DE2360118B2

DE2360118B2 - Impfstoff gegen Ferkel-Colibacillose

Info

Publication number: DE2360118B2
Application number: DE2360118A
Authority: DE
Inventors: Lucia Bruessel Dobrescu; Constant Huldenberg Huygelen
Original assignee: Individual
Current assignee: Smithkline Beckman - Animal Health Products Sa
Priority date: 1972-12-04
Filing date: 1973-12-03
Publication date: 1980-04-30
Also published as: ES421094A1; IE38555L; DE2360118C3; MY7900152A; JPS4986530A; NL7316050A; CH590928A5; HK679A; NL177079C; BE808122A; AU6236473A; NL177079B; ZA738364B; DD109029A5; JPS5713527B2; DK141955B; GB1401588A; CA1018889A; DE2360118A1; IE38555B1

Description

Die neonatale Colibacillose des Schweins ist eine wichtige Todesursache bei Ferkeln. Es sind bereits zahlreiche Versuche unternommen worden, um diese Krankheit durch aktives Immunisieren des Muttertieres gegen Escherichia coli entweder durch Tot- oder Lebendimpfstoffe oder durch Verabreichen von Escherichia coli-Antiserum an die Schweine zu bekämpfen.

Die aktive Immunisierung der Mutterschweine ist durch parenterale Verabreichung von Escherichia coli-Impfstoffen (vgl. z. B. M. R. Wilson und J. Svendsen, Amer. J. Vet. Res. Band 32 [1971], Seiten 891 bis 898) vorgenommen worden. Da jedoch der bzw. die zur Immunisierung verwendeten Escherichia ü-Stämme nur spezifische Antikörper hervorrufen, während mit einem bestimmten Ausbruch der Krankheit mehrere und verschiedene Stamme verbunden sein können, haben diese Versuche zur Vorbeugung auf Basis einer antibakteriellen Immunität widersprechende und im allgemeinen unbefriedigende Resultate ergeben. Selbst wenn in einigen Fällen ein guter Schutz erhalten wurde, war er auf die in dem Impfstoff enthaltenen Serotypen von Escherichia coli beschränkt.

Die Verabreichung von Antiserum (vgl. z. B. O. P. Miniats, Can. Vet. J., Band 11 [1970], Seiten 52 bis 56) kann keine praktikable Vorbeugung gegen Ferkel-Colibacillose gewährleisten. Der durch die Verabreichung von Antiserum erreichte Schutz ist tatsächlich von kurzer Dauer und erfordert eine kontinuierliche Verabreichung an die Ferkel.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß bei Verabreichung von hitzelabilem (LT) Escherichia coli-Enterotoxin mit einem Adjuvans an trächtige Mutterschweine 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln anstelle der Verabreichung ganzer Zellen von Escherichia coli die geimpften Mutterschweine nicht nur Antikörper in ihrem Kolostrum und in ihrer Milch entwickeln, sondern dadurch auch die Ferkel gegen die Wirkung der Enterotoxine geschützt werden. Der Schutz erstreckt sich gegen die Wirkung von Enterotoxinen, die durch Escherichia coli-Serotypen gebildet werden, welche sowohl homolog als auch heterolog zu dem Escherichia coli-Stamm sein können, aus dem das hitüelabile (LT) Enterotoxin isoliert wurde. Mit anderen Worten, der Schutz besteht nicht nur gegenüber dem Enterotoxin aus dem gleichen enteropathogenen E. coli-Stamm, aus dem das hitzelabile Enterotoxin gewonnen wurde, sondern auch gegenüber jedem anderem Enterotoxin von enteropathogenen E. coli-Stämmen. Die Verabreichung des hitzelabilen (LT) Escherichia coli-Enterotoxins an das Muttertier schützt die Ferkel nicht nur gegen die durch das hitzelabile (LT) Escherichia coli-Enterotoxin verursachte Colibacillose, sondern auch gegen die durch das hitzestabile (ST) Enterotoxin verursachte Colibacillose.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen Impfstoff gegen Ferkel-Colibacillose zur Verfügung zu stellen, mit dem diese Krankheit zuverlässig bekämpft werden kann. Diese Aufgabe wird durch die

ίο Erfindung gelöst.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen bezeichnet

Das hitzelabile (LT) Escherichia coli-Enterotoxin kann aus jedem enteropathogenen Escherichia coli-Serotyp isoliert werden, der die Ferkel-Colibacillose hervorrufen kann und notwendigerweise das hitzelabile (LT) Escherichia coli-Enterotoxin enthält Ein bevorzugtes Beispiel eines solchen enteropathogenen Escherichia coli-Serotyps ist der bei der American Type Culture Collection, RockvÜle, Maryland, V5t.A. unter der Nummer ATCC 21 972 hinterlegte Escherichia coli-Stamm.

Die Isolierung des hitzelabilen (LT) Escherichia coli-Enterotoxins ist bekannt. Sie ist von GYLES und BARNUM (J. Infect. Dis„ Band 120[1969], Seiten 419 bis 426) beschrieben worden; Variationen dieses Verfahrens sind von H. W. SMITH und C. L. GYLES (J. Med. MicrobioL, Band 3 [1970], Seiten 387 bis 401), H.W. SMITH und S. HALLS (J. Path. Bact, Band 93 [1967], Seiten 531 bis 543) und M. R. WILSON, C. GYLES und J. SVENDSEN (Cand. J. Comp. Med. Band 35 [1971], Seiten 294 bis 297) beschrieben worden. Sämtliche dieser Verfahren und sämtliche andere, bekannte äquivalente Verfahren können zur Herstellung des erfindungsgemäß verwendeten hitzelabilen (LT) Escherichia coli-Enterotoxinpräparats benutzt werden.

Für die vorliegende Erfindung ist es nicht erforderlich, das hitzelabile (LT) Escherichia coli-Enterotoxin rein herzustellen. Eine solche Reinigung könnte gegebenenfalls z. B. durch Elektrophorese, Dichtegradienten-Ultrazentrifugation oder Adsorption, Elution an hydrophilen vernetzten Dextranen, wie Sephadex®, vorgenommen werden. Für die vorliegende Erfindung ist es im wesentlichen ausreichend, daß das Enterotoxin

j 5 freigesetzt und von den Escherichia coli-Zellen abgetrennt wird und praktisch frei von Lipopolysacchariden ist.

Als Adjuvans, das die Aufgabe hat, eine starke Immunreaktion zu gewährleisten, kann erfindungsge-

Ί0 maß jedes Produkt oder Gemisch verwendet werden, von dem man weiß, daß es bei Impfstoffen als Adjuvans wirkt. Spezielle Beispiele adäquater Adjuvantien sind gelförmige Aluminiumverbindungen, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Aluminiumhydroxid-

Gel, und Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie das Adjuvans 65 (eine Wasser-in-öl-Emulsion von Antigen in Erdnußöl, das durch Mannitmonooleat emulgiert und durch Aluminiummonostearat stabilisiert ist) und komplettes Freund's Adjuvans (eine Wasser-in-öl-Emulsion von

bo Paraffinöl, das mit Mannitmonooleat emulgiert ist und abgetötetes Mycobacterium tuberculosis enthält).

Zur Bekämpfung der Ferkel-Colibacillose wird eine wirksame Menge des hitzelabilen (LT) Escherichia coli-Enterotoxinpräparats mit dem Adjuvans an trächti-

hi ge Mutterschweine intramuskulär oder subkutan verabreicht. Die Dosiereinheit beträgt mindestens 5 mg und vorzugsweise H) bis 150 mg gefriergetrockneten Extrakt.

Beispiel 1
Züchtungsmedium (fest)

130 g BACTO-TR YPTOSE»-Brühe und 150 g BAC-TO-AGAR werden mit 10 Liter Wasser versetzt Das Gemisch wird unter Rühren 60 Minuten auf 121°C erhitzt 20 g BACTO-Dextrose werden in 20 ml destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wird durch ein Millipore-Sterilisierfilter von 0,45 Mikron filtriert Die beiden Präparationen werden vereinigt und in aliquoten Teilen von 110 ml in SOO-cm^Roax-Kolben verteilt

Herstellung der Anzuchtkultur

Der Stamm Escherichia coli ATCC 21 972 wird mit steriler physiologischer Kochsalzlösung rehydraiisiert und 18 Stunden bei 37° C in Petri-Schalen inkubiert, die jeweils 20 ml TRYPTOSE-AGAR-Festmedium enthalten, das durch Vennischen von 26 g TRYPTOSE-Brühe* und 30 g AGAR DI FCO·, Auffüllen mit Wasser bis zu einem Volumen von 1 Liter und 45minütiges Erhitzen des Gemisches auf 115° C hergestellt wird.

Sodann wird ein flüssiges Kulturmedium (als PP3 bezeichnet) wie nachstehend beschrieben hergestellt: 30 g Proteose-Pepton Nr. 3.

4 g Hefeextrakt und 5 g Glucose werden in 1 Liter Wasser bei 6O⁰C gelöst Nach dem Abkühlen wird die Lösung mit 5 g NaCl, 5,05 g Na₂HPO₄ und 1,2 g KH₂PO₄ versetzt Das Medium, dessen pH-Wert 6,9 bis 7,0 beträgt, wird durch ein Seitz-EKS-Filter filtriert und in 100-ml-Kulturkolben verteilt

Diese Kulturkolben werden mit den auf den Petri-Schalen erhaltenen glatten Kolonien beimpft, wobei eine Kolonie auf 20 ml flüssiges PPj-Medium verwendet wird. Die beimpften Kuiturkolben werden unter Schütteln auf einer Schütteleinrichtung (22 bis 24 Schüttelbewegungen pro Minute) 6 Stunden bei 37° C inkubiert.

Züchtung von Escherichia coli

Jeder der das Züchtungsmedium enthaltenden 500-cm²-Roux-Kolben wird mit einem aliquoten Teil von 4 ml der in dem flüssigen PP3-Medium erhaltenen Escherichia coli-Kultur, d. h. mit etwa 4 χ ΙΟ⁹ Bakterien, beimpft Die Kolben werden unter Schütteln auf Schütteleinrichtungen mit 22 bis 24 Schüttelbewegungen pro Minute einen Tag bei 37°C inkubiert. Jede Zellkultur wird in 25 ml destilliertem Wasser geerntet, und die Ernten aus 15-Roux-Kolben (eine Serie) werden in 1-Liter-Kolben vereinigt Aus jeder Serie wird eine Probe von 1 ml zur Reinheitsprüfung entnommen.

Hierzu werden 0,5 ml auf TRYPTOSE-AGAR-Brühe® in Petri-Schalen eingesät und 7 Tage bei 34⁰C inkubiert Die restlichen 04 ml werden in Petri-Schalen eingesät, die 20 ml Sabouraud-Dextrose-Agar enthalten, der durch Auflösen von 65 g Sabouraud-Dextrose-Agar DfFCO in 1 Liter heißem destilliertem Wasser und anschließendem Sterilisieren hergestellt wird. Die Kultur wird 7 Tage bei 22° C inkubiert

Die Ernten werden mit einer sterilen, wäßrigen lprozentigen Neomycinsulfat-Lösung (1,2 ml Neomycinsulfat-Lösung pro 100 ml Ernte) versetzt. Die Zellen werden durch 30minütiges Beschallen des Mediums in einem Branson-Europa-Beschallungsgerät Modell J 22 aufgebrochen, wobei das Medium in einem schmelzenden Eisbad gehalten wird.

Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die Suspension zum Abtrennen der Zelltrümmer 2 Stunden bei 5°C und 2550 UpM zentrifugiert Der Überstand wird zunächst durch ein Klärfilter und dann durch ein Millipore-Sterilisierfilter filtriert

Das Filtrat wird mit zuvor durch Äthylenoxid

s sterilisiertem Ammoniumsulfat bis zur 50prozentigen Sättigung (380 g Ammoniumsulfat pro Liter Fiitrat) versetzt und das Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Der erhaltene Niederschlag wird 2 Stunden bei 5° C und 2550 UpM

IQ zentrifugiert Das Dediment wird in einen hauptsächlich aus regenerierter Cellulose bestehenden Beutel gegossen und gegen fließendes Wasser dialysiert, bis die mit Nesslers Reagens bestimmte Konzentration des Ammoniumsulfats auf 0,1 bis 0,01 Prozent gesunken ist

is Die Sterilisation des Enterotoxinpräparats erfolgt durch Filtrieren durch ein Millipore-Sterilisierfilter von 0,45 Mikron und Gefi iertrocknen.

Herstellung des Impfstoffes

Ein aliquoter Teil von 1 g des in Beispiel 1 erhaltenen gefriergetrockneten Enterotoxinpräparats wird durch Zugabe von 20 ml steriler, Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,4) rehydratisiert Die sterile, Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung besteht aus
8 g NaCl,
2 g KCI,
11,5g Na₂HPO₄,
2 g KH₂PO₄,
U25gCaCI₂x2H₂O,

Ig MgCl₂x6H₂O
und 10 Liter destilliertem Wasser.

Das so erhaltene Präparat wird unter sterilen Bedingungen mit 20 ml sterilem komplettem Freund's Adjuvans, d. h. mit einer mit Mannitmonooleat emulgierten und abgetötetem Mycobacterium tuberculosis versetzten Wasser-in-öl-Emulsion von Paraffinöl, gründlich vermischt Der erhaltene Impfstoff wird in 4-ml-Ampullen verteilt, die entweder abgeschmolzen oder dicht verschlossen werden und eine (LT) Enterotoxirimenge entsprechend 100 mg gefriergetrocknetem Präparat pro Ampulle enthalten. Der Inhalt jeder Ampulle entspricht einer Impf-Dosiereinheit Der Impfstoff wird trächtigen Mutterschweinen 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln intramuskulär oder subkutan verabreicht.

Der Impfstoff kann auch in größere Ampullen verteilt werden, wobei ganzzahlige Vielfache der Dosiereinheit und somit die entsprechenden Vielfach-Dosen-Impfpräparate erhalten werden.

Beispiel 2

Das Verfahren wird bis einschließlich der 6stündigen Inkubation von Escherichia coli ATC 21 972 bei 37°C in flüssigem PP₃-Medium wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Die Züchtung von Escherichia coli wird dann in einem flüssigen Züchtungsmedium wie nachstehend beschrieben vorgenommen:

Aliquote Teile von 6 ml der so erhaltenen Escherichia coli-Kultur (d.h. etwa 6xlO^q Bakterien) werden in 300 ml flüssiges PPrMedium enthaltende Züchtungskolben eingeimpft. Die Kulturen werden einen Tag unter Schütteln auf Schütteleinrichtungen (22 bis 24

b5 Schüttelbewegungen pro Minute) inkubiert. Die Ernten aus 5 Züchtungskolben (eine Serie) werden vereinigt. Jede Ernteserie wird 2 Stunden bei 2550 UpM zentrifugiert, das Sediment wird in I50ml destilliertem

Wasser suspendiert, und eine Suspensionsprobe wird wie in Beispiel 1 auf Reinheit geprüft

Die Zellsuspension wird 30 Minuten in einem Branson-Europa-Beschallungsgerät Modell J 22 beschallt, wobei das Medium in einem schmelzenden Eisbad gehalten wird. Nach dein Aufbrechen der Zellen wird die Suspension zum Abtrennen der Zelltrümmer 2 Stunden bei 50⁰C und 2550 UpM zentrifugiert Der Oberstand wird durch ein Millipore-Sterilisierfilter von 0,45 Mikron filtriert wobei 100 ml Filtrat erhalten werden. Der pH-Wert des Filtrats wird mit n-Salzsäure auf 6,4 eingestellt Das Filtrat wird dann mit Thiomersal bis zu einer Endkonzentration von 0,02 Prozent versetzt

Herstellung des Impfstoffes

40 ml einer 2prozentigen wäßrigen Lösung von Aluminiumhydroxidgel wenden gründlich mit 80 ml des in Beispiel 3 erhaltenen Filtrais vermischt. Die Adsorption des Enterotoxins an dem Gel wird mittels des Ausfällungsversuchs mit Trichloressigsäure geprüft.

20 ml des Überstands werden verworfen. Das restliche Gemisch wird in zehn l0-ml-Ampullen verteilt, die verschlossen werden. Der Inhalt jeder Ampulle (9 ml) entspricht einer Impfdosiereinheit von 100 mg (auf Trockengewichtbasis) des hitzelabilen (LT) Escherichia coli-Enterotoxins.

Der Impfstoff wird trächtigen Mutterschweinen 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln intramuskulär oder subkutan verabreicht. Der Impfstoff kann auch in größere Ampullen verteilt werden, wobei ganzzahlige Vielfache der Dosiereinheit und somit die entsprechenden Vielfachdosen-Impfpräparate erhalten werden.

Beispiel 3

Das Verfahren wird wie in Beispiel 2 durchgeführt, wobei jedoch das Gemisch in 100 Glasampullen verteilt wird, die verschlossen werden. Der Inhalt jeder Ampulle

Tabelle I: Versuch 1

entspricht einer Impfdosiereinheit von 10 mg (auf Trockengewichtbasis) des hitzelabilen (LT) Eschenchia coli-Enterotoxinextrakts. Der Impfstoff wird trächtigen Mutterschweinen 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln intramuskulär oder subkutan verabreicht

Wirkungsweise des Impfstoffes

Die Verhütung der Ferkel-Colibacillose durch subkutane Verabreichung der erfindungsgemäßen hitzelabilen (LT) Escherichia coli-Enterotoxinpräparate wird durch die nachfolgenden Versuche 1,2 und 3 gezeigt In jedem dieser Versuche werden die Mutterschweine 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln geimpft und ein Mutterschwein wird als Kontrolltier verwendet 24

-,5 Stunden nach der Geburt werden die Ferkel pro kg Körpergewicht mit 400 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten (LT) Escherichia coli-Enterotoxins infiziert wobei für die Verabreichung ein Magenschlauch verwendet wird. Bei drei Würfen werden einige Ferkel — wie aus den nachstehenden Tabellen I bis III ersichtlich — mit 660 mg des aus dem Stamm ATCC 21 972 erhaltenen hitzestabilen (ST) Escherichia coli-Enterotoxin infiziert Die klinische Entwicklung der Ferkel wird fachgerecht verfolgt, wobei auf das Auftreten typischer Symptome der Colibacillose geachtet wird.

In den Tabellen I bis III bedeutet

Impfstoff A:

Impfstoff des Beispiels 1 mit 100 mg (auf Trockengewichtbasis) Dosiereinheit

Impfstoff B:

Impfstoff des Beispiels 2 mit 100 mg (auf Trockenj5 gewichtbasis) Dosiereinheit,

Impfstoffe:

Impfstoff des Beispiels 3 mit 10 mg (auf Trockengewichtbasis) Dosiereinheit

Mutlerschwein

geimpft mit

Ferkel

Nr.

infiziert	Diarrhöe	Dauer,	Sterblich	Gewicht, Prozent
mit	Anzahl der	Stunden	keit	(24 Stunden nach
	Stunden zwischen			der Infektion)
	Infektion und
	Ausbruch

2-10
2-11
2-12
2-13
2-14
2-15
2-16

3-17
3-18
3-19
3-20
3-21
3-22
3-23
3-24

LT LT LT LT ST ST ST

LT LT

LT LT ST ST ST ST

keine Änderung

+ 3,5

+ 9,5

keine Änderung

+ 3,6

keine Änderung

+ 2,8

+ 10,6
+ 11,8
+ 6,3
+ 5,8
+ !0
+ 11,9
+ 10,4

+ 7 S

Fortsetzung	10	Ferkel	inH/.icrt	Diarrhöe	Dauer,	Sterblich- Gewicht, Prozent
Mutterschwein	(Kontrolle)	Nr.	mit	Anzahl der	Stunden	keil (24 Stunden nach
Nr. geimpft				Stunden zwischen		der Infektion)
mit				Infektion und
				Ausbruch	24
			LT	6	24	-10
		10-01	LT	6 bis 12	12	- 10,9
	10-02	LT	6	96	- 5,3
	10-03	LT	6	10	+ - M 7
Tabelle II: Versuch 2	10-04	LT	6 bis 12	-	- 7,6
Mutterschwein	10-05	ST	-	3	keine Änderung
Nr. geimpft	10-06	ST	1	-	- keine Änderung
mit	10-07	ST	-	12	- keine Änderung
	10-08	ST	6		keine Änderung
	10-09
47 A
	Ferkel	infiziert	Diarrhöe	Dauer, Stunden	Sterblich- Gewicht, Prozent,
	Nr.	mit	Anzahl der Stunden zwischen		keit (24 Stunden nach der Infektion)
			Infektion und
			Ausbruch	_
48 B		LT	_	-	- keine Änderung
	47-12	LT	-	-	+ 9,2
	47-13	LT	-	-	- keine Änderung
	47-14	LT	-	-	+ 6,4
50	47-15	LT	-	—	+ 6,6
(Kontrolle)	47-16	LT	_	-	+ 5,2
	48-08	LT	-	-	+ 6,7
	48-09	LT	-	-	+ 3,7
	48-10	LT	-	21	+ 10,5
	48-11	LT	5	-	+ -19,8
	50-01	LT	-	-	- keine Änderung
Tabelle III: Versuch 3	50-02	LT	-	14-21	+ 2,6
Mutterschwein	50-03	LT	6	48	+ -22,1
Nr. geimpft	50-04	LT	14	10	+ -18,8
mit	50-05	LT	21	21	- 3,2
	50-06	LT	6		+ -28,5
	50-07
13 B
	Ferkel	infiziert	Diarrhöe	Dauer, Stunden	Sterblich- Gewicht, Prozent
	Nr.	mit	Anzahl der Stunden zwischen		keit (24 Stunden nach Infektion)
			Infektion und
			Ausbruch	—
	LT	—	—	+ 8,4
13-119	LT	-	-	+ 11,4
13-120	LT	-	_	+ 2
13-121	LT	_		— keine Änderune
13-122

	9	23	60 118	Dauer,	&
				Stunden
	Ferkel				ίο i
Fortsetzung	Nr.
Mutterschwein		infiziert	Diarrhöe	—
Nr. geimpft		mit	Anzahl der	2	Sterblich- Gewicht, Prozent
mit			Stunden zwischen	-	keit (24 Stunden nach !?'
			Infektion und	-	Infektion) ■
	13-123		Ausbruch	40
	13-124	LT	_	-
13 B	13-125	LT	4	48	+ 7,1 i-j
	13-126	LT	-	6-11	+ 8,1 f'
	13-127	LT	-	48	- + 8 "i
	13-128	LT	8	-	+ 5,8 =3
	21-110	LT	-	6	+ -21 ;';
	21-111	LT	3	-	+ 8,4 j
*21) C**	21-112	LT	3	-	+ -15
	21-114	LT	4	5	- 6,9 ;
	21-115	LT	-	-	+ -14,3
	21-116	LT	6	-	- 5,9
	21-117	LT	-	-	- 6,3
	21-118	LT	-	-	- 3,6
	15-129	LT	6	-	- 2
	15-130	LT	-	6	- 12,5
15 C	15-131	LT	-	6	+ 7,4
	15-132	LT	-	4	+ 4,9
	15-133	LT	-	6	+ 13,2 ^s>
	20-101	LT	-	6	+ 16
	20-102	LT	5	4-9	- keine Änderung
20	20-103	LT	6	-	- 3,6
(Kontrolle)	20-104	LT	25	6	-16,5
	20-105	LT	19	6	- 4,5) ',**
	20-106	LT	6		- 5,3 I
	20-107	LT	3		- 4,7
	20-108	LT	-	- keine Änderung
	20-109	LT	6	- 3,2
	*) 48 Stunden nach dem Ferkeln tritt	LT	6	- 5,7
	**) Gewichtsverlust 4	Mastitis auf.		- 4,2
		Stunden nach dem Auftreten der	Diarrhöe.

Die Ergebnisse der Versuche zeigen, daß 6 von 7 Würfen von geimpften Mutterschweinen gegen die orale Infektion mit Escherichia coli-Enterotoxinen geschützt sind. Der erreichte SIchutz beträgt 90 Prozent für einen Wurf und 100 Prozent für die 5 anderen Würfe. Kein von den Kontrollschweinen stammender Wurf ist widerstandsfähig gegen die gleiche Infektion mit Enterotoxinen; die Sterblichkeit und Morbidität unter den Kontrollferkeln beträgt 71,4 bis 883 Prozent

In fünf von sieben Würfen von geimpften Mutterschweinen sind sämtliche Ferkel vollständig geschützt; in einem Wurf sind 8 von 10 Ferkeln vollständig geschützt Für die mit LT-Enterotoxin infizierten und von Kontrollschweinen stammenden Ferkeln werden folgende Ergebnisse erhalten: In einem Wurf zeigen 5 von 5 Tieren, im zweiten Wurf 5 von 7 Tieren und im dritten Wurf 8 von 9 Tieren typische Symptome.

Beispiel 4

Ein aliquoter Teil von 12 g des gemäß Beispiel 1 hergestellten und gefriergetrockneten Enterotoxinpräparats wird in 1 Liter pyrogenfreiem destilliertem Wasser suspendiert Die Suspension wird mit einer Lösung von 20 g Aluminiumhydroxidgel in 1 Liter pyrogenfreiem destilliertem Wasser vermischt Der pH-Wert wird mit η Salzsäure auf 6 eingestellt und das Gemisch wird zur Adsorption des Enterotoxins an dem Gel 40 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei hin und wieder gerührt wird. Der End-pH-Wert beträgt 63.

Nach dem Zentrifugieren wird der Oberstand verworfen und das Sediment durch Zugabe von 22 Liter eines 50:50-Gemisches aus physiologischem Serum und Puffer 22 g Na₂HPO₄ (m/10) und 78 g KH₂PO₄

(m/10) und 10 mg Thiomersal auf 100 ml; pH 6,3, rehydratisiert. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 4°C gerührt und in zwei 1100-ml-Chargen geteilt, die mit A und B bezeichnet werden. Charge A enthält 5,4 mg des Enterotoxinpräparats und 9 mg Aluminiumhydroxidgel pro ml und wird in aliquote Teile von 5 ml aufgeteilt, die somit 27 mg des Enterotoxinpräparats enthalten. Die aliquoten Teile werden in Glasampullen gefüllt, die anschließend abgeschmolzen werden. Charge B wird verdünnt durch Zugabe von 303 ml eines 50 :50-Gemisches aus physiologischem Serum und Puffer, 22 g Na₂HPO₄ (m/10) und 78 g KH₂PO₄ (m/10) und 10 mg Thiomersal auf 100 ml; pH 6,3, das mit 2,7 g Aluminiumhydroxidgel versetzt wurde. Charge B enthält 43 mg des EnterüiuxitipräpäräiS und 9 mg Äluininiumhyuroxidgel pro ml und wird in aliquote Teile von 2,5 ml aufgeteilt, die somit 10,75 mg des Enterotoxinpräparats enthalten. Die aliquoten Teile werden in Glasampullen gefüllt, die dann abgeschmolzen werden.
Die aus den Chargen A und B hergestellten

Impfstoffe werden wie nachstehend beschrieben in Zuchtzentren, die mit durch Colibakterien verursachte Diarrhöe verseucht sind, an Mutterschweinen geprüft. Hierzu werden die Mutterschweine 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln subkutan mit einer Einzeldosis des Impfstoffes geimpft: 59 Mutterschweine erhalten eine Dosis des Charge-A-Impfstoffes und 28 Mutterschweine eine Dosis des Charge-B-Impfstoffs. 50 Mutterschweine dienen als Kontrolle und erhalten die gleichen Volumina

ίο desselben Aluminiumhydroxidgel-Puffergemisches ohne den Enterotoxinextrakt.

Sämtliche Ferkel werden auf das Auftreten von Diarrhöe beobachtet. Am und nach dem zweiten Tag des klinischen Krankheitssymptoms werden die Ferkel täglich mit Chloramphenicol, Ampicillin oder Suifadoxin/Trimethoprim behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV unter Berücksichtigung der Konsistenz der Fäzes, der Dauer der Diarrhöe, der Anzahl der Verabreichungen von Antibiotika und der Sterblichkeit durch Wasserentzug zusammengestellt

Tabelle IV

Vakzine-Dosis

Zahl der Würfe mit schwerer
Würfe Diarrhöe*)

Zahl Prozent

Würfe mit Sterblichkeit

Zahl

Prozent

5 ml von Charge A	59	15	25,4	2	3,3
2,5 ml von Charge B	28	10	35,7	2	7,1
Placebo**)	50	24	48	8	16

*) Flüssige Fäzes während mehr als zwei Tagen, mehrere Verabreichungen von Antibiotika, mit

und ohne Sterblichkeit

**) 25 Mutterschweine erhalten 2,5 ml und die anderen
25 Mutterschweine 5 ml.

Die in Tabelle IV zusammengestellten Ergebnisse 40 Prozentsatz beträchtlich herabgesetzt wird, wobei bei zeigen, daß durch die Verabreichung des erfindungsge- Verabreichung der 27-mg-Enterotoxin-Dosiereinheit an mäßen Impfstoffes der Krankheits- und Sterblichkeits- die Mutterschweine ein besserer Schutz erhalten wird.

Claims

Patentansprüche:

1. Impfstoff gegen Ferkel-Colibacillose, enthaltend ein aus einem enteropathogenen Escherichia coli-Serotyp gewonnenes, im wesentlichen von Lipopolysacchariden freies, hitzelabiles, zellfreies Enterotoxin sowie ein Adjuvans.

2. Verwendung von aus einem enteropathogenen Escherichia coli-Serotyp gewonnenes, im wesentlichen von Lipopolysacchariden freies, hitzelabiles, zellfreies Enterotoxin zusammen mit einem Adjuvans bei der Bekämpfung von Ferkel-Colibacillose.