DE1642601A1

DE1642601A1 - Verfahren zur Gewinnung eines Mikroorganismus oder einer einen Mikroorganismus enthaltenden Fraktion

Info

Publication number: DE1642601A1
Application number: DE19681642601
Authority: DE
Inventors: Vinh Ky Charles
Original assignee: BP PLC
Current assignee: BP PLC
Priority date: 1967-03-08
Filing date: 1968-03-07
Publication date: 1971-05-06
Also published as: BE711916A; FR1560717A; NL6802848A; GB1208572A

Description

PATENTANWÄLTE
DR.-ING. VON KREISLER DR.-I NG. S C H ÖNWALD j 64 2 60 1

DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 13.2,1968 Fu/Ax

The British Petroleum Company Limited, Britannic House, Moor Lane, London, E.C.2 (England).

Verfahren_zur Gewinriung_eines_Mikroorganismus oder einer einen Mikroorganismus enthaltenden Fraktion

Hie .,riinaung "bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung eines Mikroorganismus oder einer .Fraktion, die einen Hikroor'ganiamus enthält, aus einem Material, das aus einem Mrö:,eren Anteil eines hiieroorganismus und einem geringeren Anteil eines Kohlenwasserstoffs oder insgesamt an Kohlenwnacerstox.f en besteht oder diese Bestandteile enthält, ijö^enc-ttnd der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur kultivier ung eines Mikroorganismus auf einem Kohlenwasserstoffcubütrat; und zur Gewinnung eines von Kohlenwasserstoffen i. wesentlichen freien Mikroorganismus oder einer Fraktion, ale einen von ^ohlenwasserstoffen im wesentlichen freien r^;ianismus enthält.

nie beimische Patentschrift 643 521 beschreibt ein Verfahren, be ^: αβίί. man einen Mikroorganismus auf einem Substrat kultiviert, UHfJ aua geradketti-^en !'.!onlenwassorstoffen besteht o'iur· dibi;e enthält, und den gewonnenen Mikroorganismus, der mit .Kohlenv/aHaerBtoffen verunreinigt sein kann, einer Be- ncrjiluni' unterv/irlt, durch die die Zellwände durch Autolyse, Llaamolyije oüer Hydrolyse zerstört werden, und anschließend dau so erhaltene irodukt oder das restliche Produkt nach g deü ijellwandmaterials der Lösungsmittelextraktion

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zur Entfernung von Iiohlenwasserstoffen und/oder Lipiden unterwirfte

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dai.: man ein i'-iaterial, das aus einem größeren Gewichtsanteil eines Mikroorganismus oder insgesamt von Mikroorganismen und einem geringeren Anteil eines Kohlenwasserstoffs oder insgesamt an Kohlenwasserstoffen besteht oder diese Bestandteile enthält, vorzugsweise entweder allein oder in Mischung mit zugesetztem iTüsßigphasenmaterial unter solchen Bedingungen erhitzt, daß die Seilwände der Zellen des Likroorganismus eine Veränderung erfahren, aber derart, daß nach dieser 3ehandlun;·' die Zellen zum größeren ieil ungeschädigte Zellen bleiben, d»ho Zellen, die ihr Cytoplasma innerhalb ihrer Zellwände zurückbehalten. Vorzugsweise wird anschließend eine Fraktion, die die ungeschädigten Zellen enthält, einer Lösungsmittelextraktion unterworfen, um an die Zellen gebundenen Kohlenwasserstoff zu entfernen.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, da3 die folgenden Stufen umfaßt:

1) Kan kultiviert einen Mikroorganismus in Gegenwart eines aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden oder diese enthaltenden Einsatzmaterials, eines wässrigen Nährmediums und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases,

2) unterwirft das Produkt der Kultivierung einer Abscheidungsbehandlung oder einer Reihe von Abscheidungsbehandlungen,

3) erhitzt die in der Stufe (2) erhaltene, . den !Mikroorganismus enthaltende Fraktion vorzugsweise allein oder in Gegenwart eines zugesetzten iTüssigphasenmaterials unter solchen Bedingungen, daß die Wände der Zellen des Mikroorganismus eine Veränderung erfahren, aber derart, daß nach dieser Behandlung die Zellen zum größeren Teil

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unbeschädigte Zellen bleiben, d.h_o Zellen, die ihr öytoplasma innerhalb ihrer Zellwände zurückbehalten,.und

A) unterv/irft anschließenä eine Fraktion, die die ungeschädigten Zellen enthält, einer Lösungsmittelextraktion zur Entfernung von Kohlenwasserstoff, der an die Zellen gebuncien ist.

Die Trennbehandlung oder die Reihe von iCrennbehandlungenin Stufe (2) umfaßt vorzugsweise eine Dekantierung oder stattdessen oder zusätzlich eine Zentrifugierungo

In der Stufe (5) kann die den Mikroorganismus enthaltende /:oalition unter Bedingungen, bei denen Verdampfung stattet inoet, für eine D^uer erhitzt werden, die notwendig ist, ULI die fraktion zur i'rockene einzudampfen. Gegebenenfalls icani". jedoch die Fraktion während dieser gesagten Stufe im flüssigen Zustand gehalten werden. Gegebenenfalls kann vor den Erhitzen ein in der flüssigen Phase vorliegendes Material, vorzugsweise ein wässriges iiaterial, zugesetzt werden. Dieses wässrige Katerial ist zweckmäßig wasser oder eine verdünnte Mineralsäure»

Die «ürmebehandlung in der Stufe (3) wird unter solchen Bedingungen ά·=τ Temperatur und Zeit durchgeführt, daß die Entfernung von kohlenwasserstoffen aus den ungeschädigten Zellen durch Lösungsmittelextraktion durch diese Behandlung erleichtert wird. Vorzugsweise liegt die Temperatur der v/ärmebehandlung über 7O⁰O.

Wenn v.er p^-V.ert der Flüssigphase während des Erhitzens nicht bei 7 liegt, wird das Gemisch vor der weiteren Behandlung vorzugsweise neutralisiert.

In -,t,r ütui'e (3) wiru das Produkt nach dem Erhitzen der in Jtuie (?) erhaltenen, den Mikroorganismus enthaltenden I'r^-Ktion vorzugsweise einer Behandlung unterworfen, durch aie iieatanuteile außer ae.r; hikroor.-anismus teilweise

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entfernt werden. Vorzugsweise wird diese Entfernung von Bestandteilen durch Zentrifugieren vorgenommen, wodurch in Fällen, in üenen noch freier kohlenwasserstoff vorhanden ist, eine iiohlenwasöerstoff fraktion entfernt und /ouer, wenn wäßriges i-iaterial vorhanden ist, ein wässriges imaterial entfernt wiro„ Wenn aie WärmetehanrHun?/ in u-egenwort einea wässrigen Laterials durchgeführt wird, wira das Produkt dieser .Behandlung vorzugsweise irr. neißen Zustand zentrifugiert. Vorzugsweise wird dieses Proaulrt zwischen dieser .Behandlung und der Zentrifugierung nicht wesentlich gekühlte Der wässrige Extrakt kann mit oder ohne vorhergehende Reinigung, Veränderung oder Umwandlung in die i ultivierungsstufe aes Likroorgönisirus zurückgeführt werden.

einer aride, en ;-etLOue kann L;er Wasseranteil in btuie (3) verringert werden, inöeni ein mit v/asser mischbares organisches Lösungsmittel zugesetzt und aas so erhaltene Gemisch anschließend einer trennung unterworfen wird. Als organische lösungsmittel, die mit v/asser mischbar sind, eignen sich Ketone und Alkohole» Besonders geeignete Alkohole sind Isopropylalkohol und Äthanol.

Die Lösungsmittelextraktion in Stufe (A) wird vorzugsweise mit einem Lösungsmittel durchgeführt, das aus einem i-oiilenwasserstoff besteht oder diesen enthält. Vorzugsweise wi^T>d

Kohlenwasserstoff em o mit 4 bis 7 C-Atomen im i-iolekül verwendet. Bevorzugt als Kohlenwasserstoffe werden Paraffine, vorzugsweise geradkettige Paraffine. Als j Ö..?urii_ omit ..el eignen sich n-Pentan und η-Hexan. GegebenenftIls geht der Extraktion der 1-j.ikroorganismusfraktion mit einem Kohlenv.asse -stoil"!' ala Lösungsmittel eine Extraktion idi, einem Alkohol, vorzugsweise Äthanol oder Isopropanol, voraus,, Gerecunenfclis kann eine Extraktion vorgenommen werden, ir. der als Lösungsmittel ein Gemisch eines Kohlenwasserstoffs mit beispielsweise Äthanol vearwendet wird. Geeignet ist beis.. ielaweit?e ein Lösungsmittel, das aus 60 Οι.ν/.-,ο liexan und PO Gew.-υ Atnanol besteht.

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Die in ie·.·:· Exuraktionsatufe zurückgewonnenen Materialien können, vie .η sie abbaubar sind, in die Kultivierungs stufe des iiikroOrganismus zurückgeführt werden«

Bei Viirv/en^ung eines Einsatsmaterials, das Kohlenwasserstoffe enthält, die nicht assimiliert werden, wird der Zusatz eines oberflächenaktiven jiittels und anschließende Zentrifugierung alo zusy.tsl.iche :-!iaßna.hiue itfl nahmen der Stufe (2) "besonders bevorzugt, ferner sollte diesen beiden ϊ-iaßnahmen vorzugsweise eine jüekantierung zur Entfernung eines wesentlichen -JL¹GiIs tier wässrigen Phase vorausgehen,,

Wenn die Stufe (3) durch Erhitzen in Gegenwart von Wasser üo äu._ angeführt wird, dai3 das G-ernisch einen ρττ-Wert von atv;^f". 7 hat, wird eine Lauer der ;Jehandlu^rg von wenigstens '50 i'inut'jn besonders bevorzugt» Vorzuysx-zeise wird die Be-'j".-ηellung hei einer Temperatur im Bereich von 90 bis 110 0, z'A'ecKXiüföig bei 100⁰G durchgeführt,

uu.a /e.xpiiren einschließlich der wahlweine durchgeführten 7 :;...· .:=.: π r.'o nc stufen v/ird nachstehend ausfiüirlicher beschrieben.

Al:; i.ikrooj-'^aniomen, die in uer hier beschriebenen Weise Kultiviert v/eraen, kor/nuen riefen, Pilze und Bakterien in i'i'a^c» "'nter den hier rebrauchten Ausdruck "r'iikroorganisnius"

i3cne von iiikrooruanianieno

J-Ji'^ in -ji-.aer Htischreibung genannten Bakterien sind nach dem i'.ln.3sifizierun£üsystem eingeteilt, das in "Bergey's Manual of ueterminative Bacteriology" von R.S«, Breed, E.G.DeHurray und ii.R. Ljmith (7. Auf lage 1957), herausgegeben von Williams and wilkins (Baltimore, U.S.A.), beschrieben ist. Die liefen siOU nach dem Klasrjifi^ierungssystem gemäß "The Yeasts a i/cjxonomic Jtudy" von Lodder und Zreger-van Ri3 (1952), hor':;.u.^!4,gegt;Den von North Hol].and Publishing Company (Amsterdam), eingestuft.

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I b 4 2 6 O 1

Bevorzugt werden I-iikroorganismen, die wenigstens ein iformalparaffin zu assimilieren vermögen.

Bei Verwendung einer liefe gehört diese vorzugsweise sur Familie Cryptococcaceae, insbesondere zur Unterfomilie Oryptoooccoideae. Gegebenenfalls können jedoc· auch beispielsweise ascosporogene Hefen (er Unterfamilie Saccharomyceloideae verwenaet werden» Bevorzugte Gattungen der Unterfamilie Grypiococcoideae sind Torulopsis (auch als l'orula bekannt) und Candida, Bevorzugte Ilefestämme weraen nachstehend genannt. Besonders bevorzugt werden die dtümme, die nachstehend zusammen mit den Hinterlegungsnumrnern genannt sind. Die mit OBS gekennzeichneten Stu ine sind beim öentraal Bur&au vor Schimmeleulture, ^aarn, Holland, die r.iit GMI gekennzeichnete;) ütänime beim Commonwealth Mycologies! Institute, Kew, England, una die mit IiOYC ,"^kennzeichneten Stämme bei der National Collection of Yeast Cultures, ijutfield, England, hinterlegt,

Spezies Bevorzugter Stemm

Candida	brumptii
ir	catenulata
1!	clausanii
Il	humicola
It	intermedia
It	krusei
Il	lipolytica
Il	melibiosi
Il	parapsilosis
Il	pulcherrima
It	rugosa
It	stellatoidea
Il	tropicalis
It	utilia

CBS Nr₀ 2078; I.r.599 CMI i!r. 93743 liCYC I.r. 376; Mr. 153

CHI Wr.83350, υCYC ;ir.4!:)ö

NCYC Er,4 CMI Nrο 2331

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ί b 4 2 6

opezies

Dobaryoinyces kloec'-^eri Lansenula anomila Picliia guilliermondii ilhodotorula glutinis i'orulopcis xamata ¹¹ raagnoliae

Bevorzugter Stamm

CBS iir. 2084; Hr«2051

Von aen vorstehenden StH .men werden Candida lipolytica und Condida tropicalis besonders bevorzugt,

¹Je:' eben·, nfalls können Pilze als mikroorganismen kultiviert werfen. Geeignet sind Pilze der Familie Moniliaceae. Eine geeignete Gattung ist Penicillium. Vorzugsweise wird Penicilliuüi expansum verwendete Eine weitere geeignete Gattung ist Aspergillus_o

J¹GlIs gewünsclit, können als Mikroorganismen Bakterien verwendet werden, die zweckmäßig zu aen Ordnungen Pseudomonaa.ilee, iubacteriales und Actinomycetales gehören. Die verwendeten bakterien gehören vorzugsweise zu den Familien 'Jorynebacteriaceae, Micrococcaceae, Achromobacteraceae, Actinomycetaceae, Rhizobiaceae, Bacillaceae und Pseudomonadaceae. Vorzugsweise werden die Snezies Bacillus megaterium, üacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa verwendet. Weitere geeignete Stämme sind:

Achroiaobacter sp_o Brevibacterium sp₀ Corynebacterium sp, ilevcbacterium Sp₀ liicrococcus sp. Pseudomonas sp. Lyeobacterium smegmatis " sp.

iJocaraia erythropolis

¹¹ minima

" opaca

" polychromogenes

" rubra

" rubropertinota Streptomyces griseolus " rimosus

BAD

Ein geeignetes üährrnedium für Hefen und Pilze hat folgende Z uo amme ns e t ζ ung:

jjiammoniumphosphat 20 g

Kaliumchlorid 11,5 g

Magnesiumsulfatheptahydrat 6,5 g

Zinksulfat 1,7 g

Mangansulfatmonohydrat 0,45g

Eisen(Il)-sulfatheptahydrat 0,68g Leitungswasser zur Auffüllung auf 1000 ml

Ein weiteres geeignetes Medium für Pilze und Hefen hat folgende Zusammensetzung:

Ammoniumsulfat 50 g

Linatriumphosphat 50 g

Monokaliumphosphat 5 g

Hefeextrakt 5 g

Destilliertes wasser zur Auffüllung auf 1000 ml

Das Verfahren ist von besonderem Wert bei Verwendung eines Kohlenwasserstoff Substrats. Vorzugsvei;?e -werden geradkettig Kohlenwasserstoffe verwendet. Die :;;eraük:ettigen Kohlenwasserstoffe sind im !Sineatsmaterial für die Kaltivierungsstufe gewöhnlich als Paraffine vorhanden, ο is kö-.nen jedoch auch als Olefine vorliegen. Ferner können (jenische vervendet werden, die geradkettige Paraffine und Olefine enthalten. Lie verwendeten Kohlenwasserstoffe hrben gewöhnlich wenigstens 10 Kohlenstoff atome im riolekül.

Zu aen für das Verfahren gemäß der Erfindung geeigneten Einsatzmaterialien gehören Leuchtpetroleum, Gasöle und Schmieröle ο Diese Einsatzmaterialien können unrnil'iniert oder einer gewisser· raffinierenuen Behandlung unterworfen worden sein, jedoch müssen sie einen Anteil an geradkettircn kohlenwasserstoffen enthalten, um für die Zwecke der Erfindung geeignet au ,sein. Zweckmäßig enthalt die Erdölfraktioi; 3 bis 45 Gew.-/» geradkettige" ivchlenwaeserstof i'e.

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Verfahren gemäß der Erfindung ist von "besonderem Wert für die Behandlung von Gasölfraktionen aus Erdöl, die geradKet tige xionlenwasserstoffe in J?orm von Wachsen enthalten, da durch das Verfahren gemäß der Erfindung ein CkuKJl von verbessertem ütockpunkt erhalten wird, während aie aaohüe in ein wertvolles Produkt umgewandelt werden«

.ja:; viochstum der Mikroorganismen wird begünstigt, wenn man zur»· Xulturmedium eine sehr geringe Menge eines Hefeextraktes (ein durch Hydrolyse von Hefe erhaltenes, an Vitaminen der Gruppe 3 reiches industrielles Produkt) oder allgemein an Vitaminen der G-ruppe B und/oder Biotin zusetzt. Diese Menge liegt vorzugsweise in der Größenordnung von 25 'feilen pro i-J. iiion. uie icann je nach den für die Kultivierung gewählten Bedingungen höher oder niedriger sein.

Dau wässrige liahrmedium wird vorzugsweise durch stufenweise oder kontinuierliche Zugabe eines wässrigen Mediums von hone¹.! ρ-,-v/ert beim gewünschten Pj,-Wert gehalten. Gewöhnlich wira der Pvr-»';ert des llährmediums bei Verwendung von Pilzen öd·;!· nefen, insbesondere von Candida lipolytica, im Bereich von 'j bis 6, vorzugsweise im xiereich von 4 bis 5 gehalten, {ziA'terien erfordern einen höheren p^-Wert von gewöhnlich b,[> bio 8.) Geeignete alkalische Materialien für den Zusatz zum Lährmediurn sind ITatriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Din?-jtriumhydro;^;enphosphat und Aumoniak in freier Form oder ir· v/ü:jariger Lösung»

^h^r; opt j male Temperatur des llährmediums ist verschieden je n^ch der Art des verwendeten Mikroorganismus und liegt /-/■.■wohnlich im boroich von 25 bis 35 0« Bei Verwendung von '!■■ ndida. lipolytica wird ein i'emperaturbereich von 28-32⁰C L ο vo r ζ Uf. t.

uv: Aufnahme von üauerstoff ist für das Wachstum des Mikrooχ·?.--μπ i ijrnurj wesentlich. Der Sauerstoff wird gewöhnlich als Luft zufHjführt. Damit die Wachstumsgeschwindigkeit hoch

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bleibt, muß die für die Einführung von Sauerstoff verwendete Luft durch Rühren in feine Bläschen zerteilt werden. Die Luft kann durch eine Fritte eingeführt v/erden, jedoch κειηη auch das als "Y/irbelbelüftung" bekannte System der intensiven Belüftung zur Anwendung kommen«

Der Fermenter wird vorzugsweise kontinuierlich betriebene

Das vom Fermenter abgezogene Produkt ist ein Gemisch aus i-iikroOrganismus, wässrigem Nährmedium und restlichem Öl_o Dieses Produkt wird vorzugsweise der Dekantierung unterworfen, um den größeren Teil des wässrigen Nährmediums zu entfernen. Der Rest des Produkts wird vorzugsweise in einer oder mehreren Stufen zentrifugiert, um einen Teil uer -verbleibenden wässrigen Phase zu entfernen (und, bei Vorhandensein eines genügenden Ülanteils, um eine ülphase zu entfernen), wobei ein Gemisch aus Mikroorganismus, wässrigem Medium und restlichem öl gewonnen wird.

Die I'Iikroorganismusfraktion, die gewöhnlich in Form einer Paste oder Creme vorliegt und Kohlenwasserstoffe als Verunreinigungen enthält, wird wahlweise einer Wäsche mit einer wässrigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels unterworfen» Vorzugsweise wird die Mikroorganismusfraktion mit dem wässrigen oberflächenaktiven Mittel kräftig vermischt und ohne weitere Wachstumsperiode des Mikroorganismus einer weiteren !Trennung vorzugsweise durch Zentrifugieren unterworfen, wobei eine Mikroorganismusfraktion und eine aufgebrauchte wässrige Phase, die die aus dem Mikroorganismus abgetrennten verunreinigenden Kohlenwasserstoffe enthält, erhalten werden. Palls erforderlich, können die Wäsche und die Trennung einmal oder mehrmals unter Verwendung eines wässrigen oberflächenaktiven Mittels in der Waschstufe wiederholt werden» !!ach der Wäsche mit dem oberflächenaktiven Mittel muß mit einem wässrigen Medium nachgewaschen werden, das kein oberflächenaktives Mittel enthält, Vorzüge-

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weise wird W-sser als dieses Medium verwendet. Gegebenenfalls it η η η auch hier mit einer Reihe von Wasch- und Trenniii gearbeitet werden.

Vorzugsweise wird do lan^-c gewaschen, bis der Kohlenwasser-GtCiT:, eh alt des iiikroorgEmismus unter 7/* liegt, bezogen auf das Gewicht des Mikroorganismus (gerechnet für den ii"jcicenen Zustand)» Vor^u^aveise liegt dieser Gehalt an /oi/lenwasserstollen unter *j,~₀

Als oberflächenaktive liittel sum Waschen eignen sich kationä„-. tivc- Mittel, z.B. Stearj ltrimethylammoniumchlorid, niclrbionogene oberflächenaktive Mittel, Z₀B₀ die condensate von Oleinsäure und Äthylenoxyd, oder anionaktive Mittel, z_o-3. \: v. i r i uinalky 1 s ul fate.

.Die Mikroorganismusfraktion, die mit oder ohne die vorstehend beschriebene Waschstufe oder Waschstufen erhalten wird, wird einer Wärmebehandlung unterworfene Die optimale Kombination von Temperatur und Behandlungszeit bei der Wärmebehandlung kann ermittelt werden, indem eine Reihe von Proben dem hier beschriebenen Verfahren unterworfen wirdo (Das bei diesen Versuchen nach der Lösungsmittelextraktion erhaltene Produkt kann analysiert werden, um den Gehalt an .kohlenwasserstoff in der. Mikroorganismus zu bestimmen. Die BehandlungsbGuin{\ungen hinsichtlich Tunperatur und Dauer können dem- ·: ν:ΐ jpr achenci gewälilt werden„)

^ie Wärmebehandlung wird vorzugsweise durchgeführt, nachdem uer ^iikrocrganisiausfrr.ktion wenigstens die gleiche Gewichtsmurhve eines wässrigen iiediums, zweckmäßig Wasser, zugesetzt woraeu isto Vorzugsweise wird das so erhaltene Produkt ohne woser.tliche Zwischenkühlung zentrifugiert, wodurch etwaige - uLu^prGdutcte, die in uer wässrigen Pnase v/ährend der v.^ruetjoi oftülung gelöst oder in der Lösung gebildet werden, von uur i iKroor;;anisniusfraktion abgetrennt werden. Der v/^:. ·:;γι//ο Extrakt kann ohne vorherige Reinigung, Modifizie-

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rung oder umwandlungsbehandlung in die Kultivierungsstufe des Mikroorganismus zurückgeführt werden. i'iach der Zentrifugierung wird die Mikroorganismusfraktion vorzugsweise auf einer Trommel getrocknet, urn einen größeren Anteil, jedoch nicht die Gesamtmenge des in der Fraktion vorhandenen Wassers zu entfernen_β

Das den Mikroorganismus enthaltende Produkt aus der Trocknungsstufe wird dann vorzugsv/eise einer Lösungsmittelextraktion unterworfen. Die Extraktion wird vorzugsweise mit einem Lösungsmittel durchgeführt, das aus Wasser und/oder wenigstens einem Kohlenwasserstoff und/oder wenigstens? einem Alkohol besteht oder diese Bestandteile enthält. Vorzugsweise enthält der kohlenwasserstoff 4 "bis 7 Kohlenstoffatome im Molekül. Bevorzugt da Kohlenwasserstoff wird ein Paraffin, α .as vorzugsweise wiederum ein geraakettiges Paraifin ist» Als Lösungsmittel eignen sich n-Pentan und n-Hexan,

Der Extraktion mit einem Kohlenwasserstoff als Lösungsmittel kann gegebenenfalls eine Extraktion mit einem Alkcixl, vorzugsweise I3oprope.nol, vorausgehen, oder sie kern n roh diese Extraktion ersetzt v/erden. V/eitere geeignete Alkohole sind Äthanol, n-Propanol und Butanole»

Gegebenenfalls kann eine Extraktion vorgenommen werden, für die ein Gemisch eines Kohlenwasserstoffs mit beispielsweise Äthanol als Lösungsmittel verwendet wird. Beispielsweise eignet sich hierbei ein Lösungsmittel, das aus 80 Gew„-,.· Hexan und 20 GeWo-yi Äthanol oder Isopropanol besteht.

Die Kohlenwasserstoffe, die in der Extraktphase durch Lösungsmittelextraktion zurückgewonnen werden, icönnen, wenn sie abbaubar sind, in die Kultivierungsstufe ties Mikroorganismus zurückgeführt werden.

Gemäß einem bevorzugten Merkmal ist die Erfindung auf ein Verfahren gerichtet, das dadurch gekenr.scichnet ist, dri ::iati

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einen Mikroorganismus auf die vorstehend beschriebene weise in Oe^env'ort einer Erdölfraktion, die teilweise aus gerad-.■cö'L ti;;en Kohlenwasserstoffen besteht und eir mittleres Molekulargewicht hat, das wenigstens 10 Kohlenstoffatomen i:;. Molekül entspricht, und in Gegenwart eines wässrigen iTüiiriaediums Lind eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases kultiviert und aus dem Gemisch einerseits den Mikroorganismus und andererseits eine Erdölfraktion abtrennt, die einen VüiT.ir4 erten Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen iir.it oder frei von dieser, geraukettijen Kohlenwasserstoffen ist, uno ansciiließena den Mikroorganismus in der vorstehend umschriebenen v/eise behandelte

bevorzugte Verfahren, die bei der Kultivierung der Mikroorganismen uno. bei der Gewinnung des Produkts angewendet werden können, sind in den britischen Patentschriften 914 507 und 914 568 und in den folgenden Patentanmeldungen Deschrieben:

jjeutsehe Patentanmeldungen;

B 74 -351 IVa/6a B 85 0?2 IVd/23b

B "(ό 776 IVa/6a B 85 O73 IVd/23b

B 79 521 IVa/ob B 85 074 IVa/6a

B 79 522 IVd/23b B 85 O75 IVa/6a

B 05 071 rVa/6a

Britische Patentanmeldungen;

46 906/62 21 209/64

²I'J 049/62 22 743/Ö4

49 050/62 25 229/64

49 062/62 26 498/64

49 063/62 37 985/64

2254/63 37 988/64

19 918/63 46 732/64

?5 210/63 47 326/64

36 873/63 48 082/64

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lb42601

Britische Patentanmeldungen;

44 606/63 52 191/64

45 002/63 52 192/64 45 005/63 5035/65

45 102/63 5086/65

46 410/63 11 703/65 46 411/63 25 643/65 11 360/64 28 766/O5

Me Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Die zunächst beschriebenen Versuche wurden nicht nach eier erfindun^SKemäßen Arbeitsweise durchgeführt, sondern dienen lediglich v.-r Vergleichszwecke„

Versuch 1

Die Hefe Candida tropicalis wurde in einem kontinuierlich

betriebenen !Fermenter von 12m !Fassungsvermögen in Gegenwart eines wässrigen Ijährmediums der folgenden Zusammensetzung kultiviert:

Diammoniumhydrogenphosphat 2 g

Taliumchlorid 1,15 g

Hagnesiumsulfatheptahydrat 0,65 g

Mangansulfattetrahydrat 0,068 g

Eisensulfatheptahydrat 0,124 g

Zinlcsulfatheptahydrat 0,308 g

Hefeextrakt 0,05 g Leitungswasser zur Auffüllung auf 1000 ml

Der verwendete Fermenter hatte die Form eines senkrechten zylindrischen Gefäßes, das ein koaxiales zylindrisches Leitrohr enthielt. Das Verhältnis der Querschnittsfläche des Ringraumes zur Querschnittsfläche des Innenraumes des Leitrohres betrug 1:1. Der Fermenter war mit einem Propeller versehen. Luft wurde mit einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 60 V/V/Std_e durch V/irbelbelüftung zugeführt.

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6AO ORfGlNAL

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Als kohlenstoff quelle vurcie ein Gasöl aus Mittelost—Rohöl mit folgenden liennzahlen verwendet:

spezifisches Gewicht 0,870

+ 15 300-390

otockpunkt + 15 C

üin ue.:i.jch aus Gasöl und wässrigem Nährmedium im Volumenverhältηis von 1,5:10 wurde dem i'ermenter in einer Menge von ;!4CC 1/otd« zugeführt, jjer Fernienter wurde bei 30 C und aurch kontinuierliche Zufuhr von wässrigem Ammoniak bei Pf. 4 gehaltene

Ein irroduktstrom wurde kontinuierlich abgezogen und in ein jekantiergeiäi geführt_o 70 Vol.-yj der dekantierten Phase, o.ie f->U3 ausgebrauchi/em wässrigem Medium bestand, wurde abgezogen. Zu der; verbleibenden 30,-, die aus einer Hefecreme bSL-tan.iun, wurden 70,j ixischwasser zugesetzt, um das ur-3!dingliche GeraiGch wieder herzustellen. Zu diesem Gemisch vurüen u,ö g oxväthylierter und sulfatierter Laurinalkohol (:.e^;ndel3be^eichnung "Laural bOö") als oberflächenaktives Mittel gegeben, worauf das Geuisch gerührt wurde«, Die auf diese Weise erhaltene Emulsion wurde in eine Zentrifuge gegeben, in der sie in eine Gasölphase, eine wässrige Phase und eine Hefepaste getrennt wurde«, Die Hefepaste wurde anschließend erneut mit Leitungswasser im Verhältnis von 1 Gew.-Teil Trockensubstanz pro 5 Gew.-Teile Wasser gemischt, !lach gutem Verrühren wurde erneut zentrifugiert. Der hierbei erhaltene Hefebrei wurde einer Trockentrommel zugeführt, durch die ein Teil des Wassers entfernt und eine Creme gebildet wurde, die aus 50 Gew.-yc hefe (T_rockengewicht) und 50 Grew.-;.* V/aoser bestände Me Analyse der in dieser Creme enth-^lTenen Hefe hatte folgendes Ergebnis: jjVacJL Li,jkeit 3 Gew.-£>

'>-esar:itlipide 16,6 " (bezogen auf Trockenhefe) PhcRpnor 2,3 " " " "

Α·; ehe 8,2 " " » "

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Die Hefecreme (nit 5O.Gev.-7i> Hefe) wurde dann in einen Extraktor gepumpt, der die Form einer Filtertrommel h-tte, die mit ihrer Achse in horizontaler Lage gedreht wurde« Ein Lösungsmittelgemisch aus je 50 Gew„-> η-Hexan und Isopropanol wurde aer nassen Hefe in einer Heng.e von 8 Gew„-Teilen des Gemisches pro Teil Hefe (Trockengewicht) zugegeben„ Das Gemisch aus Hefe, Wasser und Lösungsmittel wurae 30 Hinuteri bei 80 C gehalten. Dann wurde das Lösungsmittel, das den /.rößeren Teil der Heieverunreinigungen enthielt, abgezogen» Das verbleibende nasse Hefeprodukt wurde erneut in einer zweiten Extraktionsstufe (der ersten .Extraktion) mit Lösuni'snittel behandelt, wobei auf 1 Gev„-Teil i'rockenhefe und 1 Teil V/ass-r 4 Teile des Gemisches aus je 50 Gew_o-/» η-Hexan und Isopropanol verwendet wurden. Die liontaktzeit betrug 30 Hinuten, die Temperatur 50⁰C.

Nach der Filtration des Lösungsmitteis, das mit einer gewissen Menge Hefeverunreinigungen beladen war, wurde das verbleibende Produkt in einer zweiten Extraktion mit 4 Gew₀-Teilen Isopropanol pro Teil Trockenhefe behandelt ο Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 50⁰C gehalten und. das Lösungsmittel abgezogen, wobei zum Schluß unter Vakuum gearbeitet wurde. AbociilieLiend wurae das befeprodukt mit überhitztem Dampf getrocknet. Die Analyse des Endprodukts hatte folgende Ergebnisse:

Feuchtigkeit 0,5 Gew.-'/ί

Gesamtlipide 0,6 " (auf Trockenbasis)

Phosphor 1,9 " " "

Asche 8,8 " » "

Beispiel 1

Der vorstehend beschriebene Versuch 1 wurde wiederholt üiit i.en Unterschied, dai die verdünnte Hefepaste, die nac.i der ersten Zentrifugierungsstufe erhalten wurde, durch ein mit einem Propeller versehenes Gef'ii? geführt wurde. Dieses Gefäß wurde so erhitzt, daß die Hefecreme auf eine Temrei

109819/0003

SAD

von 10O⁰G gebracht wurde« Das Verfahren wurde kontinuierlich durchgeführt. Die Verweilzeit in diesem Gefäß betrug 1 Stunae, -iiiife p^-v.-erteinstellung wurde nicht vorgenommen«

1a:.s kontinuierlich abgezogene Produkt wurde dann durch die zvyeite Zentrifugierungsstufe geführt und heiß zentrifugiert (etwa 10ν.^ο0). Anschließend wurde das Produkt in der gleichen weise, v/ie vorstehend in Versuch 1 beschrieben, getrocknet und extrahiert. Lie Analyse des Produkts nach der IVockentrcj:aii;el und des Produkts nach der Extraktion hatte folgende iir e Ln I sue:

Jesamtlipide, 'lew.-^ujo (bezogen auf Trockenbasis)

Nach der	Endprodukt
Trocken trommel
0,7	0,5
15,5	0,75
1,5 5,7 8,2	1,4 6,0 11,2

, Gev/.-/t»
(a uf i'rοc.<enbasiö)

A .J oho (auf TrocKenbasis) ,G-eWo-^f/3 stickstoff

jjiü vorstehenden Er^ebnisae zeigen, daß als iVlge der Wärmebot'.·:. Xl .".!lung der Phosphorgehalt und der A3 ehe gehalt des HefeproaukiG niedriger waren als beim Versuch 1, bei dem keine w iriii^u/riandlung vorgenomuen vmrde. Der Anteil unversehrter Zeij.en Lu Material nach der Wärmebehandlung betrug 95'/<ό

Beispiel 2

Ur i/j :i«i3piel 1 beschriebene Versuch wurde unter Verwen-U¹Uj₁.. von Candida lipolytica an Stelle von Candida tropicalis wiederholt,, Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten. Der Anteil urve-aehrter ZoLlen im Material nach der Wärmebehandlung

1 0 9 8 1 9 / Π 0 0 3 ÖAD ORIGINAL

1042601

Versuch 2

Die Hefe Candida lipolytica wurde in einein kontinuierlich betriebenen Fermenter von 1800 1 Fassungsvermögen in Gegenwart eines wässrigen iiährtnediums und einea , ohlenstoffsubstrats unter folgenden Bedingungen kultiviert:

Temperatur 32-33,5°C

Druck 0,53 atü

Rührgeschwindigkeit 500 UpM

Verdünnungsrate 0,1 V/V/Stunde

Belüftung 1 V/V/Minute

Ptr-Regelung durch Zusatz von gasförmigem Ammoniak

-Als kohlenstoff quelle diente ein Gemisch aus ii"ormalparaffinen der nachstehend genannten Zusammensetzung, die dem i'ermenter in einer Menge von 38,8 g/l Gesamteinsatz zugeführt wurden,, Das Normalpraffingemisch hatte folgende Zusammensetzung:

G -	■ Zahl	Paraffine
unter 1	1
1	1
1	2
1	3
1	4
1	5
1	6
1	7
1	8
1	9
verzweigte

0,2 0,1 0,9 5,9 14,4 25,5 29,5 18,6 3,3 0,2

1,4

Das wässrige Mhrmedium hatte folgende Zusammensetzung pro Liter:

109819/Π003

fbA2601

(im )_oH10	(i-lonohydrat)	Oft p-;;n	2,2
(üi,₄)₂o0₄	: Kupfer	0,2 ppm	4,48
KOl	Kobalt	0,2 ppm	1,2
OaCl₀₀D Ii₀O	I-lolybdän	0,10
Ua Öl		0,2
HgDO₄.7 H₂O		0,3
KnSO₄,4 H₂O		0,044
]?eü0,.7 H₀O		0,068
ZnSO₄.7 H₂O		0,17
hefeextrakt		2,0
Citronensäure		0,4
0 j. ur <= η e 1 en e η t e

Leitungswasser sur Auffüllung auf 1 1.

1j*s Iroaukt des /ermenters wurde in eine Zv.'ischenvorlage
unu von dort unmittelbar in eine kontinuierlich arbeitende Zentrifuge geführt, eius der eine Konzentrierte Creme erhalten wurde, die 100 bis 150 g Troc_-..enhefe pro Liter enthielt« Diese Creme wurde dann mit kaltem Wasser gewaschen, das das fünffache Volumen der Hefecreme hatte„ Die so erhaltene Suspension wurde zentrifugiert. Die erhaltene Creme wuräe mit (
r;e trocknet,

v.'uräe mit der Trockentrommel bei 140-15O⁰C und Kormaldruck

Versuch 3

.uie Hefe Candida lipolytica wurde in einen Kontinuierlich
betriebenen Percenter von 4000 1 Fassungsvermögen bei Ausnutzung eines Arbeitsvolumens von 274C 1 (Füllhöhe 2/3)
in Ge. env/art eines wässrigen Hährmediums und einer Kohlenstoll quelle unter folgenden Bedingungen kultiviert:

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- ²⁰ " lfci42601

Yerdünnungsrate 0,1 V/V/Std.

Belüftung	0,9 V/V/Minute	bei xTormald
		-temperatur
P_H-¥ert	5,5
Druck	0,7 kg/cm²
Temperatur	34⁰C
Rührgeschwindigkeit	300 UpM
Propeller	1/3 Durchmesser	des Gefäße«

Als liohlenstoffquelle diente ein Gemisch von lormalpar äff inen, das dem Fermenter in einer Menge von 40 ml/l Gesamteinsatz zugeführt wurde. Das ITormalparaffingemisch hatte folgende Zusammensetzung:

C - Zahl . Gew.-fo

0,8

1,5

3,0

6,7 15,3 25,5 26,4 16,3

3,1

0,2

1,2

Das wässrige liährmedium hatte pro Liter folgende Zusammensetzung:

K/l

Ammoniumphosphat 0,94

Phosphorsäure 0,70

Kaliumchlorid 0,76

Calciumchlorid 0,091

natriumchlorid 0,204

Magnesiumsulfat 1,22

108819/0003

unter 1	1
1	1
1	2
1	3
1	4
1	5
1	6
1	7
1	8
1	9
verzweigte Paraffine

21 - 1&42601

Mangansulfat 0,065

Eisen(ll)-sulfat 0,2

Zinksulfat . 0,528

Citronensäure 0,4

Kupfersulfat 0,1 ppm Ou

fhiamin 100 g/l

Die Gewinnung des Hefeprodukts erfolgte auf die in Versuch beschriebene Weise. i)ie Wasserwäsche der Hefecreme wurde 2 Stunden mit kaltem Wasser durchgeführte

Ve?:auch 4

Lie Hefe Candida lipolytica wurde kontinuierlich in einem Fermenter von 1800 1 Fassungsvermögen kultivierte Das wässrige ,iährKisdium der in Versuch 2 genannten Zusammensetzung v/urü-s dem JPerrnenter in einer nenge von 180 1/Std. zugeführt.

ιΛ~ Kohlenstoff quelle diente ein Gemisch von Hormalpa?affinen, die α-in t'crmenter in einer kenge von 17,6 g/l Gesamteinsatz zugeführt wurden und folgende Zusammensetzung hatten:

O-Z&hl ι 9 10 11 12 13 14 Gev,.-₇a : 0,4 6,9 32,3 33,2 24,6 2,6

Id.κ folgenden Arbeitsbedingungen wurden angewendet:

l'emperatur 3O⁰O

jruck ' 0,6 kg/cm

Rührgüijcnwindigkeit 350 UpM

Voraünnungsrate 0,1 V/V/Stunde

üolüftnng 0,8 V/V/Minute ^:

p,.-Regelung durch Zusatz von gasförmigem Ammoniak,

υ--).·; ProdUiLt wurde -wie folgt aufgearbeitet: Zentrifugieren, ',/■'..;;;:'; r'V/ i iohu der ^r/.0xitrif ugierten Creme in der Leitung mit 1'Ur₁Hi'-ionon Voiumen kalben Wassers, anschließende Zentrifu- f'.'i üi'^ri/i und ΐί-ockriung muF uor j.rockentro'amel bei 140-150 C

98i9/nno3

22- 1542601

Beispiel 3

Der Verauoh 2 wurae wiederholt mit dem Unterschied, ds3 die V/äs ehe mit kaltem Wasser durch eine Wärmebehandlung ersetzt wurde, die darin bestand, day wasaerdampf bei 3,5 atü so eingeblasen wurde, daß die ieraperatur der Creme 30 Minuten bei 100⁰C gehalten wurde. Das Produkt wurde dann durch Verdünnung mit dem 2,5-fa.chen Volumen an kaltem Wasser gekühlt. Das so erhaltene Produkt wurde auf die gleiche ^;//eise, wie unter Versuch 2 beschrieben, zentrifugiert und getrocknet,, Die Vorteile, die gegenüber dem Versuch 2 erzielt wurden, ergeben sich aus den folgenden Analysenwerten der gewonnenen Hefe:

Versuch 2 Beispiel 3

Phosphat, Gew_e-/o 4,4 2,5

Asche, Gew.-/j 5,6 1,9

Beispiel 4

Der in .Beispiel 3 beschriebene Versuch wurue wiederholt mit dem Unterschied, dai3 das wärmebehandelte Produkt durch Zusatz des gleichen Volumens an kaltem Wasser gekühlt wurde» Die Vorteile, die gegenüber dem Versuch 2 erzielt wurden, ergeben sich aus den folgenden Analysenwerten für die gewonnene Hefe:

Versuch_2 Beispiel 4

Phosphat, Gew„-$ 4,4 2,5

Asche, GeWo-)i 5,6 1,7

Beispiel 5

Der Versuch 3 wurde wiederholt mit dem Unterschied, dar ei ie Wäsche mit kaltem Wasoer durch eine zweistündige Wäsche mit heißem Wasser, bei der das Semioch bei 90 C gehalten wurde, ersetzt wurde,, Die Vorteile, die gegenüber dem Versuch 3 erzielt wurden, ergeben sich aus den folgenden Analysenwerten für die gewonnene Hefe:

109819/noo?

	Beispiel	6	Versuch	2	J.	Beispiel	5
irh ο s phat, Gew.-/		4,	6		2,2
Asche, Gew.-/c		5,			2,3

Der '/--.-rauch 4 wurde wiederholt mit äera Unterschied, da5 die gewichene Hefecrerne vor der l'r ommel tro cknung 30 Minuten auf 70-80⁰C erhitzt wurde, Die \^rorteile, die gegenüber dem Versuch 4 erzielt wurden, ergeben sich aus den folgenden Analysenwerten für die gewonnene Hefe:

Versuch 4 Beispiel 6

Phosphat, Gew.-% 4,ö6 3,10

Asche, Gew.-yb 6,3 4,53

Bei der in den Beispielen 3-6 beschriebenen Arbeitsweise enthielt da.= Katerial nacn der j/ärmeb.ehandlung nahezu 100/j unversehrte Zellen (bezogen auf die Gesamtzahl der Zellen).

109819/nOO?

BAD ORIGINAL

Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Gewinnung eines Mikroorganismus bzw. einer einen Mikroorganismus enthaltenden Fraktion, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Material, das aus einem größeren Gewichtsanteil Mikroorganismen und einem geringeren Anteil an Kohlenwasserstoffen besteht oder diese Bestandteile enthält, unter solchen Bedingungen erhitzt, daß die Zellwänd« der Mikroorganismen zwar eine Veränderung erfahren, wonach jedoch der größere Anteil der Zellen intakt bleibt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß wan als Einsatzmaterial ein rohes oder teilweise gereinigtes Produkt des Wachstums eines Mikroorganismus auf e'v.ew. Kohlenwasserstoff substrat in Anwesenhe'-i t eines wäßrigen Ilährmediums verwendet.

Zf) Verfahren zur Züchtung eines Mikroorganismus und seiner Gewinnung aus deu. Substrat, dadurch gekennzeichnet, daß ran einen Mikroorganismus in Gegenwart eines aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden oder diese enthalterden Einsatzmaterials, eines wäßrigen Nährmediurns und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases kultiviert, das Kultivierungsprodukt einer Abtrennungsbehandlung odex¹ einer Reihe von Abtrennungsbehandluiigen unterwirft und die so erhaltene, den Mikroorganismus enthaltende Fraktion unter solchen Bedingungen erhitzt, daß die Zellwände zwar e'-ner Veränderung unterliegen, daß jedoch hierbei aer gröiSere Teil der Zellen intakt bleibt.

4) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis J>, dadurch gekennzeichnet, daß man das Einsatzmaterial in Gegenwart eines zugesetzten Flüssigphasenmaterials erhitzt.

^lj>) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß mar.

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ί b 4 ^ B 01

als Flüsslgjphasenmaterlal ein wäßriges Medium, vorzugsweise Wasser selbst, verwendet.

G) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis '}, dadurch gekennzeichnet, daß man. als Mikroorganismus einen η-Paraffine verbrauchenden Mikroorganismus einsetzt.

7) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus eine Hefe, vorzugsweise aus der Familie Cryptococcaeeae, insbesondere aus der Unterfamille Cryptoooocoideae, einsetzt.

o) Verfahre:! nach Anspruch 7* dadurch gekennzeichnet, daß man HeTe der Gattung Torulopsis einsetzt.

...') /erfahren nach Anspruch J, dadurch gekennzeichnet, daß man Hefe der Gattung Candida einsetzt.

l'O /erfahren naoh Anspruch ), dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida lipolytica einsetzt.

Ij.) 7^₁"fahren nach Anspruch 9* dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida tropicalis einsetzt.

Ii:) Vorfahren nach Ansprüchen ί bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als MiiaOorganIsmus Bakterien verwendet.

1>) /erfahren nach Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man ein !Ohlenv/asGerstoff-Einsatzrnaterlal verwendet, da;; aus v/exiigstexiS einem geradkettigen Paraffin mit wenig- yXGiiv, Ij Kohl <yar, Io ff atomen besteht oder wenigstens ein :y,\ ·Λ<<ί'Δ Paraffin enthält.

V\) /'.-rfahren nach Annpruüh Iy., dadurch gekennzeichnet, daß man fi'xii'i Λ C(W) Y \'v'd.V.\, \.< ii\ einsetzt.

109819/nnn? bado™g>nau

15) Verfahren nach Anspruch Ij5, dadurch gekennzeichnet, daß >var ein öasöl einsetzt.

16) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man das Einsatzmaterial einer Hitzebehandlung bei Temperaturen oberhalb von 70 C, vorzugsweise im Bereich von
90 bis 10Q⁰C, unterwirft.

17) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Hitzebehandlung in einer Wäsche mit heißem Wasser
besteht.

18) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 1?', dadurch gekennzeichnet, daß man eine intakte Zellen enthaltende Fraktion nach der
Hitzebehandlung einer Lösungsmittelextraktion zur Entfernung der anhaftenden Kohlenwasserstoffe unterwirft.

19) Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß i/an ein Lösungsmittel verwendet, das Wasser und/oder wenigstens einen Alkohol und/oder wenigstens einen Kohlenwasserstoff
enthält oder daraus besteht.

20) Verfahren nach Anspruch Iy, dadurch gekennzeichnet, daß ;.;an einen azeotrop bildenden Kohlenwasserstoff, vorzugsweise
η-Hexan, einsetzt.

21) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 20, dadurch gekerinzeicb.net, daß man als Alkohole Äthanol, Propanol, Isopropanol odor
Butanol einsetzt.

22) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gelcenrizei oh.toL, daß man das hltzebehandelte Material vor der Lösungsiiiutelextraktion mit l/asser verdünnt.

2j?) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet,, daß man wenigstens eine Stufe der Lösungsmittelextrakt Lon
bei Temperaturen von *>0 bis 100 C ausführt.

109819/Π003 SAD Ofn_Gi_NAk