DE1792555B2

DE1792555B2 - Verfahren zur Herstellung einer für die intravenöse Anwendung geeigneten Gammaglobulinlösung

Info

Publication number: DE1792555B2
Application number: DE19681792555
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dipl.-Chem. Dr. 6078 Neu-Isenburg Stephan
Original assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Current assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Priority date: 1968-09-19
Filing date: 1968-09-19
Publication date: 1974-11-07
Also published as: SE409546B; GB1244245A; FR2018394A1; AT290015B; CH525003A; DE1792555C3; BE837492Q; NL145143B; DE1792555A1; NL6914254A

Description

so weit festgestellt wurde, der der intramuskulär anwendbaren Präparate, deren Nachteile wie Schmerzhaftigkeit, Hämatombildungbei hämorrhagischer Diathese, Infiltrate, Verluste durch Proteolyse, langsame Resorption jedoch fehlen.

2. Akute Verträglichkeit an der Maus 100 ml/kg werden reaktionslos vertragen.

IO

3. Chronische Verträglichkeit

Das Präparat wurde alle 2 Tage 3 Wochen in einer Dosis von 20 ml/kg intravenös Ratten injiziert. Insgesamt erhielt jede Ratte 10 Injektionen mit zusammen 200 ml/kg. Das Ausgangsgewicht der Ratten betrug etwa 80 bis 100 g (nicht höher als 120 gj. Täglich wurde das Gewicht kontrolliert, einmal wöchentlich ein Differentialblutbild angefertigt sowie Blutkörperchen-Sekungsgeschwindigkeit und Leukozytenzahl bestimmt. Bei Versuchsende wurde eine Nierenfunktionsprüfung (Phenoirotausscheidung) durchgeführt und außerdem ein makroskopischer Sektionsbefund erhoben: Es zeigten sich gegenüber der NaCl-Kontrolle keine krankhaften Veränderungen.

4. Antigenität

Durch intramuskuläre und intravenöse Immunisierung von Kaninchen wurden keine präzipitierenden Antikörper gegen die durch die /S-Propiolactonbehandlung eingeführten Gruppen erhalten.

5. Komplementfixierung und Antikörperaktivität Tabelle 1

Präparat

^-Globulin hergestellt durch ^-Äthoxy-o^-diaminoacridin-Ammonsulfatfraktionierung von Humanserum

-Globulin gemäß Erfindung

Masern

1:8192 1:8192

Polio I

1:50 1:50 Polio Il

1:50
1:50

Pockenvaccine

1:32
1:32

Komplementverbr. Ό.5 ml

0,40 ml

entspricht einer 0,9%igen

NaCl-Lösung

6. Antikörperaktjvität Tabelle 2

Antikörper gegen

Masern-Virus

Herpes simplex-Virus ...

Influenza A₂

Influenza B

Parainfluenza 1,2,3

Cytomegalie-Virus

Röteln-Virus

Pocken-Virus

AU/SH-Antigen

Polio I

Proteus vulgaris

Pseudomonas Aerogenes

E. CoIi

Klebsiellen

Salmonellen

Antistreptolysin O

Technik

KBR

HHT

NT

HT

Reziproke Titcr

Antikörpermangel und durch Messimg von spezifischen Antikörperaktivitäten bestimmt.

Ergebnisse

35

HHT: Hämagglutinationshemmungs-Test. HT: Hämagglutinations-Test.

NT: Neutralisations-Test. KBR: Komplementbindungsreaktion.

20

40

20 512

16

64

80

80 160

80

80 450I.E./ml

60

40

45

50

Methode	Halb werts zeit (Tage)	Literatur
Spezifische Anti körperaktivität Gesamtimmun- globulingehalt	17 14	B. Kornhuber, Klin. Wochenschrift, 51 (3), 135 (1973) W. Stängel und H. Deicher, Bio test-Mitteilung 29, 59 (1972)

7. Halbwertszeit des Immunglobulin G

Die Halbwertszeit des /3-Propiolacton modifizierten Immunglobulins G wurde durch Verfolgung des Gesamt-immunglobulin-G-gehaltes bei Patienten mit Die Halbwertszeit ist somit vergleichbar mit der für Normal-Human-immunglobulin gefundenen Halbwertszeit von 14 bis 28 Tagen.

Beispiel

Standard - Gammaglobulinlösung (Proteinkonzentration 7 bis 10%) wird bei 20⁰C auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und 0,043 ml /Ϊ-Propiolacton je g Protein zugegeben. Man läßt 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen, dabei wird der pH-Wert alle 20 Minuten auf 8,0 nachgestellt. Die Hydrolyse wird anschließend bei 37° C durchgeführt, wobei man den pH-Wert alle 20 Minuten nachstellt (Hydrolysedauer etwa 3V₂ Stunden). Man dialysiert dann 20 Stunden gegen physiologische Kochsalzlösung, zentrifugiert gegebenenfalls 10 Minuten bei 5000 UpM, stellt die Lösung auf 5,0% Protein ein und filtriert steril durch Membranfilter.

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung einer für die intravenöse Anwendung geeigneten Gammaglobulinlösung, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung von Standard-Gammaglobulin bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 8,0 mit 0,043 ml /J-Propiolacton/g Protein versetzt und 1 Stunde stehenläßt, anschließend bei 37° C etwa 3x/2 Stunden bei einem pH-Wert von 8,0 stehenläßt, dialysiert und sterilnitriert. '5 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer für die intravenöse Anwendung geeigneten Gammaglobulinlösung. Durch Fraktionierung hergestelltes Gammaglobulin hat bekanntlich die Eigenschaft, Komplement zu fixieren. (Barandum, S. »Die Gamma-Globulin-Therapie«, S. Karger Verlag, Basel 1963). Es ist aus diesem Grunde für eine intravenöse Anwendung nicht geeignet, sondern lediglich für eine intramuskuläre Anwendung. Da die Antikörperwirksamkeit aber bei einer intravenösen Anwendung vollständiger ist und vor allem sofort eintritt, hat es nicht an Versuchen gefehlt, intravenös verträgliche Gammaglobulin-präparate herzustellen. Die biologische Funktion der Antikörper besteht in der Elimination von Bakterien und Viren sowie in der Neutralisation von Toxinen. Das Antigen bindende Fragment des Antikörpermoleküle sorgt dabei zunächst für die Erkennung und Neutralisation von Erregern. Der entstehende Antigen-Antikörper-Komplex bewirkt eine Aktivierung des Komplement bindenden Fragments des Moleküls. Dadurch werden eine Reihe von immunologischen Folgereaktionen in Gang gesetzt, deren wesentlichste die Phagozytose und die spezifische Aktivierung des Komplementsystems sind. Die spezifische Aktivierung des Komplementsystems, die man klar von der unspezifischen (antikomplementäre Wirkung) unterscheiden muß, bewirkt bei bakteriellen Infektionen eine Bakteriolyse. Als weitere Folge der Komplementaktivierung werden Anaphylatoxine und chemotaktische Faktoren »dosiert« freigesetzt. Die Anaphylatoxine sorgen durch Erhöhung der Gewebedurchlässigkeit für eine gesteigerte Antikörperkonzentration am Ort der Infektion, während die chemotaktischen Faktoren die Phagozytose unterstützen. Somit kommt bei der Infektabwehr dem Komplement bindenden Fragment (Fc-Teil) des Immunglobulin-G-Moleküls eine überragende Bedeutung zu. Klinisch von besonderer Bedeutung ist die In-vivo-Halbwertszeit der in intravenösem Gammaglobulin enthaltenen Antikörper. Je länger die In-vivo-Halbwertszeit ist, um so länger kreisen die zugeführten Antikörper im Blut und um so länger stehen sie für eine prophylaktische Wirksamkeit zur Verfügung. Dies ist von entscheidender Bedeutung bei Krankheiten, in denen Verlauf der Organismus nicht in der Lage ist, Antikörper zu bilden. Man ist in solchen Fällen gezwungen, die Antikörper laufend zuzuführen. Je weniger oft dies notwendig ist, um so einfacher ist insbesondere eine ambulante Behandlung durchzuführen. Es sind bereits Verfahren bekannt, um aus Komplement fixierendem Human-Standard-Gammaglobulin ein intravenös verträgliches Präparat herzustellen. Diese Verfahren beruhen darauf, daß das durch herkömmliche Fraktionierverfahren wie die Cohnsche Alkoholfraktionierung und die -2-Äthoxy-6,9-diaminoacridin-Ammonsulfat-Fraktionierung gewonnene Komplement fixierende Human-Standard-Gammaglobulin hydrolytisch in die einzelnen Fragmente gespalten und so die Kompleiaentfixierung beseitigt wird. Die eine dieser beiden Methoden führt die Aufspaltung mit Pepsin durch (Schulze, H. E. und Schwick, G., DMW87, 1643 [1962]), die andere Methode bedient sich der Hydrolyse durch Salzsäure bei einem pH-Wert von 4,0 (Barandum, S., Kistler, P., Vox. Sang. 7, 157 [1962]). Die erhaltenen Präparate liegen in ihrer Verweilzeit unter dem Nativ-Gammaglobulin (G. Riva, Helvetica Medica Acta 415, 268 [1963]). überraschenderweise wurde nun gefunden, daß man ein für eine intravenöse Anwendung geeigiietes Gammaglobulin mit einer gegenüber den bekannten Produkten verlängerten Halbwertszeit der Antikörper erhält, wenn man Standard-Humanglobulin mit kritischen Mengen /i-Propiolacton behandelt. Während bei den bekannten Verfahren ein Proteinabbau oder eine Denaturierung eintreten, bleibt bei dem erfindungsgemäß hergestellten Produkt der für die Mobilisierung der erwähnten immunologischen Hilfsmechanismen verantwortliche Fc-Teil des Antikörpermoleküls erhalten. Beweisend für die Intaktheit des Fc-Teiles ist die Tatsache, daß Antikörper neben der Neutralisations- und Hämagglutinations-Methode auch mit der Komplementbindungsreaktion (KBR) nachweisbar sind. Die Halbwertszeit des erfindungsgemäßen Gammaglobulins entspricht der natürlichen Halbwertszeit der Immunglobuline. Man hat /i-Propiolacton bereits zur Behandlung von Kaninchen-Immunseren verwendet. Die angewendeten hohen Konzentrationen bewirkten jedoch eine Zerstörung der Antikörpereigenschaften, so daß die durch die Modifizierung denaturierten Proteine lediglich für eine kosmetische Anwendung in Form von Cremes und Salben in Frage kommen (J oos, Chem. Abstracts, 55 25/74 [1961]). Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer für die intravenöse Anwendung geeigneten Gammaglobulinlösung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Lösung von Standard-Gammaglobulin bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 8,0 mit 0,043 ml /f-Propiolacton pro g Protein versetzt und 1 Stunde stehen läßt, anschließend bei 37° C etwa 3V2 Stunden bei einem pH-Wert von 8,0 stehen läßt, dialysiert und sterilfiltriert. Die günstigen Eigenschaften des mit /f-Propiolacton gemäß der Erfindung modifizierten Gammaglobulins zeigen folgende Untersuchungen, die mit einer 5%igen Lösung durchgeführt wurden:

1. Klinische Verträglichkeit

Es wurde eine 5%ige Lösung injiziert. Die Verträglichkeit des überwiegend Immunglobulin G enthaltenden Präparates war auch bei rascher Injektion gut. Zwischenfälle wurden bei 46 Probanden mit zusammen 95 Injektionen nicht beobachtet. Intracutantestungen ließen keine Antikörperentwicklung gegen das Präparat erkennen. Die Wirksamkeit entspricht,