DE1568166B

DE1568166B - Process for the extraction of Helvetico sid from Erysimum species

Info

Publication number: DE1568166B
Authority: DE
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH

Description

Das bekannte Herzglykosid Helveticosid (Strophantidin-digitoxosid) findet sich in Erysimum-Arten in Form des Erysimosids, das einen zusätzlichen, endständigen Glucose-Rest enthält. Einen besonders hohen Gehalt an Erysimosid besitzt Erysimum crepidifolium Rchb. Diese Pflanze muß sich daher bevorzugt zur Gewinnung des therapeutisch wertvollen Helveticosids eignen, wenn man einen Weg findet, aus Erysimosid durch enzymatische Abspaltung der Glucose die maximale Menge an Helveticosid frei zu machen und quantitativ zu isolieren.. ·',The well-known cardiac glycoside helveticoside (strophantidine-digitoxoside) is found in Erysimum species in the form of the erysimoside, which has an additional, terminal glucose residue contains. Erysimum crepidifolium has a particularly high content of erysimoside Rchb. This plant must therefore be preferred for obtaining the therapeutically valuable Helveticosids are suitable, if a way can be found, from erysimoside by enzymatic cleavage to release the maximum amount of helveticoside from glucose and to isolate it quantitatively .. · ',

Üblicherweise erfolgt die Abspaltung von^: Glucose L aus genuinen Cardenolid-glykosiden durch Autolyse, indem man zelleigene Glucosidasen der -betreffenden Pflanzen direkt im gemahlenen und angefeuchteten Blatt einwirken läßt; anschließend wird das Glykosid, oft im Gemisch mit mehr oder weniger zahlreichen verwandten Glykosiden, nach einem gangbaren Verfahren isoliert. '' ' 'The following is usually split off ^: Glucose L from genuine cardenolide glycosides by autolysis, by allowing the cell's own glucosidases from the plants in question to act directly in the ground and moistened leaf; then the glycoside, often in a mixture with more or less numerous related glycosides, is isolated by a practicable method. ''''

Nach der deutschen Auslegeschrift 1 221 764 ist dieser einfachste Weg bei den Blättern von Erysimum-Arten insbesondere wegen der stark störenden Anwesenheit von Glucosinolaten in wirtschaftlicher Form nicht möglich. Aus diesem Grunde werden gemäß dem Verfahren der genannten Auslegeschrift die frischen oder getrockneten Blätter unter Ausschluß der zelleigenen Enzymaktivität mit Alkohol extrahiert und der Extrakt nach Passieren eines Anionenaustauschers nachträglich mit dem Enzympräparat eines höheren Pilzes 5 bis 10 Tage lang fermentiert; dann erst kann der Extrakt auf Helveticosid aufgearbeitet "werden. * According to the German Auslegeschrift 1 221 764 this is the easiest way to go with the leaves of Erysimum species especially because of the highly disturbing presence of glucosinolates in economic Form not possible. For this reason, according to the method of the above-mentioned patent application the fresh or dried leaves with the exclusion of the cell's own enzyme activity with alcohol extracted and the extract after passing through an anion exchanger with the enzyme preparation of a higher mushroom fermented for 5 to 10 days; only then can the extract be applied to helveticoside processed ". *

Es wurde-nun-überraschenderweise gefunden,- daß , man doch die Einwirkung der zelleigen'en Erysimosidase zur Abspaltung der Glucose ausnutzen kann, wenn man die getrocknete und gemahlene Gesamtpflanze (Blätter, Stengel und Wurzeln) als Ausgangsmaterial einsetzt. Man gelangt hierdurch zu einem sehr einfachen, Zeit, Arbeitsaufwand und Kosten sparenden Verfahren, welches im Vergleich zu dem Verfahren gemäß deutscher Auslegeschrift 1 221 764 eine um 50 bis 60% bessere Ausbeute an-Helveticosid ^: " liefert. Außer dem gesamten Helveticosid der Blätter gewinnt man zusätzlich noch das in den Wurzeln in nicht zu vernachlässigender Menge enthaltene Glykosid (die getrocknete Wurzel enthält etwa 0,3 % Helveticosid).It has now been found, surprisingly, that the action of the cell's own erysimosidase can be used to split off glucose if the whole dried and ground plant (leaves, stems and roots) is used as the starting material. This leads to a very simple, time, labor and cost-saving method which, compared to the method according to German Auslegeschrift 1 221 764, ^{delivers a 50 to 60% better yield of helveticoside:} "Gains apart from all of the helveticoside in the leaves the glycoside contained in the roots in a non-negligible amount (the dried root contains about 0.3% helveticoside).

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Helveticosid aus Erysimum-Arten, ist: dadurch .,·.-gekennzeichnet, daß man, die- aus. ,Wurzeln, Stengeln '59 und Blättern bestehende, getrocknete und gemahlene""' Gesamtpflanze in mit Wasser angefeuchtetem ZustandThe method according to the invention for obtaining helveticoside from Erysimum species is: that one, the- from. 'Roots, Stems '59 and leaves, dried and ground "" ' Whole plant in the state moistened with water

unter Einwirkung der -zelleigenen Erysimosidase fer under the action of the cell's own erysimosidase fer

mentiert und anschließend .das Glykosid nach an.. sich bekannten' Exträktrons- und Auf arbeitungsvef-'55 fahren isoliert.mentated and then .the glycoside according to .. known 'Extraktrons- and Aufarbeitungsvef-'55 drive isolated.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das gepulverte Drogenmaterial mit etwa der doppelten Menge Wasser durchmischt und etwa 24 Stunden stehengelassen. Anschließend kann man das Helveticosid nach den zur Gewinnung von Herzglykosiden üblichen Extraktions- und Aufarbeitungsmethoden isolieren. Als Extraktionsverfahren kommen z. B. die folgenden in Frage:To carry out the method according to the invention, the powdered drug material is approximately mixed with twice the amount of water and left to stand for about 24 hours. Then you can isolate the helveticoside according to the extraction and work-up methods customary for obtaining cardiac glycosides. Come as an extraction method z. B. the following in question:

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a) Extraktion der fermentierten Droge mit Wasser, gegebenenfalls unter Zusatz von oberflächenaktiven Stoffen (z. B. Natriumlaurylsulfat), mit . niederen . Alkoholen bzw. wäßrigen niederen Alkoholen oder anderen mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln (Dioxan, Tetrahydrofuran); a) Extraction of the fermented drug with water, optionally with the addition of surface-active substances Substances (e.g. sodium lauryl sulfate), with. lower. Alcohols or aqueous lower ones Alcohols or other water-miscible organic solvents (dioxane, tetrahydrofuran);

b) Extraktion mit Chlorkohlenwasserstoffen (Methylenchlorid, Chloroform, Äthylenchlorid usw.) bzw. mit Gemischen von niederen Alkoholen und Chlorkohlenwasserstoffen oder anderen mit Wasser nicht oder nur teilweise mischbaren organischen Lösungsmitteln (z. B. Methyläthyl- ■ .:'.■; keton).■?_ T.." ;.\ . 'b) Extraction with chlorinated hydrocarbons (methylene chloride, chloroform, ethylene chloride etc.) or with mixtures of lower alcohols and chlorinated hydrocarbons or other organic solvents which are immiscible or only partially miscible with water (e.g. methylethyl- ■ .: '. ■; ketone) . ■? _ T .. ";. \ . '

Zur Aufarbeitung werden die gemäß a) erhaltenen Extrakte mit Chlorkohlenwasserstoffen oder Gemischen aus Chlorkohlenwasserstoffen und niederen Alkoholen ausgezogen. Diese Auszüge oder die gemäß b) erhaltenen Extrakte konzentriert man zunächst, nimmt sie mit Wasser oder wäßrigen niederen Alkoholen auf und trennt die Ballaststoffe bzw. unerwünschten Begleitglykoside nach einem der folgenden Verfahren ab (die man gewünschtenfalls auch in geeigneter Weise miteinander kombinieren kann):" .„*■"··'■...-; ->.:;.... .■ For work-up, the extracts obtained according to a) are extracted with chlorinated hydrocarbons or mixtures of chlorinated hydrocarbons and lower alcohols. These extracts or the extracts obtained according to b) are first concentrated, they are taken up with water or aqueous lower alcohols and the dietary fiber or undesired accompanying glycosides are separated off by one of the following processes (which can also be combined with one another in a suitable manner if desired ): " . "* ■" ·· '■ ...-; ->.:; ..... ■

1. Ausschütteln mit Petroläther oder aromatischen Kohlenwasserstoffen (Benzol, Toluol usw.) bzw. Tetrachlorkohlenstoff .oder niederen aliphatischen Äthern; ' * " ' '·1. Shake out with petroleum ether or aromatic hydrocarbons (benzene, toluene etc.) or Carbon tetrachloride or lower aliphatic ethers; '* "' '·

2. Filtration über Adsorptionsmittel (Kieselgur, Al₂O₃); :,;. ·:2. Filtration through adsorbents (kieselguhr, Al ₂ O ₃ ); :,;. ·:

3. Adsorptions- oder Verteilungschromatographie an Säulen; " * ^j;* '3. adsorption or partition chromatography on columns; "* ^j; * '

4. multiplikative Verteilung;· - "4. multiplicative distribution; · - "

5. fraktionierte Kristallisation aus geeigneten Lösungsmitteln (z. B-. wäßrigen Alkoholen).5. fractional crystallization from suitable solvents (e.g. aqueous alcohols).

In diesem Zusammenhang sei noch erwähnt, daß die in der deutschen Auslegeschrift 1221764 als besonders nachteilig geschilderte Bleiacetat-Vorreinigung-bei dem erfindungsgemäßen Verfahren' nicht erforderlich ist.In this context it should also be mentioned that the in the German Auslegeschrift 1221764 as particularly disadvantageous described lead acetate pre-cleaning in the method according to the invention 'is not required.

Das erfindungsgemäße -Verfahren ist in den folgenden Beispielen näher beschrieben.The inventive method is in the following Examples described in more detail.

For example

20 kg getrocknete, feingemahlene ganze Pflanzen von Erysimum crepidifolium werden mit 40 1 Wasser vermischt und 24 bis 48 Stunden bei 35 bis 40⁰C zur Fermentation stehengelassen. Danach wird vier- ; mal-mit je 65.1 .Wasser..je.-I¹J₉ Stunden ausgerührt, worauf man den wäßrigen Extrakt fünfmal mit 501 Chloroform—Äthanol (2:1) je 1 Stunde ausrührt. Die Chloroform-Äthanol-Auszüge, werden im Vakuum auf etwa 11 eingeengt und nach-Zugabe von 300,ml Wasser dreimal mit .30QmI Tetrachlorkohlenstoff au's^escriüttelt.'-Dann-versetzt man die' wäßrigalkoholische Phase mit 21 Wasser, saugt die ausgefallene dunkle Schmiere über Kieselgur ab und verdünnt das Filtrat bis zur beginnenden Trübung weiter mit Wasser. Man erhält 124 g Helveticosid-Kristallisat (Fp. 172 bis 174°C, [<x]? = 32 ± 0,5⁰C)₀ 20 kg of dried, finely ground whole plants of Erysimum crepidifolium are mixed with 40 1 of water and left to ferment ^{at 35 to 40 ° C. for 24 to 48 hours.} After that, four-; times-with 65.1. water each. -I ¹ J _{stirred for 9} hours, whereupon the aqueous extract is stirred five times with 50 liters of chloroform-ethanol (2: 1) for 1 hour each time. The chloroform-ethanol extracts are concentrated in vacuo to about 11 and, after adding 300 ml of water, they are shaken out three times with .30 sq Smear over kieselguhr and dilute the filtrate further with water until it starts to become cloudy. This gives 124 g Helveticosid-crystals (Fp. 172 to 174 ° C, [<x]? = 32 ± 0.5 ⁰ C) ₀

Example 2

20 kg getrocknete, feingemahlene ganze Pflanzen von Erysimum crepidifolium werden mit 40 1 Wasser vermischt und 24 bis 48 Stunden bei 35 bis 40° C zur Fermentation stehengelassen. Danach wird20 kg of dried, finely ground whole plants of Erysimum crepidifolium are mixed with 40 l of water mixed and allowed to ferment for 24 to 48 hours at 35 to 40 ° C. After that, will

einmal mit 601 Chloroform—Äthanol (2:1) 2 Stunden und zweimal mit 401 Chloroform—Äthanol (2:1) je 1 Stunde ausgerührt. Man konzentriert die abgetrennten Chloroform-Äthanol-Extrakte im Vakuum auf etwa 11, löst das Konzentrat in 241 Methanol und 8 1 Wasser und rührt dreimal mit je 6,41 Tetrachlorkohlenstoff aus. Die Methanol-Wasser-Phase wird nach Zugabe von 101 Wasser fünfmal mit 9 1 Chloroform—Äthanol (2:1) ausgerührt, im Vakuum eingeengt, der Extrakt in 3,5 1 Chloroform (+ 5 % Methanol) gelöst über 900 g Bleicherde (»Floridin«) filtriert und im Vakuum eingeengt. Der auf diese Weise vorgereinigte Extrakt wird in 3,5 1 Essigester gelöst und mit 9,7 1 Benzol und 13 1 Wasser versetzt. Nach Trennung der Phasen wird die Benzol-Essigester-Phase noch zweimal mit 3,51 Wasser ausgeschüttelt. Die gesammelten wäßrigen Phasen werden fünfmal mit V₅ Volumen Chloroform—Äthanol (2:1) ausgeschüttelt und ergeben nach dem Eindampfen 210 g Trocken-Extrakt, der beim Umkristallisieren aus 630 ml Äthanol und 3,15 1 Wasser 122 g Helveticosid-Kristallisat liefert; Fp. 172 bis 174⁰C.once with 60 liters of chloroform-ethanol (2: 1) for 2 hours and twice with 40 liters of chloroform-ethanol (2: 1) for 1 hour each time. The separated chloroform-ethanol extracts are concentrated in vacuo to about 11, the concentrate is dissolved in 24 liters of methanol and 8 liters of water and stirred three times with 6.41 carbon tetrachloride each time. After adding 101% of water, the methanol-water phase is stirred five times with 9 l of chloroform-ethanol (2: 1) and concentrated in vacuo, the extract is dissolved in 3.5 l of chloroform (+ 5% methanol) over 900 g of fuller's earth ( "Floridin") filtered and concentrated in vacuo. The extract pre-purified in this way is dissolved in 3.5 l of ethyl acetate, and 9.7 l of benzene and 13 l of water are added. After the phases have separated, the benzene-ethyl acetate phase is extracted twice more with 3.5 liters of water. The collected aqueous phases are extracted five times with ₅ volumes of chloroform-ethanol (2: 1) and after evaporation give 210 g of dry extract which, when recrystallized from 630 ml of ethanol and 3.15 l of water, yields 122 g of helveticoside crystals; Mp. 172 to 174 ⁰ C.

Example3

20 kg Erysimum-crepidifolium-Droge werden wie im Beispiel 2 beschrieben fermentiert, extrahiert und vorgereinigt. Der vorgereinigte Extrakt wird einer Gegenstromverteilung mit dem Phasengemisch Benzol — Essigester — Methanol — Wasser (3:1:2:2) unterworfen. Die Methanol-Wasser-Phasen werden mit Chloroform—Äthanol (2:1) ausgeschüttelt, im Vakuum eingeengt und wie im Beispiel 1 beschrieben20 kg of Erysimum crepidifolium drug are fermented, extracted and as described in Example 2 pre-cleaned. The pre-purified extract is countercurrently distributed with the phase mixture Benzene - ethyl acetate - methanol - water (3: 1: 2: 2). The methanol-water phases are extracted with chloroform-ethanol (2: 1), im Concentrated in vacuo and as described in Example 1

ίο aus Äthanol—Wasser umkristallisiert. Man erhält g Helveticosid; Fp. 172 bis 174° C.ίο recrystallized from ethanol-water. You get g helveticoside; Mp. 172 to 174 ° C.

Claims

Claim:

Process for obtaining helveticoside from Erysimum species, characterized in that that one consists of roots, stems and leaves, dried and ground Whole plant moistened with water under the effect of the cell's own erysimosidase fermented and then the glycoside according to extraction and known per se Work-up process isolated.