DE1218113B

DE1218113B - Process for the production of highly purified white bacitracin

Info

Publication number: DE1218113B
Application number: DEP33808A
Authority: DE
Inventors: Jack Ziffer; Thomas J Cairney
Original assignee: Pabst Brewing Co
Current assignee: Pabst Brewing Co
Priority date: 1962-11-07
Filing date: 1962-11-07
Publication date: 1966-06-02

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLANDFEDERAL REPUBLIC OF GERMANY

DEUTSCHESGERMAN

PATENTAMTPATENT OFFICE

AUSLEGESCHRIFTEDITORIAL

Int. CL:Int. CL:

C12dC12d

Deutsche Kl.: 30 h-6 German class: 30 h -6

Nummer: 1218113Number: 1218113

Aktenzeichen: P 33808IV a/30 hFile number: P 33808IV a / 30 h

Anmeldetag: 7. November 1962Filing date: November 7, 1962

Äuslegetag; 2. Juni 1966Laying day; June 2, 1966

Die Erfindung betrifft die Gewinnung von Bacitracin, insbesondere von antibiotischern, hochgereiijigtem weißem Bacitracin, das eine außerordentlich hohe Stabilität aufweist.The invention relates to the production of bacitracin, in particular of antibiotic, high-grade ones white bacitracin, which is extremely stable.

Der Wert des Bacitracins in der tierisphen Ernährung und in der tierischen \md menschlichen Therapie ist bekannt, und es sind für diesen Zweck bereits verr schiedene Bacitraeinpräparate und Verfahren zu deren Gewinnung und Reinigung vorgeschlagen worden. Die im Handel erhältlichen Präparate und die bekannten Verfahren weisen jedoch Nachteile auf, die aus? zuschalten sehr erwünscht ist. Ein wichtiges Problem ist beispielsweise der allmähliche Verlust der antibior tischen Wirkung bei längerem Lagern unter ungünstigen oder schlechten Bedingungen^ wie hohe Feuchtigkeit und Temperatur. Ferner ist es äußerst schwierig, hochreines Bacitracin herzustellen und ein weißes Endprodukt ohne farbige Verunreinigungen zu schaffen, und es ist bekannt, daß bei den üblichen Verfahren zur Bacitracingewinnung Verluste an Endprodukt auftreten.The value of bacitracin in the tierisphen diet and in animal \ md human therapy is known, and have been proposed for this purpose already verr different Bacitraeinpräparate and methods for recovery and purification. However, the commercially available preparations and the known methods have disadvantages that include? switching on is very desirable. An important problem is, for example, the gradual loss of the antibiotic effect on prolonged storage under unfavorable or poor conditions such as high humidity and temperature. Furthermore, it is extremely difficult to produce high purity bacitracin and to provide a white end product without colored impurities, and it is known that losses of the end product occur in the conventional processes for obtaining bacitracin.

Nach einem bekannten Verfahren wird eine unreine wäßrige Lösung des Bacitracins bei einem pH von etwa 1,5 bis etwa 4,0 mit einem löslichenMolybdat versetzt. Das dabei gebildete Baeitracin-Molybdat wird in Wasser auf einen pH von mindestens 5,0 eingestellt und die Bacitracinlösung mit einem teilweise mit Wasser mischbaren polaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Das dabei gebildete Bacitracin ist verhältnismäßig rein, jedoch seine Stabilität läßt zu wünschen übrig. Bei einer Temperatur von 55 bis 57° C hat es eine berechnete Halbwertszeit von 26 bis 31 Tagen.According to a known method, an impure aqueous solution of the bacitracin is at a pH of about 1.5 to about 4.0 are added with a soluble molybdate. The baeitracin molybdate formed in the process is adjusted in water to a pH of at least 5.0 and the bacitracin solution with a partial extracted with water-miscible polar organic solvents. The bacitracin formed is relatively pure, but its stability leaves something to be desired. At a temperature of 55 to 57 ° C, it has a calculated half-life of 26 to 31 days.

Es ist auch mehrfach vorgeschlagen worden, mit Ionenaustauschharzen zu arbeiten, um das Bacitracin zu reinigen. Von diesen haben sich gewisse carboxylgruppenenthaltende Ionenaustauschharze als recht zweckmäßig erwiesen. Die Durchführung weiterer experimenteller Versuche mit Ionenaustauschharzen erwies sich aber a}s nicht ratsam, weil viele dieser Versuche erfolglos blieben. Die nach einem anderen bekannten Verfahren verwendeten synthetischen quervernetzten Kationenaustauscherharze, die dUT^eh Sulf o~ nieren γοη Mischpolymeren aus Styrol und Divinyl· benzol hergestellt werden, zeigen gewisse Vorteile gegenüber den carboxylgruppenenthaltenden Austauschharzen, lassen jedoch unter anderem auch in ihrer Leistungsfähigkeit zu wüngchen übrig.It has also been suggested several times to work with ion exchange resins to purify the bacitracin. Of these, certain carboxyl group-containing ion exchange resins have been found to be quite useful. Carrying out further experimental attempts with ion exchange resins, however, turned out to be inadvisable because many of these attempts were unsuccessful. The synthetic cross-linked cation exchange resins used according to another known method, the DUT ^e h sulf o ~ kidney γοη copolymers of styrene and divinyl · are produced benzene, have certain advantages over the carboxyl containing exchange resins, but allow, among other things in their performance to wüngchen left.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung» ein Verfahren zu schaffen, mit dessen Hilfe ein antibiotisphes stabiles, gegen ungünstige Feuch.tigkeits- und Temperaturbedingungen widerstandsfähiges Bacitracin in hohen Verfahren zur Herstellung von hochgereinigtem
weißem BacitracinIt is therefore the object of the invention to create a process with the aid of which an antibiotic, stable, bacitracin resistant to unfavorable humidity and temperature conditions can be used in high processes for the production of highly purified
white bacitracin

Anmelder:Applicant:

Pabst Brewing Company, Chicago, 111. (V, St. A.)Pabst Brewing Company, Chicago, 111. (V, St. A.)

Vertreter:Representative:

Dipl.-Chem. I. Schulze, Patentanwalt,
Heidelberg, Gaisbergstr. 3Dipl.-Chem. I. Schulze, patent attorney,
Heidelberg, Gaisbergstr. 3

Als Erfinder benannt:Named as inventor:

Jack Ziffer,Jack digit,

Thomas J. Cairney, Milwaukee, Wis. (V. St. A.)Thomas J. Cairney, Milwaukee, Wis. (V. St. A.)

Ausbeuten gewonnen werden kann. Es ist insbesondere Aufgabe der Erfindung, ein hochgereinigtes, weißes pharmazeutisches Bacitracin zu schaffen.Yields can be obtained. It is a particular object of the invention to provide a highly purified, white to create pharmaceutical bacitracin.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von antibiotischem Bacitracin, insbesondere hochgereinigtem weißem Bacitracin unter Verwendung einer Bacitracinlösung, die durch Gärung eines wäßrigen Nährbodens mit einer bacitracinbildenden Kultur hergestellt wurde, das sieh dadurch kennzeichnet, daß eine Lösung aus Bacitracin und einem alialilöslichen Ligninniederschlag aus Alkalilignin und Ligninsulfonaten gebildet wird und diese Lösung nut einem nicht vollständig wassermischbaren, polaren, organischen Lösungsmittel extrahiert wird. Die Gewinnung des Bacitracins durch Ausfällen aus einer Lösung, die Verunreinigungen, wie Gärflüssigkeit oder daraus erhaltene Produkte, in unterschiedlichen Rjnheitsgradeu enthält, ist äußerst vorteilhaft, da dieses Verfahren weitgehende Konzentration und Reinigung des Bacitracins bewirkt.The invention relates to a process for the production of antibiotic bacitracin, in particular highly purified white bacitracin using a bacitracin solution that is produced by fermentation an aqueous nutrient medium with a bacitracin-producing culture, see thereby indicates that a solution of bacitracin and an alkali-soluble lignin precipitate of alkali-lignin and lignosulphonates is formed and this solution is not completely water-miscible, polar, organic solvent is extracted. The extraction of bacitracin through precipitation from a solution, the impurities, such as fermentation liquid or products obtained from it, in different Degree of purity is extremely advantageous, because this process causes extensive concentration and purification of the bacitracin.

Um den ausgefällten Ligno-BaeitraciurKomplex löslich zu machen, wird er alkalisch gemacht, d. h., das pH wird im wäßrigen Medium erhöht, bis sicn die Fällung löst· Das pH der Lösung kann von etwa 4,5 bis 9 liegen. Ein höheres pH als 9 wird zweckmäßiger^ weise vermieden, um Bacitracinverlust auf Grund von Instabilität zu vermeiden.About the precipitated Ligno-Baeitraciur complex To make it soluble, it is made alkaline, d. That is, the pH is increased in the aqueous medium until the Precipitation dissolves · The pH of the solution can be around 4.5 to 9 lie. A higher pH than 9 is expediently avoided in order to prevent loss of bacitracin due to Avoid instability.

Zur Herstellung des pharmazeutischen weißen Bacitracins wird die Lösung mit einem nicht vollständig wassermischbaren p,olaren organischen Lösungsmittel, d. h. höchstens teilweise mischbarenFor the manufacture of pharmaceutical white Bacitracins is the solution with a not completely water-miscible p, olaren organic solvent, d. H. at most partially miscible

609 577/4Q1609 577 / 4Q1

Lösungsmittel, extrahiert werden, wobei das Bacitracin in das Lösungsmittel extrahiert wird und das Lignin in der wäßrigen Schicht bleibt. Für die Extraktion ist das pH vorzugsweise auf 7 bis 9 eingestellt. Das Bacitracin kann direkt aus dem Lösungsmittel 5 gewonnen werden. Zur weiteren Reinigung wird das Bacitracin vorzugsweise aus einer wäßrigen sauren Lösung bei einem pH von etwa 2 bis 4 extrahiert. Ein niedriger pH-Wert kann, auf Grund der Instabilität, zu einem Verlust an Bacitracin führen, und ein höherer pH-Wert kann sich in einer ungünstigen Verteilungskonstante auswirken.Solvent, extracting the bacitracin into the solvent and extracting the lignin remains in the aqueous layer. The pH is preferably adjusted to 7 to 9 for the extraction. That Bacitracin can be obtained directly from the solvent 5. For further cleaning, the Bacitracin is preferably extracted from an aqueous acidic solution at a pH of about 2-4. A low pH can lead to a loss of bacitracin due to instability, and a a higher pH value can result in an unfavorable distribution constant.

Das pharmazeutische Bacitracin wird aus der wäßrigen Phase vorzugsweise nach dem Alkalischmachen gewonnen, wobei der pH-Wert auf etwa 5 bis 7 eingestellt wird, um die Stabilität zu erhalten. Die Gewinnung kann durch Konzentration zu einer Festsubstanz erfolgen. Lyophilisation (Gefriertrocknen) ist das bevorzugte Gewinnungsverfahren. Die Gewinnung des Bacitracins bei tiefer Temperatur, wie sie üblicherweise durchgeführt wird, wird bevorzugt, um Inaktivierung zu vermeiden.The pharmaceutical bacitracin is removed from the aqueous phase preferably after alkalinization recovered, adjusting the pH to about 5 to 7 to maintain stability. The extraction can take place by concentration to a solid substance. Lyophilization (freeze drying) is the preferred recovery method. The extraction of bacitracin at low temperatures, such as it is usually carried out is preferred to avoid inactivation.

Weißes pharmazeutisches Bacitracin, das eine Wirksamkeit von 60 000 bis 80 000 Einheiten pro Gramm hat, ist leicht und in hohen Ausbeuten herstellbar. Die Präparate haben ungewöhnlich hohe Stabilität. Ein nach dem vorliegenden Verfahren hergestelltes typisches pharmazeutisches Präparat wurde über einen Zeitraum von 381 Tagen bei einer Temperatur von 52 bis 58⁰C auf Stabilität geprüft. Nach dieser Zeit verblieb noch eine Wirksamkeit von 66,6%. Es trat, außerhalb der Versuchsfehler, während der letzten 234 Tage keine Änderung der Wirksamkeit auf, wie aus der folgenden Tabelle I ersichtlich ist. Die Temperaturstabilitätswerte für dieses Präparat sind weit höher als die von ähnlichen Präparaten bekannten.White pharmaceutical bacitracin, which has an activity of 60,000 to 80,000 units per gram, is easy and can be produced in high yields. The preparations are unusually stable. A typical pharmaceutical preparation produced according to the present method was tested for stability over a period of 381 days at a temperature of 52 to 58 ^{° C.} After this time there was still an effectiveness of 66.6%. Outside of the experimental errors, there was no change in the efficacy during the last 234 days, as can be seen from Table I below. The temperature stability values for this preparation are far higher than those known for similar preparations.

Table I.

TageDays Wirksamkeit
Einheiten pro Grammeffectiveness
Units per gram Verbleibende
Wirksamkeit
7oRemaining
effectiveness
7o 0
15
39
65
147
3810
15th
39
65
147
381 59 000
59 000
54 000
49 000
40 000
39 30059,000
59,000
54,000
49,000
40,000
39 300 100
91,5
83
67,8
66,6100
91.5
83
67.8
66.6

Dieser Versuch wurde über eine Zeitspanne von 725 Tagen durchgeführt. Nach Ablauf dieser Zeit hatte das Präparat immer noch eine Wirksamkeit von 48%· Vergleichsweise wurde ein im Handel erhältliches, von der S. B. Penick Company gewonnenes Bacitracin unter denselben Bedingungen getestet. Am Ende der 725 Tage betrug die noch verbliebene Wirksamkeit nur noch 19%. Nach 381 Tagen, als eine Wirksamkeit des nach dem vorliegenden Verfahren gereinigten Bacitracins von 66,6 % (^s· Tabelle I) ermittelt wurde, wies das Handelsprodukt nur noch eine Wirksamkeit von 41,4% auf. Die berechnete Halbwertszeit bei 55 bis 57 ° C betrug für das vorliegende Bacitracin 230 Tage.This experiment was carried out over a period of 725 days. At the end of this time, the preparation was still 48% effective. By way of comparison, a commercially available bacitracin obtained from SB Penick Company was tested under the same conditions. At the end of the 725 days, the remaining effectiveness was only 19%. After 381 days, when the effectiveness of the bacitracin purified according to the present method of 66.6% ( ^see Table I) was determined, the commercial product only had an effectiveness of 41.4%. The calculated half-life at 55 to 57 ° C for the present bacitracin was 230 days.

Die folgende Tabelle II zeigt eine Gegenüberstellung der Leistungsfähigkeit sowie der Kosten von carboxylgruppenenthaltenden Harzen, sulfonierten Mischpolymeren aus Styrol und den erfindungsgemäß verwendeten Ligninsulfonaten. Die Überlegenheit des des letzten Produktes ist deutlich ersichtlich.The following Table II shows a comparison of the performance and the cost of carboxyl group-containing Resins, sulfonated copolymers of styrene and the lignosulfonates used according to the invention. The superiority of the of the last product is clearly visible.

Tabelle II Reinigung von BacitracinTable II Purification of Bacitracin

Zur Reinigung verwendetes PräparatPreparation used for cleaning

Einheiten von gereinigtemUnits of purified

Bacitracin, berechnet proBacitracin calculated per

Pfund des ProduktesPound of product

Ungefähre Kosten
pro Pfund des ProduktesApproximate costs
per pound of product

Carboxylgruppenenthaltendes Harz ...
Sulfoniertes Mischpolymeres aus Styrol
Ligninsulfonate Carboxyl group-containing resin ...
Sulphonated copolymer made from styrene
Lignosulfonates

1170 000
1 816 000
3 400 0001,170,000
1,816,000
3,400,000

$ 1,20 bis 1,70
(DM 4,80 bis 6,80)$ 1.20 to 1.70
(DM 4.80 to 6.80)

$ 0,35 bis 0,50
(DM 1,70 bis 2,00)$ 0.35 to 0.50
(DM 1.70 to 2.00)

0,025 bis 0,05
(DM 0,10 bis 0,20)0.025 to 0.05
(DM 0.10 to 0.20)

Zur Fällung einer Ligno-Bacitracin-Verbindung, die leicht durch Alkalischmachen auf ein pH von 4,5 bis 9 löslich gemacht werden kann, dienen vorzugsweise Lignosulfonate. Die gefällten Alkali-Lignin^Komplexe sind unter praktischen Bedingungen zum Löslichmachen nicht zweckmäßig.For the precipitation of a ligno-bacitracin compound, which can easily be made alkaline to a pH of 4.5 to 9 Lignosulfonates are preferably used. The precipitated alkali-lignin complexes are not useful for solubilization under practical conditions.

Die Fällung kann im wesentlichen in einer Stufe vollständig sein, oder es kann eine Mehrstufenfällung durchgeführt werden, um Anfangsfraktionen von höherer Wirksamkeit herzustellen. Es kann jede beliebige Menge Lignin, die zur Fällung des Bacitracins ausreichend ist, verwendet werden. Mit einer Menge von etwa 0,001 mg Lginin pro Einheit Bacitracinaktivität kann eine ausreichende Menge von wirksamem Präparat ausgefällt werden. Es kann auch weniger verwendet werden, obwohl es scheint, daß es ohne Vorteil ist, weniger zu verwenden. Bei der Mehrstufenfällung kann bei Verwendung von etwa 0,003 bis 0,03 mg Lignin pro Einheit eine hochwirksame erste Fraktion von etwa 15 bis 20% °der mehr Wirksamkeit erhalten werden. Bei Erhalt einer maximalen Fällung in einer Stufe sind mindestens etwa 0,05 mg pro Einheit erforderlich, um das Bacitracin in Gegenwart von Gärlöslichen in eine Komplexverbindung überzuführen. Es scheint, daß eine Menge von mehr als etwa 0,25 mg pro Einheit Bacitracinwirkstoff keine Vorteile bringt.
Bei Bacitracinlösungen, die durch Gärung und anschließendes Filtrieren zur Entfernung von suspendierten Festsubstanzen hergestellt wurden, die etwa 3 bis 4 Gewichtsprozent gelöste feste Substanzen und etwa 200 bis 400 Einheiten von Wirkstoff pro Milli-Precipitation can be essentially complete in one step, or multiple step precipitation can be used to produce higher potency initial fractions. Any amount of lignin sufficient to precipitate the bacitracin can be used. With an amount of about 0.001 mg of lginine per unit of bacitracin activity, a sufficient amount of effective preparation can be precipitated. It can also be used less, although it seems that there is no benefit in using less. In the case of multi-stage precipitation, when using about 0.003 to 0.03 mg of lignin per unit, a highly effective first fraction of about 15 to 20% of the greater effectiveness can be obtained. When obtaining maximum precipitation in one stage, at least about 0.05 mg per unit is required to convert the bacitracin into a complex compound in the presence of fermentation solubles. It appears that an amount greater than about 0.25 mg per unit of bacitracin active ingredient is of no benefit.
In the case of bacitracin solutions, which have been prepared by fermentation and subsequent filtration to remove suspended solids, which contain about 3 to 4 percent by weight of dissolved solids and about 200 to 400 units of active ingredient per milliliter

liter enthalten, erfolgt der Ligninzusatz vorzugsweise in Typische Lignosulfonate, die erfindungsgemäß Vereiner Menge von etwa 0,05 bis 10 Gewichtsprozent, Wendung finden können, sind Orzane, die Toranile bezogen auf die Lösung, berechnet auf der Basis des und die Polyfone. Orzan A ist im wesentlichen Ligningehaltes des verwendeten Produktes. Vorzugs- Ammonium-Ligninsulfonat und Holzzucker, mit einem weise werden zu der Lösung, für eine maximale 5 charakteristischen Gewichtsverhältnis von 59,1% Gewinnung in einer Stufe, etwa 2% oder mehr Ligninsulfonsäuren. Es ist vollständig in Wasser Lignin zugegeben. löslich, und das pH in 30%iger Lösung ist 4,3. Eine Die Ligno-Bacitracin-Verbindung kann auf ver- typische Analyse zeigt: C = 45,6%; H = 5,6%; schiedene Weise gefällt werden, wobei Bacitracin und S = 6,4%; N = 3,7%; Ca = 0,2%; O = 38,7%· Lignin in Lösung bei einem pH bis zu 9 gemischt i° Orzan S ist im wesentlichen Natrium-Ligninsulfonat werden. Da es möglich ist, bis herab zu einem pH und Holzzucker mit einem typischen Gehalt von 57,6% von 1 zu arbeiten, werden das Bacitracin und das Ligninsulfonsäuren. Es ist vollständig in Wasser löslich, Lignin vorzugsweise bei einem pH von etwa 2 bis 7,5 und das pH in 30%iger Lösung ist 7. Eine typische gemischt. Bei den höheren pH-Werten wird die Lösung Analyse zeigt: C = 41,6%; H = 5,0%; S = 7,0%; angesäuert, d. h., ihr pH wird erniedrigt, bis Fällung 15 N = 0,5%; Ca = 0,2%; Na = 5,9%; O = 40,0%. eintritt. Bei einem niederen pH kann eine Fällung Orzane A und S sind in der Veröffentlichung »Orzan A gebildet werden, so wie das Lignin zugesetzt wird. an Orzan S« 1956 (Crown Zellerbach Corporation Wenn die Bacitracinlösung ein pH von weniger als 5,5 Chemical Products Division) beschrieben,
hat, wird es vorgezogen, das Lignin in Form einer Die Toranile werden aus entzückertem Extrakt der wäßrigen Lösung zuzugeben. 20 Nadelhölzer hergestellt, und ihr Hauptbestandteil ist Das pH zur Fällung des Komplexes kann variieren, Calcium-Ligninsulfonat in einem Verhältnis von etwa und zwar, wie oben ausgeführt, im allgemeinen von 96 Gewichtsprozent. Das Durchschnittsmolekular-1 bis 6, und es wird für die maximale Fällung einge- gewicht ist etwa 1000, und man nimmt an, daß das stellt. Es wird normalerweise vorgezogen, die Fällung Durchschnittsmolekül etwa drei Methoxyl-, fünf bei einem pH von etwa 2 bis 4 durchzuführen. 25 Hydroxyl- und zwei SuIf onatgruppen hat. Ein typischer Für die Fällung eignen sich verschiedene Säuren, Methoxylgehalt ist 8,8%. Eine typische Analyse zeigt: wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure u. dgl., C = 61 %, H = 6 %; S = 2 %; Ca = 3 %; O = 28 %. oder saure Salze, wie Natriumbisulfat, oder Kombina- Toranil A ist eine 50%ige Lösung in Wasser, und Torationen aus sauren Salzen und Säuren, wie z. B. Alu- nil B ist zusammengesetzt aus etwa 94% des Calciumminiumsulfat und Schwefelsäure, Ammonalaun und 30 Ligninsulfonate.liter, the lignin is preferably added in typical lignosulfonates, which according to the invention can be combined in an amount of about 0.05 to 10 percent by weight, are orzans, the toranils based on the solution, calculated on the basis of and the polyphones. Orzan A is essentially the lignin content of the product used. Preferred ammonium lignosulfonate and wood sugar, with a wise addition to the solution, for a maximum 5 characteristic weight ratio of 59.1% recovery in one stage, about 2% or more lignosulfonic acids. Lignin is completely added to water. soluble, and the pH in 30% solution is 4.3. A typical analysis of the ligno-bacitracin compound can show: C = 45.6%; H = 5.6%; be precipitated in different ways, with bacitracin and S = 6.4%; N = 3.7%; Ca = 0.2%; O = 38.7% · lignin mixed in solution at a pH up to 9 i ° Orzan S is essentially sodium lignin sulfonate. Since it is possible to work down to a pH and wood sugar with a typical content of 57.6% of 1, the bacitracin and lignosulfonic acids become. It is completely soluble in water, lignin preferably at a pH of about 2 to 7.5 and the pH in 30% solution is 7. A typical mixed. At the higher pH values the solution analysis will show: C = 41.6%; H = 5.0%; S = 7.0%; acidified, ie their pH is lowered until precipitation 15 N = 0.5%; Ca = 0.2%; Na = 5.9%; O = 40.0%. entry. At a lower pH, a precipitation Orzane A and S are in the publication "Orzan A" can be formed, just as the lignin is added. to Orzan S. 1956 (Crown Zellerbach Corporation When the bacitracin solution has a pH of less than 5.5 Chemical Products Division) described,
it is preferred to add the lignin in the form of an aqueous solution. 20 coniferous woods, and their main constituent is the pH for precipitation of the complex can vary, calcium lignosulfonate in a ratio of about and, as stated above, generally 96 percent by weight. The average molecular-1 to 6, and it is weighted for maximum precipitation, is about 1000, and it is believed that this constitutes. It is usually preferred to carry out the precipitation about three methoxyl average molecule, five at a pH of about 2-4. Has 25 hydroxyl and two sulfonate groups. Typical acids are suitable for the precipitation, methoxyl content is 8.8%. A typical analysis shows: such as hydrochloric acid, sulfuric acid and the like, C = 61%, H = 6%; S = 2%; Ca = 3%; O = 28%. or acid salts, such as sodium bisulfate, or Kombina- Toranil A is a 50% solution in water, and torations of acid salts and acids, such as. B. Aluminum B is composed of about 94% of calcium minium sulphate and sulfuric acid, ammonium alum and 30 lignosulphonates.

Schwefelsäure u. dgl., die zur Bildung von Nieder- Die Polyfone sind Natrium-Ligninsulfonate mitSulfuric acid and the like

schlagen, die bei einem pH von 4,5 bis 9 leicht löslich unterschiedlichen Mengen von Natriumsulfonatgrup-beat, which at a pH of 4.5 to 9 easily soluble different amounts of sodium sulfonate groups

gemacht werden können, führen. Zur Einstellung pen, beispielsweise Polyfon H 5,8%; Polyfon Ocan be made lead. To set pen, for example Polyfon H 5.8%; Polyphonic O

des gewünschten pH dienen alikalische Verbindungen, 10,9%; Polyfon T 19,7%; Polyfon R 26,9% undthe desired pH is alcalic compounds, 10.9%; Polyphonic T 19.7%; Polyfon R 26.9% and

wie Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Ammonium- 33 Polyfon F 32,8%. Das primäre Rohmaterial istsuch as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium 33 Polyfon F 32.8%. The primary raw material is

hydroxyd, Phosphate, Karbonate, Bikarbonate u. dgl. gereinigtes Fichtenho'lzlignin. Zucker, Hemizellulosenhydroxide, phosphates, carbonates, bicarbonates and similar purified spruce lignin. Sugar, hemicelluloses

Der pH-Wert, dessen bevorzugter Bereich von etwa und andere Abbauprodukte von Zellulose werdenThe pH, which is the preferred range of about and other degradation products of cellulose

6,2 bis 7,5 liegt, hängt von der Art der verwendeten im Verfahren entfernt und sind in den Produkten6.2 to 7.5 depends on the type of used in the process and are removed in the products

Ligninprodukte ab und muß so eingestellt werden, daß nicht vorhanden. Die Polyfone sind im Wasser löslichLignin products and must be adjusted so that they do not exist. The polyphones are soluble in water

eine im wesentlichen vollständige Löslichkeit des 40 und bilden dabei alkalische Lösungen mit einema substantially complete solubility of the 40, thereby forming alkaline solutions with a

Komplexes erhalten wird. Für die Extraktion ver- pH von etwa 8 bis 10,6.Complex is obtained. For the extraction, use a pH of about 8 to 10.6.

wendete polare, nicht vollständig mischbare, orga- Die Bacitracin-Ausgangsstoffe, die in den folgenden nische Lösungsmittel, die für das erfindungsgemäße Beispielen verwendet werden, wurden durch Gärung Verfahren geeignet sind, sind beispielsweise aliphatische eines wäßrigen Nährbodens mit einer bacitracin-Alkohole, Alkarylalkohole, aromatische Alkohole 45 bildenden Kultur von Bacillus subtilis durch unter- und andere Lösungsmittel, die eine besondere Lösungs- getaucht gerührte und durchlüftete Gärung hergestellt, fähigkeit für Bacitracin besitzen. Bevorzugte Lösungs- wie in der USA.-Patentschrift 2 813 061 beschrieben, mittel sind die Butanole, Pentanole, Hexanole, Phenole, Anschließend folgt übliches Filtrieren, um suspendierte Alkarylalkohole u. dgl., beispielsweise Amylalkohol, Festsubstanzen, die zellenartige Überreste einschließen, Cyclohexanol, Benzylalkohol, und das besonders 50 zu entfernen. Das Bacitracin wurde in der in der bevorzugte n-Butanol. Patentschrift beschriebenen Weise nach der »Cup-Festes Bacitracin kann aus der Lösungsmittellösung plate«-Methode geprüft.applied polar, not completely miscible, organic The bacitracin starting materials used in the following Niche solvents which are used for the inventive examples were obtained by fermentation Processes are suitable are, for example, aliphatic an aqueous nutrient medium with a bacitracin alcohol, Alkaryl alcohols, aromatic alcohols 45 forming the culture of Bacillus subtilis by and other solvents that produce a special solution immersed stirred and aerated fermentation, possess ability for bacitracin. Preferred solution as described in US Pat. No. 2,813,061, Medium are the butanols, pentanols, hexanols, phenols, followed by the usual filtration to remove the suspended Alkaryl alcohols and the like, for example amyl alcohol, solid substances that include cell-like residues, Cyclohexanol, benzyl alcohol, and that especially 50 to remove. The bacitracin was in the in the preferred n-butanol. Patent described way after the »Cup-Festes Bacitracin can be tested from the solvent solution plate 'method.

gewonnen werden. Vorzugsweise wird jedoch das Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläu-be won. Preferably, however, the following examples serve to explain

Bacitracin in eine wäßrige Phase extrahiert, indem die terung des erfindungsgemäßen Verfahrens und derBacitracin extracted into an aqueous phase by the sion of the method according to the invention and the

Lösungsmittellösung mit Wasser bei dem bevorzugten 55 erhaltenen Erzeugnisse.Solvent solution with water in the preferred products obtained.

pH von 2 bis 4 zusammengebracht wird. Für das An- . -I₁ pH 2 to 4 is brought together. For the on. -I ₁

säuern können verschiedene saure Verbindungen, BeispielVarious acidic compounds can acidify, for example

wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und 30 g Natrium-Ligninsulfonat (Polyfon F), gelöst insuch as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and 30 g sodium lignin sulfonate (Polyfon F), dissolved in

Zitronensäure, dienen. Zunächst wird das pH der 120 ml Wasser, wurden zu 11 Bacitracinfiltrat (pH 6,7)Citric acid, serve. First, the pH of the 120 ml of water was added to 11 bacitracin filtrate (pH 6.7)

wäßrigen Lösung vorzugsweise auf etwa 5 bis 7 einge- 60 mit 369 Einheiten pro Milliliter zugegeben. Deraqueous solution preferably adjusted to about 5 to 7 with 369 units per milliliter added. Of the

stellt, beispielsweise mit Ammoniumhydroxyd, Na- pH-Wert der Lösung wurde dann mit 18 n-Schwefel-represents, for example with ammonium hydroxide, Na pH value of the solution was then with 18 N sulfur

triumhydroxyd, basischen Anionenaustauscherharzen säure auf 3,5 eingestellt und der gefällte Ligno-trium hydroxide, basic anion exchange resin acid adjusted to 3.5 and the precipitated ligno-

u. dgl. und die Lösung zur Gewinnung von festem Bacitracin-Komplex durch Zentrifugieren gewonnen.and the like, and the solution for recovering solid bacitracin complex was obtained by centrifugation.

Bacitracin konzentriert. Andererseits kann die Folge Die erhaltene Feststubstanz wurde mit WasserBacitracin concentrated. On the other hand, the result can be The solid substance obtained was mixed with water

von Extrahieren des Bacitracins aus dem Lösungsmittel 65 (455 ml), dessen pH bei 3,5 lag, gewaschen. Dieby extracting the bacitracin from solvent 65 (455 ml), the pH of which was 3.5. the

in angesäuerte wäßrige Lösung ein oder mehrere Male gewaschene Festsubstanz wurde dann mit WasserSolid substance washed one or more times in acidified aqueous solution was then washed with water

vor der Gewinnung von festem Bacitracin wiederholt (480 ml) aufgeschlämmt und die AufschlämmungRepeatedly (480 ml) slurried and reslurried before recovering solid bacitracin

werden. mit konzentriertem Ammoniumhydroxyd auf pH 8will. with concentrated ammonium hydroxide to pH 8

eingestellt, um den Ligno-Bacitracin-Komplex löslich zu machen.set to make the ligno-bacitracin complex soluble close.

Die wäßrige Lösung wurde dann mit n^-Butanol (ungefähr 50 ml ) gesättigt und mit B,utanol, das mit Wasser gesättigt war (6 ·- IQQ ml), extrahiert· Dann wurde Wasser (100 ml) zu dem getrennten. Lösungsmittelextrakt (520-rol) zugefügt und der pH-Wert des Gemisches mit 18 η-Schwefelsäure auf 3 eingestellt. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und dieThe aqueous solution was then saturated with n ^ -butanol (approximately 50 ml) and extracted with butanol saturated with water (6 x - IQQ ml). Then water (100 ml) was added to the separated. Solvent extract (520-rol) was added and the pH of the mixture was adjusted to 3 with 18 η-sulfuric acid. The aqueous layer was separated and the

Ein zweiter Teil (150 ml) der mit Harz behandelten Lösung wurde mit 4 n-NH^QH auf pH 8 eingestellt und mit ButanoJ, der mit Wasser gesättigt war (6 · 25 ml) extrahiert. Dann wurde Wa.ss.er (25 ml) zu dem abgetrennten Lösungsmittelextrakt (150 ml) zugefügt und der pH-Wert des Gemisches mit 6 n-HCi auf pH 3 eingestellt. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und die Lösungsmittellösung mjt Wasser, dessen pH bei 3 lag und das mit Butanol gesättigtA second portion (150 ml) of the resin treated solution was adjusted to pH 8 with 4N NH4 QH and extracted with ButanoJ saturated with water (6 x 25 ml). Then Wa.ss.er (25 ml) became too added to the separated solvent extract (150 ml) and the pH of the mixture with 6 N HCl adjusted to pH 3. The aqueous layer was separated and the solvent solution was mixed with water, whose pH was 3 and that was saturated with butanol

sungsmittellösung mit Wasser, dessen pH bei 3 lag io war (6 · 25 nil), extrahiert, Der pH-Wert des wäßrigen und das mitButanol gesättigt war (4 · 100 rnl), extrahiert. Extraktes wurde dann mit dem Anionenaustauscher-solvent solution with water, the pH of which was 3 io (6 x 25 nil), extracted, the pH of the aqueous and which was saturated with butanol (4 x 100 ml), extracted. Extract was then with the anion exchanger

Die wäßrige Lösung (495 ml) wurde dann mit konzentriertem Ammpniumhydroxyd auf pH 8 eingestelltThe aqueous solution (495 ml) was then adjusted to pH 8 with concentrated ammonium hydroxide

und mit n-Butanpl, dej mit Wasser gesättigt war harz auf 5,7 eingesMlt, Das mit den Waschflüssigkeiten vereinigte FÜtrat hatte nach der Harzbehandlung (196 ml) 1180 Einheiten pro Milliliter mit einerand with n-butane, which was saturated with water Resin to 5.7. The filtrate combined with the washing liquids had after the resin treatment (196 ml) 1180 units per milliliter with a

(6 · IQO ml), extrahiert. Dann wurde zu der getrennten 15 Ausbeute von 2,24 g einer weißen Festsubstanz mit Lösungsmittelschicht (570 ml) Wasser (50 ml) züge- 74 000 Bacitracin?in,heiten pro Gramm,
fügt und der pH-Wert des Gemisches mit 18 U-H₂SO₄ Das. unter Verwendung von Orzan A hergestellte(6 x IQO ml), extracted. Then, to the separated yield of 2.24 g of a white solid substance with solvent layer (570 ml), water (50 ml) was added- 74,000 bacitracin? In, units per gram,
adds and the pH of the mixture with 18 UH ₂ SO ₄ Das. made using Orzan A.

auf 3 eingestellt. Die wäßrige Schicht wurde abger hpshgereinigte weiße Bacitracin hatte eine, anfängliche trennt und die Lösjmgsrnittellpsung mit Wasser, Wirksamkeit (Einheiten in Gramm) von 60 000 und dessen pH bei 3 lag und das mit Butanol gesättigt war 20 Prozent Wirksamkeit, die nach den angegebenen (5-5OmI), extrahiert. Stunden bei 110 bis 112° C verblieb, war wie folgtset to 3. The aqueous layer was cleaned off white bacitracin had an initial separates and the solvent solution with water, effectiveness (units in grams) of 60,000 and whose pH was 3 and that saturated with butanol was 20 percent potency, according to the stated (5-5OmI), extracted. Hours left at 110 to 112 ° C was as follows

Die wäßrige. Schicht wurde dann auf pH 6,2 eingestellt, wobei 3,2 g eines stark basischen quaternären Aminanionenaustauscherharzes in der Hydroxylfprrn (Amberlite IRA-40Q) verwendet wurden. Das Filtrat + Waschflüssigkeiten wurden im Vakuum konzen? triert, um das Lösungsmittel zu entfernen, Die farblose Lösung (400 ml) zeigte bei diesem Punkt 405 Einheiten prq Milliliter mit einer Gesamtausbeute von 44°/q. Eine Hälfte dieser Lösung wurde lyophüisiert, wobei 0,98 g einer weißen Festsubstanz erhalten wurde, mitThe watery one. Layer was then adjusted to pH 6.2, 3.2 g of a strongly basic quaternary amine anion exchange resin in the hydroxyl form (Amberlite IRA-40Q) were used. The filtrate + Washing liquids were concentrated in a vacuum? trated to remove the solvent, The colorless Solution (400 ml) at this point showed 405 units per square milliliter with an overall yield of 44 ° / q. One half of this solution was lyophilized to give 0.98 g of a white solid with

Stunden 52Hours 52

6 Stunden 456 hours 45

4 Stunden 494 hours 49

24 Stunden 2024 hours 20

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird mit großer Ausbeute ein stabiles, hochgereinigtes, weißes, pharmazeutisches Bacitracin gewönnen, das eine hohe Wirksamkeit hat. Im Endprodukt sind keine farbigen Verunreinigungen vorhanden.According to the process according to the invention, a stable, highly purified, white, get pharmaceutical bacitracin, which has high potency. There are no colored ones in the end product Impurities present.

3535

78 000 Bacitracin-Einheiten pro Gramm, was einer Gesamtausbeute van 41,5% entspricht.78,000 bacitracin units per gram, which corresponds to an overall yield of 41.5%.

Example 2

90 g Ammonium-Ligninsulfqnat (Orzan A) wurden zu 9000 mlBacitracinfiltrat (pH 6,7) pit 318 Einheiten pro Miniliter zugefügt. Die Lösung wurde dann mit 6 n-HCJ auf pH 3,0 eingestellt und der gefällte Lignor Baeitracin-Komplex durch Setzenlassen und Dekan? 40 tieren bei 40° C gewonnen, Die erhaltene Festsupstanz wurde mit Wasser zu einem dünnen Brei aufgeschlämmt und das pH der Aufschlämmung mit 4 n-Ammoniumhydroxyd auf 6,5 eingestellt, um den Ligno-BacitracinrKpmplex löslich zu machen. Es wurden 400 g eines löslich gemachten Konzentrates mj.t 320Q Einheiten pro Gramm erhalten.90 g of ammonium lignin sulfate (Orzan A) were to 9000 ml bacitracin filtrate (pH 6.7) pit 318 units added per miniliter. The solution was then adjusted to pH 3.0 with 6N HCI and the precipitated lignor Baeitracin complex by letting sit and dean? 40 animals obtained at 40 ° C, The solid substance obtained was slurried into a thin paste with water and the pH of the slurry is adjusted to 6.5 with 4N ammonium hydroxide to reduce the pH Ligno-BacitracinrKpmplex to make soluble. It 400 g of a solubilized concentrate with a volume of 320Q units per gram were obtained.

Ein Teil (200 g) des löslich gemachten Konzentrates, das hei der ersten Fpungsstufe erhalten worden war, wurde zur Herstellung von gereinigtem Bacitracin verwendet. Das pH des löslich gemachten Konzentrates (200 g) wurde mit 4 H-NH₄QH auf 8 eingestellt und mit Butanol, das mit Wasser gesättigt war (6 · 50 ml), extrahiert. Dann wurde Wasser (50 ml) zu dem abgetrennten Lösungsmittelextrakt (300 ml) gegeben und der pH-Wert des Gemisches mit 6 n-HCl auf 3 eingestellt. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt und mit Wasser, dessen pH bei 3 lag und das mit Butanol (5 · 5Q ml) gesättigt war, extrahiert, Der pH-Wert des wäßrigen Extraktes wurde dann mit stark basischem ^.niopenaustauscherharz in der Hydroxylf orm auf 5,7 eingestellt. Das mit den Wasche flüssigkeiten vereinigte Filtrat hatte nach der BeA portion (200 g) of the solubilized concentrate obtained from the first stage was used to make purified bacitracin. The pH of the solubilized concentrate (200 g) was _{adjusted to 8 with 4 H-NH 4} QH and extracted with butanol saturated with water (6 x 50 ml). Then water (50 ml) was added to the separated solvent extract (300 ml) and the pH of the mixture was adjusted to 3 with 6N HCl. The aqueous layer was separated and extracted with water, the pH of which was 3 and which was saturated with butanol (5 x 50 ml) , 7 set. The filtrate combined with the washing liquids had after the loading

Claims

Patent claims:

1. Process for the production of highly purified white bacitracin using a bacitracin solution obtained by fermentation of an aqueous Culture medium of a bacitracin-forming culture was produced, characterized in that, that an aqueous solution of bacitracin and an alkali-metal-soluble ligmn-low-gloss of alkali lignin and Lignin sulfate is formed and this solution with a polar, organic solvent that is not completely water-miscible is extracted.

2. The method according to claim 1, characterized in that that a compound of bacitracin and the alkali-soluble lignin precipitant precipitated is, the precipitate is separated and made alkaline in the aqueous medium to the Nieder ^ blow to solve.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that after making the alkaline Precipitation in an aqueous medium, the bacitracin from it with an incompletely miscible with water, pqlaren, organic solvent is extracted.

4. The method according to claim 1 to. 3, characterized: that the bacitracin from the Solvent phase extracted by means of acidified water and ge? will wpnnen.

5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that for the solubilization of the Precipitate the pH of the aqueous medium to a value in the range from about 4.5 to 9, preferably from about. 5 to 7, we set 4,

handJung with resin (330 ml) 1.410 units _pr p

Milliliters with a yield of 72.7 ° / _{square meter} , one part

(150 ml) of this solution was lyophilized, where 3 g of publications drawn in Betrapht:

a white festival subsection was obtained with 65 QQO Deutsche Auslegeschriften No. 1026 484.1Q79 278,

Bacitracin units per gram 1116 347,

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