DE1792555A1 - Verfahren zur Herstellung von zur intravenoesen Anwendung geeignetem gamma-Globulin - Google Patents

Description

DIPL-ING. HELLA M. DINTER 1792555 «79 B«ch$chlag b. Frankfurt (M), I7.B. 1 j6£

■udiwtg 12 Patentanwältin Tiliton: Unpin tHmtn) *—'

PeaMMckkonto: Frankfurt (M) 23» 72 ■ankko*to: Dwtadi· Bank, Frankfurt (M) 21100

;iotest - äeram - Institut GmbH, Frankfurt/llain

Verfahren zur Herstellung von zur intravenösen :iii?.'3nlurLA" .^eei-iietem ^amma-Globulin

Durcli jr'ralctionierung hergestelltes Gamma-G-lobulin hs.t die Ei^uii:;c*i--3.ft, 'Komplement zu fixieren. (Barandum, 3. "lie Gamma-j-lobulin-Therapie", S. Karger Verlag, 3a.;el 1963) Es ist aUvS diesem Gfrunie für eine intravenöse Anwendung niclit geeignet, sondern lediglich für eine iri-jrai.iuskulare Anwendung. Da die Antikörper-"i/irksa.iJi9it aber bei einer intravenösen Anwenlung voll-3tändig3r ist und vor allem sofort eintritt, hat es nicht an Ve-suchen gefehlt, intravenös vorträgliche Gramma-Globulin-Präparate herzustellen.

i-ls sind bereits zwei Verfahren bekannt, um aus kompler:ient-fixierendera otandard-jamma-Globulin ein intravenös verträgliches Präparat herzustellen» -Dieje Verfahren bex-uhen darauf, daß das durch, herkömmliche .Fraktionierverfahren ·λΊe Oohn'sche Alkoholiraktionierung und Rivanol-Ammonsulfat-Praktionierung gewonnene kompleuentfi^Leron'le otan !■•rd-Gamuia-Grlobulin hydrolytisch in lie

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einzelnen Fragmente gespu.l^ η ~.nd so die Koniplemeiitfixierung beseitigt v/ird.

Die eine dieser beiden Methoden führt die Aufspaltun.; mit Pepsin durch (Schultze, H.E. und ß,ohwick, G-., DtW 87_, 1643 (1962)), die andere Methode bedient sieh der Hydrolyse durch Salzsäure bei einem pH-Wer-t von 4.0 (Barandum, S,, Kistler, P», Vox, Sang» 7_» 157 (1962)).

Die erhaltenen Präparat·- liegen in ihrer Verweilzeit unter dem iTativ-G-amma-Globulin (3·. Siva, Helvetica Medica Acta 4]_5, 268 (1963)).

Darüber hinaus wurde noch ein weiteres'Verfahren (3.A₀ Janeway et al, She lew England Journal of Medicine, Vol. 278 J_7_ (1963)) beschrieben, mit dem man ein für eine intravenöse Anwendung geeignetes G-amma-rQ-lobulinPräparat durch Plasminbehandlung von lativ-G-amrüa-Globulin herstellen kann. Das G-ammar-Grlobulin-ilolekül wird dabei weniger stark abgebaut. Dieses Verfahren ist jedoch wegen der Plasmindarstellung und der Standardisierung dieses Snzyms sehr kompliziert. Es sind keine tierexperiiaentellen Werte über die Verträglichkeit dieses Produkts bekannt.

Außer diesen Llethoden, die einen mehr oder weniger

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BADORlGiNAU

α tar It-en Abbau les i-lolelcil',· bewirken,, ist 'noch ein anderes Verfahren bekannt, bei den die "kompl ein entbindende Eigenschaft des Gamma-Globulins durch chemische Modifizierung beseitigt wir-:;.. Es handelt sich um eine kombinierte Behandlung, iie in einer -BenzyliErung des Tryptophans und einer Amidierung , des Lysins besteht. (Öohen, B. and Becker, B.L.,.The Journal of Immunology Vol. 100 (2), 403 (1963).) '.Diese Methode wurde affi Kaninchen-Gramma-Globulin erprobt. Werte für die Verträglichkeit sind nicht bekannt. Es ist jedoch bekannt, dais die durch die -Senzylierun.-.: eingeführte aromatische Gruppe antigen wirkt.(Stephan, W., Zeitschrift für Inur-unitätaforschung 133, 153 (1967))

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die geschilderten mehrstufigen Verfahren zur Herstellung von für eine intravenöse Anwendung geeignetem (ramma-3-lobulin umgangen v/erden können, wenn man natürliches Gamma-ölobulin enthaltende Produkte, insbesondere Plasma oder Serum, oder Staiidard-Gainma-Globulin nit einem Mittel behandelt, das alkylierer.de und acylierende Eigenschaften besitzt. Beispielsweise kann man bei der bekannten Herstellung von komplementfixierendem Standard-G-amma-G-lobulin vor der Fraktionierung

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die Behandlung mit chemischen Mitteln durchfuhren, die alkylierende und acylierende Eigenschaften besitzen. Geeignete Verbindungen dieser Art sind insbesondere Lactone, Lactame, Säurechloride, Imi ölsäureester, Alkylhalogmide und Diazoinetnän. Eingeschränkt wird die. Reihe der wirksamen Verbindungen dadurch, daß nur Substanzen anwendbar sind, die immunologisch nicht als Haptene wirken und deren Abbauprodukte nicht toxisch sindt. Besonders geeignet in diesem Sinne ist ß-Propiolacton.

Behandelt man Serum oder Plasma mit mindestens 0.01 g ß-Propiolacton/g Protein, so erhält man unabhängig von der Fraktioniermethode stets ein nicht komplementfixierendes Gamma—Globulin und hat, wenn man die ß-Propiolacton-Behandlung mit einer. UV-Bestrahlung verbindet, die ""Gewähr, hepatitissicheres Material zu erhalten.

Arbeitet man mit z„3. Konzentrationen von nur 0.3 g B-Propiolacton/100 ml Plasma bzw. Serum, dann reicht diese Menge für den anti-komplementären Effekt nicht aus; lie Dosis muß bis auf das 1Ofache erhöht werden, bzw. es muß durch Entfernung von Hydrolasen für eine verminderte Hydrolyse des ß-Propiolactoi£ gesorgt werden.

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Bei der erfindungsgemäßen Behandlung von komplementfixierendem G-amma-Globulin mit alkyl i er end en unc. loylierenden Mitteln, insbesondere ß-Propiolacton, wird die komplementMMende Eigenschaft ebenfalls beseitigt ο

Die günstigen Eigenschaften des mit ß-Propiolacton modifizierten Gamma-G-lobulins zeigen folgende Untersuchungen, die mit einer 5/^igen lösung durchgeführt wurden.

1 ο Antikörperaktivität und Komplementfixierung

Präparat

iMasern Polio I Polio II Pocken-

Vaccine

Kompletaentverbr./0.5 ia3t

Gamma-Globulin ; hergest, durch j Rivanol-Ammonsul-i 1 i8192 fatfraktionierung; eines humanen ■ | Serums

1:50 1:50

.1:32

> 0.40 ml

Gamma-Globulin .\ hergest. durch i Rivanol-Ammonsul-l 1:8192 fatfraktionierung) aus ß-Pi-behandeltem Serum

1:50

1:50

1:32

entspricht einer 0.9$ IaO l-Iiö sung

2. Akute Verträglichkeit an der Maus > 100 ml/kg ?/erden reaktionolos vertragen<

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3· Chronische Verträglichkeit

Das Präparat wurde alle 2 Sage 3 Wochen in einer Dosis von 20 ml/kg intravenös Ratten injiziert. Insgesamt erhielt jede Ratte 10 Injektionen mit zusammen 200 ml/kg. Ausgangsgewicht der Ratte war etwa 80-100 g (nicht höher als 120 g)» Täglich wurde das Gewicht kontrolliert, einmal wöchentlich ein Differentialblutbild angefertigt sowie Blutkörperchen-Senkungsgakihhwindigkeit und Leukozytenzahl bestimmt. Bei Versuchsende wurde eine liierenfunktionsprüfung {Phenolrotausscheidung) durchgeführt und außerdem ein makroskopischer Sektionsbefund erhoben: Es zeigten sich gegenüber der ITaCl-Kontrolle keine krankhaften Veränderungen»

4. Antigenität ■

Durch intramuskuläre und intravenöse Immunisierung von Kaninchen wurden keine präzipitierenden Antikörper gegen die durch ß-Propiolacton-Behaixölung eingeführijö Gruppe erhalten.

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Beispiel 1

1 1 Serum vom. ivieiischen v/irl 4 stunden Idοi 20 C mit 20 g kolloidaler Kieselsäure, z.L·. dem von der ]?irma "Degussa" unter der hpndeismaSigen"Bezeichnung .aerosil · vertriebenen Produkt gerührt; danach · wird 25* bei 5000 UpH zentrifugiert und der Überstand augego^en. _ . ' .

Das ads er vierte Serum wird bei iiaaiBtsinperatur auf pH 8.0 eingestellt un-i c.043 g ß-Prcpiol^eton pro g Protein zugegeben-. Man 1^:;iit ,l--.i3tu.i-5e bei Raumtemperatur sveaen, stellt den pH-Wert Kit 1 η ITaOH auf 5.ο ein uni hvirolysiert das restliche 3-Propiolacton bei J-I⁰Of indes nan halbstündlich den pH-»,^rert auf 8.0 iiacastelit.(Hydrolyse etwa 2 1/2 Stmilen). Das G-amma-

HoDulin wird dann in bekr.unter '.feise aurch Eiianol-Airjnonsulfirfe-ffraktionierung isoliert.

St:-iiidsr -viaruma-G-lobulin-Iosun:: (Proteinkonz. 7-1 7.^rird bei 2ü°0 auf einen -cH-V/ert von 8.0 eingestellt

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und Ο'»045'ml ß-Propiolacton pro 1 g Protein zugegeben, Man läßt eine Stunde bei Raumtemperatur stehen, dabei wird der pH-Wert alle 20' auf 8.0 nachgestellt. Die Hydrolyse wird anschließend bei 57⁰C durchgeführt j wobei man den pH-Wert alle 20* naeh'#fcellt (Hydrolysedauer etwa 3 1/2 h) ♦

Man dialysiert dann 20 Stunden gegen physiologische . Kochsalzlösung, zentrifugiert gegefcönenfalls 10^! bei 5000 TJpM, stellt die lösung auf'5.0 $ Protein ein und filtriert steril durch Membranfilter.

Beispiel 5

Zu; 100 ml einer 25 mg$igen Lösung von Standard-Gramma-G-lobulin in phosphatgepuffertem 8 mol. Harnstoff von pH 5.5 werden 5 ml einer 1 $igen Lösung von Äthylbromid in Aceton gegeben und eine Stunde bei 20 C .gerührt.Danach wird gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert und durch Ultrafiltration ankonzentriert.

Beispiel 4

Zu 100 ml einer 1/Jigen Lösun-'v von Standard-Gamma-

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Globulin wird 1 ml Acetimidaäureäthylester gegeben und bei einem pH-Wert von 9.0 2 Stunden bei 20⁰O unter Konstanthaltung des pH-Wertes gerührt. Danach dialysiert man gegen physiologische Kochsalzlösung.

Beispiel 5

Zu 100 ml einer 1$igen Lösung von Stand ar d-G-amma-Globulin wird 1 ml Acetylchlorid gegeben und bei einem pH-Wert von 9·0 unter Konstanthaltung des pH-Wertes 3 Stunden bei 20⁰O gerührt. Danach wird gegen physiologische ITaOl - lösung dialysiert und anschließend durch Ultrafiltration ankonzentriert.

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Claims (1)

1. - ίο -

   Patentansprüche

   Verfahren zur Herstellung von zur intravenösen-Anwendung geeignetem nicht komplementfixierenaem Gramma-G-lobulin,dadurch gekennzeichnet, daß man natürliches Gramma-Grlobulin enthaltende Produkte, insbesondere Plasma oder Serum, oder Standard-Gramma-G-lobulin mit einem Mittel behandelt, das älkylierende und acylierende Eigenschaften besitzt.

   2p Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als alkylierende und acylierende Mittel Lactone, Lactame, Alkylhalogenide, Säurechloride, · ■ Imidsäureester oder Diazomethan verwendet.

   3. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß man als alkylierendes und acylierendes Mittel ß-Propiolacton verwendet.

   4. Verfahren nach Ansprüchen 1-3, dadurch gekenn-

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   zeichnet, daß mrn Serum oder Piasina mit alkyliereri-

   den und acylierenden Mitteln belianie.lt und dann fraktioniert. ·

   ο Tsi-fahrea nach Anspruch 3» dadurch -gskemiseic daß rian vor der ß-Propiol^cton-Sehandlung die · Hydrolasen aus dein "behandelten Produkt entfernt

   6c Verfshirc-n nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, daß man aur Entfernung der Hydrolauen mindestens 0.5 g kolloidale Kieselsäure/100 ml Serum bzv/. Plasma verwendet.

   98-51/174 6.