weißlichgrau
Lösliche Pigmente fehlt von Braungrün bis von Grau bis Rotbraun
Goldgelborange oder auch bis Tief
schwarz
Stärke nicht beschrieben ± +
Gelatine nicht beschrieben -
Nitrate nicht beschrieben -
Tyrosin nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Melanin nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Schwefelwasserstoff nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Galaktose nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Mannit nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Milch nicht beschrieben +
Fortsetzung
Streptomyces psammoticus Streptomyces sT. 13938 ATCC Streptomyces persimilis
Sporophoren gerade RF Sektion gerade RF Sektion nicht beschrieben
Sporen nicht beschrieben sphärisch oder oval nicht beschrieben
1,4 x 1,4 bis 2,1 μ ·
Vegetatives Mycel von Hellgelb bis von farblos bis Gelb, Hellgelb bis Braun
Hellbraun Rückseite von Gelb
bis Schwarz
Luftmycel von Hellbraun bis von Weißlich bis von Schneeweiß bis
Dunkelbraun mit Braungrau Hellgrau bis Dunkelgrau
grünlichen Farbtönen "
Lösliche Pigmente von Hellbraun bis fehlt von Hellgelb bis
Dunkelbraun kräftig Gelbbraun
Braungrün
Fortsetzung
10
Streptomyces psammoticus Streptomyces sT. 13938 ATCC Streptomyces persimilis
Stärke + nicht beschrieben
Gelatine ± nicht beschrieben
Nitrate nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Tyrosin nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Melanin nicht beschrieben nicht beschrieben
Schwefelwasserstoff nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Galaktose nicht beschrieben + nicht beschrieben
Mannit nicht beschrieben +
Milch nicht beschrieben +
(Fortsetzung)
Streptomyces aureofaciens Streptomyces aureofaciens Streptomyces viridifaciens
Mediolanum sT. 462840 sT. A 377 ATCC 10762 sT. BL 567201 ATCC 11980
Sporophoren. nicht beschrieben biegsam mit Tendenz offene Spiralen
zur Spiralenbildung RA Sektion
RA Sektion
Sporen nicht beschrieben glatt, rund bis Kugeln nicht beschrieben
Vegetatives Mycel von Cremegelb bis von Gelblich bis Gelb von Hellbraun bis Braun
Gelborange bis Braun orange bis Purpurbraun
Luftmycel von Weißgelb bis Weiß von Weißlich bis Mausgrau
grau bis Blau Aschgrau bis intensiv
Grau
Lösliche Pigmente von Gelbfluoreszierend manchmal vorhanden; Gelbgrün
bis Gelbbraun von Hellgelb bis
Lichtbraun
Stärke nicht beschrieben nicht beschrieben
Gelatine nicht beschrieben ± nicht beschrieben
Nitrate nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Tyrosin nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Melanin nicht beschrieben .. nicht beschrieben
Schwefelwasserstoff nicht beschrieben ± nicht beschrieben
Galaktose nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Mannit nicht beschrieben nicht beschrieben nicht beschrieben
Milch + ± nicht beschrieben
Streptomyces avellaneus IMI 126840 (IMRU 3911) kann durch Gefriertrocknung, wobei Milch als Suspensionsmedium verwendet wird, gelagert werden.
Das Kulturmedium für die Produktion des Antibiotikums enthält Kohlenstoff und Stickstoffquellen und Salze. Als Kohlenstoffquelle kann Stärke, Dextrin, Glycerin, Maltose, Maisquellflüssigkeit, Treber, Sojabohnenöl, Schmalzöl und andere für diesen Zweck gewöhnlich verwendete Substanzen benutzt werden.
Als Stickstoffquelle können, außer den obenerwähnten komplexen Substanzen, auch Fleischextrakt, Trockenhefe, Pepton oder Baumwollsamenmehl, Kasein oder Kaseinhydrolysate und Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfate, Biammoniumphosphate und Ammoniumnitrat und andere für diesen Zweck gewöhnlich verwendete Substanzen benutzt werden.
Die für die Herstellung des Antibiotikums verwendeten Mineralsalze können je nach dem verwendeten Medium verschieden sein. In einem Medium, welches komplexe Substanzen enthält, wie verschiedene Mehle und Fermentationsrückstände, hat sich der Zusatz von Kalziumkarbonat und Natrium- oder Kaliumphosphaten als zweckmäßig erwiesen. In Medien, die Dextrin, Kasein oder Ammoniumsalze enthalten, ist der Zusatz von Mineralsalzen, wie Kalium-, Magnesium-, Eisen-, Kupfer-, Zink-, Manganoder Kobaltsalzen notwendig.
Die Fermentation kann in Erlenmeyer-Kolben oder in Laboratoriums- oder industriellen Fermentern verschiedener Kapazität durchgeführt werden.
Das in der Fermentationsbrühe gebildete Tetracyclin wird durch chemische oder biologische Verfahren quantitativ bestimmt.
Um das Tetracyclin aus den Brühen zu extrahieren, werden die auf diesem Gebiet bekannten Verfahren eingesetzt, wie Extraktionen mit üblichen Lösungsmitteln, wenn gewünscht, in Anwesenheit von Koadjuvantien oder Adsorbentien. Eines dieser Verfahren gestattet eine besonders gute Extraktion und Reinigung des Tetracyclins aus der Fermentationsbrühe, worin es nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildet
Λ2
worden ist. Dieses Verfahren besteht im wesentlichen in einer Extraktion mit einer Mischung von Tficresol und Tetrachlorkohlenstoff bei alkalischem pH.
Die vorzugsweise verwendete Mischung von Tricresol, welche aus den drei Isomeren von Cresol 5 besteht und eine Dichte von 1,030 bis 1,038 besitzt und Tetrachlorkohlenstoff, die für die Extraktion verwendet wird, weist ein Mischungsverhältnis von Tricresol zu Tetrachlorkohlenstoff von 1:1 bis 1:3 auf.
Insbesondere wird die Extraktion wie folgt durchgeführt: Der Kulturbrühe, welche das Tetracyclin enthält, wird Oxalsäure zugesetzt, hierauf wird filtriert, und dem Filtrat wird ein chelatbildendes Mittel für mehrwertige Metallionen, wie Natriumäthylen-diamintetraacetat zugesetzt. Nun wird mit einer Mischung von Tricresol und Tetrachlorkohlenstoff extrahiert, bei einem pH-Wert, der durch Zusatz von Alkali auf 8 bis 8,5 eingestellt worden ist.
Die organischen Phasen werden abgetrennt, vorzugsweise durch Zentrifugieren, und es wird Aceton und eine wäßrige Lösung einer anorganischen oder organischen Säure, vorzugsweise Zitronensäure, diesen zugesetzt. Die Mischung wird geschüttelt, und die Phasen werden getrennt. Der so erhaltene wäßrige Extrakt enthält das Antibiotikum zusammen mit einer bestimmten Menge gefärbter Verunreinigungen und Tricresol; er wird durch Schütteln mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Butanol, Methylisobutylketon u. dgl., gereinigt. Um die Trennung der beiden Phasen und den übergang der obenerwähnten gefärbten Verunreinigungen in die organische Phase zu erleichtern, hat es sich als zweckmäßig herausgestellt, vor Durchführung der Extraktion eine gewisse Menge oberflächenaktive Substanzen, wie Alkalialkylsulfonat oder quaternäre Ammoniumsalze u. dgl., zuzusetzen. Dann werden die beiden Phasen getrennt, und die organische Phase wird verworfen.
Die wäßrige Phase wird dann abgetrennt, durch Zusatz von Alkali auf einen pH-Wert von 5 bis 7 gebracht, beispielsweise durch Zusatz von Alkalihydroxyden oder Karbonaten. Das Antibiotikum Tetracyclin fällt aus, wird dann als solches isoliert und durch Umkristallisierung gereinigt oder aber nach bekannten Verfahren in seine Salze mit organischen oder anorganischen Säuren übergeführt.
Die folgenden Beispiele erläutern den Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
B e i s ρ i e 1 1
Es werden zwei 300-ml-Erlenmeyerkolben jeweils mit 60 ml des folgenden vegetativen Mycels beschickt:
Maisquellflüssigkeit.
Ammoniumsulfat...
Kalziumkarbonat ..
Lösliche Stärke ....
Glukose
Maismehl
Monokaliumphosphat
1,5%
0,4%
0,6%
2,0%
0,5%
0,1%
0,06%
Leitungswasser auf 1000 ml
Die Sterilisation wird durch Erhitzen in einem Autoklav bei 1200C während 20 Minuten durchgeführt. Der pH-Wert betrug nach der Sterilisierung 6,6. ■ .
Jeder Kolben wurde etwa mit einem Drittel der Myceloberfläche von 10 Tage alten Streifenkulturen von Streptomyces avellaneus IMI 126840(IMRU 3911) beimpft, wobei die Kultur, die zum Animpfen verwendet wurde, bei 28° C auf folgendem festem Medium beschichtet worden war:
Malzextrakt 1%
Hefeextrakt 0,4%
Glukose 0,4%
Agar 1,8%
Destilliertes Wasser auf 1000 ml
pH-Wert nach der Sterilisierung: 6,2.
Die Kolben werden 27 Stunden lang bei 28° C auf einem Drehschüttler bei 240 UpM mit einer Exzentrizität von 3,5 cm bebrütet.
ml einer so erhaltenen Kultur werden verwendet, um einen 300-ml-Erlenmeyerkolben, welcher 30 ml des folgenden Mediums enthielt, anzuimpfen:
Stärke
Kalziumkarbonat ..
Sojamehl ohne Fett.
Kasein
Magnesiumsulfat ...
Melasse
Schmalzöl
55
60 6%
0,4%
3%
1%
0,05%
0,2%
1%
Leitungswasser auf 1000 ml
Der pH-Wert betrug nach Sterilisierung während Minuten bei 1200C 6,8.
Die Kultur wird bei 28° C auf einem Drehschüttler mit einer Exzentrizität von 3,5 cm bei 220 UpM, wie für die vegetative Phase beschrieben, bebrütet.
Nach 120stündiger Fermentation war eine Maximalaktivität entsprechend einer Konzentration von μg/ml Tetracyclin erhalten.
Beispiel 2
Es wird wie im Beispiel 1 gearbeitet, jedoch wird für die vegetative Phase folgendes Medium verwendet:
Maisquellflüssigkeit 3,5%
Kalziumcarbonat 1,8%
Saccharose 0,5%
Leitungswasser auf 1000 ml
Sterilisierung: 20 Minuten lang bei 1200C. pH-Wert nach Sterilisierung: 6,5. Für die Produktionsphase wird folgendes Medium eingesetzt:
Maisquellflüssigkeit 2,6%
Stärke 12%
Kalziumcarbonat 1 %
Ammoniumsulfat 1 %
Magnansulfat 14,5%
Kobaltchlorid 0,78%
Baumwollsamenmehl 0,45%
Schmalzöl 2,5%
Leitungswasser auf 1000 ml
Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxyd vor der Sterilisierung, die 20 Minuten lang bei 1200C durchgeführt wird, auf 6,2 eingestellt.
Nach 120stündiger Bebrütung unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen wird eine Aktivität erhalten, die einer Konzentration von 10500 μg/ml Tetracyclin entspricht.
13 14
Beispiel 3 Die Mischung wird während Zusatzes von 275 ml
Es wird wie im Beispiel 1 gearbeitet, jedoch wird die einer 20%igen wäßrigen Natronlaugelösung stark
vegetative Phase in folgendem Medium durchgerührt: gerührt; der pH-Wert erreicht den Wert von 8.
Maisquellflüssigkeit 1,5% t Die P^sen werden dann durch Zentrifugieren
Ammoniumsulfat 0 4% 5 Setrennt'die organische Phase wird mit einer geringen
Kalziumcarbonat'////.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'. 0>/o MenSe Wasser gewaschen mit 5g Entfärbungskohle
Monokaliumphosphat 0,03% geschüttelt und über Filterpapier m.t einer Lage
ς... ι ~0/ Infusorienerde nitriert. Dem Filtrat werden 500 ml
£ η c°o/ Aceton und 300 ml wäßriger, 10%iger Zitronensäure-
up/o io ]ösung zugesetzt. Das Ganze wird geschüttelt, die
jp?]· JM0, Phasen werden getrennt und die organische Phase
bojameni u,4/o dann mit zwd Anteilen von je 200 und 100 ml einer
bcnmalzol ^ /o 10% igen wäßrigen Zitronensäurelösung extrahiert.
Leitungswasser auf 1000 ml Die wäßrig-acetonischen Extrakte werden zusammen-
Der pH-Wert wird durch Zusatz von Natrium- i5 gebracht, es werden 10 ml einer 10%igen wäßrigen
hydroxyd auf 6,6 gebracht. Stearyl-trimethylammonium-suifat-Lösung zugesetzt,
Die produktive Phase wird in folgendem Medium und es wird mit 320 ml Butanol geschüttelt. Das
durchgeführt: Butanol, das nach dem Schütteln gelbbraun gefärbt
ς .. , -0/ ist, wird abgetrennt und verworfen.
_,.ar, e Jj ° 20 Dem gereinigten wäßrigen Extrakt wird eine 20% ige
UluKose ... U,5/o wäßrige Kaliumhydroxydlösung bis zu einem pH-Wert
Maisque !flüssigkeit 2,5% von 5*8 zugesetzt. Hi'erauf wird in einem F Eisbad
Mfemehl I0/ gekühlt, und nach 20 Stunden wird der erhaltene
. a m^e. '' ',V; n Λ, Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und
Ammoniumsulfat 0,6% bei 50c f Vakuum trocknet. Es 6 werden 35,21 g
00 % desProduktesmiteinerWirksamkeitvonl02,2μg/mgg
s ..... 3°/ ■ halten. Durch Alkalischmachen der Mutterlaugen
° auf einen pH-Wert von 7 wird eine weitere Menge des
Nach 120stündiger Fermentation wird eine maxi- 30 Antibiotikums abgeschieden, das bei 50°C im Vakuum
male Produktion von 7700 μg/ml Tetracyclin er- getrocknet, 6,69 g Tetracyclin mit einer Wirksamkeit
halten. .. " von 855 μ^/mg, entsprechend 5,72 g Tetracyclinhydro-
T, . · . Λ chlorid, zeigt.
B e 1 s ρ 1 e 1 4 "
In einem 10-1-Glasfermenter werden 61 des im 35 ^
Beispiel 2 beschriebenen vegetativen Mediums ein- Zu 16 kg einer Kulturbrühe, enthaltend 160 g
gebracht und durch 30 Minuten langes Erhitzen auf Tetracyclin als Hydrochlorid, werden 200 g Oxal-
120° C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird mit säure zugesetzt, es wird 1 Stunde lang geschüttelt,
200 ml einer vegetativen Kultur, die — wie im Bei- dann wird 1 kg Infusorienerde zugesetzt, und es wird
spiel 1 beschrieben — in einem Erlenmeyerkolben her- 40 filtriert. Der Kuchen wird mit 5,5 1 einer l%igen
gestellt worden war, geimpft. Die Mischung wird wäßrigen Oxalsäurelösung gewaschen. Dem so er-
24 Stunden lang bei 28° C unter Durchleiten eines haltenen Filtrat werden 160 gÄthylendiamin-natrium-
Luftstromes entsprechend 6 l/Min, und unter Rühren tetraacetat zugesetzt, der pH-Wert wird auf 8,4 ein-
mit einem 4-Schaufelrührschüttler bei 350 UpM be- gestellt, und die Mischung wird mit einer Mischung
brütet. Das so erhaltene vegetative Medium dient 45 von 1,07 1 Tetrachlorkohlenstoff und 1,07 1 Tricresol
zum Animpfen in einem Verhältnis von 5% von 6 1 extrahiert. Die organische Phase wird mit 1050 ml
Produktionsmedium, wie im Beispiel 2 beschrieben, Aceton und 750 ml 10%iger wäßriger Zitronensäure-
das sich in einem 10-1-Fermenter befindet und 30 Mi- lösung extrahiert. Es wird geschüttelt, die Phasen
nuten lang bei 120° C sterilisiert worden war. werden getrennt, und die organische Phase wird auf-
Die Mischung wird bei 280C mit einem Luftstrom 50 einanderfolgend mit zwei Anteilen von 400 und
von 6 I/Min, und unter Rühren mit einem 4-Schaufel- 350 ml einer 10%igen wäßrigen Zitronensäurelösung
rührmischer bei 450 UpM bebrütet. Nach 5tägiger extrahiert. Die gesammelten wäßrigen acetonischen
Bebrütung wurde Tetracyclin in einer Menge von Extrakte werden durch Schütteln mit 500 ml Methyl-
7500 μg/ml gebildet. isobutylketon und 1 g Natriumlaurylsulfonat ge-
R . . . , 55 reinigt. Der Extrakt im organischen Lösungsmittel
α e 1 s ρ 1 e 1 D wird verworferij und der wäßrige Extrakt wird mit
Zu 7,33 kg einer Kulturbrühe, hergestellt wie im 5 g Entfärbungskohle behandelt, zum filtrierten ExBeispiel 4 beschrieben und enthaltend 55 g Tetra- trakt wird eine 20%ige wäßrige Kaliumhydroxydcyclin in Form des Hydrochlorids, werden 87 g Oxal- lösung zugesetzt, bis ein pH-Wert von 5,5 erreicht ist. säure zugesetzt. Die Mischung wird 1 Stunde lang 60 Nach 30 Stunden langem Kühlen der Lösung im gerührt, dann werden 500 g Infusorienerde zugesetzt, Eisbad wird der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, und das Ganze wird filtriert. mit Wasser gewaschen und bei 50°C im Vakuum
Der Kuchen wird mit 2,5 1 einer wäßrigen Lösung, getrocknet.
enthaltend 1 % Oxalsäure, gewaschen. Es werden Es werden so 98,7 g Tetracyclin mit einer Wirksam-
9,8 1 des Filtrats erhalten, zu welchem 55 g Äthylen- 65 keit von 106 μg/mg entsprechend 104 g Tetracyclin-
diamin-natrium-tetraacetat und eine Mischung, be- hydrochlorid erhalten.
stehend aus 500 ml Tricresol und 1000 ml Tetra- Aus der Mutterlauge, welche 17 g Tetracyclin-
chlorkohlenstoff, zugesetzt werden. hydrochlorid enthält, werden durch Extraktion mit
Tricresol-tetrachlorkohlenstoff nach der oben beschriebenen Verfahrensweise 11,5 g des Antibiotikums mit einer Wirksamkeit von 951 μg/mg entsprechend 10,93 g Tetracyclinhydrochlorid erhalten.
Beispiel 7
Zu 11,25 kg einer Kulturbrühe, enthaltend 113,6 g Tetracyclin als Hydrochlorid, werden 200 g Oxalsäure zugesetzt.
Die Mischung wird 1 Stunde lang geschüttelt, es wird ein Kilogramm Infusorienerde zugesetzt, und hierauf wird filtriert. Der Kuchen wird mit 7 1 einer l%igen wäßrigen Oxalsäurelösung gewaschen.
Zu dem Filtrat (14,181) werden 100 g Äthylendiaminnatriumtetraacetat, 700 ml Tricresol und 1400 ml Tetrachlorkohlenstoff zugesetzt. Der pH-Wert wird mit einer 20%igen wäßrigen Natronlauge auf 8,4 eingestellt, und es wird 15 Minuten lang geschüttelt. Die beiden Phasen werden durch Zentrifugieren getrennt, und die wäßrige Phase wird nochmals mit 100 ml Tricresol und 300 ml Tetrachlorkohlenstoff extrahiert und dann verworfen.
Die organischen Extrakte werden vereinigt und über, ein Papierfilter mit einer Lage Infusorienerde filtriert.
Dem Filtrat (1240 ml) werden hintereinander 300 ml Aceton, 980 ml 10%iger wäßriger Zitronensäurelösung zugesetzt, dann wird geschüttelt, und es werden 150 ml einer 20%igen wäßrigen Schwefelsäurelösung zugesetzt, um eine leichte Trübung zu entfernen.
Die Mischung wird nochmals geschüttelt, und die Phasen werden getrennt. Die organische Phase wird zweimal mit je 200 ml einer 10%igen wäßrigen Zitronensäurelösung extrahiert. Zu den gesammelten acetonisch-wäßrigen Extrakten werden 600 ml n-Butanol zugesetzt, und es wird geschüttelt, dann wird nochmals 20%ige wäßrige Kalilauge zugesetzt, bis ein pH-Wert von 5,5 erreicht ist.
Das Rühren wird 63 Stunden lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit n-Butanol gewaschen und dann mit Wasser gewaschen.
Die Mischung wird bei 500C unter Vakuum getrocknet, und es werden 90,6 g Tetracyclin mit einer Wirksamkeit von 991 μg/mg, entsprechend 89,78 (79%ige Ausbeute), erhalten.
209 525/514

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin durch Züchtung eines Stammes von Streptomyces unter aeroben . Bedingungen in einem Nährmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 22 bis 350C während eines Zeitraumes von 72 bis 168 Stunden bei einem pH-Wert von 6,0 bis 7,2 und Aufarbeitung des Reaktionsgemisches in üblicher Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streptomyces avellaneus IMI 126840 (IMRU 3911) verwendet.
DE19671617815 1967-03-23 1967-08-18 Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin Expired DE1617815C (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT1404067 1967-03-23
IT1404067 1967-03-23
DES0111418 1967-08-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE1617815A1 DE1617815A1 (de) 1971-04-08
DE1617815C true DE1617815C (de) 1973-01-11

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