DE634969C - Verfahren zur Gewinnung von wasserloeslichen Vitaminen der B-Gruppe - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung von wasserlöslichen Vitaminen der B-Gruppe Gegenstand des Patentes 607 5122 ist ein Verfahren zur Gewinnung von wasserlöslichen Vitaminen der B-Gruppe. Das Verfahren besteht darin, daß man die genannten Vitamine aus ihren Lösungen adsorbiert und aus dem Adsorbat mit Aminen, insbesondere mit cyclischen, tertiären Aminen eluiert.
• Bei der weiteren Bearbeitung des Erfindungsgegenstandes wurde nun gefunden, daß man bei der Verarbeitung Vitamin B 2-haltiger Lösungen in vorteilhafter Weise vor der nach dem Verfahren des Patentes 607 512 vorzunehmenden Adsorption eine an sich bekannte Fällung mit Aceton einschaltet, die Fällung in Wasser löst und aus der klar zentrifugierten Lösung nach dem Verfahren des Patentes 607 Sie die Vitamine in an sich üblicher Weise adsorbiert und aus dem Adsorbat mit Aminen eluiert.' Zum Eluieren kann auch Ammoniaklösung Verwendung finden. Die so erhältlichen Vitamin B 2-haltigen Eluate kann man weiterreinigen und ihren Vitamingehalt anreichern, wenn man sie nach dem Einengen durch Behandeln mit wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln und durch Zusatz von Metallsalzen in saurer Lösung von Begleitstoffen in an sich üblicher Weise befreit, aus der neutralen oder schwach alkalischen Lösung die Vitamine mit Metallsalzen in bekannter Weise ausfällt, die Fällung in üblicher Weise, z. B. mit Schwefelwasserstoff, zerlegt und den Metallniederschlag abscheidet.
• Die so erhältlichen Lösungen zeichnen sich durch eine leuchtend gelbe Farbe mit ausgeprägter Fluoreszenz im Grünen aus. Diese neuen Farbstofflösungen sind außerordentlich lichtempfindlich und werden bereits bei längerer Belichtung mit sichtbarem Licht verändert. Dabei wurde die überraschende Tatsache festgestellt, daß gleichzeitig mit der Lichtveränderung der Farbstoffe eine Zerstörung des wasserlöslichen Vitamins B 2 - stattfindet. Es ist dabei nicht erwiesen, ob das Vitamin wegen seines eigenen Farbstoffcharakters oder infolge photochemischer Sensibilisierung durch die begleitenden Farbstoffe lichtempfindlich ist. Im Hinblick auf die Lichtempfindlichkeit des Vitamins ist es zweckmäßig, unter völligem Lichtabschluß zu arbeiten.
• Zu einem farbigen Präparat mit hoher Vitaminwirkung kann man gelangen, wenn man die obenerwähnte, nach Zerlegung der Metallsalzfällung anfallende Lösung, gegebenenfalls nach vorherigem Einengen, mit in Wasser schwerlöslichen Alkoholen, wivButylalkohol, Ämylalkohol >und Cyclohexanol ex@. trahiert und das Extraktionsmittel entfernt.
• Die den wirksamen Stoff enthaltenen Lt sungen haben gelbe Farbe und zeigen bef@_ neutraler Reaktion eine ausgesprochene Fluoreszenz im Grünen. Die Lösungen zeigen hinsichtlich ihrer Fluoreszenz amphoteren Charakter. Bei deutlich alkalischer und stark saurer Reaktion verschwindet die Fluoreszenz reversibel, die gelbe Färbung bleibt jedoch erhalten.
• Die Farbstärke geht in allen bisher untersuchten Fällen parallel mit dem biologischen Wirkungsgrad. Lösungen, die Farbe und Fluoreszenz irreversibel verloren haben, erwiesen sich im Tierversuch immer wieder als wirkungslos, sofern es sich nicht um eine z. B. durch ein Reduktionsmittel verursachte reversible Entfärbung handelt. Dementsprechend haben sich als Ausgangsstoffe für die Wirkungsstoffe des Vitamins B -- solche Stoffe des Tier- und Pflanzenreiches geeignet erwiesen, die durch einen Gehalt gelber, grün fluoreszierender wasserlöslicher Farbstoffe gekennzeichnet sind. Von tierischen Organen sind z. B. reich an Vitamin B z und ari solchen Farbstoffen Leber, Herz und Niere. Beim Huhn enthalten die Beinmuskeln mehr Vitamin B:2 als die Brustmuskulatur. Unterschiede im B --Gehalt der -Milch verschiedener Herkunft finden sich im Gehalt an Farbstoff, der in die Molke übergeht, wieder. Die biologische Auswertung von Frauenmilch und-Kuhmilch ergab z. B. für das Verhältnis des B --Gehaltes den Wert i : 2. Dasselbe Verhältnis wurde kolorimetrisch für die aus den entsprechenden Molken durch Adsorption an Fullererde und Elution gewonnenen Farbstofflösungen gefunden-. Im Hühnerei findet sich Vitamin B 2 zu einem beträchtlichen Teil im Eiklar, das nahezu farblos erscheint. Im frischen Eiklar und im Eieralbumin, die sich als Ausgangsmaterial für das' vorliegende Verfahren besonders bewährt haben, wurde die Anwesenheit wasserlöslicher, gelber, grün fluoreszierender Farbstoffe festgestellt. Ein hochwirksames Farbstoffpräparatkonnte daraus durch das oben gekennzeichnete Verfahren isoliert werden. Im Pflanzenreich -sind verschiedene grüne Blätter, insbesondere Spinat, als Quelle des Vitamins B:2 bekannt. Nach unseren Feststellungen finden sich auch im Spinat gelbe, grün fluoreszierende Farbstoffe. Dasselbe trifft für das bekannteste B:2-Material; die Hefe, zu. Die aus Hefe durch Adsorption an Fullererde und Elution erhältlichen gereinigten Farbstofflösungen haben sich als sehr vitaminreich erwiesen. Charakteristisch für die neuen Farbstoffe ist ihr Verhalten gegenüber Reduktions- und Oxydationsmitteln, insbesondere die folgende _#ydrosulf@t-Bromreaktion. Die wässerige, ;3ei@be, grün fluoreszierende Lösung wird mit .etvas 2 n-Natriumcarbonatlösung versetzt, .it=öbei die Fluoreszenz verschwindet, aber die Farbe erhalten bleibt. Fügt man einige Tropfen verdünnte Natriumhydrosulfitlösung zu, so erfolgt Entfärbung. Säuert man nun mit 2 n-Schwefelsäure an und gibt tropfenweise Bromwasser zu, so kehrt die gelbe Farbe, nach Abstumpfen mit Natriumacetat auch die grüne Fluoreszenz zurück. Die Leukofarbstoffe lassen sich auch durch Methylenblau dehydrieren.
• Von Interesse für die Fraktionierung nahe verwandter Farbstoffe der hier beschriebenen Gruppe ist die chromatographische Adsorptionsanalyse: Wird die aus Herz, Hefe, Eieralbumin u. a. gewonnene Farbstofflösung mit Salzsäure angesäuert und durch eine Säule von Talkum, Kieselgur, aktiver Kieselsäure, Aluminiumoxyd u. dgl. filtriert, so werden gewisse Farbstoffe dabei in Form von Zonen festgehalten, andere gelangen beim Nachwaschen mit dem Lösungsmittel ins Filtrat. Indem man die einzelnen Farbzonen des Chrömatogramms mechanisch trennt und mit verdünntem Ammoniak oder Aminen in der für Fullererde beschriebenen Weise eluiert, wird eine weitere Differenzierung der Farbstoffe erzielt.
• Die wirksamen Substanzen lassen sich aus ihren neutralen oder schwach alkalischen Lösungen in Form schwerlöslicher Metallsalze, z. B. der Silbersalze, abscheiden.
• Die einzelnen Operationen erfolgen unter möglichstem Lichtausschluß beispielsweise wie folgt. Beispiel i i kg käufliches Eieralbumin wird in 3 bis 41 destilliertem Wasser unter zweistündigem Turbinieren gelöst und danach zentrifugiert. Nach Abschäumen wird die Flüssigkeit vom Ungelösten abgegossen und mit dem gleichen Volumen Methylalkohol unter Rühren versetzt. Die so entstandene Albuminfällung wird nach einigem Stehen abgesaugt, mit dem gleichen Volumen Methylalkohol angerührt und nach mehrstündigem Stehen wiederum abgesaugt. Die vereinigten grün fluoreszierenden Filtrate werden auf die Hälfte ihres Volumens im Vakuum eingeengt und das Konzentrat zentrifugiert.
• Zu je 450 ccm der Lösung werden 37 ccm konzentrierte Salzsäure zugesetzt (diese saure Lösung darf nicht unnötig lange stehen) und mit 7 g Fullererde eine Stunde lang gerührt. Nach dem-Zentrifugieren wird die Fullererde so lange mit destilliertem Wasser gewaschen, bis sie frei von Salzsäure ist. Das Adsorbat wird zwecks Elution i1/2 Stunden mit einer Mischung von 16o ccm destilliertem Wasser, 40 ccin Alkohol und 40 ccm Pyridin gerührt,. zentrifugiert und die Lösung im Vakuum auf' 8 bis -io ccm eingeengt. Aus der dunkelbraunen Lösung wird durch Zusatz von Methylalkohol kolloidal gelöste Fullererde ausgeflockt und durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wird danach im Vakuum eingeengt und mit Aceton zur Ausfällung der Begleitstoffe versetzt. Diese Acetonfällung muß nach dem Einengen der erhaltenen Lösung gegebenenfalls nochmäls wiederholt werden, so lange bis nichts mehr gefällt wird. Die grüngelb gefärbte, stark fluoreszierende Lösung wird vom Aceton im Vakuum befreit und, gegebenenfalls unter Wasserzusatz, auf ein Volumen von 25 bis 30 ccm (bezogen auf i kg Albumin) gebracht. Diese Lösung wird mit einigen Tropfen Eisessig versetzt und so lange finit Äther ausgeschüttelt, bis keine gefärbten Substanzen mehr in den Äther gehen. Die wässerige Lösung wird mit dem gleichen Volumen 2n-Salpetersäure versetzt und mit 5 °/oiger Silbernitratlösung gefällt. Dieser im folgenden als Fällung i bezeichnete Niederschlag wird von der Lösung durch Zentrifugieren getrennt und die Lösung mit Ammoniak genau neutralisiert. Das dadurch gefällte braunrot gefärbte Silbersalz (Fällung 2) wird abzentrifugiert, wobei die zentrifugierte Lösung nur schwach gefärbt sein soll. Die Fällung i wird darauf mit 0,5 n-Salpeter= säure aufgerührt und zentrifugiert, worauf die Fällung :2 mit der erhaltenen salpetersauren Lösung durchgerührt wird. Die Fällung 2 geht dabei größtenteils in Lösung. Nach dem Zentrifugieren wird die stark gefärbte Lösung mit n-Ammoniaklösung neutralisiert und der erhaltene braunrote Niederschlag abzentrifugiert. Die Lösung bleibt gefärbt. Der Niederschlag wird dann mit 4, n-Essigsäurelösung durchgerührt, zentrifugiert und die essigsaure Lösung durch Einleiten von Schwefelwasserstoff gefällt. Der Schwefelwasserstoff wird darauf im Vakuum entfernt und die Lösung mehrmals mit Amylalkoliol ausgeschüttelt. Die amylalkoholische Lösung wird im Vakuum auf wenige Kubikzentimeter -eingeengt und der dabei sich abscheidende Niederschlag durch Zentrifugieren von der Mutterlauge befreit. Der Niederschlag -neigt starke Vitaminwirkung und liefert beim Umkristallisieren aus Wasser einen Farbstoff in Form schöner, braungelber Nadeln von gerader Auslöschung, manchmal zu Drusen vereinigt. Im Mikroschmelzpunktapparat erhitzt, verliert der Farbstoff bei etwa 315' die Doppelbrechung. Beispiele 1,5 kg fein zerkleinertes Rinderherz werden in 2 4oo ccm kochendes destilliertes Wasser .eingetragen. Das Kochen wird unter Rühren 8 Minuten fortgesetzt, die Flüssigkeit abgesaugt, auf 400 ccm im Vakuum eingedampft und mit 8oo ccm Aceton versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird in 45o ccm Wasser gelöst und diese Lösung klar zentrifugiert, darauf mit 37 ccm konzentrierter Salzsäure versetzt, wieder zentrifugiert und die erhaltene klare Lösung eine Stunde mit 25 g Fullererde verrührt. Das Adsorbat wird finit Wasser gründlich gewaschen und mit einer Lösung von i2o ccm Wasser, 3o ccm Alkohol und 3o ccm Pyridin il/, Stunden eluiert und das Eluat unter Ausschluß von Licht im Vakuum auf 8 ccm eingeengt. Durch Versetzen mit Methylalkohol und später mit Aceton wird das Eluat von den Begleitstoffen befreit. Man erhält eine gelbe, grün fluoreszierende Lösung von hohem Vitamingehalt und einen Niederschlag brauner - Farbstoffe, die aus Wasser kristallisieren. Beispiel 3 5 kg Bierhefe werden in 21/,l siedendes Wasser eingetragen und unter Rühren io Minuten gekocht. Zu dem etwas getrübten Zentrifugat wird verdünnte Schwefelsäure hinzugefügt, bis die Lösung 0,7 normal sauer ist. Dann wird sie mit 300 g Fullererde 2 Stunden verrührt. Das Adsorptionsmittel wird abzentrifugiert und so lange auf der Zentrifuge gewaschen, bis das Waschwasser neutral gegen Lackmuspapier reagiert. Zur Elution wird die Fullererde i Stunde mit einer Mischung aus 2 1 Wasser, 5oo ccm Methylalkohol und i00: ccm 20 °/oigem Ammoniak geschüttelt. Nach dem Abschleudern der Fullererde und der Entfernung des Methylalkohols und des Ammoniaks im Vakuum wird die stark vitaminhaltige Lösung nach den Angaben des Beispiels i weiter angereichert.

Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE: i. Weitere Ausbildung des Verfahrens zur Gewinnung von wasserlöslichen Vitaminen der B-Gruppe gemäß Patent 607 5 i2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung des Vitamins B2 zur Elution des Vitamins an Stelle von Aminen Ammoniak verwendet und daß man zwecks weiterer Reinigung der vitaminhaltigen Fraktionen die Adsorption und Elution mit Ammoniak oder Aminen zugleich mit einer an sich bekannten Fällung von Begleitstoffen durch mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, gegebenenfalls unter Wiederholung dieser Maßnahme, zur Anwendung bringt, die so erhaltene Lösung des Wirkstoffes, gegebenenfalls nach vorherigem Einengen durch Behandeln mit mit Wasser nick mischbaren Lösungsmitteln und durce:-Zusatz von Metallsalzen in saurer Lösüiib von Begleitstoffen in bekannter Weise befreit, aus der neutralen oder schwach alkalischen Lösung das Vitamin mit Metallsalzen in an sich bekannter Weise ausfällt, die Fällung in üblicher Weise zerlegt, den Metallniederschlag abscheidet und gegebenenfalls aus dem anfallenden Filtrat das Vitamin mit in Wasser schwerlöslichen Alkoholen extrahiert und das Extraktionsmittel entfernt. a. Verfahren nach Anspruch z, dadurch 'gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial vorzugsweise Eieralbumin verwendet. 3. Verfahren nach Anspruch z und a, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Adsorption des Wirkstoffs eine an sich bekannte Vorfällung mit Aceton eingeschaltet wird.