DE2462314A1

DE2462314A1 - Verfahren zur enzymatischen hydrolyse von ribonucleinsaeure

Info

Publication number: DE2462314A1
Application number: DE19742462314
Authority: DE
Inventors: Yuh Norimoto; Shigeru Ohmura; Yoshiaki Shimizu; Toshio Tatano
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-02-14
Filing date: 1974-02-13
Publication date: 1976-11-04
Also published as: CA1023290A; FR2217332A1; DE2462314B2; DE2406811A1; FR2217332B1; US3920519A; DE2406811B2

Description

¹¹ Verfahren zur enzymatisehen Hydrolyse von Ribonucleinsäure "

Priorität: 14. Februar 1973, Japan, Nr. 17 449/73 24. März ^: 1973, Japan, Nr. 33 088/73

, Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatisehen Hydrolyse von Ribonucleinsäure (RNS) unter Bildung von Nucleosid-3',5'-cyc1ophosphaten.

Adenosin-3',5'-cyclophosphat hat bekanntlich eine Mittlerrolle bei hormonbedingten Stoffwechselvorgängen. 3^f,5'-c-AMP und die übrigen Hucleosid-3¹,5^l-cyclophosphate sind neben ihrer Bedeutung als Reagentien für biochemische und medizinische Untersuchungen auch als Arzneistoffe von Bedeutung. - ·

Bisher wurde die enzymatische Hydrolyse von RNS zu Nucleosid-S'.S'-cyclophosphaten in der Literatur nicht beschrieben. Es ist lediglich bekannt, daß 3',5'-C-AMP durch Umsetzung von Adenosintriphosphat mit Adenylcyclase, die aus Mikroorganismen oder durch fermentative Verfahren erhalten worden ist, entstehen.

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Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur enzymatisehen Hydrolyse von IiNS unter Bildung von Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten zur Verfugung zu stellen, das sich leicht großtechnisch durchführen läßt.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß bei der Einwirkung von intakten Mikroorganismenzellen, die eine Ribonucleaseaktivität aufweisen, in Gegenwart eines Chelatbildners und Phosphationen auf RNS Nucleosid-3',5'-cyclophosphate erhalten werden können.

Gegenstand' der Erfindung ist ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Ribonucleinsäure zu Nucleosid-3¹,5'-eyclophosphaten, dadurch gekennzeichnet, daß man Ribonucleinsäure mit intakten Zellen von Ribonuclease-Aktivität aufweisenden Mikroorganismen der Species Escherichia coli oder von Aerobacter aerogenes ATCG 8329, Salmonella typhosa ATCC 9992, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246, Hansenula anomala ATCC 20144, Kloeckera apiculata ATCC 18212 oder Torulopsis sphaerica ATCC 8549 in wäßrigem Medium in Gegenwart von Äthylendiamintetraessigsäure, Cyclohexandiamintetraessigsäure oder Hydroxyäthylendiamintriessigsäure als Chelatbildner und in Gegenwart von mindestens 0,17 m Phosphationen umsetzt.

. Beispiele für Nucleosid-3',S'-cyclophosphate, die sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten lassen, sind 3·, S'-Cyclophosphat (3',5'-C-MP), Guanosin-3' ,S'-cydophosphat (3^!,5'-C-GMP), Uridin-S'^'-cyclophosphat (3¹,5'-C-UMP) und Cytidin-3',5'-cyclophosphat.

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Bei der Durchführung der Reaktion bei höheren Phosphationenkonzentrationen werden selektiv Nucleosid-3',5'-cyclophosphate gebildet. Bei der.Einhaltung einer mittleren Phosphationenkonzentration entstehen neben den 3',5'-Cyclophosphate auch 2 ', 3' -Cyclo.phosphate.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können alle Mikroorganismen der Species Escherichia coIi eingesetzt werden, die eine Ribonuclease-Aktivität aufweisen. Um festzustellen, ob ein bestimmter Mikroorganismus eine Ribonuclease-Aktivität aufweist, können übliche Verfahren angewendet werden.

■ Die im erfindμngsgemäßen Verfahren verv/endeten Mikroorganismen werden nach üblichen Züchtungsverfahren für Bakterien oder Hefengezüchtet. Beispielsweise können die Mikroorganismen in einem eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und andere Nährstoffe enthaltenden Nährmedium gezüchtet werden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Glucose und Saccharose. Organische Säuren, Alkohole und Kohlenwasserstoffe können ebenfalls verwendet werden, sofern der verwendete Mikroorganismus zur Assimilation dieser Kohlenstoffquellen befähigt ist. Beispiele für Stickstoffquellen sind organische

Stickstoff .

und anorganische /verbindungen, sowie natürliche organische Substanzen, wie Pepton* Maisquellwasser und Hefeextrakt. Ferner

kann das Nährmedium mit Phosphaten, wie Kaliumdihydrogenphosphat und Dikaliumhydrogenphosphat und Metallsalzen, wie Magnesiumsulfat, versetzt werden.

Die Züchtungsbedingungen werden je nach dem verwendeten Mikroorganismus ausgewählt. Nach beendeter Züchtung v/erden die Zellen beispielsweise durch Zentrifugation von der Gärmaische abgetrennt .

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen RNS-Hydrolyseverfahrens v/erden die Zellen in einem wäßrigen Medium in einer Konzentration von 10 bis 40 mg/ml, vorzugsweise etwa 20 mg/ml, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, suspendiert. Die Suspension wird mit RNS, einem Chelatbildner und einer bestimmten Menge ' · Phosphationeh versetzt.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete RNS wird nach üblichen Verfahren gewonnen und stammt im allgemeinen aus Mikroorganismen. Zur Hydrolyse wird sie in einer Menge von 1 bis 40 mg/ml, vorzugsweise 10 bis 20 mg/ml verwendet.

■ Die Chelatbildner werden im erfindungsgemäßen Verfahren in einer Konzentration von 5 bis 30 millimolar, vorzugsweise 10 bis 30 millimolar eingesetzt.

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Wie bereits erwähnt,"wird im erfindungsgemäßen Verfahren die die Menge an Nucleosid-3·,5^f-cyclophosphaten neben Nucleosid-2'^'-cyclophosphaten durch die Konzentration der Phosphationen im Reaktionsmedium beeinflußt.

Beispielsweise wird Escherichia coli ATCC 10798 in 50 ml eines 30 mg/ml Glucose, 6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und Oi25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Puffers vom pH-Wert 6,8 16 Stunden bei 38⁰C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden die Zellen durch Zentrifugieren von der Gärmaische abgetrennt. Anschließend werden 2,5 g (Trockengewicht) dieser Zellen in jeweils 100 ml Wasser, 0,10 m, 0,15 m, 0,16 m, 0,17 m und 0,3 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 suspendiert. Die Suspensionen werden mit 0,5 g RNS und 292 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt und 48 Stunden bei 40°C zur Umsetzung gebracht. Anschließend wird die Menge der gebildeten Nucleosid-2¹,3'-cyclophosphate und der Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphate bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Phosphationen	Bildung von Nucleosid-	Bildung von Nucleosid_r
konzentration, m	2^f,3'-cyclophosphaten, mg/ml	3',5'-cyclophosphaten, mg/ml
0		Spuren
0,10	2	Spuren
0,15	1,7	0,25
Q, 16	0,96	0,77
0,17	Spuren	1,2
0,3	Spuren	1,2

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Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, .daß die FlIiS in Abwesenheit von Phosphationen selektiv zu Nucleosid-2',3'-cyclophosphaten hydrolysiert wird. Bei steigender Phosphationenkonzentration nimmt die Bildung von Nucleosid-2¹,3'-cyclophosphaten ab, während die Menge der gebildeten Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten zunimmt. Bei einer Phosphationenkonzentration von 0,17 m oder mehr wird die RNS praktisch selektiv zu Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten hydrolysiert.

Man erhält also nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bei Phosphationenkonzentrationen von 0,17 m und höher Reaktionsprodukte, die hauptsächlich aus ITucleosid-3', 5'-cyclophosphaten bestehen.

Als Quelle für Phosphationen können verschiedene Phosphate verwendet v/erden, die Phosphationen an das wäßrige Medium abgeben. Besonders geeignete Phosphatquellen sind in den folgenden Beispielen aufgeführt.

Im allgemeinen wird die Reaktion zwischen RI¹IS, den Mikroorganismenzellen, dem Chelatbildner und den Phosphationen 1 bis 96 Stunden, vorzugsweise 24 bis 48 Stunden, bei Temperaturen von 35 bis 45⁰C, Vorzüge-.reis ο 33 bis 42⁰C, durchgeführt. Während der Umsetzung viird der pH-V/ert im Bereich von 4 bis 9 gehalten.

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0AD OHiQiNAL

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Pur die selektive Bildung von Nucleoside*,i'-cyclophosphaten wird der pH-Wert vorzugsweise im Bereich von 8 gehalten.

Geeignete wäßrige Reaktionsmedien sind verschiedene Pufferlösungen, wie Acetatpuffer und Phosphatpuffer. Im Hinblick auf die Einstellung des pH-Wertes ist die Verwendung von Phosphatpuffern "bevorzugt. . ·

Nach beendeter Umsetzung werden die Reaktionsprodukte isoliert und nach üblichen Verfahren gereinigt. Beispielsweise werden die Zellen aus dem Reaktionsgemisch durch Abfiltrieren entfernt. Das zellfreie Filtrat wird der Adsorption an Aktivkohle oder einem synthetischen Adsorptionsmittel unterworfen und anschließend mit alkalischem, wäßrigem Methanol oder einem Gemisch aus Aceton und Wasser eluiert. Das Eluat wird eingeengt und an einem Ionenaustauscherharz, beispielsweise Dowex 1x2 (Cl~-Form) (stark basisches Anionenaustauscherharz der Firma The Dow Chemical Co.), adsorbiert. Anschließend wird mit einer neutralen Salzlösung, beispielsweise einer wäßrigen Ammoniumhydrogencarbonatlösung eluiert. Durch Gefriertrocknung oder Kristallisation erhält man aus dem Eluat ein Gemisch aus Nucleosid-2¹,3^!-cyclophosphaten, das 2¹,3'-C-AMP, 2·,3'-C-GMP, 2',3'-C-TOlP und 2',3'-C-CMP enthält oder e;Ln Gemisch aus Mucleosid-3',5'-cyolophosphaten, das 3',5'-c-AMP, 3'',5'-c-GMP, 3', 5'-C-UI-IP und 3',5'-C-CMP enthält.

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, Wenn als Reaktionsprodukt ein Gemisch aus Nucleosid-2',3'-cyclophosphaten und Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten erhalten wird, kann dieses leicht in die einzelnen Nucleosid-cyclophosphate aufgetrennt werden. Beispielsweise werden die Zellen

* vom Reaktionsgemisch abfiltriert. Sodann wird das Filtrat mit einer Säure, wie Salzsäure oder Phosphorsäure, auf einen pH-Wert von 3,5 bis 4,0 eingestellt. Nach dem Einengen des Filtrates fallen die Nucleosid-3',5'-cyclophosphate aus. .: ;

". - -_- - —' : ^ Die als Fest-

/ stoff erhaltenen Nucleosid-3',5^f-cyclophosphate können anschließend in einem schwach alkalischen Lösungsmittel vom pH-Wert mindestens 7,5 gelöst werden. Die auf diese Weise erhal-. tenen ." "j' ,5·'-Cyclophosphate können auf die vorstehend •'. beschriebene Weise gereinigt werden.

Die erhaltenen 3¹,5'-Cyclophosphate lassen sich

leicht nach bekannten Verfahren in die einzelnen Komponenten auftrennen. Beispielsweise wird ein Gemisch aus

• ,. 3'^'-Cyclophosphaten auf eine mit einem Anionenaustauscherharz,

wie Dowex 1x2 (Cl""-Form) beschickte Säule gegeben. Die Elution wird stufenweise unter Verwendung von 0,1 bis 1,0 m Lösungen neutraler Salze, wie Ammoniumhydrogencarbonat, durchgeführt. Durch wiederholte Säulenchromatographie lassen sich die

3',5'-Cyclophosphate in die einzelnen Komponenten auftrennen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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— 9 Beispiel 1

EschericMa coli ATGG 10798 wird in 500 ml eines 30 mg/ml Glucose, 50 mg/ml Maisquellwasser, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Nährmediums vom pH-Wert 6,5 16 Stunden bei 38 G in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt.

4,4 g der erhaltenen Zellen v/erden in 200 ml 0,33 ra. Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 2 g RNS und 876 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt. Sodann, wird das Gemisch 48 Stunden bei 4O⁰G umgesetzt. Man erhält im Reaktionsgemische 7,2 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3¹,5'— cyclophosphaten.

Anschließend werden die Zellen abfiltriert. Das Filtrat wird an einem Kunstharz adsorbiert. Die Elution wird mit 50prozentigem Aceton durchgeführt, und das erhaltene Eluat wird eingeengt. Die eingeengte Lösung wird an Dowex 1x2 (Cl"-Form adsorbiert. Die Elution wird mit einer Calciumchlorid-Salzsäure-Pufferlösung durchgeführt. Sodann wird das Eluat eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 0,6 g eines pulverförmigen Gemisches aus Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten von 86prozentiger Reinheit.

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- ίο -

Beispiel 2^

Aerobacter aerogenes ATCC 8329 wird in 500 ml eines 10 mg/ml Glucose, 6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Nährmediums vom pH-Y.^rert 6,8 8 Stunden bei 38⁰C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert.

2,5 g der so erhaltenen Zellen werden in 100 ml 0,40 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 800 mg RNS und 584 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird 36 Stunden bei 40⁰C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man 4,3 mg/ml eines Gemisches aps Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten.

Das Reaktionsgemisch wird anschließend gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Man erhält 133 mg eines pulverförmigen Gemisches aus 3¹i5'-Cyclophosphaten von 83prozentiger Reinheit.

Beispiel 3

Salmonella typhosa ATCC 9992 wird in 500 ml eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 116 Stunden bei 28⁰C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert.

2 g der erhaltenen Zellen werden in 100 ml 0,36 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1,5 g RNS und 730 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird 44 Stunden bei 43⁰C umgesetzt. Man erhält 9>1 mg/ml eines

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Gemisches aus Nucleosid-3'>5'-eyclophosphaten.

Beispiel 4

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246 anstelle von Escherichia coli ATCC 10798. Man erhält 371 /ig/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten.

Beispiel5

Hansenula anomala ATCC 20144 wird in 500 ml eines 40 mg/ml Glucose, 5 mg/ml Pepton, 2 mg/ml Hefeextrakt, 2 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 2 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat, 1 mg/ml Magnesiumsulfat und 20 mg/ml Malzextrakt enthaltenden Nährmediums vom pH-Wert 6,5 28 Stunden bei 28°C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden die Zellen abzentrifugiert. Sodann v/erden 2,5 g der Zellen in 100 ml 0,33 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 g RNS und 500 mg Hydroxyäthylendiamintriessigsäure versetzt und 72 Stunden bei 40°C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man 3>6 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3^f,5'-cyclophosphaten. Sodann wird das Reaktionsgemisch gemäß Beispiel 4 aufgearbeitet. Man erhält 47 mg eines pulverförmigen Gemisches aus Nucleosid-3¹,5^f-cyclophosphaten von. 76prozentiger Reinheit.

- Ί2 -

Beispiele

Kloeckera apiculata ATCC 18212 wird gemäß Beispiel 5 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß die Züchtungsdauer 32 Stunden beträgt. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert. Sodann werden 3 g der erhaltenen Zellen in 100 ml 0,33 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 g RNS und 692 mg Cyclohexandiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird 72 Stunden bei 40⁰C umgesetzt. Nach beendeter Umsetzung erhält man 3>5 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten. Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Man erhält 42 mg eines pulverförmigen Gemisches aus 3¹,5'-Cyclophosphaten von 74prozentiger Reinheit.

B e i s ρ i e 1 7 "

2,5 g gemäß Beispiel 5 erhaltene Zellen von Torulopsis sphaerica ATCC 8549 v/erden in 100 ml 0,33 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 g RNS und 438 mg Athylendiamintetraessigsäure versetzt. Sodann wird das Gemisch 48 Stunden bei 40°C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man 523 ug/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3¹,5'-cyclophosphaten.

Γ). fl fi U R / Π R. U 1

Claims

Patentansprüche

1i Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Ribonucleinsäure zu Nucleosid-3' ,5 '-cyclophosphaten, dadurch gekennzeichnet, daß man Ribonucleinsäure mit intakten Zellen von Ribonuclease-Aktivität aufweisenden Mikroorganismen .der· Species Escherichia coil-oder von Aerobacter . _; aerogenes ATCG 8329, Salmonella typhosa ATCG 9992, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246, Hansenula anomala ATCC.20144, Kloeckera apiculata ATCC 18212 oder Torulopsis sphaerica ATCC 8549 in wäßrigem Kediura in Gegenwart von Athylendiainintetraessigsäure, Cyclohexandiainintetraessigsäure oder Hydroxyäthylendiamintriessigsäure als Chelatbildner und in Gegenwart von mindestens 0,17 m Phosphationen umsetzt.
2. Verfahren naeh Anspruch 1, dadurch geken η zeichnet, daß man als Mikroorganismus Escherichia coli •ATCC 10?98· verwendet. · ···..- . . .
.3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 1 bis 40 mg/ml Ribonucleinsäure mit 10 bis 40 mg/ml intakten Mikroorganismenzellen umsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration des Chelatbildner im Medium auf 5 bis 30 millimolar einstellt.
5. Verfahren nach Anspruch 1f, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des Mediums auf etwa 8 ein^stellt* 60984 5/0841