DE1278074B

DE1278074B - Process to stabilize therapeutically valuable, aqueous plasmin solutions

Info

Publication number: DE1278074B
Application number: DEN21485A
Authority: DE
Inventors: Villy Johannes Jensen
Original assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Current assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Priority date: 1961-04-25
Filing date: 1962-04-21
Publication date: 1968-09-19

Description

Verfahren zur Stabilisierung therapeutisch wertvoller, wäßriger Plasminlösungen Die Verwendung steriler wäßriger Plasminlösungen für verschiedene therapeutische Zwecke, bei denen die proteolytischen Eigenschaften des Plasmins nutzbar gemacht werden, ist bekannt. Die Art der Anwendung hängt von der Krankheit ab, die gelindert oder geheilt werden soll. So hat man Injektionen, beispielsweise bei Empyemen, Hämothorax und Sinusthorax, und Infusionen, beispielsweise bei Thrombosen und Ödemen, verabreicht. Weitere Anwendungen wurden mit Einflößungen, beispielsweise im Zusammenhang mit Fisteln verschiedener Art und Vaginitis, durchgeführt. Ferner hat man Oberflächenbehandlungen, beispielsweise bei Wundbehandlungen, angewandt.Process for stabilizing therapeutically valuable, aqueous plasmin solutions The use of sterile aqueous plasmin solutions for various therapeutic Purposes in which the proteolytic properties of plasmin are harnessed is known. The method of application depends on the disease that is being alleviated or to be cured. So you have injections, for example with empyema, hemothorax and sinus thorax, and infusions, for example in the case of thrombosis and edema. Further uses were related to instillations, for example Fistulas of various types and vaginitis. Furthermore, one has surface treatments, for example in wound treatments.

Im allgemeinen wird die Aktivität der Plasminlösungen in der Zahl der Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter angegeben. Jedoch wurde bisher noch keine Definition für eine Plasmineinheit international festgelegt. In dieser Beschreibung soll eine Plasmineinheit diejenige Menge an Plasmin bedeuten, die in 20 Minuten die Bildung von in Perchlorsäure löslichen Zerfallsprodukten bewirkt, die unter den folgenden Versuchsbedingungen eine Extinktion von einer Einheit bei 275 m#L hervorrufen: 1 ccm einer Plasminlösung, deren Aktivität bestimmt werden soll und deren pH 7,5 ist, wird in zwei Versuchsröhren gegeben, von denen jede in einem 0,4molaren Phosphatpuffer (pH 7,50) 1 ccm einer 3°/oigen Lösung von Hammarsten Kasein enthält, wobei diese Lösung auf 35,5°C vorerhitzt worden ist. Nach Stehenlassen während 2 Minuten in einem Thermostat bei 35,5°C wird einer der Röhren 3 ccm einer 1,7molaren Lösung von Perchlorsäure in destilliertem Wasser zugesetzt, und nach Stehenlassen während 22 Minuten bei 35,5'C wird der anderen Röhre dieselbe Menge an Perchlorsäurelösung zugesetzt. Durch den Zusatz der Perchlorsäure findet eine Ausfällung statt, und die beiden Versuchsröhren werden nun 20 Minuten stehengelassen, wonach eine zweimalige Filtration mit Filterpapier (J. H. M u n k t e 11 s unübertreffliches original schwedisches Filterpapier Nr. 0,9 cm) durchgeführt wird. Die Extinktion der beiden Lösungen wird hiernach bei 275 m#t in einem Beckman-D-U-Spektrophotometer (1 cm Quarzküvette) gemessen. Der Wert der Versuchsprobe, die 2 Minuten stand, wird als Blindwert verwendet. Die Plasminlösung, deren Aktivität bestimmt werden soll, wird so weit verdünnt, daß die Extinktion 0,5 nicht überschreitet, da bei höheren Plasminkonzentrationen zwischen der Extinktion und der Plasminkonzentration keine Proportionalität besteht. Während eine wäßrige Plasminlösung mit einem pH von 2 bis 3 praktisch völlig stabil bei Temperaturen bis zu 35°C ist, ist dieselbe Plasminlösung bei neutraler Reaktion (pH 7 oder pH des Blutes) instabil, es sei denn, daß die Lösung stark verdünnt ist. Macht man zur Vorbedingung, daß der zulässige Höchstwert des Plasminverlustes in der Lösung während einer Dauer von 2 Stunden und bei 25'C bei 200/, liegt, so müssen Plasminlösungen, die mehr als etwa 0,1 Einheit pro Kubikzentimeter enthalten, als instabil angesehen werden. Da die für therapeutische Zwecke verwendeten Plasminlösungen wesentlich mehr Plasmin enthalten, mußte man bisher frisch hergestellte Plasminlösungen anwenden und möglicherweise eintretende Plasminverluste in Kauf nehmen.In general, the activity of the plasmin solutions is in number of plasmin units per cubic centimeter. However, no Definition for a plasmin unit established internationally. In this description one plasmin unit is intended to mean the amount of plasmin that will last in 20 minutes causes the formation of decomposition products soluble in perchloric acid, which under an absorbance of one unit at 275 m # L under the following test conditions produce: 1 ccm of a plasmin solution, the activity of which is to be determined and the pH of which is 7.5, is placed in two test tubes, each of which is in a 0.4 molar Phosphate buffer (pH 7.50) contains 1 ccm of a 3% solution of Hammarsten casein, this solution having been preheated to 35.5 ° C. After standing for 2 Minutes in a thermostat at 35.5 ° C, one of the 3 cc tubes becomes a 1.7 molar Solution of perchloric acid in distilled water added and left to stand During 22 minutes at 35.5 ° C., the same amount of perchloric acid solution is applied to the other tube added. The addition of perchloric acid causes precipitation, and the two test tubes are now left to stand for 20 minutes, followed by two tubes Filtration with filter paper (J. H. M u n k t e 11 s unsurpassable original Swedish Filter paper no. 0.9 cm) is carried out. The absorbance of the two solutions becomes then at 275 m # t in a Beckman-D-U spectrophotometer (1 cm quartz cuvette) measured. The value of the test sample that stood for 2 minutes is used as the blank value. The plasmin solution, the activity of which is to be determined, is diluted to such an extent that that the extinction does not exceed 0.5 because of higher plasmin concentrations there is no proportionality between the absorbance and the plasmin concentration. While an aqueous plasmin solution with a pH of 2 to 3 is practically completely stable at temperatures up to 35 ° C, the same plasmin solution is at neutral reaction (pH 7 or pH of the blood) unstable unless the solution is highly diluted. If one makes a precondition that the maximum permissible value of the plasmin loss in of the solution for a period of 2 hours and at 25'C at 200 /, must Plasmin solutions containing more than about 0.1 unit per cubic centimeter than are considered unstable. As the plasmin solutions used for therapeutic purposes contain significantly more plasmin, you had to previously freshly prepared plasmin solutions apply and accept possible plasmin losses.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, klinisch wertvolle Plasminlösungen zu schaffen, die wesentlich stabiler als die bisher bekannten Plasminlösungen sind.The object of the present invention is to provide clinically valuable plasmin solutions to create that are much more stable than the previously known plasmin solutions.

Nachdem bei stark verdünnten Plasminlösungen der Plasminverlust während der üblichen Lagerungszeiten nicht wesentlich ins Gewicht fällt, zielt die Erfindung in der Hauptsache auf die Stabilisierung von wäßrigen Plasminlösungen mit einem höheren Plasmingehalt ab, bei denen die Stabilisierung des Plasmins ein wirklich ernstes Problem darstellt. Es handelt sich hierbei im wesentlichen um Plasminlösungen mit einem Plasmingehalt von 0,3 Einheiten pro Kubikzentimeter und darüber. Solche Plasminlösungen sind als therapeutisch wertvoll anzusprechen.After the loss of plasmin during The invention aims at the usual storage times mainly on the stabilization of aqueous plasmin solutions with a higher plasmin content, which stabilizes the plasmin a really poses a serious problem. It This is essentially the case to plasmin solutions with a plasmine content of 0.3 units per cubic centimeter and above. Such plasmin solutions can be considered therapeutically valuable.

Die Erfindung bezweckt insbesondere die Schaffung von Plasminlösungen, die sogar bei Temperaturen von etwa 35°C praktisch stabil sind.The invention aims in particular to create plasmin solutions, which are practically stable even at temperatures of around 35 ° C.

Es wurde nun gefunden, daß die Stabilität von therapeutisch wertvollen Plasminlösungen durch Zusatz einer oder mehrerer Aminosäuren wesentlich verbessert werden kann.It has now been found that the stability of therapeutically valuable Plasmin solutions are significantly improved by adding one or more amino acids can be.

Es ist bereits bekannt gewesen, daß s-Aminokapronsäure die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin inhibiert und auch eine inhibierende Wirkung auf die kaseinolytische Aktivität von Plasmin hat. Hieraus konnte jedoch nicht abgeleitet werden, daß e-Aminokapronsäure eine Stabilisierung des Plasmins in wäßriger Lösung bewirken würde. Es war ferner bekannt, daß unter bestimmten Bedingungen die Wirksamkeit des Plasmins auf Benzoylargininmethylester, Kasein und Fibrin gesteigert werden kann. Auch auf Grund dieser Erkenntnis konnte nicht vorausgesehen werden, daß ein Zusatz von Aminosäuren zu therapeutisch wertvollen wäßrigen Plasminlösungen das Plasmin stabilisieren würde, zumal bei den bekannten Versuchen mit stark verdünnten Plasminlösungen gearbeitet worden ist und hierbei für die Menge an a-Aminokapronsäure, vermittels derer sich die Wirksamkeit des Plasmins steigern läßt, eine obere kritische Grenze festgestellt wurde. Eine solche kritische Grenze hat für die Erfindung keine Bedeutung, wie sich noch aus der nachfolgenden Beschreibung im einzelnen ergibt.It has already been known that s-aminocaproic acid has activation inhibited from plasminogen to plasmin and also have an inhibiting effect on the has caseinolytic activity of plasmin. However, it could not be deduced from this be that e-aminocaproic acid stabilizes plasmin in aqueous solution would effect. It was also known that under certain conditions the effectiveness of the plasmin can be increased to benzoylarginine methyl ester, casein and fibrin can. On the basis of this knowledge, too, it could not be foreseen that a Addition of amino acids to therapeutically valuable aqueous plasmin solutions that Plasmin would stabilize, especially in the known experiments with highly diluted Plasmin solutions have been worked and here for the amount of α-aminocaproic acid, by means of which the effectiveness of the plasmin can be increased, an upper critical one Limit has been established. Such a critical limit has no such critical limit for the invention Meaning, as can be seen in detail from the following description.

Auf Grund des Standes der Technik muß die Feststellung, daß Aminosäuren in der Lage sind, wäßrigen Plasminlösungen eine außerordentlich hohe Stabilität zu verleihen, wodurch diese für den praktischen klinischen Gebrauch, insbesondere zur Infusion, eine beträchtliche Wertsteigerung erfahren, als überraschend angesehen werden.Based on the prior art, it must be stated that amino acids are able to give aqueous plasmin solutions an extremely high stability to lend, making these for practical clinical use, in particular for infusion, experienced a considerable increase in value, regarded as surprising will.

Durch die Versuche, die zu der vorliegenden Erfindung führten und bei denen eine große Serie von verschiedenen Aminosäuren zur Anwendung kamen, wurde gefunden, daß die chemische Struktur der Aminosäuren ihre Stabilisierungswirkung beeinfiußt. Es wurde festgestellt, daß es zweckmäßig ist, vorzugsweise aliphatische Aminomonocarbonsäuren zu verwenden. Es wurde ferner als zweckmäßig gefunden, daß mindestens eine Aminogruppe in der Aminosäure an ein Kohlenstoffatom gebunden ist, das mindestens durch ein Kohlenstoffatom von der Carboxylgruppe bzw. -gruppen der Aminosäure getrennt ist. Von besonderem Vorteil sind aliphatische Aminomonocarbonsäuren mit mehr als 3 Kohlenstoffatomen und einer endständigen Aminogruppe, da der erzielbare Stabilisierungseffekt um so besser zu sein scheint, je weiter die Carboxylgruppe der Aminosäure von deren Aminogruppe bzw. -gruppen entfernt ist.Through the experiments that led to the present invention and in which a large series of different amino acids were used found that the chemical structure of the amino acids has their stabilizing effect affected. It has been found useful, preferably aliphatic Use aminomonocarboxylic acids. It has also been found useful that at least one amino group in the amino acid is bonded to a carbon atom, the at least one carbon atom from the carboxyl group or groups of the Amino acid is separated. Aliphatic amino monocarboxylic acids are particularly advantageous with more than 3 carbon atoms and a terminal amino group, since the achievable The further the carboxyl group, the better the stabilizing effect the amino acid is removed from its amino group or groups.

Um den gemäß der Erfindung erreichbaren Stabilisierungseffekt zu verdeutlichen, wird nachstehend auf eine Serie von Stabilisierungsversuchen Bezug genommen, auch unter Hinweis auf die Zeichnung, in der F i g. 1 und 2 den Stabilisierungseffekt von verschiedenen Aminosäuren graphisch wiedergeben. Der Stabilisierungseffekt einer großen Serie von Aminosäuren wurde im Zusammenhang mit aus Schweineblut gewonnenem und in Phosphatpuffer (pH 7,5) aufgelöstem Plasmin geprüft. Eine wäßrige Lösung der jeweiligen Aminosäure wird mit der Plasminlösung vermischt, wobei erforderlichenfalls so weit verdünnt wird, daß die hergestellte Mischung etwa 0,4 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter und 0,25 Millimol Aminosäure pro Plasmineinheit enthält, wenn die Löslichkeit der Aminosäuren eine solche Aminosäurekonzentration gestattet. Andernfalls wird eine gesättigte Aminosäurelösung verwendet. Die so hergestellte Aminosäure enthaltende Plasminlösung wird in einen auf 35,5°C eingestellten Thermostat gebracht. Nach verschiedenen Stunden werden Proben genommen, die auf ihre Plasminaktivität hin analysiert werden, die in Prozentsätzen der Anfangsaktivität (etwa 0,4 Einheiten pro Kubikzentimeter) ausgedrückt wird. Die Ergebnisse der Versuche sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengestellt. Tabelle I "/a Aktivität a/a Aktivität Aminosäure nach nach 60 Minuten 120 Minuten bei 35,5°C bei 35,5° C Keine .................. 55 43 Glycin ................. 57 44 Guanidinessigsäure ...... 80 68 Kreatin ................ 81 60 ß-Alanin ............... 72 66 DL-Valin ............... 60 49 DL-Leucin .............. 72 53 DL-Isoleucin ............ 77 57 DL-Norleucin ........... 72 59 L(+)-Asparaginsäure .... 60 51 DL-Methionin . . . . . . . . . . . 69 62 y-Aminobuttersäure ..... 97 87 L(+)-Citrullin .......... 64 54 L-Arginin .............. 78 65 a-N-Acetyl-L-Arginin .... 92 87 L-Ornithin ..... . . . . . . . . . 92 81 e-Aminokapronsäure .... 85 80 L-Lysin ................ 98 96 m-Aminobenzoesäure .... 73 52 o-Aminobenzoesäure .... 79 68 p-Aminobenzoesäure .... 77 63 DL-Phenylanalin . . . . . . . . . 73 55 L-Histidin .............. 64 61 DL-Thrypthophan ....... 60 48 L(-)-Prolin ............ 62 54 L(-)-Hydroxyprolin ..... 69 66 Glycylglycin ............ 88 77 Keine ..... . ............ 55 43 Die Kurven in den F i g. 1 und 2 zeigen die unter den vorerwähnten Versuchsbedingungen erzielbare Stabilität, ebenfalls nach Lagerung bei 35,5°C während einer längeren Zeitdauer unter Verwendung der erwähnten Aminosäuren. Die Abszysse der Kurven zeigen die Lagerdauer in Stunden und die Ordinate den Prozentsatz der Anfangsaktivität an. Zum Vergleich ist auch die Stabilitätskurve der keinen Zusatz an Aminosäure aufweisenden Plasminlösung dargestellt.In order to illustrate the stabilization effect that can be achieved according to the invention, reference is made below to a series of stabilization experiments, also with reference to the drawing in which FIG. 1 and 2 graphically show the stabilizing effect of various amino acids. The stabilizing effect of a large series of amino acids was tested in connection with plasmin obtained from pig blood and dissolved in phosphate buffer (pH 7.5). An aqueous solution of the respective amino acid is mixed with the plasmin solution, diluting if necessary so that the mixture produced contains about 0.4 plasmin units per cubic centimeter and 0.25 millimoles of amino acids per plasmin unit, if the solubility of the amino acids allows such an amino acid concentration. Otherwise, a saturated amino acid solution is used. The plasmin solution containing amino acid prepared in this way is placed in a thermostat set at 35.5 ° C. After several hours, samples are taken and analyzed for their plasmin activity, which is expressed as a percentage of the initial activity (about 0.4 units per cubic centimeter). The results of the tests are compiled in Table I below. Table I. "/ a activity a / a activity Amino acid after after 60 minutes 120 minutes at 35.5 ° C at 35.5 ° C None .................. 55 43 Glycine ................. 57 44 Guanidine Acetic Acid ...... 80 68 Creatine ................ 81 60 ß-alanine ............... 72 66 DL-Valine ............... 60 49 DL-Leucine .............. 72 53 DL-isoleucine ............ 77 57 DL-norleucine ........... 72 59 L (+) - aspartic acid .... 60 51 DL-methionine. . . . . . . . . . . 69 62 y-aminobutyric acid ..... 97 87 L (+) - Citrulline .......... 64 54 L-arginine .............. 78 65 aN-acetyl-L-arginine .... 92 87 L-ornithine ...... . . . . . . . . 92 81 e-aminocaproic acid .... 85 80 L-lysine ................ 98 96 m-aminobenzoic acid ... 73 52 o-aminobenzoic acid .... 79 68 p-aminobenzoic acid .... 77 63 DL-phenylanaline. . . . . . . . . 73 55 L-histidine .............. 64 61 DL-Thrypthophane ....... 60 48 L (-) - proline ............ 62 54 L (-) - hydroxyproline ..... 69 66 Glycylglycine ............ 88 77 None ...... ............ 55 43 The curves in FIGS. 1 and 2 show the stability achievable under the above-mentioned test conditions, also after storage at 35.5 ° C. for a longer period of time using the above-mentioned amino acids. The abscyses of the curves indicate the storage time in hours and the ordinate indicates the percentage of initial activity. For comparison, the stability curve of the plasmin solution with no added amino acid is also shown.

Aus den Versuchsergebnissen geht hervor, daß der Stabilisierungseffekt von aliphatischen a-Aminvsäuren bei den angewandten Aminosäurekonzentrationen nicht sehr groß ist, daß jedoch der Stabilisierungseffekt mit zunehmender Länge der Kohlenstofffkette der a-Aminosäure ansteigt. Wenn die Kohlenstoffkette der a-Aminosäure verzweigt ist, wird der Stabilisierungseffekt der a-Aininosäure ebenfalls größer. Es kann weiterhin festgestellt werden, daß der Stabilisierungseffekt der a-Amino" säuren sprunghaft ansteigt, wenn die Aminogruppe substituiert wird, um der Säure einen ausgeprägteren basischen Charakter zu verleihen. So zeigen Guanidinessigsäure und Kreatin einen sehr viel besseren Stabilisierungseffekt als Glycin und DL-Valin. Darüber hinaus kann festgestellt werden, daß die Einführung von Säuregruppen in eine a-Aminosäure den Stabilisierungseffekt verringert. So ist der Stabilisierungseffekt von L(-)-Asparaginsäure fast identisch mit demjenigen des Glycins.It can be seen from the test results that the stabilizing effect of aliphatic a-amino acids at the amino acid concentrations used not It is very large, however, that the stabilizing effect with increasing length of the carbon chain the a-amino acid increases. When the carbon chain of the a-amino acid branches out is, the stabilizing effect of α-amino acid also becomes greater. It can can also be found that the stabilizing effect of the a-amino "acids increases sharply when the amino group is substituted to give the acid a to give a more pronounced basic character. So show guanidine acetic acid and Creatine has a much better stabilizing effect than glycine and DL-valine. In addition, it can be stated that the introduction of acid groups in an a-amino acid reduces the stabilizing effect. So is the stabilizing effect of L (-) - aspartic acid almost identical to that of glycine.

Aliphatische ß-Aminosäuren haben eine größere Stabilisierungswirkung als a-Aminosäuren, und mit größer werdendem Abstand zwischen der Carboxylgruppe der Aminosäure und ihrer Aminogruppe nimmt der Stabilisierungseffekt zu. So stabilisieren beispielsweise y-Aminobuttersäuren und E-Aminokapronsäuren wesentlich besser als ß-Alanin.Aliphatic ß-amino acids have a greater stabilizing effect than α-amino acids, and with increasing distance between the carboxyl group the stabilizing effect of the amino acid and its amino group increases. So stabilize for example γ-aminobutyric acids and E-aminokaproic acids much better than ß-alanine.

Der Stabilisierungseffekt bleibt praktisch sogar unverändert, wenn eine Aminogruppe in a-Stellung zusätzlich zu einer wesentlich von der Carboxylgruppe entfernten Aminogruppe vorhanden ist, wie ein Vergleich des Stabilisierungseffekts von s-Aminokaprons4ure und Lysin (,x"s-Diaminokapronsäure) zeigt. Ebenfalls zeigt Ornithin (a,ö-Diaminovaleriansäure) einen ausgezeichneten Stabilisierungseffekt. Ferner ist mit schwefelhaltigen Aminosäuren ein Stabilisierungseffekt erreichbar, z. B, mit DL-Methionin.The stabilizing effect remains practically unchanged even if an a-position amino group in addition to one substantially from the carboxyl group removed amino group is present, as a comparison of the stabilizing effect of s-aminocaproic acid and lysine (, x "s-diaminocaproic acid). Also shows Ornithine (α, δ-diaminovaleric acid) has an excellent stabilizing effect. Furthermore, a stabilizing effect can be achieved with sulfur-containing amino acids, z. B, with DL-methionine.

Der Umstand, daß eine Aminogruppe mit einer nichtbasischen Gruppe substituiert wird, verhindert nicht den Eintritt des Stabilisierungseffekts, wenn die Aminosäure noch eine basische Gruppe aufweist, die weit von der Carboxylgrüppe angeordnet ist. So zeigt a-N-Acetyl-L-Arginin einen ausgezeichneten Stabilisierungseffekt.The fact that an amino group with a non-basic group is substituted, does not prevent the occurrence of the stabilizing effect, if the amino acid still has a basic group that is far from the carboxyl group is arranged. Thus, a-N-acetyl-L-arginine shows an excellent stabilizing effect.

Während Glycin lediglich eine schwache Stabilisierungswirkung in den angewandten Konzentrationen aufweist, wird eine starke Stabilisierungswirkung mit Glycylglycin erreicht in Übereinstimmung mit dem Obenerwähnten, d. h., daß es für die Stabilisierungswirkung darauf ankommt, daß die Aminogruppe möglichst weit von der Carboxylgruppe der Aminosäure entfernt ist.While glycine only has a weak stabilizing effect in the Applied concentrations, will have a strong stabilizing effect Glycylglycine, in accordance with the above, i. i.e. that it is for the stabilizing effect depends on the amino group being as far from as possible the carboxyl group of the amino acid is removed.

Die untersuchten aromatischen Aminosäuren zeigen einen begrenzten Stabilisierungseffekt in den angewandten Konzentrationen. In etwa dasselbe gilt für die untersuchten heterozyklischen Aminosäuren L(-)-Prolin und L(-)-Hydroxyprolin.The aromatic amino acids examined show a limited Stabilizing effect in the concentrations used. About the same is true for the investigated heterocyclic amino acids L (-) - proline and L (-) - hydroxyproline.

Glycylglycin wird als Dipeptid angesehen, Es können auch andere Dipeptide, beispielsweise Leucylglycin, Alanylalanin und Glycylvalin, und höhere Peptide angewendet werden, wenngleich die gewöhnlichen Aminosäuren im Hinblick auf die Tatsache, daß sie leichter zugänglich und zu einem niedrigeren Preis erhältlich sind, bevorzugt werden. Entsprechend den oben beschriebenen, mit aus Schweineblut gewonnenem Plasmin durchgeführten Versuchen wurden auch solche unter Verwendung von aus Ochsenblut gewonnenem Plasmin durchgeführt. In der nachstehenden Tabelle Il sind die erzielten Ergebtiisse unter Anwendung der erwähnten Aminosäuren zusammengestellt. Talelle II Aminosäure o/o Aktivität 0/0 Aktivität 0,25 Millimol nach nach pro Plasminainheit 60 Minuten 120 Minuten bei 35,5A C bei 35,511 C L-Lysin ................ 85 83 L-Arginin .............. 86 85 s-Aminokapronsäure .... 100 99 Keine .................. 60 45 Aus der nachstehenden Tabelle 111 geht hervor, daß die Aminosäuren auch einen Stabilisierungseffekt auf Lösungen des Plasmins aus menschlichem Blut haben. Die Versuchsbedingungen stimmen mit den vorgenannten überein. Tabelle III Aminosäure °/o Aktivität ^/o Aktivität 0,25 Millimol nach nach pro Plasmineinheit 60 Minuen 120 Minten bei 35,51 C bei 35,50 C L-Lysin ............. .. 87 78 s-Aminokapronsäure .... 94 96 Keine .................. 55 32 Wie aus der Tabelle I hervorgeht, ist der Stabilisierungseffekt von Glycin bei Lagerungstemperatur der Plasminlösung bei 35,5°C verhältnismäßig unbedeutend, wenn das Glycin in einer Menge von 0,25 Millimol pro Plasmineinheit angewandt wird. Es ist jedoch eine allgemein gültige Regel, daß eine Erhöhung der Aminosäurekonzentration innerhalb gewisser Bereiche eine erhöhte Stabilität der Plasminlösungen hervorruft. Wird ein Zusatz von Glycin in einer Konzentration von 2,5 Millimol pro Plasmineinheit zur Anwendung gebracht, so zeigt die Plasmin@ lösung nach Lagerung bei 35,5°C während 60 Minuten 73 °/o ihrer anfänglichen Aktivität, verglichen mit nur 57 °/o der Anfangsaktivität, wenn das Glycin in einer Konzentration von 0,25 Millimol pro Plasmineinheit zugesetzt wird. Etwa das Entsprechende gilt auch für die anderen Aminosäuren, die entsprechend der Tabelle 1 bei den angewandten Konzentrationen einen verhältnismäßig unbedeutenden Stabilisierungseffekt zeigen.Glycylglycine is considered to be a dipeptide. Other dipeptides such as leucylglycine, alanylalanine and glycylvaline and higher peptides can also be used, although the common amino acids are preferred in view of the fact that they are more readily available and available at a lower price. In accordance with the above-described experiments carried out with plasmin obtained from pig blood, experiments using plasmin obtained from ox blood were also carried out. The results obtained using the amino acids mentioned are compiled in Table II below. Talelle II Amino acid o / o activity 0/0 activity 0.25 millimoles after after per plasmin unit 60 minutes 120 minutes at 35.5A C at 35.511 C L-lysine ................ 85 83 L-arginine .............. 86 85 s-aminocaproic acid .... 100 99 None .................. 60 45 From the following table 111 shows that the amino acids have a stabilizing effect on solutions of plasmin from human blood. The test conditions are the same as those mentioned above. Table III Amino acid ° / o activity ^ / o activity 0.25 millimoles after after 60 minutes 120 minutes per plasmine unit at 35.51 ° C at 35.50 ° C L-lysine ............. .. 87 78 s-aminocaproic acid .... 94 96 None .................. 55 32 As can be seen from Table I, the stabilizing effect of glycine at the storage temperature of the plasmin solution at 35.5 ° C. is relatively insignificant if the glycine is used in an amount of 0.25 millimoles per plasmin unit. However, it is a generally valid rule that an increase in the amino acid concentration within certain ranges produces an increased stability of the plasmin solutions. If glycine is added at a concentration of 2.5 millimoles per plasmine unit, the plasmin® solution shows 73% of its initial activity after storage at 35.5 ° C for 60 minutes, compared with only 57% o the initial activity when the glycine is added at a concentration of 0.25 millimoles per plasmin unit. About the same also applies to the other amino acids, which, according to Table 1, show a relatively insignificant stabilizing effect at the concentrations used.

Wenn eine verhältnismäßig große Menge von Aminosäuren, beispielsweise L-Lysin oder s-Arninokapronsäure, die eine starke Stabilisierungswirkung zeigen, den Plasminlösungen zugesetzt wird und die Lösungen nach dem Zusatz auf ihre Plasminaktivität hin analysiert werden, so wird eine gegenüber den Erwartungen geringere Plasminaktivität festgestellt. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, da bei den verhältnismäßig hohen Aminosäurekonzentrationen in nennenswerteren Mengen ein Plasmin-Aminosäure-Komplex gebildet wird, vier keine Aktivität besitzt. Wenn jedoch die Lösungen vor der Analyse verdünnt werden, wird die gesamte Plasminaktivität festgestellt. Zur Verdeutlichung sei auf die nachfolgenden Versuche Bezug genommen: a) Eine Plasminlösung aus Schweineblut und mit einem Gehalt von etwa 0,4 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter und 2 Millimol L-Lysin pro Plasmin. einheit wird in einem Phosphatpuffer (pH 7,5) hergestellt, wonach die Plasminaktivität der Mischung bestimmt und mit der Aktivität einer Plasminlösung ohne Aminosäurezusatz verglichen wird, wobei die Aktivität der Mischung in Prozent der Aktivität von der unvermischten Plasminlösung ausgedrückt wird. Hiernach wird die Lösung verdünnt, wobei die Verdünnung ausgedrückt wird in dem ursprünglichen Volumen der Plasminlösung dividiert durch das Volumen der Plasminlösung nach der Verdünnung. Es wird dann die Aktivität der verdünnten Lösungen bestimmt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt. Tabelle IV Millimol L-Lysin Aktivität in Verdünnung pro Prozent der Kubikzentimeter Gesamtaktivität Unverdünnt ....... 0,8 88 4 : 5 ............. 0,64 84 3 : 5 ............. 0,48 92 2 : 5 ............. 0,32 100 1 : 5 ............. 0,16 97 b) Es wird derselbe Versuch wie unter a) durchgeführt mit der Ausnahme, daß s-Aminokapronsäure an Stelle von L-Lysin verwendet wird. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle V zusammengestellt: Tabelle V Millimol Aktivität in Verdünnung --Aminokapron- Prozent der säure pro Gesamtaktivität Kubikzentimeter Unverdünnt ....... 0,8 57 4 : 5 ............. 0,64 65 3 : 5 ............. 0,48 71 2: 5 ............. 0,32 84 1 : 5 ............. 0,16 93 Was die Menge der anzuwendenden Aminosäure anbetrifft, um eine in der Praxis verwertbare Stabilisierung zu erzielen, so ist zunächst darauf hinzuweisen, daß die Stabilität sowohl von Plasminlösungen ohne Zusatz von Aminosäuren als auch von einer Plasminlösung mit einem derartigen Zusatz in hohem Maß von der Temperatur, bei der die Lösung gelagert werden soll, abhängt. Bei 25°C ist die »Halblebensdauer<<-Periode einer nichtstabilisierten Plasminlösung etwa 4- bis 5mal größer als bei 35,5'- C, vorausgesetzt, daß dieselbe Plasminkonzentration vorliegt. Desgleichen hängt auch die Stabilität einer Plasminlösung, die vermittels eines Aminosäurezusatzes stabilisiert wurde, stark von der Temperatur ab. Um dies zu verdeutlichen, soll auf die nachstehenden Tabellen Bezug genommen werden, die, wie Tabelle I, die Aktivität einer Plasminlösung mit 0,4 und 0,3 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter zeigen, wobei unterschiedliche Mengen an L-Lysin zugesetzt wurden und die Lagerzeit 60 und 120 Minuten bei 35,5 und 25°C betrug. Tabelle VI MillimolL-Lysin o/oAktivitätnach o/oAktivitätnach pro Plasmineinheit 60 Minten 120 Minten bei 35,51' C bei 35,51' C 0,000 ...... ... 55 43 0,031 ............. 74 52 0,062 ............. 89 73 0,125 ............. 99 84 0,25 ............. 100 92 Tabelle VII Millimo1L-Lysin o/oAktivitätnach o/oAktivitätnach pro Plasmineinheit 60 Minten 120 Miuten bei 25' C bei 250 C 0,00 ............. 77 70 0,005 ............. 88 78 0,010 ............. 91 84 0,021 ............. 99 91 0,042 ............. 100 99 Falls nur ein Plasminabfall von etwa 20 °/o durch Stehenlassen während 2 Stunden bei 25 bzw. 35,5°C stattfinden soll, genügt es bei der erstgenannten Temperatur, eine Lysinkonzentration von etwa 0,005 Millimol pro Plasmineinheit anzuwenden, während bei 35,5°C eine Lysinkonzentration von etwa 0,1 Millimol pro Plasmineinheit erforderlich ist.If a relatively large amount of amino acids, for example L-lysine or s-aminocaproic acid, which show a strong stabilizing effect, is added to the plasmin solutions and the solutions are analyzed for their plasmin activity after the addition, then a lower than expected plasmin activity is determined. This is probably due to the fact that a plasmin-amino acid complex is formed in significant amounts at the relatively high amino acid concentrations, four of which have no activity. However, if the solutions are diluted prior to analysis, all plasmin activity will be determined. For clarification, reference is made to the following experiments: a) A plasmin solution from pig blood and with a content of about 0.4 plasmin units per cubic centimeter and 2 millimoles of L-lysine per plasmin. unit is prepared in a phosphate buffer (pH 7.5), after which the plasmin activity of the mixture is determined and compared with the activity of a plasmin solution without amino acid addition, the activity of the mixture being expressed as a percentage of the activity of the unmixed plasmin solution. The solution is then diluted, the dilution being expressed as the original volume of the plasmin solution divided by the volume of the plasmin solution after the dilution. The activity of the diluted solutions is then determined. The results of these tests are compiled in the table below. Table IV Millimoles of L-lysine activity in Dilution per percent of Cubic centimeters of total activity Undiluted ....... 0.8 88 4: 5 ............. 0.64 84 3: 5 ............. 0.48 92 2: 5 ............. 0.32 100 1: 5 ............. 0.16 97 b) The same experiment is carried out as under a) with the exception that s-aminocaproic acid is used in place of L-lysine. The results are compiled in Table V below: Table V Millimoles of activity in dilution - aminocaproic percent of acid per total activity cubic centimeters undiluted ....... 0.8 57 4: 5 ......... .... 0.64 65 3: 5 ............. 0.48 71 2: 5 ............. 0.32 84 1: 5 of amino acids as well as of a plasmin solution with such an addition depends to a large extent on the temperature at which the solution is to be stored. At 25 ° C the "half-life" period of an unstabilized plasmin solution is about 4 to 5 times greater than at 35.5 ° C, provided that the same plasmin concentration is present. Likewise, the stability of a plasmin solution that has been stabilized by adding an amino acid also depends strongly on the temperature. In order to clarify this, reference should be made to the following tables, which, like Table I, show the activity of a plasmin solution with 0.4 and 0.3 plasmin units per cubic centimeter, with different amounts of L-lysine being added and the storage time 60 and 120 minutes at 35.5 and 25 ° C. Table VI MillimolL lysine o / o activity after o / o activity after 60 minutes 120 minutes per plasmine unit at 35.51'C at 35.51'C 0.000 ...... ... 55 43 0.031 ............. 74 52 0.062 ............. 89 73 0.125 ............. 99 84 0.25 ............. 100 92 Table VII Millimo1L-Lysine o / o activity after o / o activity after per plasmine unit 60 minutes 120 minutes at 25 ° C at 250 ° C 0.00 ............. 77 70 0.005 ............. 88 78 0.010 ............. 91 84 0.021 ............. 99 91 0.042 ............. 100 99 If only a plasmin drop of about 20% is to take place by standing for 2 hours at 25 or 35.5 ° C, it is sufficient to use a lysine concentration of about 0.005 millimoles per plasmin unit at the first-mentioned temperature, while at 35.5 ° C a lysine concentration of about 0.1 millimoles per unit of plasmin is required.

Dies zeigt also, daß die untere Grenze für die in der Praxis anwendbare Aminosäurekonzentration nicht nur von dem Charakter der Aminosäure abhängt, sondern auch von den Anforderungen, die im Einzelfall von der Klinik in bezug auf die Stabilität der angewendeten Plasminlösungen gestellt werden.So this shows that the lower limit for that which can be used in practice Amino acid concentration depends not only on the character of the amino acid, but also from the requirements made in each individual case by the clinic with regard to stability of the applied plasmin solutions.

Bei Lysin beispielsweise zeigt sich, daß zur Vermeidung eines Plasminverlustes durch Stehenlassen während 2 Stunden bei 35,5°C und einer Plasminkonzentration von 0,4 Mol pro Kubikzentimeter es erforderlich ist, eine Lysinkonzentration von mehr als 0,25 Millimol pro Plasmineinheit anzuwenden, während die entsprechende Plasminkonzentration für 25°C bei 0,04 Millimol pro Plasmineinheit liegt. In der Praxis werden jedoch im allgemeinen keine derartig hohen Anforderungen an die Stabilität gestellt. Es kann eine Toleranz im Aktivitätsverlust von 200/, während 2 Stunden bei 25°C zugestanden werden.In the case of lysine, for example, it has been shown that to avoid a loss of plasmin by standing for 2 hours at 35.5 ° C and a plasmin concentration of 0.4 moles per cubic centimeter it requires a lysine concentration of more than 0.25 millimoles per unit of plasmin to be used while the corresponding plasmin concentration for 25 ° C is 0.04 millimoles per plasmin unit. In practice, however, generally no such high demands are made on the stability. It A tolerance in the loss of activity of 200 / during 2 hours at 25 ° C can be allowed will.

Was das Lysin anbetrifft, so kann die untere Grenze der in der Praxis erforderlichen Lysinmenge auf 0,002 Millimol pro Plasmineinheit festgesetzt werden. Da Lysin zu den Aminosäuren mit dem außerordentlich starken Stabilisierungseffekt gehört, sollten immer mindestens 0,002 Millimol Aminosäure pro Plasmineinheit verwendet werden, um einen brauchbaren Stabilisierungseffekt zu erzielen. Vorzugsweise liegt die Menge der Aminosäure oberhalb 0,005 Millimol pro Plasmineinheit.As far as lysine is concerned, the lower limit of that in practice required amount of lysine should be set at 0.002 millimoles per plasmin unit. Because lysine is one of the amino acids with an extremely strong stabilizing effect heard, at least 0.002 millimoles of amino acid per plasmin unit should always be used in order to achieve a usable stabilizing effect. Preferably lies the amount of the amino acid above 0.005 millimoles per unit of plasmin.

Wie aus Tabelle IV hervorgeht, übt das Lysin bei Anwendung einer Plasminkonzentration entsprechend eine halbe Einheit pro Millimol Lysin eine inaktivierende Wirkung auf die Plasminlösung aus, vorausgesetzt, daß das Lysin in einer Konzentration von mehr als 0,32 Millimol pro Kubikzentimeter vorliegt. Da jedoch die Inaktivierung, wie Tabelle IV zeigt, reversibel ist - sie verschwindet bei Verdünnung- und da die Injektion von Plasminlösungen, insbesondere bei der Infusion, eine sehr starke Verdünnung der Plasnminlösung nach sich zieht und die Entfernung von Aminosäuren aus dem Blut und der Gewebeflüssigkeiten um ein Vielfaches so schnell eintritt als die Entfernung von Plasmin, besteht für die Zwecke der Erfindung die Möglichkeit, Lysin in Konzentrationen weit über 2 Millimol pro Plasmineinheit zu verwenden. Tatsächlich existiert keine physiologische obere Grenze für die angewandte Menge an Aminosäure, jenseits derer toxische Erscheinungen auftreten würden und die einen Wert besäße, der gegenüber den Aminosäuremengen, die für die Zwecke der Erfindung erforderlich sind, völlig verschieden wäre.As can be seen from Table IV, the lysine exercises upon application of a concentration of plasmin corresponding to half a unit per millimole of lysine has an inactivating effect the plasmin solution, provided that the lysine is in a concentration of more is 0.32 millimoles per cubic centimeter. However, since the inactivation, like Table IV shows is reversible - it disappears upon dilution - and because of the injection of plasmin solutions, especially with the infusion, a very strong one Dilution of the plasnmin solution entails and the removal of amino acids occurs from the blood and tissue fluids many times as fast as the removal of plasmin, for the purposes of the invention there is the possibility of Use lysine in concentrations well above 2 millimoles per unit of plasmine. Indeed there is no physiological upper limit for the amount of amino acid used, beyond which toxic phenomena would occur and which would have a value compared to the amounts of amino acids required for the purposes of the invention would be completely different.

Aus klinischen Gründen wird man bei intravenöser Verabreichung im allgemeinen zögern, eine Plasminlösung zu verwenden, die eine solche Menge an Aminosäure enthält, daß ein Teil davon in der Plasminlösung als Suspension in ungelöstem Zustand vorliegt. Unter Berücksichtigung eines praktischen Gesichtspunktes wird die Löslichkeit der Aminosäure folglich als Maßstab für die bei intravenöser Injektion, einschließlich Infusion, anzuwendende maximale Aminosäuremenge angesehen. Die Löslichkeit der verschiedenen Aminosäuren ergibt sich aus der Literatur und ist in den meisten Fällen so groß, daß die angestrebte Stabilisierung eintritt, ohne daß es erforderlich wäre, konzentrierte Aminosäurelösungen zu verwenden.For clinical reasons, intravenous administration im general reluctance to use a plasmin solution that contains such an amount of amino acid contains that part of it in the plasmin solution as a suspension in the undissolved state is present. Taking into account a practical point of view, the solubility becomes the amino acid consequently as a benchmark for intravenous injection, including Infusion, maximum amount of amino acids to be used. The solubility of the various Amino acids emerges from the literature and is in most cases so large that the desired stabilization occurs without it being necessary, concentrated To use amino acid solutions.

Wenn die Plasminlösung zur Infusion bestimmt ist, wird die optimale Aminosäurekonzentration durch diejenige Konzentration festgelegt, welche die gewünschte Stabilität bei der Infusionstemperatur (10 bis 36°C) während der Infusionsdauer (bis zu 3 bis 4 Stunden) ergibt. In Zahlen ausgedrückt heißt dies, daß zweckmäßigerweise eine Aminosäurekonzentration von 0,005 bis 1 Millimol pro Plasmineinheit - je nach der verwendeten Aminosäure --- angewandt wird.If the plasmin solution is intended for infusion, it will be the optimal one Amino acid concentration determined by that concentration, which is the desired Stability at infusion temperature (10 to 36 ° C) for the duration of the infusion (up to 3 to 4 hours). Expressed in numbers, this means that it is expedient an amino acid concentration of 0.005 to 1 millimole per plasmin unit - depending on the amino acid used --- is applied.

Bei den oben beschriebenen Versuchen wurden Plasminlösungen mit einem Plasmingehalt von 0,3 und 0,4 Einheiten pro Kubikzentimeter verwendet. Falls stärker konzentrierte Lösungen verwendet werden, beispielsweise mit 10 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter, tritt ein merkbarer Anfangsverlust an Plasmin sofort bei Einstellung eines pH-Wertes von 2 bis 3 auf neutrale Reaktion ein, wenn keine Aminosäuren in genügender Menge vorliegen. So entsteht im Verlauf von wenigen Minuten ein anfänglicher Verlust von 20°/0, wenn beispielsweise eine angesäuerte Plasminlösung mit 10 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter auf pH 7,5 bei 25°C eingestellt wird, welbst wenn in der Lösung Lysin in einer Menge von 0,002 Millimol pro Plasmineinheit vorhanden ist. Solche anfänglichen Verluste können jedoch durch Steigerung der Aminosäurekonzentration vermieden werden. Mit einem Lysingehalt an 0,04 Millimol pro Plasmineinheit ist es möglich, unter den obenerwähnten Versuchsbedingungen den Anfangsverlust völlig auszuschließen.In the experiments described above, plasmin solutions with a Plasma contents of 0.3 and 0.4 units per cubic centimeter are used. If stronger concentrated solutions can be used, for example with 10 plasmin units per cubic centimeter, a noticeable initial loss of plasmin occurs immediately upon discontinuation a pH value of 2 to 3 on a neutral reaction, if no amino acids in sufficient quantity are available. This creates an initial one over the course of a few minutes Loss of 20% if, for example, an acidified plasmin solution with 10 plasmin units per cubic centimeter is adjusted to pH 7.5 at 25 ° C, even if in solution Lysine is present in an amount of 0.002 millimoles per unit of plasmin. Such However, initial losses can be caused by increasing the amino acid concentration be avoided. With a lysine content of 0.04 millimoles per unit of plasmin it is possible, under the above-mentioned experimental conditions, to completely eliminate the initial loss to exclude.

Bei der Herstellung von konzentrierten Plasminlösungen mit neutraler Reaktion müssen die erwähnten Umstände berücksichtigt werden.In the production of concentrated plasmin solutions with neutral Reaction, the circumstances mentioned must be taken into account.

Um die gewünschte Stabilisierung gemäß der Erfindung zu erreichen, kann in verschiedener Weise vorgegangen werden.In order to achieve the desired stabilization according to the invention, can be done in different ways.

So kann eine Plasminlösung, die unter sterilen Bedingungen filtriert wurde, hergestellt werden, wonach das Plasmin aus der Lösung isoliert wird, beispielsweise durch Ausfriertrocknung. Es wird dann ausgesalzen oder ausgefällt und in Phiolen abgefüllt, falls eine solche Abfüllung nicht bereits während der Isolierarbeitsstufe stattgefunden hat. Es wird ebenfalls eine Aminosäurelösung hergestellt, die steril filtriert und in Phiolen abgefüllt ist. Unmittelbar vor der Verwendung des Plasmins wird dieses aus der Phiole in der Aminosäurelösung aufgelöst, wodurch eine sterile und stabile Plasminlösung erhalten wird, die für den Gebrauch bereitsteht.So can a plasmin solution that is filtered under sterile conditions , after which the plasmin is isolated from the solution, for example by freeze drying. It is then salted out or precipitated and placed in vials bottled, if such a bottling is not already carried out during the insulation work stage has taken place. An amino acid solution is also made that is sterile filtered and filled into vials. Immediately before using the plasmin this is dissolved from the vial in the amino acid solution, creating a sterile and stable plasmin solution is obtained ready for use.

Es ist auch möglich, eine sterile filtrierte Plasminlösung herzustellen, die ein oder mehrere Aminosäuren enthält und die Mischung in einen Trockenzustand, beispielsweise durch Ausfriertrocknung oder Ausfällung, zu überführen und die trockene Mischung in Phiolen abzufüllen. Unmittelbar vor Gebrauch des Plasmins wird die trockene Mischung in sterilem Wasser, einer Pufferlösung od. dgl. aufgelöst, wodurch eine stabile Plasminaufbereitung erhalten wird.It is also possible to prepare a sterile filtered plasmin solution, which contains one or more amino acids and the mixture in a dry state, for example by freeze-drying or precipitation, to transfer and the dry Fill the mixture into vials. Immediately before using the plasmin, the dry Mixture in sterile water, a buffer solution or the like. Dissolved, whereby a stable plasmin processing is obtained.

Weiterhin ist es möglich, eine sterile Plasminlösung herzustellen, die auf einen pH 1 bis 4 eingestellt ist. Eine solche saure Lösung ist über mehrere Monate stabil, wenn sie bei 4 bis 5°C gelagert wird. Durch Vermischung einer solchen Lösung vor Gebrauch mit einer sterilen Aminosäurelösung, die entweder mit einem der üblichen Säure-Base-Puffersysteme gepuffert wurde oder einen genügenden Aminosäuregehalt besitzt, besteht die Möglichkeit, eine neutrale stabile P_lasminlösung zu erzielen.It is also possible to produce a sterile plasmin solution, which is adjusted to a pH of 1 to 4. Such an acidic solution is about several Stable for months when stored at 4 to 5 ° C. By mixing such Before use, dissolve with a sterile amino acid solution containing either a the usual acid-base buffer systems or a sufficient amino acid content there is the possibility of achieving a neutral, stable plasma solution.

Schließlich ist es möglich, eine sterile Plasminlösung mit dem erforderlichen Gehalt an Aminosäure herzustellen, die auf einen pH-Wert von 1 bis 5, vorzugsweise 2 bis 3, eingestellt ist. Durch Vermischung einer solchen Lösung mit einer sterilen wäßrigen Lösung, die entweder mit einem der üblichen Säure-Base-Puffersysteme gepuffert ist oder die lediglich genügend Base enthält, ist es möglich, zu einer neutralen und stabilen Plasminlösung zu gelangen.Finally, it is possible to use a sterile plasmin solution with the required Produce amino acid content, adjusted to a pH of 1 to 5, preferably 2 to 3 is set. By mixing such a solution with a sterile one aqueous solution, either buffered with one of the usual acid-base buffer systems or which only contains enough base, it is possible to use a neutral and stable plasmin solution.

Um die praktische Anwendbarkeit der Erfindung zu verdeutlichen, wird auf die nachstehenden Beispiele Bezug genommen, die die Herstellung von stabilen Plasminlösungen beschreiben, die vorzugsweise zu Infusionszwecken anwendbar sind. Beispiel 1 50m1 einer Plasminlösung mit einem pH-Wert von 2,5 und mit 10 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter werden unter sterilen Bedingungen filtriert, einer Ausfriertrocknung unterworfen und in Phiolen abgefüllt. 50 ml einer 0,2molaren Phosphatpufferlösung, die Lysin in einer Konzentration von 0,4 Mol pro Liter enthält, werden steril filtriert und ebenfalls in Phiolen abgefüllt. Unmittelbar vor Verwendung des Plasmins wird das durch Ausfrieren getrocknete Plasmin in der Lysinlösung aufgelöst, wodurch eine sterile stabilisierte Plasminaufbereitung mit einem pH von 7,5 erhalten wird. Beispiel 2 50 ml einer Plasminlösung mit einem pH-Wert von 7,5 und mit 10 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter und 0,1 Mol e-Aminokapronsäure pro Liter werden steril filtriert, einer Ausfriertrocknung unterworfen und in Phiolen abgefüllt. Unmittelbar vor Verwendung des Plasmins wird die durch Ausfriertrocknung erhaltene Aufbereitung in 50 ml destilliertem Wasser gelöst, wodurch eine sterile stabilisierte Plasminaufbereitung mit einem pH von 7,5 erhalten wird.To illustrate the practical applicability of the invention, is Reference is made to the following examples which illustrate the manufacture of stable Describe plasmin solutions that are preferably applicable for infusion purposes. Example 1 50 ml of a plasmin solution with a pH of 2.5 and with 10 plasmin units per cubic centimeter are filtered under sterile conditions, a freeze-drying subjected and bottled in vials. 50 ml of a 0.2 molar phosphate buffer solution, which contains lysine in a concentration of 0.4 mol per liter are sterile filtered and also filled into vials. Immediately before using the plasmin the plasmin, dried by freezing, is dissolved in the lysine solution, whereby a sterile stabilized plasmin preparation with a pH of 7.5 is obtained. example 2 50 ml of a plasmin solution with a pH of 7.5 and with 10 plasmin units per cubic centimeter and 0.1 mol of e-aminocaproic acid per liter are sterile filtered, subjected to freeze-drying and filled into vials. Immediately before use of the plasmin, the preparation obtained by freeze-drying is distilled in 50 ml water dissolved, creating a sterile stabilized plasmin preparation with a pH of 7.5 is obtained.

Beispiel 3 45 ml einer Plasminlösung mit einem pH-Wert von 2,5 und mit 20 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter werden steril filtriert und in Phiolen abgefüllt. 10 ccm eines lmolaren Phosphatpuffers (pH 7,5) mit einer Lysinkonzentration von 1 Mol pro Liter werden steril filtriert und ebenfalls in Phiolen abgefüllt. Unmittelbar vor Verwendung der Plasminlösung werden dieser 5 ml der Lysinlösung zugesetzt, wodurch eine sterile stabilisierte Plasminaufbereitung mit einem pH-Wert von 7,5 hergestellt wird.Example 3 45 ml of a plasmin solution with a pH of 2.5 and at 20 plasmin units per cubic centimeter are sterile filtered and placed in vials bottled. 10 cc of an imolar phosphate buffer (pH 7.5) with a lysine concentration of 1 mol per liter are sterile filtered and also filled into vials. Immediately before using the plasmin solution, this is 5 ml of the lysine solution added, creating a sterile stabilized plasmin preparation with a pH of 7.5 is made.

Beispiel 4 45 ml einer Plasminlösung mit einem pH-Wert von 3,0 und mit 6 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter und 948 mg L-Arginin-Hydrochlorid werden steril filtriert und in Phiolen abgefüllt. 10 ml einer lmolaren Phosphatpufferlösung werden steril filtriert und ebenfalls in Phiolen abgefüllt. Unmittelbar vor Verwendung der Plasminlösung werden 5 ml des Phosphatpuffers dieser zugesetzt, wodurch eine sterile stabilisierte Plasminaufbereitung mit einem pH 7,0 erhalten wird.Example 4 45 ml of a plasmin solution with a pH of 3.0 and with 6 plasmine units per cubic centimeter and 948 mg L-arginine hydrochloride sterile filtered and filled into vials. 10 ml of an 1 molar phosphate buffer solution are sterile filtered and also filled into vials. Immediately before use 5 ml of the phosphate buffer are added to the plasmin solution, whereby a sterile stabilized plasmin preparation with a pH 7.0 is obtained.

Beispiel 5 Eine Plasminlösung in verdünnter Schwefelsäure mit einem pH 2 bis 3 wird steril filtriert und einer Ausfriertrocknung unterworfen. Eine Lösung von L-Lysinmonohydrochlorid in Phosphatpufferlösung wird steril filtriert und ausfriergetrocknet. Die durch Ausfriertrocknung erhaltenen Substanzen werden miteinander in solchen Anteilen vermischt, daß die Mischung 0,04 Millimol Lysin pro Plasmineinheit enthält. Eine 500 Plasmineinheiten entsprechende Menge der hergestellten Mischung wird unter sterilen Bedingungen in ein Infusionsgefäß mit einem Volumen von 500 ccm übergeführt. Das Gefäß wird nach teilweiser Evakuierung dicht verschlossen. Unmittelbar vor Verwendung wird ein injizierbares Lösungsmittel in geeigneter Menge dem Gefäß zugesetzt, beispielsweise in Form von sterilem destilliertem Wasser, einer sterilen Glukoselösung oder sterilem Salzwasser. Durch das in dem Gefäß herrschende Teilvakuum wird dieser Zusatz erleichtert. Der pH-Wert der Lösung liegt zwischen 7,0 und 7,5.Example 5 A plasmin solution in dilute sulfuric acid with a pH 2 to 3 is filtered sterile and subjected to freeze-drying. A solution of L-lysine monohydrochloride in phosphate buffer solution is sterile filtered and freeze-dried. The substances obtained by freeze-drying become one another in such Mixed proportions so that the mixture contains 0.04 millimoles of lysine per unit of plasmin. An amount of the prepared mixture corresponding to 500 plasmine units is taken under transferred under sterile conditions into an infusion vessel with a volume of 500 ccm. The vessel is tightly closed after partial evacuation. Immediately before use an injectable solvent is added to the vessel in a suitable amount, for example in the form of sterile distilled water, a sterile glucose solution or sterile Salt water. This addition is facilitated by the partial vacuum prevailing in the vessel. The pH of the solution is between 7.0 and 7.5.

Beispiel 6 Zu 1 1 einer Plasminlösung mit pH 2,5 und mit 5,0 Einheiten Plasmin pro Kubikzentimeter werden 36,6g L-Lysinmonohydrochlorid bei 0 bis 5°C zugesetzt. Sobald das Lysin aufgelöst ist, wird der pH auf 7,5 eingestellt, und noch bei 0 bis 5°C werden 1,02 g KH2P04 und 7,56 g Na2HP04 # 2H20 zugesetzt. Nachdem der Phosphatpuffer aufgelöst ist, wird die Lösung steril filtriert. Die steril filtrierte Lösung wird in Infusionsgefäße abgefüllt und auch einer Ausfriertrocknung unterworfen. Pro Infusionsgefäß (300 ccm) werden 50 ml der Plasminlösung verwendet. Nach der Ausfriertrocknung werden die Gefäße dicht verschlossen und beschriftet.Example 6 To 1 liter of a plasmin solution with pH 2.5 and with 5.0 units 36.6 g of L-lysine monohydrochloride are added to plasmin per cubic centimeter at 0 to 5 ° C. As soon as the lysine is dissolved, the pH is adjusted to 7.5, and still at 0 Up to 5 ° C, 1.02 g of KH2P04 and 7.56 g of Na2HP04 # 2H20 are added. After the phosphate buffer is dissolved, the solution is sterile filtered. The sterile filtered solution is filled into infusion vessels and also subjected to freeze-drying. Per infusion tube (300 ccm) 50 ml of the plasmin solution are used. Be after freeze-drying the vessels tightly closed and labeled.

Erforderlichenfalls kann die sterile filtrierte Lösung als Ganzes einer Ausfriertrocknung ausgesetzt werden, und das hergestellte Pulver kann danach gemahlen und in Infusionsgefäße abgefüllt werden.If necessary, the sterile filtered solution can be used as a whole be subjected to freeze-drying, and the powder produced can thereafter ground and filled into infusion vessels.

Die Wirkung der erfindungsgemäß stabilisierten Plasminlösungen, die aus Schweineblut erhalten wurden, sind mit ausgezeichneten Ergebnissen geprüft worden, sowohl in Tierversuchen als auch in klinischen Versuchen. Die klinischen Experimente zeigten überhaupt keine antigene Wirkung bei Verwendung von Plasmin. Auf Grund der Stabilisierung enthalten die angewendeten Plasminlösungen geringere Mengen an durch Autolyse zersetztem Plasmin, wodurch toxische Sekundärwirkungen entstehen.The effect of the plasmin solutions stabilized according to the invention, the obtained from pig blood have been tested with excellent results, both in animal studies and in clinical trials. The clinical experiments showed no antigenic effect at all when using plasmin. Due to the The applied plasmin solutions contain smaller amounts of stabilization Autolysis of decomposed plasmin, which creates toxic secondary effects.

Nach den vorgenannten Beispielen werden Lösungen mit 1 bis 18 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter erhalten. Es steht jedoch nichts entgegen, mehr oder weniger konzentrierte Lösungen, beispielsweise bis herunter zu 0,02 Plasmineinheiten und herauf bis zu 23 Plasmineinheiten pro Kubikzentimeter oder noch mehr herzustellen.According to the above examples, solutions with 1 to 18 plasmin units are used obtained per cubic centimeter. However, nothing stands in the way, more or less concentrated solutions, for example down to 0.02 plasmin units and up to 23 plasmin units per cubic centimeter or more.

Claims

Claims: 1. Method for stabilizing therapeutically valuable aqueous plasmin solutions, characterized in that one or more amino acids can be added.

2. The method according to claim 1, characterized in that a aliphatic aminomonocarboxylic acid is used.

3. One or both of the methods of the preceding claims, characterized in that an amino acid is used which has at least one amino group bonded to a carbon atom is that at least one carbon atom from the carboxyl group or groups the amino acid is separated.

4. The method according to one or more of the preceding Claims, characterized in that an aliphatic aminomonocarboxylic acid with more than 3 carbon atoms and one terminal amino group is used.

5. The method according to one or more of the preceding claims, characterized in, that the amino acid in an amount of at least 0.005 millimoles per plasmin unit, preferably 0.05 to 1 millimole per plasmin unit is used.

6. Procedure according to one or more of the preceding claims, characterized in that s-aminocaproic acid or a, e-diaminocaproic acid is used as a stabilizer.