DE1492042B - Verfahren zur Herstellung eines Pertussi-Antigens - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extra- allgemein bei Drücken im Bereich von etwa 1050

hieren von B.-pertussis-Antigen, das von jeglichem bis 3550 at erhalten werden. Auch andere Mittel zur wesentlichen Gehalt an Zellmaterial des B. pertussis Zerlegung oder Zerreißung von Zellen und Isolierung

frei ist. der Zellwände können Verwendung finden, wie

Der Keuchhusten ist als eine akute, stark über- 5 Schallschwingungen, mechanisches Mahlen usw., tragbare, infektiöse Erkrankung, die von B. pertussis aber die Erfahrung zeigt, daß mit der explosiven Dehervorgerufen wird und bei Kindern im Alter von kompression die höchsten Ausbeuten an sauberem unter 4 Jahren gefährlich ist. Eine Immunisierung Wandmaterial erhalten werden. Vor dem Einsatz gegen diese Erkrankung ist bisher durch Injektion wird die obengenannte Fraktioniervorrichtung vorabgetöteter Bazillen oder extrahierten Antigens be- ίο teilhafterweise sterilisiert, indem man ihr gesamtes wirkt worden. Das häufige Auftreten von Nebenreak- Leitungssystem 24 Stunden der Einwirkung von tionen, wie Fieber, Reizerscheinungen, Entzündungen Äthylenoxid aussetzt und dann mit sterilem Stick- und Nekrosen, sowie die seltenen, aber beunruhigen- stoffgas spült. Die Druckvorrichtung wird 1 Stunde den Berichte über Enzephalitis haben Forschungen sterilisiert, vorzugsweise durch Zusammenbringen nach einer besseren Vaccine notwendig gemacht. 15 aller ihrer Teile mit /J-Propiolacton (0,5%) und dann

Die vorliegende Erfindung macht ein B.-pertussis- Spülung mit sterilem, destilliertem Wasser. Zur Ver-

Antigen in wesentlich verbesserter Form verfügbar. bindung der Dekompressionskämmer mit einem

Mit dem Antigen läßt sich eine bleibende Immunität Stickstoff tank dient ein mehrphasiges, Bakterien

gegen Keuchhusten erreichen, ohne daß die uner- zurückhaltendes Filter oder anderes zweckentspre-

wünschten Nebeneffekte heute bekannter Vaccinen 20 chendes Filter.

auftreten. Sie stellt ein Antigen zur Verfügung, das Die Suspension der B.-pertussis-Zellen wird in die von Zellsubstanzen frei ist, die zum Teil toxisch sind Kompressionskammer der Fraktioniervorrichtung und die für die Nebenreaktionen verantwortlich sein eingeführt und in dieser einem Druck von 1050 bis können, die bei Verabreichung im Handel verfüg- 3550 at ausgesetzt, wodurch die Zellen in die Debarer Vaccinen beobachtet wurden. 25 kompressionskammer getrieben werden, in der sie

Es wurde gefunden, daß sich ein wertvolles An- explosiv bersten. Die Dekompressionskämmer wird

tigen für die Immunisierung gegen Keuchhusten mit vorgekühltem Stickstoffgas, das man durch das

durch eine Reihe von Arbeitsschritten erhalten läßt, mehrphasige Filter in die Kammer einleitet, auf

bei denen man Zellen des B. pertussis mechanisch 20 ⁰C oder darunter gehalten. Das von der Dekom-

zerlegt und das Antigen aus der Zellwand chemisch 30 pressionskammer abströmende, die Zellwände und

extrahiert. Es hat sich gezeigt, daß das Schutzantigen Protoplasma enthaltende Gut wird in einem in ein

ein Teil der Zellwand (manchmal auch als Zeil- Eisbad getauchten, sterilen Behälter gesammelt,

membran oder Zellhülle bezeichnet) ist; das Proto- Das abströmende, das geborstene Zellmaterial ent-

plasma der Zelle, das den Hauptanteil des Stickstoff- haltende Gut wird geschleudert und das über-

haltigen Materials enthält, besitzt nur eine geringe 35 stehende, flüssige Material verworfen; das verblei-

bis keine antigene Eigenschaft, die zur Immunisie- bende Zellwandmaterial kann mit kaltem Wasser

rung geeignet ist. Das Protoplasma enthält jedoch in gewaschen werden, um hochtoxische, lösliche Proto-

hoher Konzentration Protein, das bei Laboratoriums- plasmabestandteile zu beseitigen. Die gewaschenen

tieren toxisch ist und beim Vorliegen in Vaccinen zu oder ungewaschenen Zellwände werden in einem

unerwünschten Nebeneffekten führen kann. 40 Puffer auf eine Konzentration von etwa 100 bis

Die in dem Verfahren gemäß der Erfindung ein- 2000 Bazillen/ml (B/ml) suspendiert, wobei in der

gesetzten B.-pertussis-Zellen können auf jedem der Praxis im allgemeinen eine Konzentration von

bekannten, zweckentsprechenden Medien gezüchtet 200 B/ml bevorzugt wird. Das Antigen wird dann

werden, wie dem von Powell u.a. beschriebenen erfindungsgemäß extrahiert, indem man die ZeIl-

Holzkohle-Agar-Medium (Public Health Reports, 66, 45 wandsuspension mit einem Salz der Desoxycholsäure

S. 346 [1951]), den von Verwey u. a. beschriebenen, bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,1 bis 10⁰/o

flüssigen Medien (J. Bact., 58, S. 127) oder dem KuI- Desoxycholat versetzt; zur Erzielung einer maxi-

turmedium nach Cohen—Wheeler (Amer. J. Pub. malen Extraktion jedoch wird eine Endkonzentration

Health, 36, S. 371 [1946]). Nach dem Wachsen wer- von etwa 0,25 bis 1 % bevorzugt. Ein pH-Bereich

den die Zellen durch Schleudern geerntet. Man kann 50 von etwa 8 bis 10 hat sich als für die Extraktion sehr

dann die geernteten Zellen zertrümmern oder die zufriedenstellend erwiesen.

Zellpaste bis zum Bedarf gefrieren und bei — 30 ⁰C Das Zellwand-Desoxycholat-Gemisch wird konti-

aufbewahren. Wenn gewünscht, kann man die ge- nuierlich 18 bis 48 Stunden sachte bewegt, während

ernteten Zellen lyophilisieren und dann bis zum Be- _man die Temperatur zwischen etwa 2 und 5 ⁰C hält,

darf aufbewahren oder die Zellen mit Thiomersal 55 Das Material wird geschleudert und das überstehende

oder nach anderen Methoden, durch die das Antigen Gut gegen einen 0,01molaren Phosphatpuffer bei

das B. pertussis nicht zerstört wird, abtöten. Die einem pH im Bereich von 7 bis 7,7 dialysiert, um

Zellkonzentration soll für die Zwecke der Erfindung das Desoxycholat zu beseitigen. Das nicht dialysier-

vorzugsweise im Bereich von 100 bis 1000 B/ml bare Material, welches das Antigen enthält, wird auf

(Bazillen/ml) liegen. 60 pH 7,0 eingestellt und auf eine den vorgeschriebenen

Die Zellen werden in kaltem, destilliertem Wasser Normen, wie den Normen der »National Institutes of (2 bis 5° C) resuspendiert und in einer Fraktionier- Health«, entsprechende Konzentration verdünnt. Die vorrichtung der Bauart Ribi Cell Fractionator (Ivan Lösung des Antigens kann mit einem Konservie-Sorvall, Inc., Norwald, Conn., V. St. A.) bei 2110 at rungsmittel, wie Thiomerral, Benzethoniumchlorid, und einer Temperatur von 20 ⁰C oder darunter einer 65 Benzylalkohol, y-Picoliniumchlorid oder anderen beexplosiven Dekompression unterworfen. Bei einem kannten, zweckentsprechenden Konservierungsmit-Druck von 2110 at erhält man gute Ergebnisse, aber teln, konserviert und auf jede gewünschte Konzenes hat sich gezeigt, daß zufriedenstellende Ergebnisse tration verdünnt werden.

Das gemäß der Erfindung erhaltene Antigen kann zur Herstellung einer wäßrigen Vaccine verwendet oder zunächst an Hilfsstoffen, wie Aluminiumhydroxyd oder -phosphat, adsorbiert, oder mit Aluminiumkaliumsulfat gefällt und dann zur Vaccine zubereitet werden. Das Antigen kann, da es mit anderen Antigenen und bzw. oder Toxoiden verträglich ist, mit diesen in herkömmlicher Weise unter Bildung einer polyvalenten Vaccine in Form einer Einzeldosis vereinigt werden.

Die vorliegende Erfindung bietet eine ganze Reihe ausgeprägter Vorteile. Das Produkt ist frei von allen Protoplasmabestandteilen, von denen einer, das wärmelabile Toxin, dafür bekannt ist, bei Laboratoriumstieren extrem toxisch zu sein, und der für diese oder jene Nebenreaktion beim Menschen verantwortlich sein kann. Das Produkt ist frei von Nährmedium, Zellresten und chemischen Fremdstoffen. Es ist mit anderen Antigenstoffen, die bekanntlich mit der intakten Pertussiszelle kombiniert werden, verträglich. Das Verfahren ist einfach und leicht durchführbar und unter Erzielung hoher Ausbeuten an aktivem Material reproduzierbar.

Das Verfahren ist in dem folgenden Beispiel im einzelnen erläutert. Die grundsätzliche Arbeitsweise besteht darin, das Schutzantigen mit Desoxycholat aus B.-pertussis-Zellwänden zu isolieren, die von Protoplasma wie auch anderen Fremdstoffen abgetrennt worden sind.

Beispiel

Die Zellen einer auf einem Cohen-Wheeler-Medium gewachsenen 48-Stunden-Kultur von B. pertussis werden geerntet, indem man das Medium mit konzentrierter Salzsäure auf pH 7,0 einstellt und auf einer Sharples-Zentrifuge schleudert. Die erhaltene Zellpaste wird in destilliertem Wasser suspendiert, durch ein 200-Maschen-Nylonsieb passiert, um Grobteilchen zu entfernen, und das Filtrat auf eine Konzentration von 500 B/ml eingestellt.

Das Zellkonzentrat (1600 ml) wird in eine vorsterilisierte Fraktioniervorrichtung der Bauart Ribi Cell Fractionator eingeführt und einem Druck von 2110 at unterworfen. Die Zellen werden unter Druck in die Dekompressionskammer ausgepreßt, die mit gekühltem Stickstoff gas auf 20 ⁰C oder darunter gehalten wird, und unterliegen in dieser einem explosiven Bersten. Das Zellmaterial läuft von der Dekompressionskammer in einen in ein Eisbad getauchten, sterilen Behälter ab, wobei 1600 ml erhalten werden.

Die Suspension wird 3 Stunden bei 16 000 Umdr./ Min. in einer Zentrifuge der Bauart Spinco 18000 geschleudert, wobei aber auch andere Schleudervorrichtungen, wie z. B. die Sharples-Zentrifuge, verwendbar sind. Man entfernt das überstehende Gut aus der Zentrifuge durch Dekantieren und kann, wenn gewünscht, die Zentrifuge ein oder mehrmals wieder füllen und umlaufen lassen, ohne den Rückstand zu entfernen. Das überstehende Gut, das entfernt und verworfen wird, enthält die hochtoxische Protoplasmafraktion des Zellkonzentrates.

Der Rückstand oder das Sediment in dem Rotor wird vorzugsweise entfernt, indem man an dem Rotor Stahlkugeln anbringt und ihn durch Aufbringen auf einen Rollmechanismus sacht bewegt. Die Loslösung des Rückstandes von dem Rotor kann aber auch nach anderen, an sich bekannten Verfahren erfolgen.

Man wäscht den Rückstand aus dem Rotor mit kaltem, destilliertem Wasser (2 bis 5 ⁰C, ungefähr 800 ml) aus, stellt das pH durch Zusatz 10⁰/oiger Natronlauge (ungefähr 1,0 ml) auf 8,5 ein und bringt das Endvolumen der Zellwandsuspension mit kaltem, destilliertem Wasser (2 bis 5 ⁰C) auf 1600 ml. Weiter stellt man eine sterile, 2°/oige Lösung des Natriumdesoxycholates bei pH 8,5 (Einstellung mit In Natronlauge von der Hitzesterilisierung) her und vereinigt 1600 ml dieser Lösung der Wandmaterialsuspension. Durch Zusatz von kaltem, sterilem, destilliertem Wasser (800 ml) erhält man 4000 ml Wandmaterialsuspension mit einer Desoxycholatkonzentration von 1,0%, die in 1 ml das Wandmaterial von 200 B.-Pertussi enthält. Die Suspension wird in einer mechanischen Schüttelvorrichtung 18 bis 24 Stunden bei 2 bis 5 ⁰C sachte bewegt und dann in dem Rotor einer Fraktioniervorrichtung der Bauart Spinco 18000 (oder einer anderen Zentrifuge) 1 Stunde bei 16000 Umdr./Min. (30100 X Schwerkraft Durchschnitt) geschleudert. Das überstehende Gut wird durch Dekantieren gewonnen; der Rotor kann wiederholt eingesetzt werden, um weitere Anteile an Zellwandsuspension zu behandeln, ohne daß man das Sediment zu entfernen braucht.

Die erhaltenen Anteile an überstehendem, das. Schutzantigen und Natriumdesoxycholat enthaltendem Gut werden vereinigt und gegen 0,01-molaren Phosphatpuffer, pH 7,4 bis 7,7, dialysiert, bis in dem Dialysat bei Zusatz von konzentrierter Salzsäure kein Desoxycholat mehr festzustellen ist. Gewöhnlich wird der Endpunkt der Desoxycholatbestimmung bei dem vierten Wechsel des Puffers erhalten, wobei man bei jedem Wechsel etwa 135 1 Puffer 48 bis 72 Stunden einwirken läßt. Der nichtdialysierbare Extrakt, der bei Verdünnung auf einen 32 B/ml entsprechenden Wert nunmehr ein Volumen von 4500 ml hat, enthält 14,7 Schutzeinheiten/ml (das N.I.H. Nr. 6-Kontrollmaterial zum Vergleich 8 Schutzeinheiten/ml) und kann zur Herstellung von wäßrigen, adjuvanten oder multivalenten Vaccinen verwendet werden.

Zur Bestimmung des Wirkungsvermögens des Zellextraktes und des N.I.H.-Kontrollmaterials werden getrennten Gruppen von Mäusen verschieden verdünnte Lösungen des Extraktes und des Kontronmaterials verabreicht und dann die Tiere intrakranial mit 0,03 ml einer Verdünnung von bekanntem, virulentem B. pertussis mit einem Gehalt von 10⁵ Organismen/ml infiziert. Ergebnisse:

	Verdünnung überlebende/geprüfte Tiere Aj B I C	0,01	0,002	ED50 ♦)	Grenzwerte der Zuverlässigkeit °/o	Schutzeinheiten/ml
Extrakt gemäß Beispiel N.I.H. Nr. 6	0,05	8/32 0,02	1/32 0,0024	0,0165 0,0304	85 bis 118 85 bis 118	14,7 8
29/32 0,06	4/32	0/32
25/31

*) Wirksame Dosis zum Schutz von 50 °/o der getesteten Tiere.

Der Antigenextrakt gemäß dem Beispiel erweist sich entsprechend den N.I.H.-Normen als nichttoxisch; diese Normen fordern, daß bei intraperitonaler Injektion der Hälfte der Einzeldosis für den Menschen bei Mäusen in 3 Tagen kein Gewichtsverlust, in 7 Tagen eine Nettozunahme von 3 g und bei nicht mehr als 5% der untersuchten Tiere ein Todesfall eintritt. Bei intraperitonaler Injektion von 0,25 ml des Schutzantigen-Extraktes gemäß Beispiel bei zehn Mäusen wurde im Durchschnitt am Ende von 3 Tagen eine Gewichtszunahme von 2,1 und am Ende von 7 Tagen eine durchschnittliche Zunahme von 6,5 g beobachtet, ohne daß am Ende der Prüfzeit ein Todesfall vorgelegen hätte.

Der Extrakt gemäß Beispiel genügte auch dem Tier-Sicherheitstest; bei Injizierung von 20-g-Mäusen mit jeweils der halben Einzeldosis für den Menschen und dreimaliger Injizierung von zwei 350-g-Meerschweinchen mit jeweils einer Einzeldosis für den Menschen ergaben sich keine Todesfälle und keine Symptome.

Herkömmliche Sterilitätsprüfungen haben gezeigt, daß der Extrakt von Schimmelpilzen und Bakterien frei ist.

Die elektrophoretische Analyse und die Ouchterlony-Analyse haben ergeben, daß der Extrakt gemäß Beispiel von dem Hauptanteil der Protoplasmastoffe und Wandantigenstoffe mit Ausnahme des Antigens frei war. Die Endvaccine enthielt ein Drittel oder weniger des Gesamtstickstoffs, der bei herkömmlichen Vaccinen ermittelt worden ist.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zum Herstellen eines Pertussis-Antigens, dadurch gekennzeichnet, daß man das vom Protoplasma befreite Zellwandmaterial in Wasser suspendiert, so daß die Suspension das Zellwandmaterial in einer Menge von 100 bis 200 Bazillen/ml enthält, diese Suspension dann durch Zugabe eines Alkalimetallsalzes der Desoxycholsäure bis zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 10% und durch Zugabe von Alkali auf einen pH-Wert von 8 bis 10 einstellt, und bei 2 bis 5 ⁰C bis zu 48 Stunden beläßt, von den Zellwänden abtrennt und das Desoxycholat aus der Lösung des Antigens entfernt.