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Verfahren zur Stabilisierung therapeutisch wertvoller, wäßriger Plasminlösungen
Die Verwendung steriler wäßriger Plasminlösungen für verschiedene therapeutische
Zwecke, bei denen die proteolytischen Eigenschaften des Plasmins nutzbar gemacht
werden, ist bekannt. Die Art der Anwendung hängt von der Krankheit ab, die gelindert
oder geheilt werden soll. So hat man Injektionen, beispielsweise bei Empyemen, Hämothorax
und Sinusthorax, und Infusionen, beispielsweise bei Thrombosen und Ödemen, verabreicht.
Weitere Anwendungen wurden mit Einflößungen, beispielsweise im Zusammenhang mit
Fisteln verschiedener Art und Vaginitis, durchgeführt. Ferner hat man Oberflächenbehandlungen,
beispielsweise bei Wundbehandlungen, angewandt.
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Im allgemeinen wird die Aktivität der Plasminlösungen in der Zahl
der Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter angegeben. Jedoch wurde bisher noch keine
Definition für eine Plasmineinheit international festgelegt. In dieser Beschreibung
soll eine Plasmineinheit diejenige Menge an Plasmin bedeuten, die in 20 Minuten
die Bildung von in Perchlorsäure löslichen Zerfallsprodukten bewirkt, die unter
den folgenden Versuchsbedingungen eine Extinktion von einer Einheit bei 275 m#L
hervorrufen: 1 ccm einer Plasminlösung, deren Aktivität bestimmt werden soll und
deren pH 7,5 ist, wird in zwei Versuchsröhren gegeben, von denen jede in einem 0,4molaren
Phosphatpuffer (pH 7,50) 1 ccm einer 3°/oigen Lösung von Hammarsten Kasein enthält,
wobei diese Lösung auf 35,5°C vorerhitzt worden ist. Nach Stehenlassen während 2
Minuten in einem Thermostat bei 35,5°C wird einer der Röhren 3 ccm einer 1,7molaren
Lösung von Perchlorsäure in destilliertem Wasser zugesetzt, und nach Stehenlassen
während 22 Minuten bei 35,5'C wird der anderen Röhre dieselbe Menge an Perchlorsäurelösung
zugesetzt. Durch den Zusatz der Perchlorsäure findet eine Ausfällung statt, und
die beiden Versuchsröhren werden nun 20 Minuten stehengelassen, wonach eine zweimalige
Filtration mit Filterpapier (J. H. M u n k t e 11 s unübertreffliches original schwedisches
Filterpapier Nr. 0,9 cm) durchgeführt wird. Die Extinktion der beiden Lösungen wird
hiernach bei 275 m#t in einem Beckman-D-U-Spektrophotometer (1 cm Quarzküvette)
gemessen. Der Wert der Versuchsprobe, die 2 Minuten stand, wird als Blindwert verwendet.
Die Plasminlösung, deren Aktivität bestimmt werden soll, wird so weit verdünnt,
daß die Extinktion 0,5 nicht überschreitet, da bei höheren Plasminkonzentrationen
zwischen der Extinktion und der Plasminkonzentration keine Proportionalität besteht.
Während eine wäßrige Plasminlösung mit einem pH von 2 bis 3 praktisch völlig stabil
bei Temperaturen bis zu 35°C ist, ist dieselbe Plasminlösung bei neutraler Reaktion
(pH 7 oder pH des Blutes) instabil, es sei denn, daß die Lösung stark verdünnt ist.
Macht man zur Vorbedingung, daß der zulässige Höchstwert des Plasminverlustes in
der Lösung während einer Dauer von 2 Stunden und bei 25'C bei 200/, liegt, so müssen
Plasminlösungen, die mehr als etwa 0,1 Einheit pro Kubikzentimeter enthalten, als
instabil angesehen werden. Da die für therapeutische Zwecke verwendeten Plasminlösungen
wesentlich mehr Plasmin enthalten, mußte man bisher frisch hergestellte Plasminlösungen
anwenden und möglicherweise eintretende Plasminverluste in Kauf nehmen.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, klinisch wertvolle Plasminlösungen
zu schaffen, die wesentlich stabiler als die bisher bekannten Plasminlösungen sind.
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Nachdem bei stark verdünnten Plasminlösungen der Plasminverlust während
der üblichen Lagerungszeiten nicht wesentlich ins Gewicht fällt, zielt die Erfindung
in der Hauptsache auf die Stabilisierung von wäßrigen Plasminlösungen mit einem
höheren Plasmingehalt ab, bei denen die Stabilisierung des Plasmins ein wirklich
ernstes Problem darstellt. Es
handelt sich hierbei im wesentlichen
um Plasminlösungen mit einem Plasmingehalt von 0,3 Einheiten pro Kubikzentimeter
und darüber. Solche Plasminlösungen sind als therapeutisch wertvoll anzusprechen.
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Die Erfindung bezweckt insbesondere die Schaffung von Plasminlösungen,
die sogar bei Temperaturen von etwa 35°C praktisch stabil sind.
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Es wurde nun gefunden, daß die Stabilität von therapeutisch wertvollen
Plasminlösungen durch Zusatz einer oder mehrerer Aminosäuren wesentlich verbessert
werden kann.
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Es ist bereits bekannt gewesen, daß s-Aminokapronsäure die Aktivierung
von Plasminogen zu Plasmin inhibiert und auch eine inhibierende Wirkung auf die
kaseinolytische Aktivität von Plasmin hat. Hieraus konnte jedoch nicht abgeleitet
werden, daß e-Aminokapronsäure eine Stabilisierung des Plasmins in wäßriger Lösung
bewirken würde. Es war ferner bekannt, daß unter bestimmten Bedingungen die Wirksamkeit
des Plasmins auf Benzoylargininmethylester, Kasein und Fibrin gesteigert werden
kann. Auch auf Grund dieser Erkenntnis konnte nicht vorausgesehen werden, daß ein
Zusatz von Aminosäuren zu therapeutisch wertvollen wäßrigen Plasminlösungen das
Plasmin stabilisieren würde, zumal bei den bekannten Versuchen mit stark verdünnten
Plasminlösungen gearbeitet worden ist und hierbei für die Menge an a-Aminokapronsäure,
vermittels derer sich die Wirksamkeit des Plasmins steigern läßt, eine obere kritische
Grenze festgestellt wurde. Eine solche kritische Grenze hat für die Erfindung keine
Bedeutung, wie sich noch aus der nachfolgenden Beschreibung im einzelnen ergibt.
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Auf Grund des Standes der Technik muß die Feststellung, daß Aminosäuren
in der Lage sind, wäßrigen Plasminlösungen eine außerordentlich hohe Stabilität
zu verleihen, wodurch diese für den praktischen klinischen Gebrauch, insbesondere
zur Infusion, eine beträchtliche Wertsteigerung erfahren, als überraschend angesehen
werden.
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Durch die Versuche, die zu der vorliegenden Erfindung führten und
bei denen eine große Serie von verschiedenen Aminosäuren zur Anwendung kamen, wurde
gefunden, daß die chemische Struktur der Aminosäuren ihre Stabilisierungswirkung
beeinfiußt. Es wurde festgestellt, daß es zweckmäßig ist, vorzugsweise aliphatische
Aminomonocarbonsäuren zu verwenden. Es wurde ferner als zweckmäßig gefunden, daß
mindestens eine Aminogruppe in der Aminosäure an ein Kohlenstoffatom gebunden ist,
das mindestens durch ein Kohlenstoffatom von der Carboxylgruppe bzw. -gruppen der
Aminosäure getrennt ist. Von besonderem Vorteil sind aliphatische Aminomonocarbonsäuren
mit mehr als 3 Kohlenstoffatomen und einer endständigen Aminogruppe, da der erzielbare
Stabilisierungseffekt um so besser zu sein scheint, je weiter die Carboxylgruppe
der Aminosäure von deren Aminogruppe bzw. -gruppen entfernt ist.
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Um den gemäß der Erfindung erreichbaren Stabilisierungseffekt zu verdeutlichen,
wird nachstehend auf eine Serie von Stabilisierungsversuchen Bezug genommen, auch
unter Hinweis auf die Zeichnung, in der F i g. 1 und 2 den Stabilisierungseffekt
von verschiedenen Aminosäuren graphisch wiedergeben. Der Stabilisierungseffekt einer
großen Serie von Aminosäuren wurde im Zusammenhang mit aus Schweineblut gewonnenem
und in Phosphatpuffer (pH 7,5) aufgelöstem Plasmin geprüft. Eine wäßrige Lösung
der jeweiligen Aminosäure wird mit der Plasminlösung vermischt, wobei erforderlichenfalls
so weit verdünnt wird, daß die hergestellte Mischung etwa 0,4 Plasmineinheiten pro
Kubikzentimeter und 0,25 Millimol Aminosäure pro Plasmineinheit enthält, wenn die
Löslichkeit der Aminosäuren eine solche Aminosäurekonzentration gestattet. Andernfalls
wird eine gesättigte Aminosäurelösung verwendet. Die so hergestellte Aminosäure
enthaltende Plasminlösung wird in einen auf 35,5°C eingestellten Thermostat gebracht.
Nach verschiedenen Stunden werden Proben genommen, die auf ihre Plasminaktivität
hin analysiert werden, die in Prozentsätzen der Anfangsaktivität (etwa 0,4 Einheiten
pro Kubikzentimeter) ausgedrückt wird. Die Ergebnisse der Versuche sind in der nachstehenden
Tabelle I zusammengestellt.
| Tabelle I |
| "/a Aktivität a/a Aktivität |
| Aminosäure nach nach |
| 60 Minuten 120 Minuten |
| bei 35,5°C bei 35,5° C |
| Keine .................. 55 43 |
| Glycin ................. 57 44 |
| Guanidinessigsäure ...... 80 68 |
| Kreatin ................ 81 60 |
| ß-Alanin ............... 72 66 |
| DL-Valin ............... 60 49 |
| DL-Leucin .............. 72 53 |
| DL-Isoleucin ............ 77 57 |
| DL-Norleucin ........... 72 59 |
| L(+)-Asparaginsäure .... 60 51 |
| DL-Methionin . . . . . . . . . . . 69 62 |
| y-Aminobuttersäure ..... 97 87 |
| L(+)-Citrullin .......... 64 54 |
| L-Arginin .............. 78 65 |
| a-N-Acetyl-L-Arginin .... 92 87 |
| L-Ornithin ..... . . . . . . . . . 92 81 |
| e-Aminokapronsäure .... 85 80 |
| L-Lysin ................ 98 96 |
| m-Aminobenzoesäure .... 73 52 |
| o-Aminobenzoesäure .... 79 68 |
| p-Aminobenzoesäure .... 77 63 |
| DL-Phenylanalin . . . . . . . . . 73 55 |
| L-Histidin .............. 64 61 |
| DL-Thrypthophan ....... 60 48 |
| L(-)-Prolin ............ 62 54 |
| L(-)-Hydroxyprolin ..... 69 66 |
| Glycylglycin ............ 88 77 |
| Keine ..... . ............ 55 43 |
Die Kurven in den F i g. 1 und 2 zeigen die unter den vorerwähnten Versuchsbedingungen
erzielbare Stabilität, ebenfalls nach Lagerung bei 35,5°C während einer längeren
Zeitdauer unter Verwendung der erwähnten Aminosäuren. Die Abszysse der Kurven zeigen
die Lagerdauer in Stunden und die Ordinate den Prozentsatz der Anfangsaktivität
an. Zum Vergleich ist auch die Stabilitätskurve der keinen Zusatz an Aminosäure
aufweisenden Plasminlösung dargestellt.
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Aus den Versuchsergebnissen geht hervor, daß der Stabilisierungseffekt
von aliphatischen a-Aminvsäuren bei den angewandten Aminosäurekonzentrationen
nicht
sehr groß ist, daß jedoch der Stabilisierungseffekt mit zunehmender Länge der Kohlenstofffkette
der a-Aminosäure ansteigt. Wenn die Kohlenstoffkette der a-Aminosäure verzweigt
ist, wird der Stabilisierungseffekt der a-Aininosäure ebenfalls größer. Es kann
weiterhin festgestellt werden, daß der Stabilisierungseffekt der a-Amino" säuren
sprunghaft ansteigt, wenn die Aminogruppe substituiert wird, um der Säure einen
ausgeprägteren basischen Charakter zu verleihen. So zeigen Guanidinessigsäure und
Kreatin einen sehr viel besseren Stabilisierungseffekt als Glycin und DL-Valin.
Darüber hinaus kann festgestellt werden, daß die Einführung von Säuregruppen in
eine a-Aminosäure den Stabilisierungseffekt verringert. So ist der Stabilisierungseffekt
von L(-)-Asparaginsäure fast identisch mit demjenigen des Glycins.
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Aliphatische ß-Aminosäuren haben eine größere Stabilisierungswirkung
als a-Aminosäuren, und mit größer werdendem Abstand zwischen der Carboxylgruppe
der Aminosäure und ihrer Aminogruppe nimmt der Stabilisierungseffekt zu. So stabilisieren
beispielsweise y-Aminobuttersäuren und E-Aminokapronsäuren wesentlich besser als
ß-Alanin.
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Der Stabilisierungseffekt bleibt praktisch sogar unverändert, wenn
eine Aminogruppe in a-Stellung zusätzlich zu einer wesentlich von der Carboxylgruppe
entfernten Aminogruppe vorhanden ist, wie ein Vergleich des Stabilisierungseffekts
von s-Aminokaprons4ure und Lysin (,x"s-Diaminokapronsäure) zeigt. Ebenfalls zeigt
Ornithin (a,ö-Diaminovaleriansäure) einen ausgezeichneten Stabilisierungseffekt.
Ferner ist mit schwefelhaltigen Aminosäuren ein Stabilisierungseffekt erreichbar,
z. B, mit DL-Methionin.
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Der Umstand, daß eine Aminogruppe mit einer nichtbasischen Gruppe
substituiert wird, verhindert nicht den Eintritt des Stabilisierungseffekts, wenn
die Aminosäure noch eine basische Gruppe aufweist, die weit von der Carboxylgrüppe
angeordnet ist. So zeigt a-N-Acetyl-L-Arginin einen ausgezeichneten Stabilisierungseffekt.
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Während Glycin lediglich eine schwache Stabilisierungswirkung in den
angewandten Konzentrationen aufweist, wird eine starke Stabilisierungswirkung mit
Glycylglycin erreicht in Übereinstimmung mit dem Obenerwähnten, d. h., daß es für
die Stabilisierungswirkung darauf ankommt, daß die Aminogruppe möglichst weit von
der Carboxylgruppe der Aminosäure entfernt ist.
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Die untersuchten aromatischen Aminosäuren zeigen einen begrenzten
Stabilisierungseffekt in den angewandten Konzentrationen. In etwa dasselbe gilt
für die untersuchten heterozyklischen Aminosäuren L(-)-Prolin und L(-)-Hydroxyprolin.
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Glycylglycin wird als Dipeptid angesehen, Es können auch andere Dipeptide,
beispielsweise Leucylglycin, Alanylalanin und Glycylvalin, und höhere Peptide angewendet
werden, wenngleich die gewöhnlichen Aminosäuren im Hinblick auf die Tatsache, daß
sie leichter zugänglich und zu einem niedrigeren Preis erhältlich sind, bevorzugt
werden. Entsprechend den oben beschriebenen, mit aus Schweineblut gewonnenem Plasmin
durchgeführten Versuchen wurden auch solche unter Verwendung von aus Ochsenblut
gewonnenem Plasmin durchgeführt. In der nachstehenden Tabelle Il sind die erzielten
Ergebtiisse unter Anwendung der erwähnten Aminosäuren zusammengestellt.
| Talelle II |
| Aminosäure o/o Aktivität 0/0 Aktivität |
| 0,25 Millimol nach nach |
| pro Plasminainheit 60 Minuten 120 Minuten |
| bei 35,5A C bei 35,511 C |
| L-Lysin ................ 85 83 |
| L-Arginin .............. 86 85 |
| s-Aminokapronsäure .... 100 99 |
| Keine .................. 60 45 |
Aus der nachstehenden Tabelle
111 geht hervor, daß die Aminosäuren auch einen
Stabilisierungseffekt auf Lösungen des Plasmins aus menschlichem Blut haben. Die
Versuchsbedingungen stimmen mit den vorgenannten überein.
| Tabelle III |
| Aminosäure °/o Aktivität ^/o Aktivität |
| 0,25 Millimol nach nach |
| pro Plasmineinheit 60 Minuen 120 Minten |
| bei 35,51 C bei 35,50 C |
| L-Lysin ............. .. 87 78 |
| s-Aminokapronsäure .... 94 96 |
| Keine .................. 55 32 |
Wie aus der Tabelle I hervorgeht, ist der Stabilisierungseffekt von Glycin bei Lagerungstemperatur
der Plasminlösung bei 35,5°C verhältnismäßig unbedeutend, wenn das Glycin in einer
Menge von 0,25 Millimol pro Plasmineinheit angewandt wird. Es ist jedoch eine allgemein
gültige Regel, daß eine Erhöhung der Aminosäurekonzentration innerhalb gewisser
Bereiche eine erhöhte Stabilität der Plasminlösungen hervorruft. Wird ein Zusatz
von Glycin in einer Konzentration von 2,5 Millimol pro Plasmineinheit zur Anwendung
gebracht, so zeigt die Plasmin@ lösung nach Lagerung bei 35,5°C während 60 Minuten
73 °/o ihrer anfänglichen Aktivität, verglichen mit nur 57 °/o der Anfangsaktivität,
wenn das Glycin in einer Konzentration von 0,25 Millimol pro Plasmineinheit zugesetzt
wird. Etwa das Entsprechende gilt auch für die anderen Aminosäuren, die entsprechend
der Tabelle 1 bei den angewandten Konzentrationen einen verhältnismäßig unbedeutenden
Stabilisierungseffekt zeigen.
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Wenn eine verhältnismäßig große Menge von Aminosäuren, beispielsweise
L-Lysin oder s-Arninokapronsäure, die eine starke Stabilisierungswirkung zeigen,
den Plasminlösungen zugesetzt wird und die Lösungen nach dem Zusatz auf ihre Plasminaktivität
hin analysiert werden, so wird eine gegenüber den Erwartungen geringere Plasminaktivität
festgestellt. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, da bei den verhältnismäßig
hohen Aminosäurekonzentrationen in nennenswerteren Mengen ein Plasmin-Aminosäure-Komplex
gebildet wird, vier keine Aktivität besitzt. Wenn jedoch die Lösungen vor der Analyse
verdünnt werden, wird die gesamte Plasminaktivität festgestellt. Zur Verdeutlichung
sei auf die nachfolgenden Versuche Bezug genommen: a) Eine Plasminlösung aus Schweineblut
und mit einem Gehalt von etwa 0,4 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter und 2 Millimol
L-Lysin pro Plasmin.
einheit wird in einem Phosphatpuffer (pH 7,5)
hergestellt, wonach die Plasminaktivität der Mischung bestimmt und mit der Aktivität
einer Plasminlösung ohne Aminosäurezusatz verglichen wird, wobei die Aktivität der
Mischung in Prozent der Aktivität von der unvermischten Plasminlösung ausgedrückt
wird. Hiernach wird die Lösung verdünnt, wobei die Verdünnung ausgedrückt wird in
dem ursprünglichen Volumen der Plasminlösung dividiert durch das Volumen der Plasminlösung
nach der Verdünnung. Es wird dann die Aktivität der verdünnten Lösungen bestimmt.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt.
| Tabelle IV |
| Millimol L-Lysin Aktivität in |
| Verdünnung pro Prozent der |
| Kubikzentimeter Gesamtaktivität |
| Unverdünnt ....... 0,8 88 |
| 4 : 5 ............. 0,64 84 |
| 3 : 5 ............. 0,48 92 |
| 2 : 5 ............. 0,32 100 |
| 1 : 5 ............. 0,16 97 |
b) Es wird derselbe Versuch wie unter a) durchgeführt mit der Ausnahme, daß s-Aminokapronsäure
an Stelle von L-Lysin verwendet wird. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle
V zusammengestellt: Tabelle V Millimol Aktivität in Verdünnung --Aminokapron- Prozent
der säure pro Gesamtaktivität Kubikzentimeter Unverdünnt ....... 0,8 57 4 : 5 .............
0,64 65 3 : 5 ............. 0,48 71 2: 5 ............. 0,32 84 1 : 5 .............
0,16 93 Was die Menge der anzuwendenden Aminosäure anbetrifft, um eine in der Praxis
verwertbare Stabilisierung zu erzielen, so ist zunächst darauf hinzuweisen, daß
die Stabilität sowohl von Plasminlösungen ohne Zusatz von Aminosäuren als auch von
einer Plasminlösung mit einem derartigen Zusatz in hohem Maß von der Temperatur,
bei der die Lösung gelagert werden soll, abhängt. Bei 25°C ist die »Halblebensdauer<<-Periode
einer nichtstabilisierten Plasminlösung etwa 4- bis 5mal größer als bei 35,5'- C,
vorausgesetzt, daß dieselbe Plasminkonzentration vorliegt. Desgleichen hängt auch
die Stabilität einer Plasminlösung, die vermittels eines Aminosäurezusatzes stabilisiert
wurde, stark von der Temperatur ab. Um dies zu verdeutlichen, soll auf die nachstehenden
Tabellen Bezug genommen werden, die, wie Tabelle I, die Aktivität einer Plasminlösung
mit 0,4 und 0,3 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter zeigen, wobei unterschiedliche
Mengen an L-Lysin zugesetzt wurden und die Lagerzeit 60 und 120 Minuten bei 35,5
und 25°C betrug.
| Tabelle VI |
| MillimolL-Lysin o/oAktivitätnach o/oAktivitätnach |
| pro Plasmineinheit 60 Minten 120 Minten |
| bei 35,51' C bei 35,51' C |
| 0,000 ...... ... 55 43 |
| 0,031 ............. 74 52 |
| 0,062 ............. 89 73 |
| 0,125 ............. 99 84 |
| 0,25 ............. 100 92 |
| Tabelle VII |
| Millimo1L-Lysin o/oAktivitätnach o/oAktivitätnach |
| pro Plasmineinheit 60 Minten 120 Miuten |
| bei 25' C bei 250 C |
| 0,00 ............. 77 70 |
| 0,005 ............. 88 78 |
| 0,010 ............. 91 84 |
| 0,021 ............. 99 91 |
| 0,042 ............. 100 99 |
Falls nur ein Plasminabfall von etwa 20 °/o durch Stehenlassen während 2 Stunden
bei 25 bzw. 35,5°C stattfinden soll, genügt es bei der erstgenannten Temperatur,
eine Lysinkonzentration von etwa 0,005 Millimol pro Plasmineinheit anzuwenden, während
bei 35,5°C eine Lysinkonzentration von etwa 0,1 Millimol pro Plasmineinheit erforderlich
ist.
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Dies zeigt also, daß die untere Grenze für die in der Praxis anwendbare
Aminosäurekonzentration nicht nur von dem Charakter der Aminosäure abhängt, sondern
auch von den Anforderungen, die im Einzelfall von der Klinik in bezug auf die Stabilität
der angewendeten Plasminlösungen gestellt werden.
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Bei Lysin beispielsweise zeigt sich, daß zur Vermeidung eines Plasminverlustes
durch Stehenlassen während 2 Stunden bei 35,5°C und einer Plasminkonzentration von
0,4 Mol pro Kubikzentimeter es erforderlich ist, eine Lysinkonzentration von mehr
als 0,25 Millimol pro Plasmineinheit anzuwenden, während die entsprechende Plasminkonzentration
für 25°C bei 0,04 Millimol pro Plasmineinheit liegt. In der Praxis werden jedoch
im allgemeinen keine derartig hohen Anforderungen an die Stabilität gestellt. Es
kann eine Toleranz im Aktivitätsverlust von 200/, während 2 Stunden bei 25°C zugestanden
werden.
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Was das Lysin anbetrifft, so kann die untere Grenze der in der Praxis
erforderlichen Lysinmenge auf 0,002 Millimol pro Plasmineinheit festgesetzt werden.
Da Lysin zu den Aminosäuren mit dem außerordentlich starken Stabilisierungseffekt
gehört, sollten immer mindestens 0,002 Millimol Aminosäure pro Plasmineinheit verwendet
werden, um einen brauchbaren Stabilisierungseffekt zu erzielen. Vorzugsweise liegt
die Menge der Aminosäure oberhalb 0,005 Millimol pro Plasmineinheit.
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Wie aus Tabelle IV hervorgeht, übt das Lysin bei Anwendung einer Plasminkonzentration
entsprechend eine halbe Einheit pro Millimol Lysin eine inaktivierende Wirkung auf
die Plasminlösung aus, vorausgesetzt, daß das Lysin in einer Konzentration von mehr
als 0,32 Millimol pro Kubikzentimeter vorliegt. Da jedoch die Inaktivierung, wie
Tabelle IV zeigt, reversibel ist - sie verschwindet bei Verdünnung- und da die Injektion
von Plasminlösungen,
insbesondere bei der Infusion, eine sehr starke
Verdünnung der Plasnminlösung nach sich zieht und die Entfernung von Aminosäuren
aus dem Blut und der Gewebeflüssigkeiten um ein Vielfaches so schnell eintritt als
die Entfernung von Plasmin, besteht für die Zwecke der Erfindung die Möglichkeit,
Lysin in Konzentrationen weit über 2 Millimol pro Plasmineinheit zu verwenden. Tatsächlich
existiert keine physiologische obere Grenze für die angewandte Menge an Aminosäure,
jenseits derer toxische Erscheinungen auftreten würden und die einen Wert besäße,
der gegenüber den Aminosäuremengen, die für die Zwecke der Erfindung erforderlich
sind, völlig verschieden wäre.
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Aus klinischen Gründen wird man bei intravenöser Verabreichung im
allgemeinen zögern, eine Plasminlösung zu verwenden, die eine solche Menge an Aminosäure
enthält, daß ein Teil davon in der Plasminlösung als Suspension in ungelöstem Zustand
vorliegt. Unter Berücksichtigung eines praktischen Gesichtspunktes wird die Löslichkeit
der Aminosäure folglich als Maßstab für die bei intravenöser Injektion, einschließlich
Infusion, anzuwendende maximale Aminosäuremenge angesehen. Die Löslichkeit der verschiedenen
Aminosäuren ergibt sich aus der Literatur und ist in den meisten Fällen so groß,
daß die angestrebte Stabilisierung eintritt, ohne daß es erforderlich wäre, konzentrierte
Aminosäurelösungen zu verwenden.
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Wenn die Plasminlösung zur Infusion bestimmt ist, wird die optimale
Aminosäurekonzentration durch diejenige Konzentration festgelegt, welche die gewünschte
Stabilität bei der Infusionstemperatur (10 bis 36°C) während der Infusionsdauer
(bis zu 3 bis 4 Stunden) ergibt. In Zahlen ausgedrückt heißt dies, daß zweckmäßigerweise
eine Aminosäurekonzentration von 0,005 bis 1 Millimol pro Plasmineinheit - je nach
der verwendeten Aminosäure --- angewandt wird.
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Bei den oben beschriebenen Versuchen wurden Plasminlösungen mit einem
Plasmingehalt von 0,3 und 0,4 Einheiten pro Kubikzentimeter verwendet. Falls stärker
konzentrierte Lösungen verwendet werden, beispielsweise mit 10 Plasmineinheiten
pro Kubikzentimeter, tritt ein merkbarer Anfangsverlust an Plasmin sofort bei Einstellung
eines pH-Wertes von 2 bis 3 auf neutrale Reaktion ein, wenn keine Aminosäuren in
genügender Menge vorliegen. So entsteht im Verlauf von wenigen Minuten ein anfänglicher
Verlust von 20°/0, wenn beispielsweise eine angesäuerte Plasminlösung mit 10 Plasmineinheiten
pro Kubikzentimeter auf pH 7,5 bei 25°C eingestellt wird, welbst wenn in der Lösung
Lysin in einer Menge von 0,002 Millimol pro Plasmineinheit vorhanden ist. Solche
anfänglichen Verluste können jedoch durch Steigerung der Aminosäurekonzentration
vermieden werden. Mit einem Lysingehalt an 0,04 Millimol pro Plasmineinheit ist
es möglich, unter den obenerwähnten Versuchsbedingungen den Anfangsverlust völlig
auszuschließen.
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Bei der Herstellung von konzentrierten Plasminlösungen mit neutraler
Reaktion müssen die erwähnten Umstände berücksichtigt werden.
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Um die gewünschte Stabilisierung gemäß der Erfindung zu erreichen,
kann in verschiedener Weise vorgegangen werden.
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So kann eine Plasminlösung, die unter sterilen Bedingungen filtriert
wurde, hergestellt werden, wonach das Plasmin aus der Lösung isoliert wird, beispielsweise
durch Ausfriertrocknung. Es wird dann ausgesalzen oder ausgefällt und in Phiolen
abgefüllt, falls eine solche Abfüllung nicht bereits während der Isolierarbeitsstufe
stattgefunden hat. Es wird ebenfalls eine Aminosäurelösung hergestellt, die steril
filtriert und in Phiolen abgefüllt ist. Unmittelbar vor der Verwendung des Plasmins
wird dieses aus der Phiole in der Aminosäurelösung aufgelöst, wodurch eine sterile
und stabile Plasminlösung erhalten wird, die für den Gebrauch bereitsteht.
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Es ist auch möglich, eine sterile filtrierte Plasminlösung herzustellen,
die ein oder mehrere Aminosäuren enthält und die Mischung in einen Trockenzustand,
beispielsweise durch Ausfriertrocknung oder Ausfällung, zu überführen und die trockene
Mischung in Phiolen abzufüllen. Unmittelbar vor Gebrauch des Plasmins wird die trockene
Mischung in sterilem Wasser, einer Pufferlösung od. dgl. aufgelöst, wodurch eine
stabile Plasminaufbereitung erhalten wird.
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Weiterhin ist es möglich, eine sterile Plasminlösung herzustellen,
die auf einen pH 1 bis 4 eingestellt ist. Eine solche saure Lösung ist über mehrere
Monate stabil, wenn sie bei 4 bis 5°C gelagert wird. Durch Vermischung einer solchen
Lösung vor Gebrauch mit einer sterilen Aminosäurelösung, die entweder mit einem
der üblichen Säure-Base-Puffersysteme gepuffert wurde oder einen genügenden Aminosäuregehalt
besitzt, besteht die Möglichkeit, eine neutrale stabile P_lasminlösung zu erzielen.
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Schließlich ist es möglich, eine sterile Plasminlösung mit dem erforderlichen
Gehalt an Aminosäure herzustellen, die auf einen pH-Wert von 1 bis 5, vorzugsweise
2 bis 3, eingestellt ist. Durch Vermischung einer solchen Lösung mit einer sterilen
wäßrigen Lösung, die entweder mit einem der üblichen Säure-Base-Puffersysteme gepuffert
ist oder die lediglich genügend Base enthält, ist es möglich, zu einer neutralen
und stabilen Plasminlösung zu gelangen.
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Um die praktische Anwendbarkeit der Erfindung zu verdeutlichen, wird
auf die nachstehenden Beispiele Bezug genommen, die die Herstellung von stabilen
Plasminlösungen beschreiben, die vorzugsweise zu Infusionszwecken anwendbar sind.
Beispiel 1 50m1 einer Plasminlösung mit einem pH-Wert von 2,5 und mit 10 Plasmineinheiten
pro Kubikzentimeter werden unter sterilen Bedingungen filtriert, einer Ausfriertrocknung
unterworfen und in Phiolen abgefüllt. 50 ml einer 0,2molaren Phosphatpufferlösung,
die Lysin in einer Konzentration von 0,4 Mol pro Liter enthält, werden steril filtriert
und ebenfalls in Phiolen abgefüllt. Unmittelbar vor Verwendung des Plasmins wird
das durch Ausfrieren getrocknete Plasmin in der Lysinlösung aufgelöst, wodurch eine
sterile stabilisierte Plasminaufbereitung mit einem pH von 7,5 erhalten wird. Beispiel
2 50 ml einer Plasminlösung mit einem pH-Wert von 7,5 und mit 10 Plasmineinheiten
pro Kubikzentimeter und 0,1 Mol e-Aminokapronsäure pro Liter werden steril filtriert,
einer Ausfriertrocknung unterworfen und in Phiolen abgefüllt. Unmittelbar vor Verwendung
des Plasmins wird die durch Ausfriertrocknung erhaltene Aufbereitung in 50 ml destilliertem
Wasser
gelöst, wodurch eine sterile stabilisierte Plasminaufbereitung
mit einem pH von 7,5 erhalten wird.
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Beispiel 3 45 ml einer Plasminlösung mit einem pH-Wert von 2,5 und
mit 20 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter werden steril filtriert und in Phiolen
abgefüllt. 10 ccm eines lmolaren Phosphatpuffers (pH 7,5) mit einer Lysinkonzentration
von 1 Mol pro Liter werden steril filtriert und ebenfalls in Phiolen abgefüllt.
Unmittelbar vor Verwendung der Plasminlösung werden dieser 5 ml der Lysinlösung
zugesetzt, wodurch eine sterile stabilisierte Plasminaufbereitung mit einem pH-Wert
von 7,5 hergestellt wird.
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Beispiel 4 45 ml einer Plasminlösung mit einem pH-Wert von 3,0 und
mit 6 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter und 948 mg L-Arginin-Hydrochlorid werden
steril filtriert und in Phiolen abgefüllt. 10 ml einer lmolaren Phosphatpufferlösung
werden steril filtriert und ebenfalls in Phiolen abgefüllt. Unmittelbar vor Verwendung
der Plasminlösung werden 5 ml des Phosphatpuffers dieser zugesetzt, wodurch eine
sterile stabilisierte Plasminaufbereitung mit einem pH 7,0 erhalten wird.
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Beispiel 5 Eine Plasminlösung in verdünnter Schwefelsäure mit einem
pH 2 bis 3 wird steril filtriert und einer Ausfriertrocknung unterworfen. Eine Lösung
von L-Lysinmonohydrochlorid in Phosphatpufferlösung wird steril filtriert und ausfriergetrocknet.
Die durch Ausfriertrocknung erhaltenen Substanzen werden miteinander in solchen
Anteilen vermischt, daß die Mischung 0,04 Millimol Lysin pro Plasmineinheit enthält.
Eine 500 Plasmineinheiten entsprechende Menge der hergestellten Mischung wird unter
sterilen Bedingungen in ein Infusionsgefäß mit einem Volumen von 500 ccm übergeführt.
Das Gefäß wird nach teilweiser Evakuierung dicht verschlossen. Unmittelbar vor Verwendung
wird ein injizierbares Lösungsmittel in geeigneter Menge dem Gefäß zugesetzt, beispielsweise
in Form von sterilem destilliertem Wasser, einer sterilen Glukoselösung oder sterilem
Salzwasser. Durch das in dem Gefäß herrschende Teilvakuum wird dieser Zusatz erleichtert.
Der pH-Wert der Lösung liegt zwischen 7,0 und 7,5.
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Beispiel 6 Zu 1 1 einer Plasminlösung mit pH 2,5 und mit 5,0 Einheiten
Plasmin pro Kubikzentimeter werden 36,6g L-Lysinmonohydrochlorid bei 0 bis 5°C zugesetzt.
Sobald das Lysin aufgelöst ist, wird der pH auf 7,5 eingestellt, und noch bei 0
bis 5°C werden 1,02 g KH2P04 und 7,56 g Na2HP04 # 2H20 zugesetzt. Nachdem der Phosphatpuffer
aufgelöst ist, wird die Lösung steril filtriert. Die steril filtrierte Lösung wird
in Infusionsgefäße abgefüllt und auch einer Ausfriertrocknung unterworfen. Pro Infusionsgefäß
(300 ccm) werden 50 ml der Plasminlösung verwendet. Nach der Ausfriertrocknung werden
die Gefäße dicht verschlossen und beschriftet.
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Erforderlichenfalls kann die sterile filtrierte Lösung als Ganzes
einer Ausfriertrocknung ausgesetzt werden, und das hergestellte Pulver kann danach
gemahlen und in Infusionsgefäße abgefüllt werden.
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Die Wirkung der erfindungsgemäß stabilisierten Plasminlösungen, die
aus Schweineblut erhalten wurden, sind mit ausgezeichneten Ergebnissen geprüft worden,
sowohl in Tierversuchen als auch in klinischen Versuchen. Die klinischen Experimente
zeigten überhaupt keine antigene Wirkung bei Verwendung von Plasmin. Auf Grund der
Stabilisierung enthalten die angewendeten Plasminlösungen geringere Mengen an durch
Autolyse zersetztem Plasmin, wodurch toxische Sekundärwirkungen entstehen.
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Nach den vorgenannten Beispielen werden Lösungen mit 1 bis 18 Plasmineinheiten
pro Kubikzentimeter erhalten. Es steht jedoch nichts entgegen, mehr oder weniger
konzentrierte Lösungen, beispielsweise bis herunter zu 0,02 Plasmineinheiten und
herauf bis zu 23 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter oder noch mehr herzustellen.