DE1807185B2

DE1807185B2 - Verfahren zur Herstellung von proteolytische Enzyme enthaltenden Aufbereitungen und deren Verwendung

Info

Publication number: DE1807185B2
Application number: DE1807185A
Authority: DE
Inventors: Knud Farum Aunstrup
Original assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Current assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Priority date: 1967-11-10
Filing date: 1968-11-06
Publication date: 1979-02-08
Also published as: DE1807185A1; NL6815944A; US3674643A; CH523319A; SE372561B; FR1599036A; GB1205403A; IL30998A; DE1807185C3; BR6803854D0; RO71501A; BE723649A; ES360055A1; AT290444B; IL30998A0

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer proteolytischer Enzymaufbereitungen, die für gewisse industrielle Zwecke, wo es auf eine ausgeprägte proteolytische Aktivität bei sehr hohen pH-Werten ankommt, einsetzbar sein sollen.

Es ist bekannt, daß ein Anzahl von Bakterien während ihres Stoffwechseis proteolytische Enzyme erzeugen und daß einige dieser Bakterien in industriellem Umfange kultiviert worden sind zum Zwecke der Gewinnung der erzeugten proteolytischen Enzyme. Die derart hergestellten Enzymaufbereitungen zeigen indessen eine optimale proteolytische Aktivität bei einem pH-Wert unterhalb 9, wenn diese Aktivität nach der bekannten Anson-Hämoglobinmethode in Anwesenheit von Harnstoff (Journal of General Physiology, 22,79-89 (1939)) gemessen wird. Für viele industrielle Zwecke wird aber gewünscht, daß die optimale proteolytische Aktivität bei höheren pH-Werten (10—12) liegt

In der holländischen Zeitschrift »Antonie von Leeuwenhoek«, 1,141-147(1934) hat A. V e d d e r seine Versuche zur Isolierung gewisser Bakterien aus dem Fäzes beschrieben. Durch eine Anreicherung in alkalischem Peptonwasser und Kultivierung auf »Glykokoll Platten«, welche Hämoglobin, KOH, Glykokoll und Peptonagar enthalten oder noch besser auf »Karbonat Platten« (diese Platten sind von V e d d e r so genannt worden), welche Hämoglobin, K2CO3, KHCO3 und Peptonagar enthalten, gelang es V e d d e r, 16 Stämme eine Bakteriums zu isolieren, das zur Gattung Bacillus gehört und nach V e d d e r als einer neuen Spezies zugehörend angesehen werden kann, die er Bacillus alcalophilus nannte, weil diese Spezies nur bei pH-Werten oberhalb 7, vorzugsweise im Bereich von 8,6 bis 10 wächst Im Zusammenhang mit der Beschreibung von Bacillus alcalophilus wurde von

V e d d e r darauf hingewiesen, daß die zu dieser Spezies _bo gehörenden Bakterien in stark alkalischem Milieu Eiweiß (Gelatine, Hämoglobin) spalten. Die Spezies Bacillus alcalophilus wurde in die 6. Ausgabe von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, jedoch nicht in die 7. Ausgabe aufgenommen.

Ein Stamm von Bacillus alcalophilus wurde von

V e d d e r beim National Collection of Type Cultures in London unter der NCTC-Nummer 4553 hinterlegt, und dieser Stamm wurde später 1956 unter der NCIB-Nummer 8772 hinterlegt, wo der Stamm durch ein Versehen als ein Bacillus Subtilis angesehen wurde.

Es wurde nun gefunden, daß die Stämme von Bacillus alcalophilus unter bestimmten Züchtungsbedingungen während ihres Stoffwechsels neue proteolytische Enzyme extrazellular erzeugen, die eine ausgeprägte Aktivität bei hohen Alkalitätsgraden (pH 10-12) zeigen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von Bacillus alcalophilus unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert wird, das assilimierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, wobei der pH-Wert des Nährmediums auf einen Wert zwischen 7,5 und 11 eingestellt wird, und daß anschließend die während der Kultivierung extrazellular erzeugte proteolytische Enzymaufberekung abgetrennt wird. Dabei wird die Kultivierung vorzugsweise unter submersen Bedingungen durchgeführt

Das Nährmedium ist nach den hierfür bekannten Grundsätzen zusammengesetzt Geeignete assimilierbare Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie z. B. Saccharose, Glukose, Stärke, Getreidekörner, Malz, Reis, Zuckerhirse usw. Die Kohlehydratkonzentration kann in weiten Grenzen variieren, z. B. nach oben bis zu 25% und nach unten bis 1 —5%. Im allgemeinen erweist sich eine Konzentration von 8—10% als zweckmäßig, wobei der Prozentsatz auf Dextrose bezogen ist Es wurde festgestellt, daß die Anwesenheit von Kohlehydraten im Nährmedium den Anlaß zur Bildung von sauer reagierenden Verbindungen gibt, was sich in einer Abnahme des pH-Wertes während der Kultivierung äußerst Da es wesentlich ist, einen pH-Wert im obenerwähnten Nährmedium im Bereich von 7,5—11, vorzugsweise S—10, aufrechtzuerhalten, sollen während des Züchtens Maßnahmen dagegen getroffen werden, daß der pH-Wert während der Kultivierung während einer nennenswerten Zeitdauer auf einen unterhalb des vorgenannten Bereichs liegenden Wert abfällt Um den pH-Wert innerhalb des gewünschten Bereichs zu halten, kann eine begrenzte Menge an Kohlehydraten zusammen mit einer Puffersubstanz verwendet werden, die in der Lage ist, den gewünschten pH-Wert einzustellen. Karbonate und insbesondere Sesquikarbonate in einer Konzentration bis zu 0,2 M im Medium können einen pH-Wert von etwa 9,3 bis 10,5 herbeiführen.

Es können natürlich auch andere Puffersysteme, wie z. B. Phosphatpuffer, eingesetzt, werden.

Es ist auch möglich, das Züchten mit einem niedrigen Kohlehydratgehalt zu beginnen und während des ZUchtens nach und nach kleine Mengen an Kohlehydrat zuzusetzen.

Eine dritte Möglichkeit besteht in der Anwendung einer automatischen pH-Kontrolle durch Zusatz von verschiedenen basisch reagierenden Substanzen, wie sie auf diesem Gebiet verwendet werden.

Die Verwendung von Karbonaten und Sesquikarbonaten als pH regelnde Substanzen erweist sich als sehr zweckmäßig. Es ist überraschend, daß es während des Züchtens in einem industriellen Umfange möglich ist, diese Substanzen in den vorerwähnten Konzentrationen einzusetzen.

Bei der Stickstoffquelle des Nährmediums kann es sich um eine solche von anorganischer und/oder organischer Natur handeln. Geeignete anorganische Stickstoffquellen sind Nitrate und Ammoniumsalze. Unter den organischen Stickstoffquellen gibt es eine

ganze Anzahl, die als für Fermentationsprozesse und für das Züchten von Bakterien geeignet bekannt sind. In diesem Zusammenhang sei beispielsweise auf Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Kasein, eine Aufschlämmung von gequollenem Mais, Hefeextrakte, Harnstoff, Albumin usw. hingewiesen.

Außerdem sollte das Nährmedium die üblichen Spurensubstanzen enthalten.

Die Temperatur, bei der das Züchten durchgeführt wird, liegt normalerweise in demselben Bereich wie beim bekannten Züchten von bekannten Spezies der Gattung Bacillus. Im allgemeinen sind Temperaturen zwischen 25 und 40° C zweckentsprechend. Vorzugsweise liegt die Temperatur zwischen 30 und 37° C

Da das Züchten unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden muß, ist es bei Einsatz von Fermentationstanks notwendig, eine künstliche Belüftung vorzusehen. Die Luftmenge entspricht derjenigen bei den bekannten Züchtungen.

Im allgemeinen werden maximale Ausbeuten der proteolytischen Enzyme nach einer Züchtungszeit von 1 bis 5 Tagen erhalten.

Die Züchtungsversuche sind sowohl in Schüttelflaschen als auch in Fermentationseinrichtungen von Versuchsanlagen mit künstlicher Belüftung durchgeführt worden. Die erhaltenen Ausbeuten wurden nach der genannten Ansonhämoglobinmethode bestimmt In dieser Beschreibung bedeutet eine Anson-Einheit die Menge an proteolytischem Enzym, welche Hämoglobin bei einem pH-Wert von 10,1 und einer Temperatur von 25° C während einer Reaktionszeit von 10 Minuten mit einer solchen Anfangsgeschwindigkeit aufschließt, daß pro Minute eine solche Menge an Spaltprodukten gebildet wird, die mit Trichloressigsäure nicht ausgefällt werden kann und wobei diese Spaltprodukte mit Phenolreagenz dieselbe Farbe ergeben wie ein Milliäquivalent von Tyrosin.

Für das Züchten wurden die folgenden beiden Medien eingesetzt:

1) Medium BPFA folgender Zusammensetzung:

Kartoffelmehl Saccharose Gerstenmehl Sojabohnenmehl Natriumkaseinat

Na₂HPO₄ · 12 H₂O

50 g pro Liter Leitungswasser 50 g pro Liter Leitungswasser 50 g pro Liter Leitungswasser 20 g pro Liter Leitungswasser 10 g pro Liter Leitungswasser 9 g pro Liter Leitungswasser

2) Medium BSX folgender Zusammensetzung:

Gerstenmehl 100 g pro Liter Leitungswasser Sojabohnenmehl 30 g pro Liter Leitungswasser

Diese beiden Medien wurden auf den gewünschten pH-Wert durch Zugabe von Sesquikarbonat oder Soda unter sterilen Bedingungen eingestellt

Für die mit Schüttelflaschen durchgeführten Versuche wurden 500 mm Schüttelflaschen eingesetzt, wobei jede Flasche 100 ml des Nährmediums BPFA und BSX enthielt, das vorher im Autoklaven während 90 Minuten bei 120⁰C sterilisiert und hiernach durch Zugabe von Natriumkarbonat oder Natriumsesquikarbonat in einer Konzentration von 0,2 M bzw. 0,1 M auf einen pH-Wert zwischen 9,3 und 103 eingestellt wurde. Für jedes Bakterium wurden vier Flaschen verwendet Die von den Kulturmedien für die Bestimmung des Enzymgehalts in Ansoneinheiten benötigten Proben wurden nach einer Kultivierung von 3, 4, 5 und 6 Tagen abgezogen.

Die Flaschen wurden während des Züchtens auf einem rotierenden Tisch mit 220 U/Min, abgestellt und die Temperatur lag bei 30° C

Die in Ansoneinheiten pro kg Nährmedium gemessene maximale proteolytische Aktivität geht aus der nachstehenden Tabelle I hervor:

Tabele I

Bacillus	Nähr	Maximale	End-
Alcalophilus	medium	proteolytische	pll-Wert
		Aktivität
		Ansoneinheiten
		pro kg
NCIB 8772	BPFA	14	7,7
		25	7,7
	BSX	6	8,8
		2,5	8,2
NCTC 45 53	BPFA	16	7,9
		13	7,6

Bei einer fraktionierten Fällung mit Äthylalkohol wurden pulverförmige Aufbereitungen erhalten. Wie hierbei verfahren wurde, ergibt sich aus der nachfolgenden Tabelle II:

	Tabelle II	NCIB 8772	NCTC 4553
	Bacillus Alcalophilus
35	A usgangsmaterial	0,10	0,25
	Kulturbrühe in kg	7,6	12
	Ansoneinheiten pro kg	0,76	3
	Ansoneinheiten
40	insgesamt
	1. Fällung	3	0,75
	g Kieselgur	150	385
	ml C₂HsOH
45	2. Fällung	2,5	3
	g Kieselgur	370	770
	ml C₂H₅OH
	Ausbeute	4,4	5,3
50	Pulver in g	0,14	0,3
	Ansoneinheit pro g
	(gemessen bei pH 10,1)	0,62	1,6
	Ansoneinheit insgesamt	81	53
	%

Der Stamm NClB 8772 wurde ebenfalls in 5501 Tanks aus rostfreiem Stahl unter submersen Bedingungen und bei künstlicher Belüftung und Verwendung von 2501 des vorerwähnten BPFA-Nährmediums gezüchtet Der pH-Wert des Mediums wurde durch sterile Zugabe von 151 einer 2 M Sodalösung auf 10,2 eingestellt Während des Züchtens betrug die Temperatur 3O⁰C, die Geschwindigkeit des Rührers 570 Drehungen pro Minute und die Belüftung 0,25 m³ Luft pro Minute. Nach einer Züchtungszeit von HO Stunden lag der pH-Wert ,der Brühe bei 8,9 und die proteolytische Aktivität betrug 17 Ansoneinheiten pro kg, gemessen bei pH 10,1.

Die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten Enzymaufbereitungen wurden in bezug auf die prcteolytische Aktivität gegenüber Hämoglobin bei verschiedenen pH-Werten und verschiedenen Temperaturen untersucht Die Aktivität wurde bei pH 7, 7,5, 8, 9, 10, 11 und 12 bei 25^D gemessen und in dem Prozentsatz der maximalen Aktivität ausgedrückt Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle III zusammengestellt:

Tabelle III

pH-Wert 7 7,5 8

10 11 12

NCIB 8772

NCTC 4553

Temperatur C

25 37 50 60 66

75

NCTC 4553 % Aktivität bei bei pH 10,1

10

15

50 75 85 100

33 54 67 71 85 100 44 70 80 100

34 52 M 72 79 100

Die Aktivität wurde ebenfalls bei einem konstanten pH-Wert von 10,1 und unterschiedlichen Temperaturen, nämlich 25°, 37°, 50°, 60°, 66° und 75° C gemessen. Die bei diesen Messungen erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengestellt:

Tabelle IV

30

14 32 65 100 26 2 ₃>

Im allgemeinen werden die durch die Erfindung erhältlichen neuen Enzyme in kleinen Mengen eingesetzt Im Hinblick hierauf besitzen die Enzymaufbereitungen im Rahmen der Erfindungsdefinition für industrielle Zwecke normalerweise einen Enzymgehalt von nicht mehr als etwa 10Gew.-%. In einigen Fällen kann jedoch der Enzymgehalt beträchtlich höher sein. 4 ■-,

Die nach der Erfindung erhaltenen Enzymaufbereitungen werden als Bestandteil von Detergenzien (Waschmittel, Geschirrspülmittel) eingesetzt

Das in der oben beschriebenen Weise vom Stamm 8 772 erhaltene Enzympulver wurde bei Waschversuchen eingesetzt, die unter Verwendung von EMPA-Teststreifen oder -stücken No. 116 durchgeführt wurden, die mit Blut, Milch und RuB beschmutzt waren.

Das verwendete Detergenz hatte die folgende Zusammensetzung:

Dodecylbenzolsulfonat (50%) 20 g Nonylphenol 9,5 EO 5 g Natriumtripolyphosphat 30 g Natriumkarbonat, anhydr. 15 g

CMC (45%) 2 g

Natriumsulfat, anhydr. 28 g

Der Waschversuch wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Wasserhärte in deutschen

Einheiten 10°

Faser/Wasserverhältnis 1 :20

Versuchsdauer	30 Minuten
pH-Wert	etwa 10
Konzentration des
Detergenz	4,8 g/l der Waschlö
	sung
Proteolytische Aktivität
gemessen bei pH 7,5	0,04 Ansoneinheiten
	pro liter
	Waschlösung
WaschtemDeratur	60 und 70⁰C

b0 Der Waschprozeß wurde bei 6O⁰C wie folgt durchgeführt:

Mit einer Pipette wurden 20 ml einer aus dem vorerwähnten Enzympulver hergestellten Lösung, die eine Temperatur von 20⁰C, einen pH-Wert von 11,2 und eine proteolytische Aktivität von 0,24 Ansoneinheiten pro Liter besaß, in ein 200 ml Becherglas gegeben. Gleich zu Beginn, also zum Zeitpunkt 0, wurden 100 ml der Detergenzlösung zugesetzt, die auf einen pH-Wert von 113 und auf eine Temperatur von 68°C eingestellt war. Die Mischung wurde sofort in eine langhalsige Erlenmeyer-Flasche mit einem Fassungsvermögen von 200 ml überführt, die auf einem Schütteltisch abgestellt und in Wasser von 6O⁰C eingetaucht war. Die Erleimeyer-Flasche enthielt schon vorher 6 EM PA-Streifen 116, die insgesamt 3,0 g wogen. Das Schütteln wurde während des 30minütigen Waschvorganges fortgesetzt Dann wurde die Waschlösung abgetrennt und der pH-Wert nach dem Abkühlen gemessen. Die Teststreifen wurden abgespült und zwischen den Fingern unter der Wasserleitung entnommenem heißen Wasser gerieben. Sämtliche Teststreifen wurden in einem Beckmann-Spektrophotometer bei 460 πιμ Remissionsmessungen unterworfen.

Bei den bei 70⁰C durchgeführten Untersuchungen hatte die Detergenzlösung eine Temperatur von 8O⁰C

Neben diesen Versuchen wurden noch Kontrollversuche durchgeführt, bei denen die Enzymlösung durch Wasser ersetzt wurde.

Darüber hinaus wurden alle Versuche auch mit einem Zusatz von 1 g Perborat (NaBO₃, 4 H₂O) pro Liter Waschlösung ausgeführt

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle V zusammengestellt:

Tabelle V	Ohne 60 C	Perborat 70C	Mit Perborat 60 C
	54,7 46,7	49,2 46,2	41,5 31,5
Enzympulver NClB 8772 Kontrolle ohne Enzym

Die Remissionswerte stellen Durchschnittszahlen der bei jedem der sechs Teststreifen jedes Versuchs durchgeführten Messungen dar.

Die mit den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Enzymaufbereitungen erzielbaren Wirkungen waren selbst unter Berücksichtigung des früheren Hinweises von A. V e d d e r, daß Bacillus alcalophilus in stark alkalischem Milieu Eiweiß (Gelatine, Hämoglobin) spaltet, nicht voraussehbar. Abgesehen davon, daß es

am Prioritätstag zum allgemeinen Wissens- und Erfahrungsstand gehörte, daß Gelatine und Hämoglobin unter bestimmten, nicht-enzymatischen Bedingungen abgebaut werden, z. B. durch Alkalien, wie sie oft während des Wachstums von Mikroorganismen erzeugt werden (vgl. »Manual of Microbiological Methods by the Society of American Bacteriologists«, McGraw Hill, New York, 1967 insbes. S. 158/159; »Topley and Wilson's Principles of Bacteriology and Immunity«, 5. Ausgabe insbes. S. 652/653) oder im Falle von Hämoglobin durch die von allen Bacillus-Arten erzeugte Milchsäure, konnte durch Untersuchungen nachgewiesen werden, daß unter den von A. V e d d e r angewandten Bedingungen eine starke proteolytische Wirkung auch solcher Enzyme zu beobachten ist, deren Akuivitätsoptimum irn saueren, neutralen oder schwach alkalischen Bereich liegt. Somit konnte der Fachmann aus dem Hinweis von V e d d e r auf eine Spaltungswirkung von Bacillus alcalophilus in stark alkalischem Milieu auf Eiweiß nicht folgern, daß durch diese Species extrazellular eine Protease erzeugt wird, die sich von bekannten Proteasen dadurch unterscheidet, daß ihr Aktivitätsoptimum sehr viel weiter im alkalischen Bereich (oberhalb pH 10) liegt und auch noch bei sehr hohen pH-Werten ausreichen stabil ist. Nach solchen Proteasen bestand am Prioritätstag bereits seit längerer

ίο Zeit ein starkes Bedürfnis, nachdem seit den 50er Jahren eine sehr starke Forschungsaktivität zur Entwicklung von Waschmitteln auf Enzymbasis eingesetzt hat. Bei der Verwendung der bekannten alkalischen Proteasen in Detergenzien war jedoch die Stabilität und Aktivität

υ der Enzyme bei hohen pH-Werten (oberhalb 10) unbefriedigend.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung proteolytischer Enzymaufbereitungen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von Bacillus alcalophilus unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert wird, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, wobei der pH-Wert des Nährmediums auf einen Wert zwischen 7,5 und 11 eingestellt wird, und daß anschließend die während der Kultivierung extrazellular erzeugte proteolytische Enzymaufbereitung abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung unter submersen Bedingungen durchgeführt wird.

3. Verwendung einer nach dem Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche erhaltenen Enzymaufbereitung in Waschmitteln und Geschirrspülmitteln.