DE1216009B - Verfahren zur Zuechtung von differenziertem Wurzelgewebe - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

AOIn

Deutschem.: 451-5/00

Nummer: 1216 009

Aktenzeichen: M 62717IV a/451

Anmeldetag: 10. Oktober 1964

Auslegetag: 5. Mai 1966

Die Züchtung von Pflanzen in Nährlösungen hat in letzter Zeit an Bedeutung gewonnen. Besonderes Interesse kommt der Züchtung von Pflanzengeweben, z. B. Wurzelgewebe, in Nährlösungen zu, da die Inhaltsstoffe beispielsweise der Wurzeln auf diese Weise biosynthetisch in technischem Maßstab erzeugt und vielseitig, z. B. als Drogen zur Bereitung von Pharmazeutika, verwertet werden können. Es sind eine Reihe von Publikationen bekannt, nach denen Wurzelgewebe in Nährlösungen gezüchtet werden können. Jedoch weisen die bisher bekannten Verfahren erhebliche Nachteile auf. Zum Teil sind bei diesen Verfahren die Wachstumszeiten sehr lang bzw. müssen teure voll definierte Substrate angewandt werden oder können die in Nährlösung gezüchteten Gewebekulturen nicht beliebig lange weitergezüchtet werden, so daß eine technische Verwertung nicht in Frage kommt. Bei den meisten bekannten Verfahren entstehen außerdem nur undifferenzierte Zellgewebe, die häufig — im Gegensatz zu differenziertem Gewebe — die gewünschten Inhaltsstöffe nicht aufbauen können.

Es wurde nun gefunden, daß man ausgezeichnete Ausbeuten an differenziertem Wurzelgewebe mit wertvollen Inhaltsstoffen nach kurzen Wachstumszeiten erhält, wenn man Wurzelsegmente in Submerskultur weiterzüchtet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Züchtung von differenziertem Wurzelgewebe, das darin besteht, daß man Wurzelabschnitte in einer Nährlösung den Bedingungen einer zur Vermehrung von Mikroorganismen üblicherweise angewandten Submerskultur unterwirft.

Für das Verfahren nach der Erfindung können Wurzelabschnitte, die ein Wachstumszentrum besitzen (Wurzelspitzen) oder Wurzelabschnitte ohne intaktes Wachstumszentrum als Ausgangsmaterial verwendet werden. Hierbei sind Wurzelsegmente behebiger, insbesondere höherer Pflanzen, deren Wurzeln technisch verwertbare Verbindungen synthetisieren, als Ausgangsmaterial geeignet. Das Ausgangsmaterial kann in an sich bekannter Weise, z. B. durch Keimung von an der Oberfläche sterilisierten Samen, anschließende keimfreie Anzucht der jungen Pflanzen auf festen oder flüssigen Nährsubstraten und keimfreie Entnahme von Wurzelstücken erhalten werden. Beispielsweise sind Wurzelabschnitte von etwa 1 bis etwa 100 mm, vorzugsweise 5 bis 10 mm Länge zur Weiterzüchtung nach dem Verfahren der Erfindung geeignet.

Die Wurzelabschnitte werden hierbei in einer Nährlösung unter kräftiger Bewegung und Belüftung den an sich zur Vermehrung von Mikroorganismen angewandten Bedingungen einer Submerskultur aus-Verfahren zur Züchtung von differenziertem
Wurzelgewebe

Anmelder:

E. Merck Aktiengesellschaft,

Darmstadt, Frankfurter Str. 250

Als Erfinder benannt:
Dipl.-Biol. Dr. Harald Metz,
Dr. Hermann Lang, Darmstadt

gesetzt. Die Nährlösung enthält die aus der Züchtung von Mikroorganismen bekannten Bestandteile, wie beispielsweise eine oder mehrere Kohlenstoffquellen,

z. B. einen Zucker wie Saccharose, Glucose, Maltose, sowie Stickstoff-, Phosphor- und Schwefelquellen, vorzugsweise die entsprechenden Salze wie Nitrate, Phosphate, Sulfate, z. B. Calciumnitrat, Ammoniumphosphat, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat und Spurenelemente, vorzugsweise Salze z. B. der Elemente Eisen, Kupfer, Magnesium, Titan, beispielsweise Sulfate, Halogenide, insbesondere Chloride, Nitrate, Acetate, Citrate wie Eisen(III)-citrat oder Magnesiumsulfat. Ferner kann der Zusatz von essentiellen organischen Stoffen, z. B. von Aminosäuren, wie Arginin, Alanin oder Glycin, und/oder Vitaminen, wie Vitamin B₁, sowie gegebenenfalls von Wuchsstoffen, wie Auxinen und/oder Kinetinen, z. B. 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure oder /J-Indolylessigsäure, vorteilhaft sein. Diese Stoffe können gegebenenfalls ganz oder teilweise durch komplexe Substrate, wie Malzextrakt, Hefeextrakt, Cocosnußmilch, Cornsteep und andere geeignete Wirkstoffe enthaltende Gemische ersetzt werden. Außerdem kann der Zusatz von viskositätssteigernden Stoffen, z. B. mit Wasser mischbaren natürlichen oder synthetischen Polymeren, insbesondere Polysacchariden wie Agar-Agar oder Polypeptiden, wie Gelatine, oder mit Wasser mischbaren, z. B. Hydroxylgruppen enthaltenden synthetischen Polymeren, wie Polyvinylalkohol, bei der Züchtung von Wurzelgewebe nach der Erfindung günstig sein. In manchen Fällen kann man auch Vorprodukte der gewünschten, von dem Wurzelgewebe zu synthetisierenden Endprodukte der Nährlösung zugeben und damit die Ausbeute an Endprodukt steigern. Es läßt sich z. B. ein hoher Gehalt an Scopolamin in nach dem vorliegenden Verfahren gezüchteten Wurzelseg-

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menten von Hyoscyamus niger erzielen, wenn der mente in 15-1-Fermentern mit 101 Füllung bei Einleiten

Nährlösung Ornithin zugesetzt wird. von etwa 5001 Luft pro Stunde und Rührgeschwindig-

Es können hierbei exakt definierte Nährlösungen, keiten von etwa 500 Umdr./min gezüchtet werden.

z. B. Nährlösungen nach I. Reinert und P. R. Die Durchströmungsgeschwindigkeit der Luft und

White, Physiologia Plantarum, Band 9, S. 177 5 die Rührgeschwindigkeit sind im übrigen natürlich

(1956) angewandt werden. Jedoch können für das von den Verfahrensbedingungen, z. B. der Gestalt des

vorliegende Verfahren auch in bezug auf die Zusam- Gefäßes und des Rührers, der Löslichkeit von Sauer-

mensetzung nur teilweise oder nicht genau definierte stoff in der Nährlösung usw., abhängig.

Nährlösungen verwendet werden, die bilige Abfall- Die Nährlösung wird nach dem Verfahren der

stoffe der Naturstoffraffination enthalten. io Erfindung so stark bewegt und belüftet, daß die als

Die Konzentration der Komponenten in der Nähr- Ausgangsmaterial verwendeten Wurzelsegmente Seitenlösung liegt vorteilhaft in den folgenden Größen- wurzeln anlegen, die — in Abhängigkeit vom Grad bereichen: etwa 0,1 bis etwa 20%= vorzugsweise 0,5 der jeweiligen mechanischen Beanspruchung — zu bis 5%, für Kohlenstoffverbindungen, jeweils etwa einer bestimmten Größe, wie etwa 2 bis 20 mm, z. B. 0,01 bis etwa 5 %, vorzugsweise 0,1 bis 1 %, für Stick- 15 etwa 5 mm Länge, auswachsen und sich dann von der stoffsalze, Schwefelsalze bzw. Phosphorsalze, etwa Hauptwurzel ablösen. Sofern die ursprünglich ein-10~⁶ bis 1 % für Spurenelemente, etwa 10~⁶ bis 1 %> gesetzten Wurzelabschnitte ein intaktes Wachstumsz. B. IO-³ oder 10-*% für essentielle organische Stoffe Zentrum besitzen, wächst auch die Hauptwurzel in der (z. B. Aminosäuren oder Vitamine), etwa 10~^β bis 1 %, Nährlösung weiter, wobei sich von dieser Wurzel nicht vorzugsweise etwa 10-⁴%, für Wuchsstoffe, etwa 0,1 20 nur die Seitenwurzeln, sondern auch das der Wurzeibis etwa 10%, vorzugsweise etwa 0,5 bis 2%, für spitze entgegengesetzte Ende — meist an den Stellen, viskositätssteigernde Stoffe. Bei Verwendung von an denen sich bereits Seitenwurzeln abgetrennt komplexen Substraten werden diesem Konzentrationen haben — ebenfalls ablöst. Die Wurzelkultur ist im von etwa 0,1 bis 20%* vorzugsweise 0,5 bis 3 %, ein- allgemeinen nach etwa einem halben Tag bis 20 Tagen gesetzt. 25 ausgewachsen und besteht dann aus einer Suspension

Eine erhöhte Konzentration einiger der Kompo- etwa gleich langer Wurzelabschnitte in der Nährlösung,

nenten, z. B. von Wuchsstoffen, Aminosäuren oder Die wie angegeben gezüchteten Gewebe sind morpho-

komplexen Substraten, kann unter Umständen das logisch und anatomisch eindeutig als Wurzeln zu

Wachstum der Wurzeln in der Nährlösung hemmen. erkennen, lediglich die Ausbildung von Wurzelhaaren

Jedoch gelangt man andererseits auch durch Ver- 30 unterbleibt in der Regel. Die abgelösten Seitenwurzeln

änderung der Konzentrationen einiger Bestandteile sind durch die Bildung und Abtrennung von neuen

zu besonders vorteilhaften Varianten des Verfahrens. Seitenwurzeln vermehrungsfähig und lassen sich ähn-

So erhält man z. B. durch erhöhte oder erniedrigte lieh wie Mikroorganismen in weiteren Nährlösungen Zusätze von Wuchsstoffen oder essentiellen orga- beliebig lange weiterkultivieren, ohne daß Degenenischen Stoffen Wurzelkulturen, die besonders viel 35 ration eintritt. So konnte z. B. eine Wurzelkultur von Wurzelmassen enthalten, jedoch zur Weiterimpfung Hyoscyamus niger mehr als siebzigmal in wöchentweniger geeignet sind. Man wird also diese Aus- lichem Abstand weiter geimpft werden, ohne daß ihre führungsform des Verfahrens dann anwenden, wenn Eigenschaften sich geändert hätten. Damit ist es mögeine größere Menge Wurzelmasse herangezüchtet lieh, Wurzeln nach dem Verfahren der Erfindung in wird, jedoch keine Weiterimpfung mehr erfolgen 40 großtechnischem Maßstab in Submerskultur zu züchsoll. Durch Zusatz von viskositätssteigernden Stoffen ten. Hierin liegt der besondere Vorteil des Verfahrens wie Agar-Agar werden ebenfalls Kulturen erzielt, die gemäß der Erfindung gegenüber den bisher bekannten eine erhöhte Wurzelmasse aufweisen und zusätzlich Verfahren zur Züchtung von Wurzelgewebe in Nährnoch freie Zellen und Zellkomplexe in der Nährlösung lösung,
enthalten. 45 Aus differenzierten Wurzelgeweben, die nach dem

Die als Ausgangsmaterial verwendeten Wurzel- Verfahren der Erfindung in Submerskultur gezüchtet abschnitte werden in der Nährlösung in für die Sub- wurden, können technisch verwertbare Inhaltsstoffe, merskultur geeigneten Gefäßen, z. B. in Schüttelkolben Stoffwechselprodukte oder Enzyme gewonnen werden, oder Kleinfermentern, unter guter Belüftung bei etwa Die gezüchteten Wurzelsegmente enthalten diese 10 bis 50⁰C, vorzugsweise bei 20 bis 30°C, insbeson- 5o Stoffe in gleicher oder in vielen Fällen in höherer dere bei etwa 28 ⁰C, durch Rühren oder Schütteln Konzentration als das Ausgangsmaterial. Gegebenenbewegt. Es muß sowohl im Schüttelkolben als auch falls können die von den Wurzelzellen biosynthetisch im Fermenter nach den an sich für die Submerskultur erzeugten Stoffe auch in die Nährlösung übergehen von Bakterien bekannten Methoden für eine aus- und aus dieser isoliert werden,
reichend starke Belüftung der Kultur gesorgt werden. 55 Als Ausgangsmaterial für das vorstehend beschrie-Die durch die Bewegung gleichzeitig verursachte bene Verfahren können z. B. Wurzelsegmente mit starke mechanische Beanspruchung der Wurzeln ist oder ohne intaktes Wachstumszentrum von Pflanzen eine weitere Voraussetzung für die Durchführung des verwendet werden, aus denen folgende technisch verVerfahrens nach der Erfindung. Die Schüttelfrequenz wertbare Verbindungen erhalten werden: Alkaloide, wird zweckmäßigerweise z. B. um so höher gewählt, 60 wie Scopolamin (z. B. aus Hyoscyamus niger), CoI-je kleiner das Gefäß bzw, je kleiner die Schüttel- chicin (z. B. aus Colchicum autumnale), Nicotin (z. B. amplitude ist. Zum Beispiel läßt sich das Verfahren in aus Nicotiana tabacum); Vitamine, wie ß-Carotin jeweils zu einem Fünftel mit Nährlösung gefüllten (z. B. aus Daucus carota), Ascorbinsäure (z. B. aus 1000-ml-Schüttelkolben bei etwa hundert Ausschlägen Gladiolus communis); Enzyme, wie Papain (z. B. aus pro Minute und einer Amplitude von etwa 5 cm oder 65 Carica papaya), Peroxidase (z. B. aus Cochlearia in 50-ml-Schüttelkolben bei etwa zweihundert Aus- armoracia); Glykoside, wie Saponin (z. B. aus Saposchlägen pro Minute und einer Amplitude von etwa naria officinalis); Farbstoffe, wie Curcuma (ζ. Β. aus 2 bis 3 cm durchführen. Analog können Wurzelseg- Curcuma longa), Berberin (z. B. aus Berberisvulgaris);

Gerbstoffe (ζ. B. aus Bergenia crassifolia und Rumex hymenosepalus); Aminosäuren, wie Tyrosin (z. B. aus Cucurbita pepo); Bitterstoffe, wie Panaquüon (z. B. aus Panax quinquefolius), Podophyllin (z. B. aus Podophyllub peltatum); Zucker, Polysaccharide und verwandte Verbindungen, wie Phytin (z. B. aus Dahlia variabilis), Inulin (z. B. aus Helianthus tuberosus).

Beispiell

Von einer keimfrei angezüchteten Pflanze von Hyoscyamus niger wird die Wurzel abgeschnitten und in eine Nährlösung der folgenden Zusammensetzung übertragen:

2,0% Saccharose

0,02% Ca(NOa)₂-4 H₂O

0,04% KNO₃

0,04 % KH₂PO₄ 0,02% MgSO₄-7 H₂O

0,02% Na₂SO₄

5 mg/1 Eisen-III-citrat

Die Wurzel wächst langsam weiter und kann jederzeit als Ausgangskultur für Submerskulturen dienen. Zur Anzucht einer Submerskultur werden etwa zehn bis zwanzig Wurzelstücke von 1 cm Länge, die z. T. kein intaktes Wachstumszentrum besitzen, abgeschnitten und in einen 1-1-Erlenmeyerkolben übertragen, der 200 ml Nährlösung enthält. Die Nährlösung entspricht der obengenannten mit Zusatz von 0,2% Malzextrakt und 0,2 mg/1 2,4-Dichlor-phenoxyessigsäure. Die Kultur wächst auf der Schüttelmascbine bei 28⁰C im Dunkeln und ist nach 7 bis 12 Tagen ausgewachsen. Sie wird weitergeimpft, indem man mit dem Inhalt eines Kolbens fünf neue Kolben mit je 200 ml Nährlösung beimpft. Diese Kolben sind nach 5 bis 7 Tagen gut angewachsen und können weitergeimpft werden. Die größte Wurzelmenge ist nach 7 bis 10 Tagen erreicht. Zur Gewinnung der Wurzelmasse wird der Inhalt eines Kolbens abfiltriert; man erhält aus 200 ml Wurzelkultur 7 g Wurzeln mit 300 mg Trockensubstanz. Der Scopolamingehalt beträgt 0,2 % der Trockensubstanz.

Beispiel 2

Eine analog Beispiel 1 angezüchtete Kultur wird in einen Kleinfermenter mit 101 der in Beispiel 1 angegebenen Nährlösung geimpft; der Fermenter läuft unter Belüftung und Rühren bei mäßiger Drehzahl im Dunkeln bei 28 ⁰C. Nach 11 Tagen Laufzeit erhält man 177 g Wurzeln mit 1,65 g Trockensubstanz mit 0,3 % Scopolamin.

Beispiel 3

Von einer keimfrei angezüchteten Pflanze von Hyoscyamus niger wird die Wurzel abgeschnitten und diese in der in Beispiel 1 angegebenen Nährlösung, die jedoch zusätzlich 0,1% Agar-Agar enthält, in Submerskultur, wie in Beispiel 1 angegeben, weitergezüchtet. Die bei der Weiterimpfung verwendeten Nährlösungen entsprechen jeweils der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung, enthalten jedoch zusätzlich 0,1 % Agar-Agar. Man erhält aus 200 ml Wurzelkultur 13 g Wurzeln mit 560 mg Trockensubstanz mit 0,2 % Scopolamin.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Züchtung von differenziertem Wurzelgewebe, dadurch gekennzeichnet, daß man Wurzelabschnitte in einer Nährlösung den Bedingungen einer zur Vermehrung von Mikroorganismen üblicherweise angewandten Submerskultur unterwirft.

2. Verfahren zur Züchtung von differenziertem Wurzelgewebe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährlösung so stark bewegt und belüftet wird, daß sich an den als Ausgangsmaterial verwendeten Wurzelabschnitten Seitenwurzeln bilden und diese sich infolge der durch die Bewegung verursachten mechanischen Beanspruchung von den Wurzelabschnitten ablösen.

3. Verfahren zur Züchtung von differenziertem Wurzelgewebe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährlösung viskositätserhöhende Stoffe, vorzugsweise Agar-Agar, enthält.

4. Verfahren zur Züchtung von differenziertem Wurzelgewebe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Wurzelabschnitte ohne intaktes Wachstumszentrum verwendet.

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