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DE3228306A1 - Verfahren zur herstellung von polyen-antibiotika und eines neuen tetraen-antibiotikums mit wirksamkeit gegen fungi - Google Patents

Verfahren zur herstellung von polyen-antibiotika und eines neuen tetraen-antibiotikums mit wirksamkeit gegen fungi

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Publication number
DE3228306A1
DE3228306A1 DE19823228306 DE3228306A DE3228306A1 DE 3228306 A1 DE3228306 A1 DE 3228306A1 DE 19823228306 DE19823228306 DE 19823228306 DE 3228306 A DE3228306 A DE 3228306A DE 3228306 A1 DE3228306 A1 DE 3228306A1
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DE
Germany
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antibiotic
antibiotics
fermentation
active ingredient
culture medium
Prior art date
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Application number
DE19823228306
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English (en)
Inventor
Francisco Salto Dr. Maldonado
Luis Costa Dr. Pla
Jose Luis Fernandez Dr. Leon Puentes
Jose Maria Fernandez Dr. Villanueva de la Canada Sousa-Faro
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Antibioticos SA
Original Assignee
Antibioticos SA
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Publication date
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Description

Polyen-Antibiotika weisen konjugierte Doppelbindungen in ihrer Struktur auf, die diesen Verbindungen außerordentlich interessierende biologische Eigenschaften verleihen .
Beispiele für solche Verbindungen sind Amphotericin B (US-Patentschrift 2 908 611 und 2 908 612), der Philip-IS pinen-Komplex (britische Patentschrift 783 486), Nystatin (britische Patentschrift 866 600), Pimaricin, das auch als Tennecetin oder Natamycin bekannt ist (britische Patentschrift 852 883 und deutsche Patentschrift 10 24 206), Candicidin (US-Patentschrift 2 992 162) usw. Diese Substanzen können aufgrund ihres UV- und IR-Spektrums und Chromatographischer Verfahren (Papier-, Dünnschicht- oder Hochdruckchromatographie) voneinander unterschieden werden.
Die Polyen-Antibiotika werden hauptsächlich von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales, insbesondere von Streptqmyces und Streptoverticillium gebildet.
Die Biosynthese dieser Verbindungen verläuft gewöhnlich unter Bildung mehrerer Polyene im gleichen Kulturmedium.
Der Wirkungsmechanismus auf die eukaryotischen Zellen besteht in der Wirkung auf die Membransterine, die eine -10 Auflösung der Zelle bewirken, so daß die von diesen Sterinen verliehene selektive Permeabilität geändert wird.
Die Polyene werden .in starkem Maße auf medizinischem Gebiete angewandt, aufgrund ihrer Toxizität bei intravenöser Verabreichung jedoch hauptsächlich äußerlich oder oral, da sie in dieser Verabfolgungsform praktisch nicht toxisch sind.
Was die Polyene jedoch zur Zeit so interessant macht, ist der Unterschied in ihrer Wirkung auf die Permeabilität der Membran von Tumorzellen oder normaler Zellen. Eine weitere interessierende Eigenschaft beruht darauf, daß einige dieser Verbindungen (Candicidin) bei oraler Verabreichung den Blutchloesterinspiegel herabsetzen.
Es ist auch bekannt, daß bestimmte Polyene gegen eine Hypertrophie der Prostata wirken. Dies ist der Grund, warum man nach Mikroorganismen gesucht hat, die diese Substanzen bilden.
Die Erfindung beschreibt die Herstellung verschiedener
Polyene, die gegen Fungi wirksam sind. Herausragend unter diesen ist das neue als Ab 400 bezeichnete Polyen, das das Wachstum von Fungi und Hefen hemmt, so -\q daß es zur Behandlung von Infektionen angewandt werden kann, die durch pathogene Mikroorganismen verursacht werden, die zu den erwähnten Klassen gehören, und zwar sowohl bei Tieren als auch bei Pflanzen.
-| 5 Ab 400 wird durch aerobe Züchtung eines zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus gebildet, der als Streptomyces sp. Stamm SF-1 (ASA) bezeichnet wurde. Ein weiteres Charakteristikum dieses Mikroorganismus besteht in der Bildung anderer Polyene, wobei die Menge des gebildeten, bereits bekannten Tetraens, Pimaricin, besonders hervorzuheben ist.
Die Erfindung beschreibt auch die Gewinnung und Identifizierung dieser Substanzen, sowie das Wirkumsspektrum von Ab 400.
Der angegebene Mikroorganismus wurde aus einer Bodenprobe aus der Umgebung von Madrid isoliert und bei der ^u ANTIBIOTICOS, S.A. in Leon, Spanien gehörenden Kultur.
Sammlung unter der Bezeichnung Streptomyces sp. Sv
SF-1 (ASA) und der National Collection of Industr--Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Aber'"?.
Schottland unter der Nr. NCIB 11 738 hinterlegt.
Für die taxonomische Bestimmung des Mikroorganismus wur-
-|0 den die Richtlinien in "The Actinomycetales" von Sykes und Skinner (1973) Academic Press herangezogen. Dabei kam man zu dem Schluß, daß der Mikroorganismus zur Gattung Streptomyces gehört, da er ein Luftmycel mit Sporophoren aufweist, die viele Sporen in Ketten enthalten, die weder im Kreis noch in Kapseln angeordnet sind. Eine Aufteilung des Mycels wurde nicht beobachtet.
Für die Bestimmung der Art wurden die Methoden von Shirling und Gottlieb in "International Streptomyces Project"-ISP-(Int. J. Sist. Bacteriology Band 16 (1966) Seite 313 bis 40) angewandt. Unter dem Kontrastmikroskop zeigte der Mikroorganismus SF-1 (ASA) spiralförmige Sporophoren mit 1 bis 6 mehr oder weniger geschlossenen Spiralen in ISP-3 und ISP-4 Medium mit Ketten von über zehn 0,8 χ 0,5,um ovalen Sporen. In ISP-2 und
ISP-5 Medium weisen diese Sporophore keine wirklichen Spiralen auf, sondern mehr oder weniger geschlossene Haken, die sich manchmal zu einer Spirale schließen. Die Sporen haben unter dem Elektronenmikroskop eine warzige Oberfläche.
Die Charakteristika der Kulturen in den verschiedenen Medien sind in der Tabelle I zusammengestellt.
-IO Alle Kulturen wurden bei 28 C hergestellt. Die Farben wurden auf zwei verschiedenen Wegen bestimmt. Einmal nach dem "Code Universal des Couleurs" von E. Seguy (1936), herausgegeben von P. Lechevalier (Paris) und zum anderen subjektiv unter Verwendung der üblichen
15 Bezeichnungen für die Farben.
Das Spektrum für die assimilierte Stickstoffquelle (N) ist in der Tabelle II wiedergegeben. Als Basismedium wurde 1 % Glucose und 1,5 % Agar (Luedemann G.M. Int. J. Sist. Bacteriol. Band 21 (1971) Seite 240 bis 47) verwendet.
Das Spektrum für die assimilierte Kohlenstoffquelle (C) wurde nach der Methode von Shirling, E.B. und Gottlieb,
D. (Int. J. Sist. Bacteriol. Band 16 (1966) Seite 313
bis 340) zusammengestellt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III aufgeführt.
Die physiologischen Charakteristika sind in der jLe le IV angegeben. Zusammengefaßt, der untersuchte Stamm hat die folgender taxonomischen Eigenschaften:
Tabelle I Morphologische und physiologische Eigenschaften von Streptomyces sp. SF-1 (ASA) Kulturen
Ref. Medium
Zeit, Tage
Wachstum
Luftmycel
Substratmycel
lösliches Pigment
Bemerkungen
ISP-2 Agar
Hefe-Malz
21
Orange 180
gräulich
violett
Rot 116
schwärzlich
braun
stark Braun kein pH-Indikator
samtartiges Wachstum, reichliche Sporenbildung
ISP-3
Hafermehl
ISP-4 Agar
Stärke Salze
21
21
Violett 675 dunkelgrauviolett
Violett 675 dunkelgrauviolett
Violett 687
rötlich
kastanienbraun
Violett 687
rötlich
kastanienbraun
sehr hell
spärlich
samtartiges Wachstum, gute Sporenbildung
samtartiges Wachstum, mäßige Sporenbildung
ISP-5 Agar Glycerin-Asparagin 21
Bennet Agar
mit CaCCL (0,1 %) 14
Violett 675 dunkelgrauviolett
rötlichbraun 707
hellpurpurschwarz
Gelb 312 grünlich schwarz
Violett 641 rußschwarz
stark braun kein pH-Indikator
kein pH-Indikator
samtartiges Wachstum, reichliche Sporenbildung
samtartiges Wachstum, wenige Sporen ,·'■' Zunahme in der Sporen-r.,, zahl wenn CaCCL «.«, zugefügt wird Ί
Czapek Agar
(Saccharose)
14 sehr geringes Wachstum
Tabelle I (Fortsetzung)
Morphologische Medium und physiologische Wachs
tum		 Eigenschaften von Streptomyces sp. SF-1 lösliches
Pigment		 (ASA) Kulturen GO
NJ
NJ
OO
(Lo
Ref. Emerson Agar
mit CaCO3 (0,1 %) 		Zeit,
Tage		 -H- Luftmycel Substrat-
mycel		 negativ Bemerkungen I
3 Agar, Glucose,
Asparagin,
Rindfleischextrakt		 14 -H- Cremefarben Cremefarben positiv
rot		 körniges Wachstum *
t
ι »
I »
y *
3 Agar, Glucose,
Hefeextrakt mit
Phosphat		 14 Rot 41
rötlich
braun		 Violett 641
rußschwarz		 stark
nicht rot
Farb
indikator		 leichte
Sporenbildung		 % »
3 Agai—Thyrosin 14 —. Violett 606
violett
grau		 Violett 641
rußschwarz		 — samtartiges
Wachstum
4 Nr. 172 ATCC 14 — __ spärlich —
5 Agarmilch 14 - positiv
dunkelgrau		 körniges Wachs
tum, wenig
Sporenbildung
6 14 ROt 87 Rot 87 hydrolysiert
nicht
1. SHIRLING, E.B. und Gottlieb, D., Int.J. Sist. Bacteriol. Bd. 16 (1966) S. 313-340
3. WAKSMAN, S.A. "The Actinomycetes", Bd. 2 (1961).
4. GORDON, R.E. und SMITH, M.M., J. Bacteriol. Bd. 69 (1955) S. 147-150
5. "American Type Culture Collection", (ATCC), Katalog S. 518 (1980)
6. LUEDEMANN, G.M., Int. J. Sist. Bacteriol. Bd. 21 (1971) S. 240-247
Tabelle II
Assimilierung von N-Quellen durch Streptomyces sp. SF-1 (ASA)
14 tägiges Wachstum bei 28° C
Kontrolle NH4NO3
N-Z Amin A Hefeextrakt Asparagin Glutaminsäure
Bildung von
löslichem
Pigment
Tabelle III
Assimilierung von C-Quellen durch Streptomyces sp. SF-1 (ASA)
Kohlenstoffquelle
Kontrolle D-Glucose Saccharose Inosit
D-Fructose Raffinose L-Arabiose D-Xylose D-Mannitol L-Rhamnose D-Galactose D-Arabinose a-Melibiose Glycerin ß-Lactose Stärke
D-Ribose Cellobiose Trehalose Sorbose Sorbit Mannose Dulcit Melezitose 21 tägiges/Wachstum bei 28° C /
Tabelle IV
Physiologische Eigenschaften von
Streptomyces sp. SF-1 (ASA)
Bildung von Melaninpigmenten
a) ISP-6
b) ISP-7
c) ISP-1
Gelatinhydrolyse Stärkehydrolyse MagermiIch
Nitratreduktion NaCl-Resistenz
Wachstum bei verschiedenen Temperaturen
Reaktion Referenz
negativ 1
negativ 1
negativ 1
stark 2
leicht 2
negative
Hydrolyse		 3
positiv 4
4 % ist
die Grenze		 4
mesophyl
Nach 14 Tagen wird ein starkes dunkelpurpur-braunes Pigment gebildet.
1. SHIRLING, E.B. und Gottlieb, D., Int. J. Sist. Bacteriol. Bd. 16 (1966) S. 313 - 340
2. WAKSMAN, S.A. "The Act inomycetes" Bd. 2 (1961). The Williams and Wilkins Company.
3. GORDON, R.E. und SMITH, M.M., J. Bacteriol, Bd. 69 (1955) S. 147 - 150
4. LUEDEMANN, G.M., Int. J. Sist. Bacteriol. Bd. 21 (1971) S. 240 - 247
Tabelle V St. chattanoogensis St. natalensis Streptomyces sp. I CO
NJ
ATCC-13358(2) NRRL-2651(3) SF-1 (ASA)(4) _1
Ul		 NJ
OO
t . ^
Taxonomische Unterschiede zwischen den Pimaricin erzeugenden Streptomyceten ' negativ negativ negativ I O
St. gilbosporeus gelb oder weiß grau oder rot rot oder violett QD
Melaninpigmente ATCC-13326(1) nicht untersucht . kastan ienfarben-
gelb		 kastanienfarben-
gelb + rot		 *
*
t t *
Farbe des Luftmycels positiv gelb negativ positiv rot y *
* S
> » * J
Farbe des
Substratmycels		 rot ? spiralförmig spiralförmig spiralförmig
lösliches Pigment kastanienfarben-
gelb		 stachelig stachelig warzig
Sporophorenform negativ positiv nicht untersucht positiv
Form der Sporen
wandung		 spiralförmig wächst nicht
bei 3 % 		wächst nicht
bei 5 %
Nitratreduktion
NaCl-Resistenz positiv - ++ -
Assimilierung von
Kohlenstoffquellen
a) Xylose
b) Saccharose
c) Inosit
-H-
•1. Britische Patentschrift 846 933 (1960)
2. SHIRLING, E.B. und GOTTLIEB, D., Int. J. Sist. Bacteriol. Bd. 18 (1968) S. 69 - 189
3. SHIRLING, E.B. und GOTTLIEB, D., Int. J. Sist. Bacteriol. Bd. 22 (1972) S. 265 - 304
4. -Im Labor erhaltene Ergebnisse
a) Er gehört zu den Spiralen bildenden Mikroorganismen
b) seine Sporen haben eine warzige Oberfläche
c) Er erzeugt keine Melanin-Pigmente
d) die Farbe des Sporen tragenden Luftmycels ist je na.ch dem verwendeten Medium Violett oder Rot
e) Er erzeugt ein lösliches rotes (rötlichbraunes) Pigment, das kein pH-Indikator ist
f) Die Farbe des Substratmycels variiert je nach dem Medium von rötlich-kastanienfarben- bis violettkastanienfarben
g) Er assimiliert die folgenden einzelnen Kohlenstoffquellen :
- Glucose
- Inosit
- Fructose
- Mannit
- Galactose
- Glycerin
- Stärke
- Cellobiose
- Trehalose
- Mannose
Es ist zweifelhaft, ob er Saccharose und Raffinose assimiliert.
h) Andere physiologische Eigenschaften sind:
1. Er hydrolysiert Gelatine in starkem Maße
2. Er reduziert Nitrate zu Nitriten
3. Er hydrolysiert Milchkasein nicht
4. Er ist gegenüber bis zu 4 % NaCl resists· '
5. Er ist mesophyl
i) Er erzeugt mehrere Tetraen-Antibiotika mit Wirksamkeit gegen Fungi.
ΊΟ Bei der Überprüfung der taxonomischen Eigenschaften von
. j Streptomyces-apten in "Bergey's Manual of\ Determinative Bacteriology", 8. Aufl. 1974, The Williams and Wilkins Company und in den "International Streptomyces Project" Veröffentlichungen von SHIRLING und GOTTLIEB in "Cooperative description of Type strains of Streptomyces", Int. J. Sist. Bacteriol. Bd. 18 (1968) Seiten 69 bis 189; ebenda Bd. 18 (1968) Seiten 279 bis 392; ebenda Bd. 19 (1969) Seiten 391 bis 512 una Bd. 22 (1972) Seiten 265 bis 394 sowie in den entsprechenden Veröffentlichungen von 1974 bis heute wurde kein Mikroorganismus ermittelt, der dem Mikroorganismus SF-1 (ASA) entspricht.
Er wurde insbesondere mit solchen Streptomyceten verglichen, die ebenfalls Pimaricin erzeugen, nämlich S. nata-
- 18 -
lensis, S. chattanoogensis und S. gilbosporeus. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der Tabelle V zusammengestellt und führen zu dem Schluß, daß Streptomyces sp. SF-1 (ASA) von den anderen Pimaricin erzeugenden Mikroorganismen verschieden ist.
Der vorliegend beschriebene Mikroorganismus ist der wilde Stamm, jedoch können auch dessen Mutanten, spontan oder mittels eine Mutation hervorrufenden Substanzen -}O erhalten, die Gruppe der Polyen-Antibiotika zusammen oder getrennt erzeugen, wobei im vorliegenden Verfahren sowohl der wilde Stamm als auch dessen Mutanten verwendet werden können.
' Die vorliegend beschriebenen Tetraene können auf festen oder in flüssigen Medien erzeugt werden, obgleich letztere für die Herstellung großer Mengen der Verbindungen geeigneter sind. In den flüssigen Medien können die Antibiotika sowohl in Oberflächen- als auch in submersen Kulturen gebildet werden. Für die Erzeugung großer Mengen an Produkt sind submerse Kulturen besser.
Das für die Kultivierung verwendete Medium muß mindestens enthalten:
a) Eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Fructose, Mannit, Glycerin., Stärke, Dextrin, Cello-
- 19 -
biose, Trehalose, Mannose, allein oder in Kombination .
b) Eine assimilierbare Stickstof f quelle, wie pf3a',~ -liehe Mehle (Sojabohnen-, Baumwollsaat-, Nußmeh' usw.), Maisquellwasser, pflanzliche oder tierisch
Peptone, Hefe, Harnstoff, Ammoniumsalze usw.,- allein oder in Kombination.
-JO c) Mineralsalze, um die notwendigen mineralischen Elemente oder Puffersubstanzen zur Verfugung zu stellen.
d) Pflanzliche oder tierische Öle als Schaumdrücker und auch als Kohlenstoffquelle. Silikone.
Der die Kultivierung erlaubende pH-Bereich erstreckt
sich von 5,1 bis 8,4. Die optimale Temperatur liegt zwischen 25 und 30° C.
Für die erfindungsgemäße Herstellung der Tetraene wird das übliche Fermentationsverfahren für die Gewinnung von Antibiotika angewandt, d.h. Schrägröhrchen, die ein Medium enthalten, in dem der Stamm gut Sparen bildet, werden mit den lyophilisierten Sporen beimpft, worauf bei der optimalen Temperatur gezüchtet und dann, die
gebildeten Sporen und das Mycel aus diesen Röhrchen für die submerse Kultur in flüssigem Medium verwendet werden. Diese Stufen können kürzer oder langer und mehr oder weniger zahlreich sein, je nach dem zu fermentierenden Volumen. Wenn große Fermentationstanks verwendet werden, kann die Anzahl der Stufen 5 erreichen.
Für die Fermentation in einem Kolben reicht es aus, wenn auf einem geeigneten Schütteltisch in einer mit
-JO einem Thermostaten kontrollierten Kammer geschüttelt wird. Wenn in einem Tank fermentiert wird, muß belüftet und gerührt, der pH-Wert, der gelöste Sauerstoff und die Temperatur kontrolliert werden, ferner die Nährstoff-, Alkali- und Säurezugabe, um optimale Bedingun-
-^5 9©n zu erreichen. Alle diese Maßnahmen müssen unter absolut sterilen Bedingungen erfolgen, um eine Verunreinigung durch von außen eintretende Mikroorganismen zu vermeiden. Die Medien können in den Behältern sterilisiert oder in sterilisierter Form in die Behälter eingebracht werden, vorausgesetzt, daß der Behälter zuvor sterilisiert wurde.
Die Bildung der Antibiotika beginnt, wenn im Medium ausreichend Mycel vorhanden ist, was nach 48 Stunden der Fall ist. Die Antibiotikabildung nimmt allmählich
ft Λ #
«I *»4 «
bis zum 5. oder 6. Tag der Fermentation zu, dann hört die Zunahme auf.
Um festzustellen, welche Menge Antibiotikum in
brühe enthalten ist, wurde als Standard für Ab 4GO *.s.-.
gereinigte Probe verwendet, die bei der Papier- unr* Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) eine einzige wirksame Substanz enthielt, die gegen Saccharomyces cerevisiae ATCC 9767 eine Mindesthemmkonzentration von 0,5,ug/ml aufwies. Als Pimaricin Standard wurde eine Probe .von der Koninklijke Nederlandsche Gist- & Spiritusfabriek N.V., Delft, Holland (Charge 9117 A) mit 900 Einheiten/mg verwendet.
Obgleich das Vorliegen von Ab 400 in den Gärbrühen patentierter Fermentationsverfahren nicht beschrieben ist, wurde ein Vergleichsversuch unter Verwendung von Streptomyces sp. SF-1 (ASA), St. natalensis NRRL-2651 und von St. chattanoogensis ATCC 13358 durchgeführt, um herauszufinden, ob diese Substanz in den in den Patentschriften erläuterten Fermentationsmedien gebildet wird. Die erhaltenen Ergebnisse sind in üer Tabelle VT zusammengestellt. Sie zeigt deutlich die Unterschiede zwischen den bekannten Pimaricin erzeugenden Stämmen und dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm. Denn während
— 22 —
Streptomyces sp. SF-1 (ASA) in allen untersuchten Medien eine große Menge Ab 400 erzeugt, ferner Pimaricin, war bei den beiden anderen Stämmen die Bildung von Ab 400 nicht nachweisbar. Ein weiterer Unterschied des Stammes SF-1 (ASA) liegt in der Erzeugung eines starken Apfelgeruches in den Fermentationsbrühen.
Tabelle VI
Erzeugung von Ab 400 und Pimaricin durch St. natalensis, St. chattanoogensis und St. sp. SF-1 (ASA
Mikroorganismus Fermentationsmedium .ug/ml
Pimaricin Ab 4OJ
St. sp. SF-1 (ASA) ( SFMF-3 * 288 409
( MCH -1 * 61 92
( MFNa-1 * 73 205
( SFMF-3 26 0
St. natelensis ( MCH -1 322 0
NRRL 2651 ( MFNa-1 32 0
( SFMF-3 10 0
St. chattanoogen- ( MCH -1 76 0
sis ATCC 13358 ( MFNa-1 127 0
Das SFMF-3 Medium enthält 4 % Sojabohnenmehl, 6 %
Glucose, 0,5 % (NH4J2SO4, 0,13 % K CaCO3 und 0,5 % Sojabohnenöl, pH 6,2.
Das als MOH-1 bekannte Medium ist in der britischen Patentschrift 852 883 beschrieben und enthält 2 % Glycerin, 0,5 % Phyton, 0,5 % Pepton, 0,3 % Hefeextrakt, 0r3 % Fleischextrakt und 0,25 % CaCO3. Der pH-Wert beträgt 7,6, ' ;:V , ' . Λ
Das als MFNa-1 bekannte Medium ist in der deutschen Patentschrift 10 24 206 unter D beschrieben und enthält 5% Söjabohnenmehl, 1 % Glucose, 0,5% (.NH4J2SO4, 0,02 % KH2PO4, 1 % CaCO3, 0,5 % Sojabohnenöl und 0,1 % -|0 Maisquellwasser. Der pH-Wert beträgt 6,3.
Nach Beendigung der Fermentation beträgt die Mindesthemmkonzentration (MHK) der filtrierten Gärbrühe normalerweise 1/2Ö00 gegenüber Saccharomyces cerevisiae.
15 ..■ · ■ ■'■ ' \ ;...
Die gesamte Gärbrühe, deren pH-Wert 5 bis 6 beträgt, wird durch Hyflo-Supercell filtriert, worauf die filtrierte Gärbrühe mit Natriumhydroxid auf pH 8,0 eingestellt und dann mit einem mit Wasser nicht mischbaren aliphatischen Alkohol, wie Butanol extrahiert wird.
Der organische Extrakt wird unter Vakuum auf 1/20 seines ursprünglichen Volumens eingeengt, worauf ein weißes Pulver ausfällt, das den "rohen Wirkstoff" darstellt. Dieser wird abfiltriert und unter Vakuum bei
- 25 -
Raumtemperatur getrocknet. Die Mindesthemmkonzentration dieses ganz leicht gelben Pulvers beträgt gegenüber der oben genannten Hefe etwa 1/1.500.000 (0,067.UgZsT1I). D Ausbeute beträgt 0,7 g/l filtrierter Gärbrühe.
Der "rohe Wirkstoff" ist verhältnismäßig wasserlösJ"c und enthält mindestens zwei Hauptantibiotika, die gegen Saccharomyces cerevisiae wirksam sind, wie durch Papierchromatographie festgestellt wurde.
Wenn der "rohe Wirkstoff" in Wasser in einer Menge von etwa 4 mg/ml gelöst, diese Lösung auf pH 10,2 eingestellt und 24 Stunden bei +1° stehengelassen wird, fällt eine weiße Substanz mit einer Mindesthemmkonzen-
-I5 tration von 1/10.000.000 (0,1.ug/ml) aus, die den "Wirkstoff 1" bzw. das Ab 400 darstellt. Dieser Wirkstoff wird in einer Ausbeute von 6,6 %, bezogen auf den "rohen Wirkstoff" erhalten. Das UV-Spektrum des "Wirkstoffs 1" in Methanol zeigt, daß dieser ein Tetraen ist, während das IR-Spektrum in Kaliumbromid ähnlich dem des Tetraens Pimaricin, aber nicht mit diesem identisch ist.
Pimaricin hat einen niedrigeren R.-Wert als der "Wirkstoff 1" in einem chromatographischen System aus Butanol-Ethanol-Wasse.r im Volumverhältnis 5:4:1.
Unter Anwendung der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und einer LiCrosorb rp-18 Säule (5 u), einer mobilen Phase aus 0,06 M Ammoniumeitrat, pH 5,0, und Acetonitril im Volumverhältnis 3 : 1 und Feststellung bei 300 nm wurden im "rohen Wirkstoff" 7 Substanzen mit antibiotischer Wirksamkeit gegen Saccharomyces cerevisiae und einem Tetraen UV-Spektrum identifiziert.
Die Elementaranalyse des "Wirkstoffes 1" ergab G 54,5 %, H 7,1 %, N 2,9 %, O (Differenz) 35,5 %, entsprechend einer empirischen Mindestformel von ^oo^qA-i^ unc' einem Mindestmolekulargewicht von 488,522.
Die Untersuchung der antimikrobiellen Wirksamkeit von Ab 400 ergab keine Wirkung gegenüber Bakterien und positive Wirksamkeit gegenüber den Hefen:
Candida
Cryptococcus
Debaryonyces Il
Geotricum Hansenula Il
Pichia albicans anomala dolonii desusei melinii pelliculosa pulcherrima tropicalis albidus difluens neoformans hansenii klockenii versiforme pseudopelliculosa suaveolens pseudopolimorfa membranaefaciens
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Medium Wasser Beispiel 1 9 Zusammensetzung her g 9 9
Es wurde. ein auf 9 - g
gestellt: Baumwolisaatmehl der folgenden 9 9 ml
Maisquellwasser 9
Dextrin 20 g
Glucose 10 5
(NH4)2S04 10 g
NaNO3 50 05
K2HPO4 5 05
FeSO4.7H2O 2, 05
MgSO4.7H2O 1 1
MnSO4.H2O 0,
ZnSO4.7H2O 0, 1000k
Destilliertes 0,
zum Auffüllen 0,
Der pH-Wert wurde mit KOH auf 6,2 eingestellt.
200 ml Anteile dieses Mediums wurden in 1000 ml Erlen-
meyer-Kolben gefüllt.
In jeden Kolben wurde 1 g CaCO gegeben.
Die Kolben wurden 30 Minuten bei 121° C sterilisiert.
Das so hergestellte Medium wurde mit einer Sporensuspen-
sion von Streptomyces sp. Stamm SF-1 (ASA) beimpft
- 29 -
Diese Suspension wurde aus einer Schrägkultur auf einem festen Medium hergestellt, in dem der Mikroorganismus Sporen bildet.
Nach dem Impfen wurde das Medium 5 Tage in eine·" ρ :·.
einem Thermostaten auf 28 C gehaltenen Kammer auf einem in Umlaufbahnen mit einem Ausschlag von 5 cm bei 240 UpM bewegten Tisch inkubiert. Der so hergestellte Impfstoff kann zur Beimpfung des Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet werden.
Sojabohnenmehl 40 g
Glucose 60 g
(NH4)2S04 5 g
15 K2HPO4 - 13g
CaCO3 10 g
Destilliertes Wasser
zum Auffüllen auf 1000 ml
Der pH-Wert wurde mit verdünnter Schwefelsäure vor de-^
Zusatz des Carbonats auf 6,2 eingestellt. 20
200 ml Anteile des Mediums wurden in einen 1 Liter
Kolben gefüllt.
In jeden Kolben wurde 1 ml Sojabohnenöl gegeben.
Die Kolben wurden 30 Minuten bei 121° C sterilisiert.
25
Nach der Sterilisation wurde das Medium mit 5 % des
Impfstoffes* versetzt.
Dann wurde 4 Tage bei 28 C in einer Kammer auf einem Schütteltisch unter den oben angegebenen Bedingungen fermentiert. Die Analyse der Gärbrühe nach Ablauf dieser Zeit ergab einen pH-Wert von 5,5 bis 6,5, einen Zuckergehalt von 2 %, einen Gehalt an Ammoniumstickstoff von 100 mg/1, einen Gesamtgehalt an löslichem Stickstoff von 950 mg/1 und ein Mycelvolumen von 32.
Gegenüber Saccharomyces cerevisiae ATCC 9767 zeigte sie -JO eine Mindesthemmkonzentration von 1/4.000 bis 1/5.000; die HochdruckflUssigkeitschromatographie ergab eine Ab 400 Wirksamkeit von 300 bis 500 ,ug/ml und eine Pimaricinwirksamkeit von 1000 bis 1200 ,ug/ml bei Verwendung von Pimaricin 900 Einheiten/mg als Standard.
Beispiel 2
Es wurde ein Medium mit der gleichen Zusammensetzung hergestellt wie sie der Impfstoff des Beispiels 1 hatte und in einer Menge von 200 ml Medium in 1 1 Erlenmeyer-Kolben gegeben. Anschließend wurde 30 Minuten bei 121 C sterilisiert. Das so hergestellte Medium wurde mit einer Sporensuspension des erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus beimpft. Dann wurde 5 Tage bei
- 31 -
28 C in einer mit einem Thermostaten kontrollierten Kammer unter fortwährendem Schütteln auf einem Schütteltisch inkubiert, der bei einem Ausschlag von 5 cm -'
240 UpM rotierte.
Der so hergestellte Impfstoff wurde in einer Mengf ve·
0,5 % zur Beimpfung von Fermentationsbehältern mit einer Kapazität von 8 Litern verwendet, die jeweils 4 1 Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie das Fermentationsmedium des Beispiels 1 enthielten. Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 28° C, Belüftungsgeschwindigkeit 0,3 Volumen/Volumen/Minute, Rührgeschwindigkeit 400 UpM, Fermentationsdauer 90 Stunden. Danach hatte das Fermentationsmedium eine Pimaricinwirksamkeit von 500 bis 1000,ug/ml und eine Ab Wirksamkeit von 300 bis 600.ug/ml. Es wurden die gleichen Standard-Proben wie in Beispiel 1 verwendet.
20 Beispiel 3
3540 .ml Gesamtgärbrühe vom pH 5,9 wurden unter Vakuum durch eine Schicht aus Hyflo-Supercell filtriert, worauf man 2150 ml einer rötlich klaren filtrierten Brühe mit einer Mindesthemmkonzentration von 1/2222
erhielt. Der pH-Wert wurde mit 25 %igem Natriumhydroxid auf 8,0 eingestellt, worauf man den ausgeflockten Feststoff auf die gleiche Weise abfiltrierte und verwarf. Eine erste Extraktion der filtrierten Gärbrühe mit 700 ml Butanol wurde durch Zentrifugieren der organischen Phase durchgeführt. Die wäßrige Phase wurde zwei weitere Male mit jeweils 350 ml Butanol in der gleichen Weise extrahiert. Der gesamte klare gelbe Butanolextrakt wurde unter Vakuum auf 1/20 seines anfäng-
-I0 liehen Volumens eingeengt, was zu einer Ausfällung ' eines weißen Pulvers führte, das nach dem Abfiltrieren mit Butanol gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur -getrocknet wurde. Ausbeute 1,52 g, d.h. 0,71 g je Liter filtrierter Gärbrühe. Dieser "rohe Wirkstoff" zeigte eine Mindesthemmkonzentration von 1/1.450.000 (0,69,UgZmI).
Das Produkt wurde in 380 ml Wasser gelöst und der
pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 10,2 eingestellt. Nach
24 stunden bei +1° C wurde der ausgeflockte Feststoff abfiltriert, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Ausbeute 101 mg "Wirkstoff 1"; 6,7 % des "rohen Wirkstoffes". Die Mindesthemmkonzentration des "Wirkstoffs 1" betrug
25 1/10.000.000 (0,1/Ug/ml).
Beispiel 4
3800 ml Gesamtgärbrühe vom pH 5,6 wurden unter
durch Hyflo-Supercell filtriert, worauf man 2500 rl f
trierte Gärbrühe mit einer Mindesthemmkonzentraticn
1/2000 erhielt. Der pH-Wert wurde mit Natriumhydro: .·
auf 8,0 eingestellt. Dann wurde die Gärbrühe nochmals auf die gleiche Weise filtriert. Anschließend wurde wie im vorhergehenden Beispiel mit Butanol extrahiert,
ΙΟ worauf der Butanolextrakt unter Vakuum auf 1/20 seines anfänglichen Volumens eingeengt wurde. Der ausgefällte "rohe Wirkstoff" wurde abfiltriert, mit Butanol gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur zu 2,0 g mit einer Mindesthemmkonzentration von 1/1.666.000
-I5 , (0,60.ug/ml) getrocknet.
Der obige rohe Wirkstoff wurde in 500 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mit Natriumhydroxid auf 10,2 eingestellt. Dann ließ man die Lösung 24 Stunden be.- +1° C stehen. Der ausgefällte "Wirkstoff 1" wog nach dem Trocknen 131 mg; Ausbeute 6,6 %. Seine Mindesthemmkonzentration betrug 1/10.000.000 (0,1,ug/ml).
Beispiel 5
3750 ml Gesamtgärbrühe vom pH 5,9 ergaben nach dem Filtrieren durch Hyflo-Supercell 2300 ml Filtrat mit einer Mindesthemmkonzentration von 2500. Dieses Filtrat wurde auf pH 8,0 eingestellt, filtriert und auf die gleiche Weise wie in den vorhergehenden Beispielen mit Butanol extrahiert. Nach dem Einengen des organischen Extraktes erhielt man 1,9 g "rohen Wirkstoff" mit einer Mindest- -|0 hemmkonzentration von 1/2.222.000 (0,45 .ug/ml) . Der "rohe Wirkstoff" ergab nach dem Lösen in 475 ml Wasser, dem Einstellen des pH-Wertes auf 10,2 und 24 stündigem Stehen bei +1° C 146 mg "Wirkstoff 1"; Ausbeute 7,7 %; Mindesthemmkonzentration 1/10.000.000 (0,1 ,ug/ml).
SCHA/wo

Claims (6)

ANTIBIOTICOS, S.A. Bravo Murillo 38 Madrid Spanien (Prio: 6. Aug. 1931 ES 504 582 18902Scha:wo August 1982 Verfahren zur Herstellung von Polyen-Antibiotika und eines neuen Tetraen-Antibiotikums mit Wirksamkeit gegen Fungi Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Polyen-Antibiotika, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. NCIB 11738 in einem Kulturmedium züchtet und die gebildeten Antibiotika aus dem Mycel und/oder dem Kulturmedium gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation unter aeroben Bedingungen bei 25 bis 30° C in einem Kulturmedium durchführt, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium als Kohlenstoffquelle, allein oder in Mischung, Glucose, Fructose, Mannit, Glyce-
-|0 rin, Stärke, Dextrin, Cellobiose, Trehalose und
Mannose und als Stickstoffquelle, allein oder in Mischung, pflanzliche Mehle, Maisquellwasser, pflanzliche oder tierische Peptone, Hefe, Harnstoff und Ammoniumsalze enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentationsbrühe filtriert, den pH-Wert des Filtrats auf etwa 8,0 einstellt, das Filtrat extrahiert, den Extrakt unter Vakuum einengt und aus dem ausgefällten Antibiotika-Komplex oder dem rohen Wirkstoff Pimaricin isoliert.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentationsbrühe filtriert, den pH-Wert auf etwa 8,0 einstellt, das
_ ο
Filtrat extrahiert, den Extrakt zur Ausfällung eines Antibiotika-Komplexes oder rohen Wirkstoffes unter Vakuum einengt, die Fällung in einer Wer-.g ■ von etwa 4 mg/ml in Wasser löst, den pH-Wort ·
erhaltenen Lösung auf etwa 10,2 einstellt ur'-j .--...
der Lösung das Tetraen-Antibiotikum Ab 400 ausfällt.
6. Tetraen-Antibiotikum mit Wirksamkeit gegen Fungi, -|0 dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren des Anspruchs 5 erhältlich ist, die Elementaranalyse C - 54,5 %, H -7,1 %, N - 2,9 %, 0 - 35,5 % und eine Mindesthemmkonzentration gegen Saccharomyces cerevisiae von 1/10,000,000 hat.
15
DE19823228306 1981-08-06 1982-07-29 Verfahren zur herstellung von polyen-antibiotika und eines neuen tetraen-antibiotikums mit wirksamkeit gegen fungi Ceased DE3228306A1 (de)

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