DE19526386C1

DE19526386C1 - Papillomviren, Mittel zu deren Nachweis sowie zur Therapie von durch sie verursachten Erkrankungen

Info

Publication number: DE19526386C1
Application number: DE19526386A
Authority: DE
Inventors: Vladimir Dr Shamanin; Hausen Ethel-Mich Villiers-Zur; Hausen Harald Prof Dr Dr Zur
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1995-07-19
Filing date: 1995-07-19
Publication date: 1997-01-02
Anticipated expiration: 2015-07-20
Also published as: US20020110865A1; WO1997004099A3; US6368832B1; US20020110866A1; WO1997004099A2; US6322795B1; US6562597B2; EP0839199A1; JPH11512925A; US6555345B2

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA, die für ein Peptid eines Papillomvirus-Hauptcapsid- Protein bzw. ein Papillomvirus-Genom codiert. Desweiteren betrifft die Erfindung durch das Papillomvirus-Genom codierte Proteine und gegen sie gerichtete Antikörper sowie deren Verwendung in Diagnose, Therapie und Vakzinierung.

Es ist bekannt, daß Papillomviren das Epithelgewebe von Mensch und Tier infizieren. Human-Papillomviren (nachstehend mit HP-Viren bezeichnet) finden sich in benignen, z. B. Warzen, Kondylome im Genitalbereich, und malignen, z. B. Karzinome der Haut und der Gebärmutter, epithelialen Neoplasmen (vgl. zur Hausen, H., Cancer Research 49 (1989), Seiten 4677-4681). Auch werden HP-Viren für die Entwicklung maligner Tumoren des Respirations trakts in Betracht gezogen (vgl. zur Hausen, H., Cancer Research 36 (1976), Seite 530). Desweiteren werden HP-Viren für die Entwicklung squamöser Karzinome der Lunge als zumindest mitverantwortlich angesehen (vgl. Syrjänen, K. J., Lung 158 (1980), Seiten 131-142).

Papillomviren weisen ein ikosaedrisches Capsid ohne Hülle auf, in dem ein zirkuläres, doppelsträngiges DNA-Molekül von etwa 7900 bp vorliegt. Das Capsid umfaßt ein Hauptcapsid-Protein (L1) und ein Nebencapsid-Protein (L2). Beide Proteine, coexprimiert oder L1 alleine exprimiert, führen in vitro zur Ausbildung von Virus-ähnlichen Partikeln (vgl. Kirnbauer, R. et al., Journal of Virology, (1993), Seiten 6929-6936).

Papillomviren lassen sich nicht in Monolayer-Zellkultur vermehren. Ihre Cha rakterisierung ist daher äußerst schwierig, wobei bereits der Nachweis von Papillomviren erhebliche Probleme schafft. Dies trifft insbesondere für Papil lomviren in Karzinomen der Haut zu. Hier ist bisher kein verläßlicher Nachweis dieser und damit kein gezieltes Vorgehen gegen sie möglich.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, mit dem Papillomviren, insbesondere in Karzinomen der Haut, nachgewiesen werden können. Ferner sollte ein Mittel bereitgestellt werden, um gegen diese Papillomviren therapeutisch vorgehen zu können.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Bereitstellung der Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine für ein Peptid eines Papillomvirus- Hauptcapsid-Proteins (L1) codierende DNA gemäß Anspruch 1.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine für ein Peptid eines Papillomvi rus-Hauptcapsid-Proteins codierende DNA gemäß Anspruch 2.

Fig. 1 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid VS19-6 bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorga nismen und Zellkulturen) unter DSM 10104 am 11. Juli 1995 hinterlegt.

Fig. 2 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid VS200-1 bei der DSM unter DSM 10096 am 11. Juli 1995 hinterlegt.

Fig. 3 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid VS201-1 bei der DSM unter DSM 10097 am 11. Juli 1995 hinterlegt.

Fig. 4 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid VS202-8 bei der DSM unter DSM 10098 am 11. Juli 1995 hinterlegt.

Fig. 5 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid VS203-2 bei der DSM unter DSM 10099 am 11. Juli 1995 hinterlegt.

Fig. 6 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid VS204-4 bei der DSM unter DSM 10100 am 11. Juli 1995 hinterlegt.

Fig. 7 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid VS205-1 bei der DSM unter DSM 10101 am 11. Juli 1995 hinterlegt.

Fig. 8 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid VS206-2 bei der DSM unter DSM 10109 am 13. Juli 1995 hinterlegt.

Fig. 9 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid VS207-22 bei der DSM unter DSM 10102 am 11. Juli 1995 hinterlegt.

Fig. 10 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer für ein Peptid von L1 eines Papillomvirus codierenden DNA. Diese DNA wurde als Plasmid VS208-1 bei der DSM unter DSM 10103 am 11. Juli 1995 hinterlegt.

Vorstehende DNA weist zu bekannten Papillomviren folgende Sequenzhomo logie auf:
DNA von Fig. 1: 69.1% zu HP-Virus 65
DNA von Fig. 2: 80.7% zu HP-Virus 24
DNA von Fig. 3: 69.4% zu HP-Virus 48
DNA von Fig. 4: 66.3% zu HP-Virus 48
DNA von Fig. 5: 66.9% zu HP-Virus 65
DNA von Fig. 6: 66.4% zu HP-Virus 65
DNA von Fig. 7: 69.1% zu HP-Virus 4
DNA von Fig. 8: 68.7% zu HP-Virus 48
DNA von Fig. 9: 76.6% zu HP-Virus 48
DNA von Fig. 10: 81.8% zu HP-Virus 68.

Erfindungsgemäß kann vorstehende DNA in einem Vektor bzw. Expressions vektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEM-T und pGEX-2T. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEF-BOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind.

Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um vorstehende, in einem Expressions vektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109 und XL1-Blue, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, NH-3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, und Hela.

Der Fachmann weiß, in welcher Weise vorstehende DNA in einen Expres sionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß vorstehende DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid codierenden DNA inseriert werden kann, so daß vorstehende DNA in Form eines Fusions proteins exprimiert werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Papillomvirus-Genom, das vor stehende DNA umfaßt. Der Ausdruck "Papillomvirus-Genom" umfaßt auch ein unvollständiges Genom, d. h. Fragmente eines Papillomvirus-Genoms, die vor stehende DNA umfassen. Dies kann z. B. eine für L1 codierende DNA oder ein Teil davon sein.

Zur Bereitstellung vorstehenden Papillomvirus-Genoms kann ein Verfahren verwendet werden, das folgende Verfahrensschritte umfaßt:

(a) Isolierung der Gesamt-DNA aus einer Biopsie epithelialen Neoplasmas,
(b) Hybridisierung der Gesamt-DNA von (a) mit vorstehender DNA, wo durch ein in der Gesamt-DNA von (a) enthaltenes Papillomvirus-Genom nachgewiesen wird, und
(c) Klonierung der das Papillomvirus-Genom enthaltenden Gesamt-DNA von (a) in einem Vektor, und gegebenenfalls Subklonierung des erhalte nen Klons, wobei sämtliche Verfahrensschritte üblicher DNA-Rekom binationstechnik entstammen.

Hinsichtlich der Isolierung, Hybridisierung und Klonierung von Zell-DNA wird ergänzend auf Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) verwiesen.

Der Ausdruck "epitheliales Neoplasma" umfaßt jegliche Neoplasmen des Epithelgewebes bei Mensch und Tier. Beispiele solcher Neoplasmen sind Warzen, Kondylome im Genitalbereich und Karzinome der Haut. Letztere werden vorliegend bevorzugt verwendet, um vorstehendes Papillomvirus- Genom zu isolieren.

Der Ausdruck "Vektor" umfaßt jegliche zur Klonierung von chromosomaler bzw. extrachromosomaler DNA geeignete Vektoren. Beispiele solcher Vekto ren sind Cosmide, wie pWE15 und Super Cos1, und Phagen, wie λ-Phagen, z. B. λZAP Expressvector, λZAPII Vector und λgt10 Vektor. Vorliegend wer den λ-Phagen bevorzugt verwendet. Vorstehende Vektoren sind bekannt und bei der Firma Stratagene erhältlich.

Erfindungsgemäße Papillomvirus-Genome können integriert in chromosomaler DNA oder extrachromosomal vorliegen. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, dies abzuklären. Auch weiß er um Verfahren, die zur Klonierung der Papillomvirus-Genome optimalen Restriktionsenzyme herauszufinden. Er wird sich an Genomen bekannter Papillomviren orientieren. Insbesondere wird der Fachmann die vorstehend genannten HP-Viren entsprechend beachten.

Beispielhaft wird die Bereitstellung eines mit VS19-6 bezeichneten Papil lomvirus-Genoms beschrieben. Hierzu wird die Gesamt-DNA aus einer Biopsie eines plattenepithelialen Karzinoms isoliert, mit BamHI gespalten und in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Das Agarosegel wird danach einem Blotting-Verfahren unterzogen, wodurch die DNA auf eine Nitrozellulosemem bran übertragen wird. Diese wird in ein Hybridisierungsverfahren eingesetzt, in dem die DNA von Fig. 1, ggfs. in Kombination mit einer DNA von HP-Virus 65 als markierte Probe verwendet wird. Es wird eine Hybridisierung mit der in der Gesamt-DNA vorliegenden Papillomvirus-DNA erhalten.

Im weiteren wird vorstehende mit BamHI gespaltene Gesamt-DNA in einem λ-Phagen kloniert. Die entsprechenden Klone, d. h. die die Papillomvirus-DNA enthaltenden Klone, werden durch Hybridisierung mit der DNA von Fig. 1, ggfs. in Kombination mit einer DNA des HP-Virus 65 identifiziert. Das Insert dieser Klone wird dann einer weiteren Klonierung in einem Plasmid-Vektor unterzogen, wodurch ein Klon erhalten wird, der das Papillomvirus-Genom VS19-6-G enthält. Das Genom wird durch Sequenzierung bestätigt.

In analoger Weise werden weitere Papillomvirus-Genome bereitgestellt. Sie werden entsprechend der zu ihrer Bereitstellung verwendeten DNAs bezeich net, mit: VS200-1-G, VS201-1-G, VS202-8-G, VS203-2-G, VS204-4-G, VS205-1-G, VS206-2-G, VS207-22-G bzw. VS208-1-G.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Protein, das durch vorstehendes Papillomvirus-Genom codiert wird. Ein solches Protein ist z. B. ein Hauptcap sid-Protein (L1) oder ein Nebencapsidprotein (L2). Die Herstellung eines vor stehenden Proteins erfolgt in üblicher Weise. Beispielhaft wird die Herstellung von L1 bzw. L2 des Papillomvirus-Genoms VS19-6-G beschrieben. Hierzu wird das zu der DNA von Fig. 1 verwandte HP-Virus 65 herangezogen. Von diesem ist die vollständige Sequenz und die Lage einzelner für Proteine codie render DNA-Bereiche bekannt. Durch parallele Restriktionsspaltungen beider Genome und anschließender Hybridisierung mit verschiedenen, die L1 bzw. L2 codierende DNA betreffenden Fragmenten werden diese DNAs auf dem Papillomvirus-Genom VS19-6-G identifiziert. Sie werden durch Sequenzierung bestätigt. Die für L1 codierende DNA wird mit VS19-6-G-L1-DNA und die für L2 codierende DNA mit VS19-6-G-L2-DNA bezeichnet.

Im weiteren wird die für L1 bzw. L2 codierende DNA in einen Expressions vektor inseriert. Beispiele eines solchen für E. coli, Hefe und tierische Zellen sind vorstehend genannt. Ergänzend hierzu wird für die Expression in E. Coli auf den Vektor pGEX-2T verwiesen (vgl. Kirnbauer, R. et al., supra). Nach Insertion der VS19-6-G-L1- bzw. VS19-6-G-L2-DNA wird pGEX-2T-VS19-6- G-L1 bzw. pGEX-2T-VS19-6-G-L2 erhalten. Diese Expressionsvektoren exprimieren nach Transformation von E. coli ein Glutathion S-Transferase-L1- bzw. Glutathion S-Transferase-L2-Fusionsprotein. Die Reinigung dieser Protei ne erfolgt in üblicher Weise.

Für eine weitere Expression vorstehender L1 bzw. L2 codierender DNA wird das Bacculovirus- bzw. Vacciniavirus-System genannt. Hierfür verwendbare Expressionsvektoren sind z. B. pEV mod. und pSynwtVI für das Bacculovirus- System (vgl. Kirnbauer, R. et al., supra). Für das Vacciniavirus-System sind insbesondere Vektoren mit dem Vacciniavirus "early" (p7.5k)- bzw. "late" (Psynth, p11K)-Promotor zu nennen (vgl. Hagensee, M., E. et al., Journal of Virology (1993), Seiten 315-322). Vorliegend wird das Bacculovi rus-System bevorzugt. Nach Insertion vorstehender L1 bzw. L2 codierender DNA in pEV mod. wird pEVmod.-VS19-6-G-L1 bzw. pEVmod.-VS19-6-G-L2 erhalten.

Der erstere Expressionsvektor alleine bzw. beide Expressionsvektoren zusam men führen nach Infektion von SF-9 Insektenzellen zur Ausbildung von Virus ähnlichen Partikeln. Im ersteren Fall umfaßt ein solches Partikel ein L1-Pro tein, während es im letzteren Fall neben einem L1- auch ein L2-Protein ent hält.

Ein Virus-ähnliches Partikel letzteren Falls wird auch erhalten, indem die vorstehenden VS19-6-G-L1- und VS19-6-G-L2-DNAs gemeinsam in den Expressionsvektor pSynwtVI inseriert werden und das erhaltene pSynwtVI VS19-6-G-L1/L2 zur Infektion von SF-9 Insektenzellen verwendet wird. Die Reinigung vorstehender Virus-ähnlicher Partikel erfolgt in üblicher Weise. Sie stellen auch einen Gegenstand der Erfindung dar.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein gegen ein vorstehendes Protein bzw. Virus-ähnliches Partikel gerichteter Antikörper. Die Herstellung eines solchen erfolgt in üblicher Weise. Beispielhaft wird es für die Herstellung eines Antikörpers beschrieben, der gegen ein L1 von VS19-6-G umfassendes Virus-ähnliches Partikel gerichtet ist. Hierzu wird das Virus-ähnliche Partikel BALB/c-Mäusen subcutan injiziert. Diese Injektion wird im Abstand von jeweils 3 Wochen wiederholt. Etwa 2 Wochen nach der letzten Injektion wird das den Antikörper enthaltende Serum isoliert und in üblicher Weise getestet.

In bevorzugter Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler Antikör per. Zu seiner Herstellung werden nach vorstehender vierten Injektion den Mäusen Milzzellen entnommen und diese in üblicher Weise mit Myelomzellen fusioniert. Die weitere Klonierung erfolgt ebenso nach bekannten Verfahren.

Mit der vorliegenden Erfindung wird es ermöglicht, Papillomviren, insbesonde re in Karzinomen der Haut, nachzuweisen. Hierzu kann die erfindungsgemäße DNA als solche oder von einer weiteren DNA umfaßt eingesetzt werden. Letztere kann auch ein Papillomvirus-Gom oder ein Teil davon sein.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht ferner die Bereitstellung von bisher nicht gekannten Papillomviren. Diese finden sich insbesondere in Karzinomen der Haut. Desweiteren liefert die Erfindung Proteine und Virus-ähnliche Partikel, die auf diese Papillomviren zurückgehen. Darüberhinaus werden Antikörper bereitgestellt, die gegen diese Proteine bzw. Partikel gerichtet sind.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es also, diagnostische und therapeuti sche Maßnahmen bei Papillomvirus-Erkrankungen zu ergreifen. Darüberhinaus liefert sie die Möglichkeit, eine Vakzine gegen Papillomvirus-Infektionen aufzubauen. Die vorliegende Erfindung stellt somit einen Durchbruch auf dem Gebiet der Papillomvirus-Forschung dar.

Die Erfindung wird durch die Beispiele erläutert.

Beispiel 1 Identifizierung des Papillomvirus-Genoms VS19-6-G

Aus der Biopsie eines plattenepithelialen Karzinoms einer immun supprimierten Person wird die Gesamt-DNA isoliert. 10 µg dieser DNA werden mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und in einem 0,5% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Gleichzeitig werden auch 10 µg vorstehender DNA aufgetrennt, die nicht gespalten worden ist. Das Agarosegel wird einem Blotting-Verfahren unterzogen, wodurch die DNA aus dem Aga rosegel auf eine Nitrozellulosemembran übertragen wird. Diese wird in ein Hybridisierungsverfahren eingesetzt, in dem die vor stehende DNA von Fig. 1 in Kombination mit HP-Virus-65 DNA als p³²-markierte Probe verwendet wird. Es wird eine Hybridis ierung mit der geblotteten DNA erhalten.

Vorstehende Verfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der DNA-Rekombinationstechnik bekannt. Ergänzend wird auf Sam brook et al., supra verwiesen.

Beispiel 2 Klonierung des Papillomvirus-Genoms VSi9-6-G

Die aus Beispiel 1 erhaltene Biopsie-DNA wird mit dem Restrik tionsenzym BamHI gespalten. Die erhaltenen Fragmente werden in eine Ligasereaktion eingesetzt, in der ebenfalls der mit BamHI gespaltene und dephosphorylierte Vektor AZAP Express vorliegt.

Die hierbei erhaltenen rekombinanten DNA-Moleküle werden in Bakteriophagen verpackt und diese zur Infektion von Bakterien verwendet. Für diese Verfahrensschritte wird der von der Firma Stratagene angebotene ZAP Express Vektor Kit verwendet. Die erhaltenen Phagenplaques werden dann einem Hybridisierungs verfahren unterzogen, in dem die in Beispiel 1 verwendete p³²- markierte DNA von Fig. 1 in Kombination mit p³²-markierter HP- Virus-65-DNA verwendet wird. Es wird eine Hybridisierung mit entsprechenden Phagenplaques erhalten. Aus diesen werden die BamHI-Fragmente von VS19-6-G isoliert und zusammen mit einem BamHI-gespaltenen, dephosphorylierten Plasmid-Vektor, pBluescript, in eine weitere Ligasereaktion eingesetzt. Die erhal tenen rekombinanten DNA-Moleküle werden zur Transformation von Bakterien, E. coli XI1-Blue, verwendet. Durch Restriktions spaltungen bzw. Hybridisierung mit vorstehenden DNA-Proben wird ein das Papillomvirus-Genom VS19-6-G enthaltender Bakte rienklon identifiziert. Das Plasmid dieses Bakterienklons wird mit pBlue-VS19-6-G bezeichnet.

Claims

1. DNA, codierend für ein Peptid eines Papillomvirus-Hauptcapsid-Proteins, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6. Fig. 7, Fig. 8, Fig. 9 oder Fig. 10, wobei die Fig. 1-10 Bestandteil dieses Anspruchs sind, oder eine davon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz umfaßt, und wobei die DNA durch folgende Verfahrensschritte erhältlich ist:

(a) Isolierung der Gesamt-DNA aus einer Biopsie epithelialen Neoplasmas,
(b) Hybridisierung der Gesamt-DNA von (a) mit einer DNA von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6. Fig. 7, Fig. 8, Fig. 9 oder Fig. 10, wodurch ein in der Gesamt-DNA von (a) enthaltenes Papillomvirus- Genom nachgewiesen wird, und
(c) Klonierung der das Papillomvirus-Genom enthaltenden Gesamt-DNA von (a) in einem Vektor sowie Sequenzierung des Klons.

2. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptid des Papillomvirus-Hauptcapsid-Proteins codierende DNA die Basense quenz von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6. Fig. 7, Fig. 8, Fig. 9 oder Fig. 10, wobei die Fig. 1-10 Bestandteil dieses Anspruchs sind, oder eine davon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Basensequenz umfaßt, und wobei die DNA durch folgende Verfahrensschritte erhältlich ist:

3. DNA nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA ein Papillomvirus-Genom umfaßt.

4. Protein, codiert durch das Papillomvirus-Genom nach Anspruch 3.

5. Protein nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Papillomvirus-Hauptcapsid-Protein als Virus-ähnliches Partikel vorliegt.

6. Protein nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus-ähnliche Partikel auch ein Papillomvirus-Nebencapsid- Protein enthält.

7. Expressionsvektor, umfassend eine für das Protein nach Anspruch 4 codierende DNA.

8. Transformante, enthaltend den Expressionsvektor nach Anspruch 7.

9. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 4, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 8 unter geeigneten Bedingungen.

10. Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1-3 als Reagens zur Diagnose von Papillomvirus-Erkrankungen.

11. Verwendung des Proteins nach einem der Ansprüche 4-6 als Reagens zur Diagnose, Therapie von Papillomvirus- Erkrankungen und/oder zur Vakzinierung gegen solche.

12. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach einem der Ansprüche 4-6.