DE1792555C3

DE1792555C3 - Verfahren zur Herstellung einer für die intravenöse Anwendung geeigneten Gammaglobulinlösung

Info

Publication number: DE1792555C3
Application number: DE19681792555
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dipl.-Chem. Dr. 6078 Neu-Isenburg Stephan
Original assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Current assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Priority date: 1968-09-19
Filing date: 1968-09-19
Publication date: 1980-01-10
Also published as: SE409546B; GB1244245A; FR2018394A1; DE1792555B2; AT290015B; CH525003A; BE837492Q; NL145143B; DE1792555A1; NL6914254A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer für die intravenöse Anwendung geeigneten Gammaglobulinlösung.

Durch Fraktionierung hergestelltes Gammagio· bulin hat bekanntlich die Eigenschaft. Komplement zu fixieren. (Parandum, S. »Die Gamma-Globulin-Therapie«, S. Karger Verlag, Basel 1964, 32). Es ist aus diesem Grunde für eine intravenöse Anwendung nicht geeignet, sondern lediglich für eine intramuskuläre Anwendung. Da die Antikörperwirksamkeit aber bei einer intravenösen Anwendung vollständiger ist und vor allem sofort eintritt, hat es nicht an Versuchen gefehlt, intravenös verträgliche Gammaglobulin-präparate herzustellen.

Die biologische Funktion der Antikörper besteht in der Elimination von Bakterien und Viren sowie in tier Neutralisation von Toxinen. Das Antigen bindende Fragment des Antikörpermoleküls sorgt dabei zunächst für die Erkennung und Neutralisation von Erregern. Der entstehende Antigen-Antikörper-Komplex bewirkt eine Aktivierung des Komplement bindenden Fragments des Moleküls. Dadurch werden eine Reihe von immunologischen Folgereaktionen in Gang gesetzt, deren wesentlichste die Phagozytose und die spezifische Aktivierung des Komplementsystems sind. Die spezifische Aktivierung des Komplementsystems, die man klar von der unspezifischen (antikomplementäre Wirkung) unterscheiden muß, bewirkt bei bakteriellen Infektionen eine Bakteriolyse. Als weitere Folge der Komplementaktivierung werden Anaphylatoxine und chemotaktische Faktoren »dosiert« freigesetzt. Die Anaphylatoxine sorgen durch Erhöhung der Gewebedurchlässigkeit für eine gesteigerte Antikörperkonzentration am Ort der Infektion, während die chemotaktischen Faktoren die Phagozytose unterstützen Somit kommt bei der Infektabwehr dem Komplement bindenden Fragment (Fc-Teil) des Immunglobulin-G-Moleküls eine überragende Bedeutung /u. Klinisch von besonderer Bedeutung ist die In-vivo-Halbwertszeit der in intravenösem Gammaglobulin enthaltenen Antikörper. Je langer die In-vivo-Halbwcrtszeit ist. um so langer kreisen die zugeführten Antikörper im Blui und um so länger stehen sie Tür eine prophylaktische Wirksamkeit ZUf Verfugung« Dies ist Von entscheidender Bedeutung bei Krankheiten, in deren Verlauf der Organismus nicht in der Lage ist, Antikörper zu bilden, Man ist in solchen Fällen gezwungen, die Antl· körper laufend zuzuführen. Je weniger oft dies notwendig ist, um so einfacher ist insbesondere eine ambulante Behandlung durchzuführen.

Es sind bereits Verfahren bekannt, um aus Komplement fixierendem Human-Standard-Gammaglobulin ein intravenös verträgliches Präparat herzustellen. Diese Verfahren beruhen darauf, daß das durch herkömmliche Fraktionierverfahren wie die Cohnsche Alkoholfraktionierung und die -2-Äthoxy-6,9-diaminoacridin-Ammonsuifat-Fraktionierung gewonnene Komplement fixierende Human-Standard-Gammaglobulin hydrolytisch in die einzelnen Fragmente gespalten und so die Komplementfixierung beseitigt wird. Die eine dieser beiden Methoden führt die Aufspaltung mit Pepsin durch (Schulze, H. E. und Schwick, G., DMW 87, 1643 [1962]), die andere Methode bedient sich der Hydrolyse durch Salzsäure bei einem pH-Wert von 4,0 (B a rand um, S., Kistler, P., Vox. Sang. 7, 157 [1962]). Die erhaltenen Präparate liefen in ihrer Halbwertszeit unter dem Nativ-Ga.nmaglobulin (G. Riva, Helvetica Medica Acta 415, 286 [1963]).

überraschenderweise wurde nun gefunden, daß man ein PJr eine intravenöse Anwendung geeignetes Gammaglobulin mit einer gegenüber den bekannten Produkten verlängerten Halbwertszeit der Antikörper erhält, wenn man Standard-Humanglobulin mit kritischen Mengen /f-Propiolacton behandelt. Während bei den bekannten Verfahren ein Proteinabbau oder eine Denaturierung eintreten, bleibt bei dem erfindungsgemäß hergestellten Produkt der für die Mobilisierung der erwähnten immunologischen Hilfsmechanismen verantwortliche Fc-feil des Antikörpermoleküls erhalten. Beweisend für die Intaktheit des Fc-Teiles ist die Tatsache, daß Antikörper neben der Neutralisations- und Hämagglutinations-Methode auch mit der Kom:>lementbindungsreaktion (KBR) nachweisbar sind Die Halbwertszeit des erfindungsgemäßen Gammaglobulins entspricht der natürlichen Halbwertszeit der Immunglobuline.

Man hat ^-Propiolacton bereits zur Behandlung von Kaninchen-Immunseren verwendet. Die angewendeten hohen Konzentrationen bewirkten jedoch eine Zerstörung der Antikörpereigenschaften, so daß die durch die Modifizierung denaturierten Proteine lediglich für emc kosmetische Anwendung in Form von Cremes und Salben in Frage kommen (J oos.

Chem. Abstracts. 55 25 74 [ 1961]).

Gegenstand der (Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer für die intravenöse Anwendung geeigneten Gammaglobulinlösung. das dadurch gekennzeichnet ist. daß man eine Lösung von Standard-Gammaglobulin bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 8.0 mit 0.043 ml ,ί-Propiolacton pro g Protein versetzt und I Stunde unter Nachstellen des pH-Wertes auf 8.0 stehenläßt, anschließend bei 37 C etwa 3'₂ Stunden unter Nachstellen des pH-Wertes auf 8.0 stehenläßt, dialysiert und sterilfiltriert.

Die günstigen Eigenschaften des mit ,i-Propiolacton gemäß der Erfindung modifizierten Gammaglobuhns zeigen folgende t'ntersuchungcn. die mit einer 5"„igen Lösung durchgeführt wurden:

L. Klinische Verträglichkeit

Es wurde eine 5%ige Lösung injiziert. Die Verträglichkeit des überwiegönd immunglobulin G einhaltenden Präparates war auch bei rascher Injektion gut. Zwischenfälle würden bei 46 Pföbändert mit zusammen 95 Injektionen nicht beobachtet, tntracuiäntestungen ließen keine Antikörperentwicklung gegen das Präparat erkennen. Die Wirksamkeit entspricht,

so weit festgestellt wurde, der der intramuskulär anwendbaren Präparate, deren Nachteile wie Schmerzhaftigkeit, Hämatombildungbei hämorrhagischer Diathese, Infiltrate, Verluste durch Proteolyse, langsame Resorption jedoch fehlen.

2. Akute Verträglichkeit an der Maus 100 ml/kg werden reaktionslos vertragen.

3. Chronische Verträglichkeit

Das Präparat wurde alle 2 Tage 3 Wochen in einer Dosis von 20 ml/kg intravenös Ratten injiziert Insgesamt erhielt jede Ratte 10 Injektionen mit zusammen 200 ml kg. Das Ausgangsgewicht der Ratten betrug etwa 80 bis 100 g (nicht höher als 120 g). Täglich wurde das Gewicht kontrolliert, einmal wöchentlich ein Differentialblutbild angefertigt sowie Blutkörperchen-Senkungsgeschwindigkeit und Leukozytenzahl bestimmt. Bei Versuchsende wurde eine Nierenfunktionsprüfung (Phenolrotausscheidung) durchgeführt und außerdem ein makroskopischer Sektionsbefund erhoben: Es zeigten sich gegenüber der NaCI-Kontrolle keine krankhaften Veränderungen.

4. Antigenität

Durch intramuskuläre und intravenöse Immunisierung von Kaninchen wurden keine präzipitierenden Antikörper gegen die durch die /J-Propiolactonbehandlung eingeführten Gruppen erhalten.

5. Komplementfixierung und Antikörperaktivität Tabelle I

Priiparai

'/-Globulin hergestellt durch ^-Äthoxy-o^-diaminoacridin-Ammonsulfatfraktionierung von Humanserum

j-Globulin gemäß Erfindung

Masern

1:8192 1:8192

Polio!

:50 :50

Poüoü	Pockcn- vaccine
1:50	1.32
1:50	1:32

Knmplfmeniverhr 0.5 ml

0,40 ml

entspricht einer 0.9%igen

NaCI-Lösung

6. Antikörperaktivität Tabelle 2

Antikörper gegen

Masern-Virus

Herpes simplex-Virus ...

Influenza A₂

Influenza B

Parainfluenza 1,2,3

Cytomegalie- Virus

Röteln-Virus

Pocken-Virus

Aü/SH-Antigen

Polio I

Proteus vulgaris

Pseudomonas Aerogenes

E.Coli

Klebsiellen

Salmonellen

Antistreptolysin O

Γι tnik

KBR

HHT

NT

HT

Reziproke Tiler

20

40

20 512

16

64

80

80 160

80

80 450 I. E./ml Antikörpermangel und durch Messung von spezifischen Antikörperaktivitäten bestimmt.

Ergebnisse

Methode

Spezifische Antikörperaktivität

Halbwerts
zeit

(Tage)

Literatur

HFI Γ Mamagglulinationshemmungs-Tesl.

M Γ HamagglutirKiltons-Tesl

N Γ Neutralisations-fest.

KBR K'implemcnlbindungsrcaktion.

7, Halbwertszeit des Immunglobulin G

Die Halbwertszeit des /^Propiolacton modifizierten ImmUnglobuHns G wurde durch Verfolgung des Gesamt-immunglobulin-G-gehaltes bei Patienten mit 17 B. Kornhuber, Klin. Wochenschrift, 51 (3), 135 (1973)

Gesamtimmun- 14 W. S tan gel und

globulingehalt H. Deicher, Bio

test-Mitteilung 29, 59(1972)

Die Halbwertszeit ist somit vergleichbar mit der für Normal-Humaii-immunglobulin gefundenen HaIbwertszeit von 14 bis 28 Tagen.

Beispiel

Standard - Gammaglobulinlösung (Proteinkonzentration 7 bis 10%) wird bei 20⁰C auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und 0,043 ml /i-Propiolacton je g Protein zugegeben. Man läßt 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen, dabei wird der pH-Wert alle 20 Minuten auf 8,0 nachgestellt. Die Hydrolyse wird anschließend bei 37° C durchgeführt, wobei man den pH-Wert alle 20 Minuten nachstellt (Hydrolysedauer etwa 3V2 Stunden), Man dialysiert dann 20 Stunden gegen physiologische Kochsalzlösung, zentrifugiert gegebenenfalls 10 Minuten bei 5000 UpM, stellt die Lösung auf 5,0% Protein ein und filtriert steril durch Membranfilter.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung einer für die intravenöse Anwendung geeigneten Gammaglobulinlösung, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung von Standard-Gammaglobulin bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 8,0 mit 0,043 ml /i-Propiolacton/g Protein versetzt und 1 Stunde unter Nachstellen des pH-Wertes auf 8,0 stehenläßt, anschließend bei 37° C etwa 3¹I₂ Stunden unter Nachstellen des pH-Wertes auf 8,0 stehenläßt, dialysiert und sterilfiltriert.