DE1216009B

DE1216009B - Method for breeding differentiated root tissue

Info

Publication number: DE1216009B
Application number: DEM62717A
Authority: DE
Inventors: Dipl-Biol Dr Harald Metz; Dr Hermann Lang
Original assignee: E Merck AG
Current assignee: Merck KGaA
Priority date: 1964-10-10
Filing date: 1964-10-10
Publication date: 1966-05-05

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLANDFEDERAL REPUBLIC OF GERMANY

DEUTSCHESGERMAN

PATENTAMTPATENT OFFICE

AUSLEGESCHRIFTEDITORIAL

Int. α.:Int. α .:

AOInAOIn

Deutschem.: 451-5/00German: 451-5 / 00

Nummer: 1216 009Number: 1216 009

Aktenzeichen: M 62717IV a/451File number: M 62717IV a / 451

Anmeldetag: 10. Oktober 1964Filing date: October 10, 1964

Auslegetag: 5. Mai 1966Opening day: May 5, 1966

Die Züchtung von Pflanzen in Nährlösungen hat in letzter Zeit an Bedeutung gewonnen. Besonderes Interesse kommt der Züchtung von Pflanzengeweben, z. B. Wurzelgewebe, in Nährlösungen zu, da die Inhaltsstoffe beispielsweise der Wurzeln auf diese Weise biosynthetisch in technischem Maßstab erzeugt und vielseitig, z. B. als Drogen zur Bereitung von Pharmazeutika, verwertet werden können. Es sind eine Reihe von Publikationen bekannt, nach denen Wurzelgewebe in Nährlösungen gezüchtet werden können. Jedoch weisen die bisher bekannten Verfahren erhebliche Nachteile auf. Zum Teil sind bei diesen Verfahren die Wachstumszeiten sehr lang bzw. müssen teure voll definierte Substrate angewandt werden oder können die in Nährlösung gezüchteten Gewebekulturen nicht beliebig lange weitergezüchtet werden, so daß eine technische Verwertung nicht in Frage kommt. Bei den meisten bekannten Verfahren entstehen außerdem nur undifferenzierte Zellgewebe, die häufig — im Gegensatz zu differenziertem Gewebe — die gewünschten Inhaltsstöffe nicht aufbauen können.Growing plants in nutrient solutions has recently become more important. Special There is interest in the cultivation of plant tissues, e.g. B. root tissue, in nutrient solutions too, as the ingredients for example the roots are produced in this way biosynthetically on an industrial scale and versatile, e.g. B. can be used as drugs for the preparation of pharmaceuticals. There are a number of them known from publications according to which root tissue can be grown in nutrient solutions. However the previously known methods have considerable disadvantages. In some of these procedures, the Very long growth times or expensive fully defined substrates have to be used or can be used the tissue cultures grown in nutrient solution are not cultivated indefinitely, so that a technical recovery is out of the question. In most of the known processes only arise undifferentiated cell tissue, which, in contrast to differentiated tissue, is often the desired Ingredients cannot build up.

Es wurde nun gefunden, daß man ausgezeichnete Ausbeuten an differenziertem Wurzelgewebe mit wertvollen Inhaltsstoffen nach kurzen Wachstumszeiten erhält, wenn man Wurzelsegmente in Submerskultur weiterzüchtet.It has now been found that excellent yields of differentiated root tissue are obtained with valuable Ingredients obtained after short growth times when root segments are cultivated in submerged form continues to breed.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Züchtung von differenziertem Wurzelgewebe, das darin besteht, daß man Wurzelabschnitte in einer Nährlösung den Bedingungen einer zur Vermehrung von Mikroorganismen üblicherweise angewandten Submerskultur unterwirft.The present invention accordingly provides a method for growing differentiated Root tissue, which consists in placing sections of roots in a nutrient solution under the conditions of a submerged culture commonly used for the reproduction of microorganisms.

Für das Verfahren nach der Erfindung können Wurzelabschnitte, die ein Wachstumszentrum besitzen (Wurzelspitzen) oder Wurzelabschnitte ohne intaktes Wachstumszentrum als Ausgangsmaterial verwendet werden. Hierbei sind Wurzelsegmente behebiger, insbesondere höherer Pflanzen, deren Wurzeln technisch verwertbare Verbindungen synthetisieren, als Ausgangsmaterial geeignet. Das Ausgangsmaterial kann in an sich bekannter Weise, z. B. durch Keimung von an der Oberfläche sterilisierten Samen, anschließende keimfreie Anzucht der jungen Pflanzen auf festen oder flüssigen Nährsubstraten und keimfreie Entnahme von Wurzelstücken erhalten werden. Beispielsweise sind Wurzelabschnitte von etwa 1 bis etwa 100 mm, vorzugsweise 5 bis 10 mm Länge zur Weiterzüchtung nach dem Verfahren der Erfindung geeignet.For the method according to the invention, root sections which have a growth center can be used (Root tips) or root sections without an intact growth center are used as starting material will. Here root segments are more important, especially higher plants whose roots are technical synthesize usable compounds, suitable as starting material. The starting material can in a manner known per se, for. B. by germination of surface sterilized seeds, subsequent germ-free cultivation of the young plants on solid or liquid nutrient substrates and germ-free removal of root pieces can be obtained. For example, are Root sections from about 1 to about 100 mm, preferably 5 to 10 mm in length for further cultivation suitable according to the method of the invention.

Die Wurzelabschnitte werden hierbei in einer Nährlösung unter kräftiger Bewegung und Belüftung den an sich zur Vermehrung von Mikroorganismen angewandten Bedingungen einer Submerskultur aus-Verfahren zur Züchtung von differenziertem
WurzelgewebeThe root sections are here in a nutrient solution with vigorous movement and aeration under the conditions of a submerged culture used per se for the multiplication of microorganisms
Root tissue

Anmelder:Applicant:

E. Merck Aktiengesellschaft,E. Merck Aktiengesellschaft,

Darmstadt, Frankfurter Str. 250Darmstadt, Frankfurter Str. 250

Als Erfinder benannt:
Dipl.-Biol. Dr. Harald Metz,
Dr. Hermann Lang, DarmstadtNamed as inventor:
Dipl.-Biol. Dr. Harald Metz,
Dr. Hermann Lang, Darmstadt

gesetzt. Die Nährlösung enthält die aus der Züchtung von Mikroorganismen bekannten Bestandteile, wie beispielsweise eine oder mehrere Kohlenstoffquellen,set. The nutrient solution contains the components known from the cultivation of microorganisms, such as for example one or more carbon sources,

z. B. einen Zucker wie Saccharose, Glucose, Maltose, sowie Stickstoff-, Phosphor- und Schwefelquellen, vorzugsweise die entsprechenden Salze wie Nitrate, Phosphate, Sulfate, z. B. Calciumnitrat, Ammoniumphosphat, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat und Spurenelemente, vorzugsweise Salze z. B. der Elemente Eisen, Kupfer, Magnesium, Titan, beispielsweise Sulfate, Halogenide, insbesondere Chloride, Nitrate, Acetate, Citrate wie Eisen(III)-citrat oder Magnesiumsulfat. Ferner kann der Zusatz von essentiellen organischen Stoffen, z. B. von Aminosäuren, wie Arginin, Alanin oder Glycin, und/oder Vitaminen, wie Vitamin B₁, sowie gegebenenfalls von Wuchsstoffen, wie Auxinen und/oder Kinetinen, z. B. 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure oder /J-Indolylessigsäure, vorteilhaft sein. Diese Stoffe können gegebenenfalls ganz oder teilweise durch komplexe Substrate, wie Malzextrakt, Hefeextrakt, Cocosnußmilch, Cornsteep und andere geeignete Wirkstoffe enthaltende Gemische ersetzt werden. Außerdem kann der Zusatz von viskositätssteigernden Stoffen, z. B. mit Wasser mischbaren natürlichen oder synthetischen Polymeren, insbesondere Polysacchariden wie Agar-Agar oder Polypeptiden, wie Gelatine, oder mit Wasser mischbaren, z. B. Hydroxylgruppen enthaltenden synthetischen Polymeren, wie Polyvinylalkohol, bei der Züchtung von Wurzelgewebe nach der Erfindung günstig sein. In manchen Fällen kann man auch Vorprodukte der gewünschten, von dem Wurzelgewebe zu synthetisierenden Endprodukte der Nährlösung zugeben und damit die Ausbeute an Endprodukt steigern. Es läßt sich z. B. ein hoher Gehalt an Scopolamin in nach dem vorliegenden Verfahren gezüchteten Wurzelseg-z. B. a sugar such as sucrose, glucose, maltose, and nitrogen, phosphorus and sulfur sources, preferably the corresponding salts such as nitrates, phosphates, sulfates, z. B. calcium nitrate, ammonium phosphate, potassium phosphate, magnesium sulfate and trace elements, preferably salts z. B. the elements iron, copper, magnesium, titanium, for example sulfates, halides, in particular chlorides, nitrates, acetates, citrates such as iron (III) citrate or magnesium sulfate. Furthermore, the addition of essential organic substances, e.g. B. of amino acids such as arginine, alanine or glycine, and / or vitamins such as vitamin B ₁ , and optionally of growth substances such as auxins and / or kinetins, z. B. 2,4-dichlorophenoxyacetic acid or / I-indolyl acetic acid, be advantageous. These substances can optionally be replaced in whole or in part by complex substrates such as malt extract, yeast extract, coconut milk, cornsteep and mixtures containing other suitable active ingredients. In addition, the addition of viscosity-increasing substances such. B. water-miscible natural or synthetic polymers, especially polysaccharides such as agar or polypeptides such as gelatin, or water-miscible, z. B. hydroxyl-containing synthetic polymers, such as polyvinyl alcohol, be beneficial in the cultivation of root tissue according to the invention. In some cases it is also possible to add preliminary products of the desired end products to be synthesized from the root tissue to the nutrient solution and thus increase the yield of the end product. It can be z. B. a high content of scopolamine in root segments grown according to the present process

609 567/510609 567/510

3 43 4

menten von Hyoscyamus niger erzielen, wenn der mente in 15-1-Fermentern mit 101 Füllung bei EinleitenAchieve ments of Hyoscyamus niger when the mente is introduced into 15-1 fermenters with 101 filling

Nährlösung Ornithin zugesetzt wird. von etwa 5001 Luft pro Stunde und Rührgeschwindig-Ornithine nutrient solution is added. of about 5001 air per hour and stirring speed

Es können hierbei exakt definierte Nährlösungen, keiten von etwa 500 Umdr./min gezüchtet werden.Exactly defined nutrient solutions can be grown at speeds of around 500 revolutions per minute.

z. B. Nährlösungen nach I. Reinert und P. R. Die Durchströmungsgeschwindigkeit der Luft undz. B. Nutrient solutions according to I. Reinert and P. R. The flow rate of the air and

White, Physiologia Plantarum, Band 9, S. 177 5 die Rührgeschwindigkeit sind im übrigen natürlichWhite, Physiologia Plantarum, Volume 9, p. 177 5 the stirring speed are natural for the rest

(1956) angewandt werden. Jedoch können für das von den Verfahrensbedingungen, z. B. der Gestalt des(1956) can be applied. However, for the process conditions, e.g. B. the shape of the

vorliegende Verfahren auch in bezug auf die Zusam- Gefäßes und des Rührers, der Löslichkeit von Sauer-present process also with regard to the joint vessel and the stirrer, the solubility of acidic

mensetzung nur teilweise oder nicht genau definierte stoff in der Nährlösung usw., abhängig.Composition only partially or not precisely defined substance in the nutrient solution, etc., dependent.

Nährlösungen verwendet werden, die bilige Abfall- Die Nährlösung wird nach dem Verfahren derNutrient solutions are used, the cheap waste- The nutrient solution is made according to the method of

stoffe der Naturstoffraffination enthalten. io Erfindung so stark bewegt und belüftet, daß die alscontain substances from natural product refining. io invention so strongly moved and ventilated that the as

Die Konzentration der Komponenten in der Nähr- Ausgangsmaterial verwendeten Wurzelsegmente Seitenlösung liegt vorteilhaft in den folgenden Größen- wurzeln anlegen, die — in Abhängigkeit vom Grad bereichen: etwa 0,1 bis etwa 20%= vorzugsweise 0,5 der jeweiligen mechanischen Beanspruchung — zu bis 5%, für Kohlenstoffverbindungen, jeweils etwa einer bestimmten Größe, wie etwa 2 bis 20 mm, z. B. 0,01 bis etwa 5 %, vorzugsweise 0,1 bis 1 %, für Stick- 15 etwa 5 mm Länge, auswachsen und sich dann von der stoffsalze, Schwefelsalze bzw. Phosphorsalze, etwa Hauptwurzel ablösen. Sofern die ursprünglich ein-10~⁶ bis 1 % für Spurenelemente, etwa 10~⁶ bis 1 %> gesetzten Wurzelabschnitte ein intaktes Wachstumsz. B. IO-³ oder 10-*% für essentielle organische Stoffe Zentrum besitzen, wächst auch die Hauptwurzel in der (z. B. Aminosäuren oder Vitamine), etwa 10~^β bis 1 %, Nährlösung weiter, wobei sich von dieser Wurzel nicht vorzugsweise etwa 10-⁴%, für Wuchsstoffe, etwa 0,1 20 nur die Seitenwurzeln, sondern auch das der Wurzeibis etwa 10%, vorzugsweise etwa 0,5 bis 2%, für spitze entgegengesetzte Ende — meist an den Stellen, viskositätssteigernde Stoffe. Bei Verwendung von an denen sich bereits Seitenwurzeln abgetrennt komplexen Substraten werden diesem Konzentrationen haben — ebenfalls ablöst. Die Wurzelkultur ist im von etwa 0,1 bis 20%* vorzugsweise 0,5 bis 3 %, ein- allgemeinen nach etwa einem halben Tag bis 20 Tagen gesetzt. 25 ausgewachsen und besteht dann aus einer SuspensionThe concentration of the components in the root segments side solution used in the nutrient starting material is advantageously in the following size roots, which range - depending on the degree: about 0.1 to about 20% = preferably 0.5 of the respective mechanical stress - up to 5%, for carbon compounds, each of about a certain size, such as about 2 to 20 mm, e.g. B. 0.01 to about 5%, preferably 0.1 to 1%, for stick 15 about 5 mm in length, grow out and then detach from the substance salts, sulfur salts or phosphorus salts, such as the main root. If the originally a -10 ~ ⁶ to 1% for trace elements, about 10 ~ ⁶ to 1%> set root sections an intact growth zone. B. IO- ³ or 10 - *% for essential organic substances have the center, the main root also grows in the ^{nutrient solution (e.g. amino acids or vitamins), about 10 ~ β} to 1%, whereby this root does not grow preferably about 10- ^4%, for growth substances, about 0.1 20 only the lateral roots, but also that of Wurzeibis about 10%, preferably about 0.5 to 2%, for top opposite end - usually at the sites, viscosity-increasing substances. When using complex substrates on which side roots have already been severed, these will have concentrations - also peeled off. The root culture is set in about 0.1 to 20%, preferably 0.5 to 3%, generally after about half a day to 20 days. 25 fully grown and then consists of a suspension

Eine erhöhte Konzentration einiger der Kompo- etwa gleich langer Wurzelabschnitte in der Nährlösung,An increased concentration of some of the root sections of roughly the same length in the nutrient solution,

nenten, z. B. von Wuchsstoffen, Aminosäuren oder Die wie angegeben gezüchteten Gewebe sind morpho-nents, e.g. B. of growth substances, amino acids or The tissues grown as indicated are morpho-

komplexen Substraten, kann unter Umständen das logisch und anatomisch eindeutig als Wurzeln zucomplex substrates, this can be logically and anatomically clear as roots

Wachstum der Wurzeln in der Nährlösung hemmen. erkennen, lediglich die Ausbildung von WurzelhaarenInhibit the growth of the roots in the nutrient solution. recognize only the formation of root hairs

Jedoch gelangt man andererseits auch durch Ver- 30 unterbleibt in der Regel. Die abgelösten SeitenwurzelnOn the other hand, however, one can also get there by means of 30 as a rule omits. The detached lateral roots

änderung der Konzentrationen einiger Bestandteile sind durch die Bildung und Abtrennung von neuenChanges in the concentrations of some components are due to the formation and separation of new ones

zu besonders vorteilhaften Varianten des Verfahrens. Seitenwurzeln vermehrungsfähig und lassen sich ähn-to particularly advantageous variants of the method. Lateral roots are capable of reproduction and can be similar

So erhält man z. B. durch erhöhte oder erniedrigte lieh wie Mikroorganismen in weiteren Nährlösungen Zusätze von Wuchsstoffen oder essentiellen orga- beliebig lange weiterkultivieren, ohne daß Degenenischen Stoffen Wurzelkulturen, die besonders viel 35 ration eintritt. So konnte z. B. eine Wurzelkultur von Wurzelmassen enthalten, jedoch zur Weiterimpfung Hyoscyamus niger mehr als siebzigmal in wöchentweniger geeignet sind. Man wird also diese Aus- lichem Abstand weiter geimpft werden, ohne daß ihre führungsform des Verfahrens dann anwenden, wenn Eigenschaften sich geändert hätten. Damit ist es mögeine größere Menge Wurzelmasse herangezüchtet lieh, Wurzeln nach dem Verfahren der Erfindung in wird, jedoch keine Weiterimpfung mehr erfolgen 40 großtechnischem Maßstab in Submerskultur zu züchsoll. Durch Zusatz von viskositätssteigernden Stoffen ten. Hierin liegt der besondere Vorteil des Verfahrens wie Agar-Agar werden ebenfalls Kulturen erzielt, die gemäß der Erfindung gegenüber den bisher bekannten eine erhöhte Wurzelmasse aufweisen und zusätzlich Verfahren zur Züchtung von Wurzelgewebe in Nährnoch freie Zellen und Zellkomplexe in der Nährlösung lösung,
enthalten. 45 Aus differenzierten Wurzelgeweben, die nach demSo you get z. B. by increased or decreased borrowed such as microorganisms in further nutrient solutions, additions of growth substances or essential orga- continue to cultivate as long as you like, without degenerative substances root cultures, which occurs particularly much. So could z. B. contain a root culture of root masses, but are suitable for further vaccination Hyoscyamus niger more than seventy times in a week less. This spacing will therefore be further inoculated without using the method used when properties have changed. This means that a larger amount of root mass may be grown, roots are to be grown in accordance with the method of the invention, but no further inoculation is to be carried out on an industrial scale in submerged culture. Th by adding viscosity-increasing substances. Herein lies the particular advantage of the method such as agar-agar, cultures are also achieved which, according to the invention, have an increased root mass compared to the previously known ones and, in addition, methods for growing root tissue in nutrient cells and cell complexes in the Nutrient solution,
contain. 45 From differentiated root tissues, which according to the

Die als Ausgangsmaterial verwendeten Wurzel- Verfahren der Erfindung in Submerskultur gezüchtet abschnitte werden in der Nährlösung in für die Sub- wurden, können technisch verwertbare Inhaltsstoffe, merskultur geeigneten Gefäßen, z. B. in Schüttelkolben Stoffwechselprodukte oder Enzyme gewonnen werden, oder Kleinfermentern, unter guter Belüftung bei etwa Die gezüchteten Wurzelsegmente enthalten diese 10 bis 50⁰C, vorzugsweise bei 20 bis 30°C, insbeson- 5o Stoffe in gleicher oder in vielen Fällen in höherer dere bei etwa 28 ⁰C, durch Rühren oder Schütteln Konzentration als das Ausgangsmaterial. Gegebenenbewegt. Es muß sowohl im Schüttelkolben als auch falls können die von den Wurzelzellen biosynthetisch im Fermenter nach den an sich für die Submerskultur erzeugten Stoffe auch in die Nährlösung übergehen von Bakterien bekannten Methoden für eine aus- und aus dieser isoliert werden,
reichend starke Belüftung der Kultur gesorgt werden. 55 Als Ausgangsmaterial für das vorstehend beschrie-Die durch die Bewegung gleichzeitig verursachte bene Verfahren können z. B. Wurzelsegmente mit starke mechanische Beanspruchung der Wurzeln ist oder ohne intaktes Wachstumszentrum von Pflanzen eine weitere Voraussetzung für die Durchführung des verwendet werden, aus denen folgende technisch verVerfahrens nach der Erfindung. Die Schüttelfrequenz wertbare Verbindungen erhalten werden: Alkaloide, wird zweckmäßigerweise z. B. um so höher gewählt, 60 wie Scopolamin (z. B. aus Hyoscyamus niger), CoI-je kleiner das Gefäß bzw, je kleiner die Schüttel- chicin (z. B. aus Colchicum autumnale), Nicotin (z. B. amplitude ist. Zum Beispiel läßt sich das Verfahren in aus Nicotiana tabacum); Vitamine, wie ß-Carotin jeweils zu einem Fünftel mit Nährlösung gefüllten (z. B. aus Daucus carota), Ascorbinsäure (z. B. aus 1000-ml-Schüttelkolben bei etwa hundert Ausschlägen Gladiolus communis); Enzyme, wie Papain (z. B. aus pro Minute und einer Amplitude von etwa 5 cm oder 65 Carica papaya), Peroxidase (z. B. aus Cochlearia in 50-ml-Schüttelkolben bei etwa zweihundert Aus- armoracia); Glykoside, wie Saponin (z. B. aus Saposchlägen pro Minute und einer Amplitude von etwa naria officinalis); Farbstoffe, wie Curcuma (ζ. Β. aus 2 bis 3 cm durchführen. Analog können Wurzelseg- Curcuma longa), Berberin (z. B. aus Berberisvulgaris);The root method of the invention used as starting material are grown in submerged sections in the nutrient solution in for the sub-were, technically usable ingredients, merculture suitable vessels, z. B. in shake flasks metabolic products or enzymes are obtained, or small fermenters, with good ventilation at about The cultivated root segments contain these 10 to 50 ⁰ C, preferably at 20 to 30 ° C, in particular 5o substances in the same or in many cases in higher ones at about 28 ⁰ C, by stirring or shaking concentration as the starting material. Moved given. It must both in the shake flask and if the root cells biosynthetically in the fermenter after the substances generated per se for the submerged culture also pass into the nutrient solution by bacteria known methods for a removal and isolated from this,
sufficient aeration of the culture must be provided. 55 As a starting material for the above-described bene process caused by the movement at the same time, z. B. Root segments with strong mechanical stress on the roots or without an intact growth center of plants is a further prerequisite for the implementation of the, from which the following technical process according to the invention is used. The shaking frequency evaluable compounds are obtained: alkaloids, is expediently z. B. selected the higher, 60 like scopolamine (e.g. from Hyoscyamus niger), CoI-the smaller the vessel or the smaller the shaking chicin (e.g. from Colchicum autumnale), nicotine (e.g. amplitude. For example, the method can be found in Nicotiana tabacum); Vitamins, such as ß-carotene, each filled to one fifth with nutrient solution (e.g. from Daucus carota), ascorbic acid (e.g. from 1000 ml shake flasks with about one hundred rashes of Gladiolus communis); Enzymes such as papain (e.g. from per minute and an amplitude of about 5 cm or 65 Carica papaya), peroxidase (e.g. from Cochlearia in 50 ml shake flasks at about two hundred Ausarmoracia); Glycosides such as saponin (e.g. from sapo beats per minute and an amplitude of about naria officinalis); Colorings, such as turmeric (ζ. Β. From 2 to 3 cm. Analog can be used root seg- Curcuma longa), berberine (eg from Berberis vulgaris);

Gerbstoffe (ζ. B. aus Bergenia crassifolia und Rumex hymenosepalus); Aminosäuren, wie Tyrosin (z. B. aus Cucurbita pepo); Bitterstoffe, wie Panaquüon (z. B. aus Panax quinquefolius), Podophyllin (z. B. aus Podophyllub peltatum); Zucker, Polysaccharide und verwandte Verbindungen, wie Phytin (z. B. aus Dahlia variabilis), Inulin (z. B. aus Helianthus tuberosus).Tannins (ζ. B. from Bergenia crassifolia and Rumex hymenosepalus); Amino acids such as tyrosine (e.g. from Cucurbita pepo); Bitter substances, such as panaquuone (e.g. from Panax quinquefolius), Podophyllin (e.g. from Podophyllub peltatum); Sugars, polysaccharides and related compounds such as phytin (e.g. from Dahlia variabilis), inulin (e.g. from Helianthus tuberosus).

For example

Von einer keimfrei angezüchteten Pflanze von Hyoscyamus niger wird die Wurzel abgeschnitten und in eine Nährlösung der folgenden Zusammensetzung übertragen:The roots of a Hyoscyamus niger plant grown aseptically are cut off and transferred to a nutrient solution of the following composition:

2,0% Saccharose2.0% sucrose

0,02% Ca(NOa)₂-4 H₂O0.02% Ca (NOa) ₂ -4 H ₂ O

0,04% KNO₃ 0.04% KNO ₃

0,04 % KH₂PO₄ 0,02% MgSO₄-7 H₂O0.04% KH ₂ PO ₄ 0.02% MgSO ₄ -7 H ₂ O

0,02% Na₂SO₄ 0.02% Na ₂ SO ₄

5 mg/1 Eisen-III-citrat5 mg / l ferric citrate

Die Wurzel wächst langsam weiter und kann jederzeit als Ausgangskultur für Submerskulturen dienen. Zur Anzucht einer Submerskultur werden etwa zehn bis zwanzig Wurzelstücke von 1 cm Länge, die z. T. kein intaktes Wachstumszentrum besitzen, abgeschnitten und in einen 1-1-Erlenmeyerkolben übertragen, der 200 ml Nährlösung enthält. Die Nährlösung entspricht der obengenannten mit Zusatz von 0,2% Malzextrakt und 0,2 mg/1 2,4-Dichlor-phenoxyessigsäure. Die Kultur wächst auf der Schüttelmascbine bei 28⁰C im Dunkeln und ist nach 7 bis 12 Tagen ausgewachsen. Sie wird weitergeimpft, indem man mit dem Inhalt eines Kolbens fünf neue Kolben mit je 200 ml Nährlösung beimpft. Diese Kolben sind nach 5 bis 7 Tagen gut angewachsen und können weitergeimpft werden. Die größte Wurzelmenge ist nach 7 bis 10 Tagen erreicht. Zur Gewinnung der Wurzelmasse wird der Inhalt eines Kolbens abfiltriert; man erhält aus 200 ml Wurzelkultur 7 g Wurzeln mit 300 mg Trockensubstanz. Der Scopolamingehalt beträgt 0,2 % der Trockensubstanz.The root continues to grow slowly and can serve as a starting culture for submerged cultures at any time. To grow a submerged culture, about ten to twenty pieces of root 1 cm in length, which z. T. have no intact growth center, cut off and transferred to a 1-1 Erlenmeyer flask containing 200 ml of nutrient solution. The nutrient solution corresponds to the above with the addition of 0.2% malt extract and 0.2 mg / 1 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. The culture grows on the shaking machine at 28 ^° C. in the dark and is fully grown after 7 to 12 days. It is further vaccinated by inoculating five new flasks with 200 ml of nutrient solution each with the contents of one flask. These cobs will have grown well after 5 to 7 days and can be vaccinated further. The largest number of roots is reached after 7 to 10 days. To obtain the root mass, the contents of a flask are filtered off; 7 g of roots with 300 mg of dry matter are obtained from 200 ml of root culture. The scopolamine content is 0.2% of the dry substance.

Example 2

Eine analog Beispiel 1 angezüchtete Kultur wird in einen Kleinfermenter mit 101 der in Beispiel 1 angegebenen Nährlösung geimpft; der Fermenter läuft unter Belüftung und Rühren bei mäßiger Drehzahl im Dunkeln bei 28 ⁰C. Nach 11 Tagen Laufzeit erhält man 177 g Wurzeln mit 1,65 g Trockensubstanz mit 0,3 % Scopolamin.A culture grown analogously to Example 1 is inoculated into a small fermenter with 101 of the nutrient solution specified in Example 1; the fermenter runs with aeration and stirring at moderate speed in the dark at 28 ^° C. After a running time of 11 days, 177 g of roots with 1.65 g of dry matter with 0.3% scopolamine are obtained.

Example 3

Von einer keimfrei angezüchteten Pflanze von Hyoscyamus niger wird die Wurzel abgeschnitten und diese in der in Beispiel 1 angegebenen Nährlösung, die jedoch zusätzlich 0,1% Agar-Agar enthält, in Submerskultur, wie in Beispiel 1 angegeben, weitergezüchtet. Die bei der Weiterimpfung verwendeten Nährlösungen entsprechen jeweils der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung, enthalten jedoch zusätzlich 0,1 % Agar-Agar. Man erhält aus 200 ml Wurzelkultur 13 g Wurzeln mit 560 mg Trockensubstanz mit 0,2 % Scopolamin.The roots of a Hyoscyamus niger plant grown aseptically are cut off and this in the nutrient solution specified in Example 1, which, however, additionally contains 0.1% agar-agar, in Submerged culture, as indicated in Example 1, grown further. The ones used for further vaccination Nutrient solutions correspond in each case to the composition given in Example 1, but contain in addition 0.1% agar-agar. From 200 ml of root culture, 13 g of roots with 560 mg of dry matter are obtained with 0.2% scopolamine.

Claims

Patent claims:

1. A method for growing differentiated root tissue, characterized in that that one root sections in a nutrient solution the conditions of a for propagation Submerged culture commonly used by microorganisms.

2. A method for growing differentiated root tissue according to claim 1, characterized in that that the nutrient solution is so strongly moved and ventilated that it is used as the starting material The root sections used form side roots and these develop as a result of the movement Remove the mechanical stress caused by the root sections.

3. A method for growing differentiated root tissue according to claim 1, characterized in that that the nutrient solution contains viscosity-increasing substances, preferably agar-agar.

4. A method for growing differentiated root tissue according to claim 1, characterized in that that one uses root sections without an intact growth center.