DE1276295B - Verfahren zur Herstellung von ª‡-AEscin - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von a-Ascin Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von a-Ascin aus Teilen des Roßkastanienbaumes, insbesondere Roßkastaniensamens, das im Vergleich zum p-Äscin nur etwa halb so stark hämolytische Wirkung aufweist.
• Bemerkt sei, daß nach den bisherigen Untersuchungen weder das ß-Äscin noch das o;-Äscin einheitliche Stoffe darstellen; es handelt sich nach den bisherigen Erkenntnissen um Glykosidgemische mit ähnlichen chemisch-physikalischen Eigenschaften (z. B. Verteilungsverhalten in zweiphasigen Lösungsmittelgemischen oder auf Adsorbentien).
• Es wurde nun gefunden, daß unter bestimmten Bedingungen eine Umwandlung des ß-Äscins zum a-Äscin gelingt, ohne daß dabei erhebliche Verseifung zu acylärmeren Produkten stattfindet, die bekanntlich relativ leicht bei Roßkastaniensaponinen im alkalischen Milieu durch Verseifen unter Abspaltung ihrer Acylgruppen zum schwerlöslichen, hämolytisch unwirksamen Äscinol vor sich geht.
• Gemäß der Erfindung wird aus einem Roßkastanienextrakt unter Umwandlung des ß-Äscins, das im frischen Extrakt den Anteil an oc-Äscin weit übersteigt, ein großer Anteil an dem wertvollen O aiscin mit einem HI von etwa 1 :15 000 bis 1 : 22 000, z. B. 1 :18 000 hergestellt.
• Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß das ß-Äscin sich in oc-Äscin dann umwandeln läßt und eine Abspaltung von Acylgruppen bzw. eine Verseifung zu Äscinol sich - mindestens im wesentlichen - vermeiden läßt, wenn die Acidität eines wäßrig-alkoholischen Extraktes bzw. einer ß-Äscinlösung verringert und die Reaktion der Lösung durch Zugeben von etwa neutral reagierenden Puffersubstanzen oder einfacher von alkalischen Mitteln, z. B.
• Natronlauge, auf einen pH-Wert von 5,0 bis 7,5, jedenfalls über 4,5, vorzugsweise über 6,0 und unterhalb 7,0 eingestellt wird, so daß die Erfindung vorschlägt, eine ß-Äscin enthaltende Lösung auf einen pH-Wert im Bereich von über 4,5 und unterhalb 7,5, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 7, insbesondere über 6 und unterhalb 7 einzustellen und eine solche Lösung stehenzulassen.
• Es wurde festgestellt, daß im etwa neutralen Milieu das ß-Äscin in Form eines Anions vorliegt, das sich beim Lagernlassen bei Raumtemperatur und rascher bei erhöhter Temperatur, vorzugsweise im Bereich von 50 bis 3.000 C in oc-Äscin umwandelt, d. h. in ein Produkt, das mit einem niedrigen HI eine hohe pharmakologische Wirksamkeit verbindet, ohne daß dabei größere Mengen an hämolytisch unwirksamen Verseifungsprodukten entstehen.
• Bekannt ist, daß das ß-Äscin sich durch 50stündiges Verreiben im Mörser in ein röntgenamorphes Produkt überführen läßt, das zu 20/0 über einige Stunden in Wasser gelöst bleibt. Ebenso ist die Einführung von ein bis drei Acetylgruppen beschrieben, die zu einer Löslichkeitssteigerung führen. Schließlich ist die Gewinnung von oc-Äscin aus dem mit Cholesterin fällbaren Saponinanteil von Roßkastanienextrakten bekannt.
• Während einerseits die Gewinnung von a-Äscin über das Saponin-Cholesterid relativ umständlich ist, andererseits das mikronisierte Äscin nur instabile Lösungen geringer Konzentration ergibt, führt eine Acetylierung bereits zu einem partiell synthetisch veränderten Äscin.
• Nach der Erfindung dagegen gelingt es auf einfache Weise, aus dem in Wasser schwer löslichen ß-Äscin ein leichtlösliches Produkt herzustellen, das in Wasser über Jahre hinaus stabil in Lösung bleibt.
• Wäßrige Lösungen von cu-Ascin lassen sich in Konzentrationen von 0,01 bis iOO/o in der Hitze sterilisieren, ohne daß dabei ein Rückgang an hämolytischer Aktivität eintritt.
• Hochprozentige (10 bis 20°/o), wäßrige a-Ascinlösungen neigen nach längerem Lagern zu einer Assoziatbildung, die sich in der Bildung von Gallerten bemerkbar macht. Kurzes Erwärmen auf 50 bis 600 C bringt diese Erscheinung wieder zum Verschwinden, ohne daß dabei Ausfällungen eintreten.
• Auf Grund dieser günstigen chemisch-physikalischen Eigenschaften sind o;-Ascinlösungen als Injektionspräparat ebenso geeignet wie für eine orale Anwendung.
• Es hat sich herausgestellt, daß oc-Äscin trotz seines verhältnismäßig geringen hämolytischen Index (HI) eine erhebliche antiödematöse Wirkung aufweist, die sich am Verbrennungsödem messen läßt.
• Die hämolytische Aktivität der Roßkastaniensaponine wird vorzugsweise gemäß der im folgenden beschriebenen photometrischen Methode, die optimal genaue Werte liefert, festgestellt. Gemessen wird die Extinktion des in Lösung gegangenen Blutfarbstoffes, stabilisiert als Cyanhämoglobin.
• Man setzt diejenige Konzentration des Testsaponins mit der des Standardsaponins (ß-Äscin, HI = 1:40000) ins Verhältnis, die die Auflösung der Hälfte einer 20/oigen Erythrocytensuspension (erhalten durch Vermischen von 1 ml 4e/Oiger Hammel-Erythrocytensuspension mit 1 ml Saponinlösung) bei pH 7,2 nach 24stündigem Stehen bei Raumtemperatur verursacht.
• Bisher ist man von anderer Seite den Weg gegangen, das für besonders wirksam angesehene ß-Ascin zu gewinnen, und hat geglaubt, daß das, was im Extrakt an Roßkastaniensaponinen nach Fällung und Abtrennen des ß-Siscins übrigbleibt, entweder völlig wertlos sei (infolge des geringen HI) bzw. wenig Wert habe und verworfen werden könne, da es von der Fällung nicht erfaßte Spuren von ß-Äscin seien.
• Die Erfindung lehrt nun einen entgegengesetzten Weg, d. h., es soll so viel wie möglich oc-Äscin gewonnen werden, und zwar weit mehr als in dem frischen Extrakt frischer Kastanien vorliegt. ~~~ Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird von einem Roßkastanienextrakt ausgegangen, insbesondere von einem frisch bereiteten Roßkastanienauszug aus frisch geernteten Roßkastaniensamen; anschließend an die Extraktion wird nach dieser Ausführungsform der Erfindung der Extrakt in an sich bekannter Weise auf ß-Äscin aufgearbeitet, z. B. durch Zusetzen von starker Säure oder durch Verwendung eines Kationenaustauschers, wobei das ß-Äscin in seiner Säureform zur Ausfällung gebracht wird.
• Dieses ß-Äscin wird dann in die Form seines Salzes, vorzugsweise Alkalisalzes, z. B. Natriumsalz, übergeführt, z. B. durch Hinzufügen von wäßriger Natronlauge, bis ein pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 7,5, insbesondere 6,4 bis 6,9 erreicht ist. Diese Lösung wird entweder bei Raumtemperatur belassen oder vorzugsweise erwärmt, wobei in Abwesenheit von Puffersubstanzen durch geringfügige Abspaltung von Acylresten der pH auf etwa 6 absinken kann und in ein wasserlösliches Produkt umgewandelt wird.
• Wird nach erfolgter Umwandlung zum wasserlöslichen Saponin die Aufbewahrungsfrist im Reaktionsmilieu weit überschritten, so tritt in Abhängigkeit von pH, Temperatur und Konzentration die bereits früher beobachtete Abspaltung der Acylgruppen ein, die zu hämolytisch unwirksamen Produkten mit geringer Löslichkeit führt.
• Bevorzugt ist - wie oben ausgeführt - die Umwandlung des gesamten ß-Äscins in ou-Äscin, d. h. die Gewinnung der Roßkastaniensaponine des Extraktes zur Gänze als a-Äscin.
• Für die Umwandlungsgeschwindigkeit von ß-Äscin zu a-Äscin ist neben Temperatur und Konzentration vor allem der pH-Wert der Lösung entscheidend. Im pH-Bereich 4,5 bis 2,5 ist die Reaktion stark gehemmt. Unter pH 2,5 steigt die Reaktionsgeschwindigkeit wieder an, wobei sich als Nebenreaktion eine Glykosidspaltung mit zunehmender Wasserstoffionenkonzentration bemerkbar macht. Ab pH 4,5 beschleunigt sich die Umwandlung mit steigenden pH-Werten, wobei nach Überschreiten des Äquivalenzpunktes (pH 7,5) mit sinkender Wasserstoffionenkonzentration die Bildung von Verseifungsprodukten zunimmt.
• Ebenfalls ist für die Geschwindigkeit der Umwandlung und auch das Maß der Umwandlung die Temperatur, bei der die Lösung gehalten wird, von Belang. Hier ergaben sich günstige Wirkungen im Bereich von Raumtemperatur bis 100, vorzugsweise 50 bis 960 C.
• Statt aus der Extraktlösung das ß-Ascin durch Ansäuern oder Passage durch einen Kationenaustauscher auszufällen und auf diese Weise das ß-Äscin aus dem Extrakt, d. h. von dem a-Ascin und den übrigen Extrakt-Inhaltsstoffen zu trennen, kann nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform auch so vorgegangen werden, daß der frisch bereitete Roßkastanien-Auszug in der Nähe des Neutralpunktes bei Raumtemperatur oder kürzer bei erhöhter Temperatur belassen wird, wobei die Umsetzung des anfänglich als ß-Äscin im Extrakt vorliegenden Anteils z. B. quantitativ in ov-Äscin erfolgt. Bezüglich Zeit, Temperatur, Konzentration und pH-Werten gelten auch für diese Ausführungsform die oben angegebenen Regeln.
• Die folgende Tabelle zeigt die Umwandlung von ß-Äscin in a-Äscin in Abhängigkeit von Zeit, Temperatur, Konzentration und pH.
• Als Versuchssubstanz wurde ein durch mehrfaches Umfällen hochgereinigtes ß-Äscin (Schmelzpunkt 223 bis 2240 C) gewählt, das in l50loiger wäßriger Suspension nach Versetzen mit Natronlauge bis pH 6,9 in das wasserlösliche Salz übergeführt wurde.
• Der Verlauf der Reaktion wurde entweder durch Auswaage des noch vorhandenen ß-Äscinanteils und durch Messung der hämolytischen Aktivität des Reaktionsgemisches verfolgt. Zur Bestimmung des noch vorhandenen ß-Ascins wurde das Reaktionsgemisch über eine Kationenaustauschersäule gegeben und die abfließende saure Lösung 7 Minuten auf 960 C erhitzt. Das dabei ausfallende j6-Äscin wurde abgetrennt und das in Lösung verbliebene a-Äscin im Vakuum zur Trockne gebracht und gravimetrisch bestimmt. Die hämolytische Aktivität des -Äscins war zu jedem Zeitpunkt der Reaktion gegenüber dem ß-Äscin auf etwa die Hälfte abgesunken Prozentualer Anteil an a:-Äscin nach Umlagerung von ß-Ascin Ansatz: Konzentration 1% Temperatur 900 C pH 6,9 Messung gravimetrisch Reaktionszeit . . 2 Stunden 3,5 Stunden 5 Stunden 6,5 Stunden 9 Stunden a-Äscinanteil .. 49 ovo 74°/o 84°/o 87°/o 100 O/o Ansatz: Konzentration iOO/o Temperatur 900 C pH 6,9 Messung gravimetrisch Reaktionszeit . . 3,5 Stunden 5 Stunden 6,5 Stunden 10 Stunden 14 Stunden 18 Stunden oo-Äscinanteil .. 43 O/o 55°/o 64°/o 74O/o 85°/o 100% Ansatz: Konzentration 10/o Temperatur 680 C pH 6,9 Messung gravimetrisch Reaktionszeit 24 Stunden 48 Stunden 72 Stunden a-Äscinanteil .. 470/0 80% 92 ovo Ansatz: Konzentration 100/o Temperatur 680 C pH 6,9 Messung gravimetrisch Reaktionszeit .. 24 Stunden 48 Stunden 72 Stunden 96 Stunden «-Äscinanteil .. 190/0 400/0 48% 77 ovo Ansatz: Konzentration 1 O/o Temperatur 500 C pH 6,9 Messung gravimetrisch Reaktionszeit.. 68Stunden a-Äscinanteil .. 260/0 Ansatz: Konzentration 0,10/0 Temperatur 1000 C pH 5,2 Messung Ht Reaktionszeit . . 0,5 Stunden 1,5 Stunden 2,5 Stunden 3,5 Stunden 5,0 Stunden a-Äscinanteil . . 440/o 72% 81°/o 91 0/o 1000/o Ansatz: Konzentration 0,1 0/o Temperatur 220 C pH 7,4 Messung HI Reaktionszeit 68 Stunden 142 Stunden 244 Stunden 333 Stunden 404 Stunden o scinanteil .. 44 0/o 56% 75% 84 ovo 96°/o Beispiel 1 10 g ß-Ascin werden in 50 ml Wasser suspendiert, vorsichtig mit 1 n-NaOH auf pH 6,9 gebracht und die klare Lösung mit Wasser auf 100ml verdünnt.
• Die 100/oige Natriumäscinatlösung wird über Nacht (14 Stunden) auf 900 C erhitzt, nach dem Abkühlen mit 100 ml Wasser versetzt und über eine Kationenaustauschersäule (etwa 50 ml Austauscher) gegeben.
• Die abfließende saure Lösung wird 7 Minuten auf etwa 900 C erhitzt und der sich bildende ß-Äscin-Niederschlag abzentrifugiert. Die leicht trübe Lösung wird durch Druckfilter geklärt und das Filtrat im RotationsverdampferunterVakuum zurTrocknegebracht.
• Ausbeute: 850/0 -Äsdnsäure, HI etwa 1 : 20000.
• Beispiel 2 10 g ß-Äscin werden in 50 ml Wasser suspendiert, vorsichtig mit 1 n-KOH auf pH 6,9 gebracht und die klare Lösung auf 100 ml verdünnt. Die 100/oige Kaliumäscinatlösung wird im geschlossenen Gefäß 6,5 Stunden auf 1000 C erhitzt und nach dem Abkühlen über eine Kationenaustauschersäule gegeben.
• Die sauer abfließende Lösung zeigt nach 10 Minuten langem Kochen keinen ß-Äscin-Niederschlag. Die Lösung wird im Rotationsverdampfer unter Vakuum zur Trockne gebracht.
• Ausbeute: 100°/o oc-Äscinsäure, HI etwa 1: 20000.
• Beispiel 3 1 g ß-Äscin-Natrium wird in 1000 ml 0,15 Mol Phosphatpuffer (pH 7,4) gelöst und nach Sterilfiltration in sterilen Gefäßen bei Raumtemperatur 400 Stunden belassen. Der HI des in Lösung vorliegenden a-Äscins beträgt etwa 1: 20 000.
• Beispiel 4 1 g ß-Äscin-Natrium wird mit 1000 ml 0,15 Mol Acetatpuffer (pH 5,2) aufgenommen und im geschlossenen Gefäß 5 Stunden auf 1000 C erhitzt. Die anfäglich trübe Lösung (= Anteil an ß-Äscinsäure bei pH 5,2) ist bereits nach kurzer Erhitzungszeit verschwunden. Der HI des in Lösung vorliegenden a-Äscins beträgt etwa 1: 10 000.
• Beispiel 5 Ein aus getrockneten Kastanien mit etwa 600/oigem Äthanol oder Methanol bei Raumtemperatur frisch gewonnener Extrakt wird vom Alkohol befreit, auf 100/o Trockenrückstand eingestellt und bis pH 6,7 vorsichtig mit NaOH versetzt. Nach zweistündigem Erhitzen auf 960 C läßt sich im Gegensatz zum nicht erhitzten Extrakt durch Ansäuern auf pH 2 und weiteren 10 Minuten langem Erhitzen auf 960 C kein ß-Äscin mehr ausfällen. Die hämolytische Aktivität des erhitzten Extraktes ist um etwa ein Viertel abgesunken.
• Nachdem im Screening am Verbrennungsödem der depilierten Rattenbauchhaut nach der Methode von Spector und Willoughby es-Äscin in Dosen bis 0,25 mg/kg i. v., 16 Stunden vor Ödemprovokation verabreicht, das Ödem um 47 % gegenüber unbehandelten Kontrolltieren hemmte, bestimmten wir die ED 50 am Aerosil-Pfotenödem der Ratte. Die mittlere wirksame Dosis und die dazugehörigen Vertrauensgrenzen für 95 % Wahrscheinlichkeit betrugen 0,56 (0,41 bis 0,77) mg/kg i. v.
• Die akute Toxizität von o;-Äscin nach intravenöser Applikation und einer Beobachtungszeit von 7 Tagen ergab für verschiedene Species folgende LD-50-Werte: Maus . . 2,8 (2,0 bis 3,9) mg/kg Ratte ....... . 2,4 (1,7 bis 4,0) mg/kg Meerschweinchen .. . 18,5 (15,4 bis 22,2) mg/kg Diese Ergebnisse zeigen, daß α-Ärscin bei relativ geringer Toxizität eine gute ödemhemmende Wirkung besitzt.

Claims (2)

1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Herstellung von a-Äscin, dadurch gekennzeichnet, daß ß-Äscin durch Belassen in Lösungen mit einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 7,5 - gegebenenfalls in der Wärme - zu Äscin umgelagert wird.
2. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als ß-Äscin-Lösung ein frischer Roßkastanienextrakt verwendet wird.