DE1944043B2

DE1944043B2 - Biotechnisches verfahren zur herstellung von l-asparaginase mit antitumor-aktivitaet

Info

Publication number: DE1944043B2
Application number: DE19691944043
Authority: DE
Inventors: Ichiro Suita Tosa Tetsuya Kyoto Sano Ryujiro Takatsuki Ando Katsuko Toyonaka Chibata, (Japan)
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1968-08-31
Filing date: 1969-08-29
Publication date: 1973-05-03
Also published as: US3652402A; DE1944043A1; GB1236670A; DE1944043C3; FR2016724A1

Description

Es i5.t an sich bekannt, daß !.-Asparaginase ein Enzvm ist, welches als Katalysator bei der Hydrolyse von i.-Asparagin wirkt, wobei sich !.-Asparaginsäure und Ammoniak bildet, und daß dieses Enzym durch die verschiedensten Bakterienarten bzw. -gattuncen gebildet wird, beispielsweise durch Escherichia coli, Bacillus, Pseudomonas, Salmonella, Aerobacter aerogenes. Bacterium cadaveris, Bruceila abortus, Leuconostoc mesenteroides Pasieurella tularensis und Scrratia marcescens. Von der durch Stämme von Escherichia coli oder Serralia marcescens erzeugten L-Asparag nase ist bekannt, daß sie Antittimor-Aktivität aufweist (vgl. Arch Biochem. Biophys., Bd. 105 [1964]. S. 450. Cancer Researcn, Bd. 2b [1966], S. 2213, Proc. Nat. Acad. Sei., Bd. 56 [1966], S. 1516, Biochemistry, Bd. 6 [1967], S. 721. Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 28 [1967], S. 160. Trans. N. Y. Acad. Sei., Bd. 30 [1968]. S. 690, und J. Bacteriol., Bd. 95 [1968], S. 2117 bis 2123). Eine langer dauernde Verabreichung einer solchen proteinhaltigen !--Asparaginase ruft jedoch im lebenden Organismus die Bildung von Antikörpern hervor, die zum anaphylaktischen Schock oder zur Unwirksamkeit der verabreichten !.-Asparaginase führen können.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Herstellung einer neuen i.-Asparaginase mit holier Antikimor-Aktivität zur Verfügung zu stellen, die sich in ihren immunologischen Eigenschaften von bekannter !.-Asparaginase unterscheidet. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung von !.-Asparaginase durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem hierfür üblichen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperaturen und pH-Werten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Proteus vulgaris OUT 8226 einsetzt.

Der beim erlindungsgemäßen Verfahren einzusetzende Proteus vulgaris OUT 8226 ist in der »Faculty of Engineering«, Osaka University, Japan, hinterlegt und für die Öffentlichkeit zugänglich.

Immunodiffusionstestversuche mit einem Antiserum des auf dem Markt erhältlichen i.-Asparaginase-Präparates aus einem Eschcrichia-coli-Stamm haben gezeigt, da!? die !.-Asparaginase aus Proteus vulgaris OUT 8226 und aus dem Escherichia :oli in ihren immunologischen Eigenschaften verschieden sind. Dies ist äußerst vorteilhaft, da sich durcli abwechselnde Anwendung von i.-Asparaginasen verschiedenen Ursprungs die mit der Bildung von Antikörpern verbundenen Schwierigkeiten bei der Antitumor-Therapie vermieden werden können.

Das Nährmedium zur erfindungsgemäßen Züchtung von Proteus vulgaris OUT 8226 enthält Kohlenstofflieferamen wie Glukose. Fructose. Maltose. Laci.i-.e, Citronensäure und Fumarsäure, ferner Stick-: ■:!- lieferanien. wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Pep;,,;). Polvpepton Caseinhydrolvsat und Aminosäuren. -■ ..-,ic ano'nia.mche Salze. z.B. Natriumchlorid. Kai! phosphat und Magnesiumsulfat. Man kann dan- r.v. Rahmen der Friindun<i ein Nährmedium \erwe: :..:. wie ^ ÜPÜcherueise für die Züchtung \on Bakk.v.n eingesetzt wird. L in die Ausbeute an i.-Aspara.-: ._c zu erhöhen, wird empfohlen, auch eine Amino- ·.·. wie i.-AsparaL'in- oder !.-Glutaminsäure. muzu\er,■> ·.,-

den.

Die Züchtung de< Mikroorganismus kann v.a; :, : d etwa 15 bis 72\Sumuen unter aeroben 'jcdingi:: _: .11 bei Tcmp.rauiren ir, Bereich son etwa 25 bis A< r und bei einem pll-W en im Bereich von 5 bi-, 9 u vr ständigem Schütteln oder unter Tauchhedmgi-.. ·>> erfolgen.

Bei der Züchtung sammelt sich die i.-Asparaj: . e in der Kuiuirbrühe und insbesondere in den Bakle: , nzellen an. L in das Enzym aus den Bakterien/eile·; u «e\\innen, können die üblichen Maßnahmen ;::·;_.-wendet w.-rden. wie sie auch sonst für die Isolie; :j \on 1 iizsir.en aus Mikroorganismen bekannt s J. Beispielweise kann man die Bakterienzellen ;·,;.ι Quar/>and vermählen und die aufgebrochenen /c!>n mit Wasser oder einer wäßrigen Salzlösung exln:; ;eren. Fine andere Möglichkeil besieht darin. ..!ic Baktericnzellen ?iner l.'liraschallbehandlung zu ui-u-r-

werfen.

Auch kann man die Bakterienzellen mit einem bakteriolvtischen Enzym, wie Lysozym. behändJn und anseiiließend die Zellen mit Wasser oder einer wäßrigen Salzlösung in Anwesenheit eines oberfläckenaktisen Mittels extrahieren. Eine andere Arbeitsmethode besteht danü. die Bakterienzellen einzufrieren ihid wieder aufzutauen und die so aufgebrochenen Zellen anschließend mit Wasser oder einer wäßrigen Salzlösung zu extrahieren.

Die au/diese Weise erhaltene i.-Asparaginaselösung wird dann gereinigt, wie es auch sonst für Enz.vme üblich ist. Geeignete Reinigungsmethoden bestehen z. B. darin, das Enzym mit Ammoniumsiilfat auszusalzen oder das Enzym mit einem organischen Lösungsmittel, wie Alkohol oder Aceton, auszufällen. Auch kann man die Nukleinsäuren mittels Protamin. Streptomycin oder Magnesiui.iionen abtrennen. Weiterhin kann man die Enzymlösung der Chromatographie an einem Ionenaustauscher unterwerfen. Außerdem eignen sich für die Reinigung eine Gelfiltration unter Verwendung von Dextran oder Polyacrylamid sowie eine Elektrophorese. Derartige Reinigungsmethoden sind hoKannt.

Die erfmdungsgemäß herstellbare Asparaginase weist eine hohe Aktivität bezüglich der Unterdrückung des Tumorwachstums auf. Diese Tatsache ergibt sich aus den nachstehend beschriebenen Versuchsergebnissen.

Testmethode

Versuchstieren (C3H-Mäuse, welche in zwei Gruppen von jeweils neun Versuchstieren zusammengefaßt sind) werden intraperitoneal 10000000 Tumorzellen (6C3HED) implantiert. Nach 24 Stunden werden diese Mäuse mit !.-Asparaginase (6,7 I.E.) in einer wäßrigen Lösung von Natriumbicarbonat behandelt. Die Überlebenszeit der behandelten Versuchstiere im Vergleich zu derjenigen von Mäusen, die nur mit einer

wäßrigen Lösung von Natriumbicarbonat behandelt worden sind, wird beobachtet. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt.

Tabelle

	aus	Anzahl	Überlcbenszeit,
		der
		Versuchs	Tage
		tiere	12, 12, 12, 12, 12,
Kontrollgruppe . .		9	12, 12. 13. 13

Mit Asparaginase
Proteus vulsiaris
OUT 8226 "		19. 30. 43, >180
behandelte Tiere	9	>18O. >180.
		>180. >180,
		>180

Aus diener Tabelle ist klar ersichtlich, daß die mit der eriindungsgemäß hergestellten !.-Asparaginase behandelten Versuchstiere selir viel langer lebten als die betreffenden Kontrolltiere.

Die Erlindiing /ird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert, wobei sieb die Prozentangaben auf Gewicht/Volumen beziehen.

Beispiel 1
200 ml eines wäßrigen Nährmediums (pH 7,0),

welche

0/

Fleischextrakt, l°/₀ Polypepton, 1,25%

Hefeextrakt, 1% Glukose, 0,5% Natriumchlorid und 0.2% i.-Asparagin enthält, werden mit Proteus vulgaris OUT 8226 beimpft. Die Züchtung wird während 16 Stunden unter ständigem Schütteln bei 30⁰C durchgeführt. Die Kulturbrühe wird anschließend zentritugiert. und die Bakterienzellen werden abgetrennt. Diese Zellen werden in 40 ml destilliertem Wasser suspendiert und dann 10 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung bei 1OkFl/. unterworfen. Nach dem Zentrifugieren der behandelten Suspension erhält man eine i.-Asparaginase enthaltende überstehende Flüssigkeit.

0,5 ml der überstehenden Flüssigkeit werden mit 1 ml M/20-Boralpuffer (pH 8,4) oder M/20-Acetatpuffer (pH 5.0) sowie 0,5 ml einer 0,04 M-Asparaginlüsung 30 Minuten bei 37°C inkubiert, und mittels der 'ndophenolmethode wird die durch eine solche Mischung freigesetzte Ammoniummenge bestimmt. Die enzymatische Aktivität wird durch die internationale Einheit (Freisetzung von I mMol Ammoniak

je Minute) definiert. In 200 ml KulUirbrühe sind

72,0 I.E. !.-Asparaginase, gemessen bei pH 8,4. und

50,8 I.E. !.-Asparaginase, gemessen bei pH 5,0, enthalten.

B e i s ρ i e 1 2

Ein Rüttelfermentor wird mit 101 eines Nährmediums (pH 7,0) beschickt, welches 100 g Fleischextrakt, 100 g Polypepton, 125 g Hefeextrakt. 100 g

ίο Glukose, 50 g Natriumchlorid, 20 g i.-Asparagin und 5 Natriumhydroxid enthält. Nach dem Sterilisieren wird das Nährmedium mit Proteus vulgaris OUT 8226 beimpft. Die Züchtung wird 20 Stunden bei 30'C mit. einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 l/Minute und einer Rührgeschwindigkeil von 300 UpM durchgeführt. Die Kulturbrühe wird anschließend zentrifugiert, und die abgetrennten Bakterienzellen werden in 1 1 destilliertem Wasser suspendiert.

Diese Suspension wird 1 Stunde bei 10 kHz mit Ultraschall behandelt und dann zentrifugiert. Zu der abgetrennten überstehenden Flüssigkeit, welche 5200 I.E. !.-Asparaginase, gemessen bei pH 8,4, und 3500 I.E. !--Asparaginase, gemessen bei pH 5,0, enthält, setzt man 50 ml 1 M-Manganchloridlösung hinzu.

Der sich bildende Niederschlag wird abzentrifugiert. Zu der üherstenenden Flüssigkeit setzt man 418 g Ammoniumsulfat hinzu und entfernt den gebildeten Niederschlag wiederum durch Zentrifugieren. Zu der so erhaltenen überstehenden Flüssigkeit setzt man nochmals 190 g Ammoniumsulfat hinzu und trennt den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren ab. Der Niederschlag wird dann in destilliertem Wasser gelöst und 24 Stunden dialysiert. Das Dialysat wird in einer mit Diälhylaminoä"^!ivlcellu!ose gelullten Chromatographiersän.le gereinigt. Die Fraktionen mit !--Asparaginase-Aktivität werden gesammelt, 48 Stunden lang dialysiert und dann lyophilisiert. Man erhält so 2340 I.E. ecreinigte i.-Asparaginase, gemessen bei pH 8,4.

B e i s ρ i e 1 3

Ein Fermentor wird mit 90 1 Nährmedium (pH 7,0) beschickt, das 4,5 kg Maisquellflüssigkeit und 1,8 kg Natriumfumarat enthält. Nach dem Sterilisieren wird das Nährmedium mit Proteus vulgaris OUT 8226 beimpft. Die Züchtung wird während 20 Stunden bei 30°C mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 45 l/Minute, einer Rührgeschwindigkeit von 150 UpM und einem Druck von l,6kp/cm² durchgeführt. In ImI Kultur sind dann 3,3 I.E. i.-Asparaginase enthalten. Dieser Wert liegt höher als der entsprechende Höchstwert in J. Bacieriol., Bd. 95 (1968), S. 2117 bis 2123.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung \on ι.-Asparaginase durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem hierfür üblichen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperaturen und pH-Werten, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Proteus vulgaris OUT 8226 einsetzt.