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Verfahren zur vereinfachten Gewinnung eines Gemisches der Natriumsalze
von 5'-Iiiosinsäure und 5'-Guanylsäure Die Erfindung betrifft ein vereinfachtes
Verfahren zur Gewinnung eines Gemisches der Natriumsalze von 5'-Inosinsäure und
5'-Guanylsäure aus einem an Aktivkohle adsorbierten enzymatisch gewonnenen Nucleinsäurehydrolysat.
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Bekanntlich kann 5'-Iiiosinsäure als Mittel zu- Verbesserung des Geschmacks
bzw. Aromas von Nahrungs- und Genußmitteln, d. h. als chemische Würze, verwendet
werden. Ferner hat sich erwiesen, daß 5'-Guanylsäure in dieser Hinsicht ebenfalls
sehr vorteilhaft, daß beide Komponenten unmittelbar in Mischung hergestellt werden
können, ohne die Komponenten einzeln aus den Purin-nucleotiden abzutrennen.
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5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure gehören ebenso wie 5'-Adenylsäure
zu den sogenannten »Purinnucleotiden«, die ein Puringeriist als Grundbestandteil
aufweisen, und unterscheiden sich von den sogenannten »Pyrimidin-nucleotiden«, z.
B. 5'-Cytidylsäure und 5'-Uridylsäure, die ein Pyrimidingerüst als Grundbestandteil
enthalten. Die Wirkung der Pyrimidin-nucleotide als chemische Würze ist gewöhnlich
ziemlich gering. Jedoch liegen die Pyrimidinnucleotide im allgemeinen gemeinsam
mit Purinnucleotiden als Bestandteile der Nucleinsäuren vor. 5'-Nucleotide beider
Typen werden also in gemischter Form im Hydrolysat von natürlicher Nucleinsäure
erhalten. Es ist daher sehr erwünscht, aus dem Hydrolysat nach einem einfachen Verfahren
eine Mischung zu gewinnen, die nur aus 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure besteht,
die beide eine starke Wirkung als chemische Würze aufweisen. Da ferner 5'-Adenylsäure
als solche keine Wirksamkeit in bezug auf die Verbesserung des Geschmacks bzw. des
Aromas von Nahrungs- und Genußmitteln zeigt, jedoch ohne Beeinträchtigung der anderen
Purinnucleotide, d. h. der 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure, mit Hilfe der beispielsweise
in gewissen Mikroorganismen vorhandenen 5'-Adenylsäuredesaminase in 5'-Inosinsäure
umgewandelt werden kann, ist es erwünscht, ein Gesamtgemisch von Purin-nucleotiden
aus einem Purin- und Pyrimidin-nucleotide enthaltenden Hydrolysat von Nucleinsäure
zu gewinnen und nicht 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure einzeln abzutrennen.
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Bei einem bekannten Verfahren zur Gewinnung von Purin-nucleotiden
aus Nucleinsäurehydrolysaten wurden die im Hydrolysat enthaltenen Pyrimidin-und
Purin-nucleodite zur Abtrennung von ebenfalls im Hydrolysat enthaltenen Verunreinigungen,
wie anorganischen Salzen, Proteinen, Aminosäuren u. a., an Aktivkohle adsorbiert
und dann gemeinsam mit einem Lösungsmittel eluiert. Die im Eluat enthaltenen Nucleotide
wurden dann mit Hilfe eines Ionenaustauschers in die einzelnen Nucleotide aufgetrennt.
Durch Vereinigen der die einzelnen Purin-nucleotide enthaltenen Fraktionen konnte
dann ein Purinnucleotidgemisch gewonnen werden. Eine solche Trennmethode ist jedoch
sehr langwierig und kostspielig, da zwei Adsorptionsstufen durchlaufen und außer
der Aktivkohle noch große Mengen an Ionenaustauschermaterial eingesetzt werden müssen.
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Es ist an sich bekannt, daß durch Adsorptionscliromatographie an Aktivkohle
Gemische, deren Komponenten eine unterschiedliche Molekülgröße aufweisen, aufgetrennt
werden können. Da diese Trennmethode auf Grund der unpolaren Oberfläche der Aktivkohle
wenig selektiv ist, wird sie praktisch nur zur Trennung von unpolaren Verbindungen,
für die es keine besseren Trennmöglichkeiten gibt, oder solchen Verbindungen angewendet,
bei denen die relative Molekulargewichtsdifferenz so groß ist, daß eine wirkungsvolle
Trennung erwartet werden kann. Auch wurde schon versucht, Nucleotide enthaltende
Gemische durch Gelfiltrierung mit Hilfe von quervernetztem
Dextran
in die einzelnen Komponenten aufzutrennen. Hierbei gelang jedoch weder eine Trennung
der verschiedenen Nucleotide noch eine gemeinsame Abtrennung der Purin-nucleotide.
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Es wurde gefunden, daß es trotz der relativ geringen Differenz der
Molekülgröße der Purin- und Pyrimidin-nucleotide einerseits und der dabei relativ
großen Unterschiede zwischen den einzelnen Purinnucleotiden andererseits möglich
ist, die 5'-Purinnucleotide mit Hilfe von Aktivkohle gemeinsam aus einem Gemisch
von 5'-Nueleotiden abzutrennen.
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Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur vereinfachten
Gewinnung eines Gemisches der Natriumsalze von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure
aus einem an Aktivkohle adsorbierten enzymatisch gewonnenen Nucleinsäurehydrolysat
durch Elution und gegebenenfalls Überführung im Eluat vorhandener 5'-Adenylsäure
in 5'-Inosinsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Elution mit einem neutralen
oder alkalischen wäßrigen Lösungsmittel so vorgenommen wird, daß nach Durchlauf
der die 5'-Pyrimidin-nueleotide enthaltenden Fraktion die die 5'-Purin-nucleotide
enthaltene Fraktion aufgefangen wird, die 5'-Inosinsäure sowie 5'-Guanylsäure in
üblicher Weise in Natriumsalze übergeführt werden und dieses Salzgemisch isoliert
wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber dem bekannten Verfahren
den wesentlichen Vorteil, daß die Abtrennung der 5'-Purin-nueleotide in einer Adsorptionsstufe
erreicht wird, wobei als Trennmittel lediglich die leicht zugängliche Aktivkohle
erforderlich ist. Ferner wird beim erfindungsgemäßen Verfahren bei der Eluierung
der Nucleotide aus der Aktivkohle direkt ein Gemisch der Purin-nucleotide erhalten,
das in einfacher Weise als solches oder nach Desaminierung im Eluat gegebenenfalls
vorhandener Adenylsäure zu dem gewünschten Salzaemisch weiterverarbeitet werden
kann.
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Das Ausgangsmaterial für das Verfahren gemäß der Erfindung, d. h.
das Hydrolysat der Nucleinsäure, enthält gewöhnlich Nucleotide, Aminosäuren, Proteine,
Polysaccharide, anorganische Salze usw. als Verunreinigungen. Diese Verunreinigungen
haben jedoch keine nachteiligen Auswirkungen auf das Verfahren gemäß der Erfindung.
Das heißt, es ist nicht erforderlich, diese Verunreinigungen vor der Durchführung
des Verfahrens zu entfernen.
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Als Nucleotidgemisch für das Verfahren gemäß der Erfindung dient das
Hydrolysat oder Teilhydrolysat von Nucleinsäure, das mit einem Enzymsystem erhalten
wurde, das fähig ist, Nucleinsäure in 5'-Nucleotide zu hydrolysieren. Ein Enzymsystem
dieser Art ist bekanntlich in der Kultur von bestimmten Mikroorganismen oder in
Schlangenserum oder in den Darmschleimhäuten von Rindern enthalten. Ein Enzymsystem,
das von einem Mikroorganismus stammt. ist bevorzugt und kann in einigen Fällen auch
5'-Adenylsäuredesaminase enthalten. Ein solches Enzymsystem kann in der Form des
lebenden Mikroorganismus selbst oder als extrahiertes oder gereinigtes Enzymsystem
od. dgl. verwendet werden. Mikroorganismen, die ein solches Enzymsystem bilden können,
sind unter den Klassen Schizomycetes, Ascomycetes usw. verteilt. Genauer gesagt,
findet sich das Enzymsystem in der Kultur von Mikroorganismen, die zu folgenden
Ordnungen gehören: Fungi Imperfecti (z. B. Gattung Fusarium, Verticillium, Gliomastix,
Helminthosporium), Eubacteriales (z. B. Gattung Bacillus), Actinomycetales (z. B.
Gattung Streptomyces), Spheriales (z. B. Gattung Anixiella, Botryosphaeria, Chaetomidium,
Glomerella, Neurospora, Ophiobolus, Ophistoma, Sordaria, Tilachlidium), Plectascales
(z. B. Aspergillus). Insbesondere einige Mikroorganismen, die zu den Ordnungen Actinomycetales,
Fungi Imperfecti oder Pleetascales gehören, erzeugen 5'-Adenylsäuredesaminase gleichzeitig
mit einem Enzymsystem das Nucleinsäure zu 5'-Nucleotide zu hydrolysieren vermag.
Bei Verwendung des gesamten Enzymsystems dieser Mikroorganismen werden also unmittelbar
5'-Nucleotidgemische erhalten, die 5'-Inosinsäure enthalten.
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Die zur Herstellung des erfindungsgemäß benötigten Ausgangsmaterials
verwendete Nucleinsäure kann als tierisches oder pflanzliches Gewebe oder dessen
Extrakt eingesetzt werden. Diese Materialien enthalten Nucleinsäure oder ihr Teilhydrolysat.
Am vorteilhaftesten und bequemsten ist es, als Ausgangsmaterial Hefe oder Hefeextrakt
mit einem wäßrigen Lösungsmittel zu verwenden.
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Die Hydrolyse der Nucleinsäure enthaltenden Stoffe kann in üblicher,
hier nicht beanspruchter Weise durchgeführt werden, indem die vorstehend genannten
Mikroorganismen in dem Medium, das die Nucleinsäure enthält, bebrütet werden oder
indem das Kulturfiltrat, die Zellsuspension oder das extrahierte Enzym zum Extrakt
oder zur Suspension des die Nucleinsäure enthaltenden Materials in einer wäßrigen
Lösung gegeben wird. Das extrahierte Enzym kann roh oder rein sein. Die Hydrolyse
kann in einem wäßrigen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 5 bis 9 und einer Temperatur
durchgeführt werden, bei der die Enzymaktivität weder geschädigt noch zerstört wird.
Diese Temperatur beträgt gewöhnlich 30 bis 50° C. Die Reaktionszeit wird so gewählt,
daß die Ausbeute an 5'-Nucleotiden optimal ist. Gewöhnlich beträgt sie 2 bis 40
Stunden. Gegebenenfalls kann ein Enzymaktivator, z. B. ein zweiwertiges Metall,
wie Magnesium, zum Reaktionsmedium gegeben werden.
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In gewissen Fällen ist Phosphatase - ein Enzym, das Nucleotide zu
Nucleosiden zu hydrolysieren vermag - im Enzymsystem des Mikroorganismus vorhanden.
In einem solchen Fall muß ein Phosphatase-Inhibitor dem Reaktionssystem zugesetzt
werden, um den Abbau der gewünschten 5'-Nucleotide in Nucleoside zu verhindern.
Geeignet als Inhibitoren sind Phosphate, Arsenate, Cyanate, Aminosäuren (z. B. Cystein
und Glutamin), Äthylendiamintetraessigsäure, Metallionen (z. B. Zn++ und Cu++) usw.
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Durch Wahl der Reaktionsbedingungen kann der Anteil jedes 5'-Nucleotids
im Produktgemisch nach Wunsch eingestellt werden. Die Reaktion kann abgebrochen
werden, wenn der Gehalt an 5'-Purinnucleotiden am höchsten ist. Dieser Zeitpunkt
kann beispielsweise durch Messung der Ultraviolettabsorption festgestellt werden.
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Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsgemisch stellt das Ausgangsmaterial
für das Verfahren gemäß der Erfindung dar. Es enthält 5'-Purin-nucleotide (5'-Adenylsäure,
5'-Guanylsäure und 5'-Inosinsäure usw.) und 5'-Pyrimidin-nucleotide (5'-Uridylsäure,
5'-Cytidylsäure usw.). Dieses Gemisch wird beim Verfahren gemäß der Erfindung der
Adsorptions-, ehromatographie an Aktivkohle unterworfen, wodurch Verunreinigungen,
wie Enzyme, aus der
Enzymflüssigkeit stammende anorganische Stoffe,
Proteinsubstanzen, Aminosäuren und Polysaccharide, entfernt und gleichzeitig die
5'-Pyrimidin-nucleotide und 5'-Purin-nucleotide vollkommen getrennt werden.
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Die zu verwendende Teilchengröße und Menge der Aktivkohle sowie die
Beziehung zwischen Durchmesser und Höhe der mit Aktivkohle zu füllenden Kolonne
werden experimentell bestimmt oder aus der Durchflußmenge und Trennbarkeit berechnet.
Da die Purin-nucleotide gleichzeitig eluiert werden, wird keine besonders große
Menge an Aktivkohle benötigt. Ferner ist die zur wirksamen Chromatographie erforderliche
Zeit verhältnismäßig kurz.
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Die an der Aktivkohleschicht adsorbierten 5'-Nucleotide werden mit
einem neutralen oder alkalischen wäßrigen oder organischen Lösungsmittel eluiert.
Am vorteilhaftesten als Lösungsmittel ist verdünntes wäßriges Ammoniak. Während
der Elution wird die Ultraviolettabsorption des Abflusses ständig mit einem Spektrophotometer
gemessen. Art und Gehalt an 5'-Nucleotiden, die eluiert werden, lassen sich in einfacher
Weise aus dem Absorptionskoeffizienten und dem Absorptionsverhältnis jeder Fraktion
währen der Messung der Ultraviolettabsorption entnehmen. Auf Grund dieser Ermittlung
ist es leicht möglich, Fraktionen abzunehmen, die das Gemisch von 5'-Purin-nucleotiden
enthalten.
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Wenn das als Ausgangsmaterial verwendete Hydrolysat der Nucleinsäure
keine 5'-Adenylsäure enthält, sind 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure im Abfluß enthalten.
Enthält dagegen das Ausgangsmaterial 5'-Adenylsäure, ist auch 5'-Adenylsäure zusammen
mit 5'-Guanylsäure und zuweilen 5'-Inosinsäure im Abfluß enthalten. Im letzteren
Fall wird die Adenylsäure einer an sich bekannten Desaminierung unterworfen. Diese
Desaminierung kann in einfacher Weise mit 5'-Adenylsäuredesaminase durchgeführt
werden. Zweckmäßigerweise wird hierzu der Abfluß auf eine geeignete Konzentration
eingeengt und nach geeigneter Einstellung des pH-Werts der Wirkung von der 5'-Adenylsäuredesaminase
unterworfen, wodurch die 5'-Adenylsäure in 5'-Inosinsäure umgewandelt wird, ohne
daß die gleichzeitig vorhandene 5'-Guanylsäure und 5'-Inosinsäure beeinträchtigt
werden. 5'-Adenylsäuredesaminase kann im Enzymsystem beispielsweise folgender Mikroorganismen
gefunden werden: Gattung Streptomyces, wie Streptomyces aureus, oder Aspergillus,
wie Aspergillus elegans, Aspergillus fischen, Aspergillus quercinus und Aspergillus
melleus.
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Wenn zur Herstellung des Ausgangsmaterials ein Enzymsystem eines Mikroorganismus
gebraucht worden ist, der 5'-Adenylsäuredesaminase gleichzeitig mit einem Enzymsystem,
das Nucleinsäure in 5'-Nucleotide hydrolysieren kann, zu bilden vermag, enthält
der Abfluß hauptsächlich 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure. Wenn es erforderlich
ist, die restliche 5'-Adenylsäure vollständig in 5'-Inosinsäure umzuwandeln, kann
das Produkt erneut der Einwirkung der 5'-Adenylsäuredesaminase unterworfen werden.
Zu diesem Zweck läßt man das Enzymsystem, das die 5'-Adenylsäuredesaminase enthält,
mit dem die 5'-Adenylsäure enthaltenden Abfluß reagieren. Die Reaktionsbedingungen
in dieser Stufe sind etwa folgende: pH-Wert des Mediums 5 bis 8,5, Reaktionstemperatur
etwa 37° C, Reaktionsdauer 2 bis 50 Stunden. Die Gewinnung der Natriumsalze wird
im folgenden an einem Eluat beschrieben, das mit verdünntem, ammoniakalischem wäßrigem
Methanol als bevorzugt an Eluiermittel erhalten wurde. Das erhaltene Eluat wird
eingeengt, wobei gleichzeitig das Ammoniak entfernt wird und die Nucleotide als
Bariuni-Mischsalz niedergeschlagen werden. Für die Fällung wird beispielsweise Bariumacetat
bei einem pH-Wert um 8 und anschließend beispielsweise Methanol oder Äthanol, also
ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, dem Abfluß zugegeben.
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Um dieses Bariumsalz in das Natriumsalz umzuwandeln, wird verdünnte
Schwefelsäure einer wäßrigen Suspension des Bariumsalzes zugegeben. Das niedergeschlagene
Bariumsulfat wird entfernt, worauf mit Natriumhydroxyd neutralisiert wird. An Stelle
der Neutralisation kann die Lösung mit der Natriumform eines stark sauren Sulfonsäure-Ionenaustauschharzes
(beispielsweise des unter dem Handelsnamen »Amberlite IR-120« bekannten Austauschers)
behandelt und anschließend mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel,
z. B. Methanol, versetzt werden. Als weitere Möglichkeit kann eine doppelte Zersetzung
zwischen dem Bariumsalz der Nucleotide und Natriumsulfat durch Schütteln in einer
wäßrigen Suspension des Bariumsalzes vorgenommen werden, worauf Bariumsulfat abfiltriert
und beispielsweise Methanol oder Äthanol zum Filtrat gegeben wird, wobei sich das
Natrium-Mischsalz von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure abscheidet.
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Gegebenenfalls kann die Mischung der Natriumsalze von 5'-Inosinsäure
und 5'-Guanylsäure aus dem mit verdünntem ammoniakalischem wäßrigem Methanol von
der Aktivkohle entfernten Eluat ohne Zwischenabscheidung der Mischung als Bariumsalz
hergestellt werden. Diese Herstellung kann erfolgen, indem das Eluat eingeengt wird,
zwei äquivalente Anteile Natrium, bezogen auf die im Konzentrat enthaltenen Nucleotide,
zugegeben werden, das Gemisch eingeengt und anschließend Polethanol zum Konzentrat
gegeben wird, um das gewünschte Natriumsalz der Säuremischung niederzuschlagen.
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Das Natriumsalz kann je nach der Art des zugeführten Natriumions als
Gemisch von Dinatriumsalzen oder als Gemisch von Mononatriumsalzen der Nucleotide
hergestellt werden.
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In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentsätze auf das
Gewicht, falls nicht anders angegeben. Die zur Gewinnung des Enzymsystems verwendeten
Mikroorganismen Streptomyces griseus und Streptomyces aureus wurden bei der American
Type Culture Collection unter den Nummern 10 137 und 13 404 hinterlegt.
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Als stark saures Kationenaustauschharz dient in den Beispielen 3 und
5 sulfoniertes Polystyrolharz in Perlform mit einer Teilchengröße von 0,45 bis 0,60
nun, einem ungefähren Gesamtaustauschvermögen von etwa 1,9 Milliäquivalent pro Kubikmeter
benetztes Harz und einem Vernetzungsmittelgehalt von 8 bis 10%. Beispiel 1 6 1 eines
Abbauprodukts, das durch Abbau von aus Hefe erhaltener Ribonucleinsäure mit einem
durch Züchten von Streptomyces aureus erhaltenen Enzymsystem gewonnen worden war
(und gemäß enzymatischer Bestimmung 3 g Inosinsäure enthielt), wird in Gegenwart
eines Filterhilfsmittels filtriert.
Das Filtrat wird auf pH 1,5
eingestellt. Die Lösung wird in einer Menge von 1 1/h durch eine mit 120 g Aktivkohle
(für Chromatographie geeignete Sorte) gefüllte Kolonne (4,3 cm Durchmesser, 43 cm
Höhe) geleitet.
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Nach sorgfältigem Waschen mit Wasser wird die Kolonne mit lo,1oigem
wäßrigem Ammoniak bei einer Durchlaufmenge von 110 cm3/h eluiert. Das Absorptionsverhältnis
jeder Fraktion wird fortlaufend durch Messung der Ultraviolettabsorption ermittelt.
Hierdurch wird festgestellt, daß sowohl 5'-Uridylsäure als auch 5'-Cytidylsäure
in den ersten 160 cm,' des Ablaufs enthalten sind. Die Elution wird mit dem gleichen
Eluiermittel fortgesetzt, wobei mit den folgenden 16 1 Ablauf eine Fraktion erhalten
wird, die 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure enthält. Diese Fraktion wird unter vermindertem
Druck auf 160 cm-9 eingeengt und dann durch Zusatz einer geringen Menge wäßrigen
Ammoniaks auf pH 8,5 eingestellt. Zum Konzentrat werden zuerst 30 cm3 25o/oige Bariumacetatlösung
und dann 100 cms Methanol gegeben. Die Mischung wird in einem Kühlschrank aufbewahrt.
Der sich hierbei abscheidende Niederschlag wird mit etwas Methanol gewaschen, wobei
15,2 g einer Mischung erhalten werden, die aus den Bariumsalzen von 5'-Inosinsäure
und 5'-Guanylsäure besteht.
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Zu einer Suspension der Bariumsalzmischung der Nucleotide in Wasser
wird eine Lösung von 5 g Natriumsulfat in 50 cm3 Wasser gegeben. Nach Umrühren wird
die Mischung filtriert, um das abgeschiedene Bariumsulfat zu entfernen. Das Filtrat
wird eingeengt und mit Methanol versetzt, wobei 6,3 g einer Mischung erhalten werden,
die aus den Natriumsalzen von 5'-Guanylsäure und 5'-Inosinsäure besteht. Beispiel
2 Zu 6 1 einer Flüssigkeit, die eine Mischung von 5'-Nucleotiden enthält, durch
Abbau von Hefe-Ribonucleinsäure mit Hilfe einer Enzymlösung von Streptomyces griseus
erhalten wurde und laut enzymatischer Bestimmung 3 g 5'-Adenylsäure enthält, werden
40 cm3 konzentrierte Salzsäure gegeben, um den pH-Wert auf 2 einzustellen. Die Lösung
wird in einer Menge von 1,21/h durch eine mit 120 g Aktivkohle (für Chromatographie
geeignete Sorte) gefüllte Kolonne von 4 cm Durchmesser und 45 cm Höhe geleitet.
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Nach sorgfältigem Waschen mit Wasser wird die Aktivkohleschicht mit
1,5o,'oigem wäßrigem Ammoniak bei einer Durchlaufmenge von 120 cm3/h eluiert. Das
Absorptionsverhältnis jeder Fraktion wird fortlaufend durch Messung der Ultraviolettabsorption
ermittelt. Es wird festgestellt, daß die Pyrimidinnucleotide 5'-Uridylsäure und
5'-Cytidylsäure in den ersten 360 cm3 des Abflusses enthalten. In den folgenden
3,5 1 des Abflusses werden 5'-Adenylsäure und 5'-Guanylsäure in Mischung miteinander
eluiert. Diese 3,5 1 werden unter vermindertem Druck auf 350 cm3 eingeengt, in denen
durch enzymatische Bestimmung 2,85 g 5'-Adenylsäure festgestellt werden.
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Zu einer Kultur von Streptomyces aureus wird Natriummonohydrogenphosphat
bis zu einer Konzentration von 1,0 Millimol pro Liter gegeben. Zu dem obengenannten,
5'-Adenylsäure und 5'-Guanylsäure enthaltenden Konzentrat werden 45 ems des Kulturfiltrats
gegeben, und die Mischung wird durch Zugabe von Essigsäure auf pH 5 eingestellt.
Man läßt die Mischung 30 Stunden bei 37°C stehen. Nach dieser Zeit enthält sie keine
5'-Adenylsäure mehr, sondern 2,4 g 5'-Inosinsäure.
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Die Lösung wird auf pH 1,5 eingestellt und durch eine Schicht aus
45 g Aktivkohle geleitet. Die Schicht wird zuerst mit Wasser gewaschen und dann
mit 21 20%igem Methanol, das 0,5% Ammoniak enthält, eluiert. Der Abfluß wird unter
vermindertem Druck auf 100 cm3 eingeengt und das Konzentrat auf pH 8,5 eingestellt.
Zur Mischung werden nacheinander 20 cm3 30o/oige Bariumacetatlösung und 180 cm3
Methanol gegeben, wobei sich 9,3 g einer Mischung abscheiden, die aus dem Bariumsalz
von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure besteht. Zu einer Suspension des Bariumsalzes
in 450 cm3 Wasser werden 21 cin3 10o/oige Natriumsulfatlösung gegeben, wobei sich
Bariumsulfat abscheidet.
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Nach Entfernung des Bariumsulfats durch Filtration wird die Lösung
auf 45 cm3 eingeengt. Zum Konzentrat werden 100 cm3 Methanol gegeben, wobei sich
ein Natriumsalz abscheidet. Das Natriumsalz wird mit Methanol und dann mit Äther
gewaschen und 30 Minuten bei 60° C unter einem Druck von 20 mm Quecksilbersäule
gewaschen, wobei 4,5 g einer Mischung der Natriumsalze von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure
in Form eines farblosen, kristallinen Pulvers erhalten werden.
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Durch Papierteilungschromatographie und Messung der Ultraviolettabsorption
wird festgestellt, daß das Produkt 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure in einem Verhältnis
von 4,16: 2,22 enthält. Beispiel 3 Die auf die in Beispiel l erläuterte Weise erhaltene
Suspension der Mischung von Bariumsalzen von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure wird
mit 30 cm3 der Natriumform eines stark sauren Sulfonsäure-Kationenaustauschharzes
(»Amberlite IR-120«) geschüttelt, um das Bariumsalz zu lösen und in das Natriumsalz
umzuwandeln. Nach Entfernung des Harzes durch Filtration wird die Lösung unter vermindertem
Druck eingeengt und dann mit Methanol versetzt, wobei 6,1 g einer Mischung der Natriumsalze
von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure erhalten werden. Beispiel 4 Das auf die in
Beispiel 1 erläuterte Weise erhaltene Eluat (durch Elution der Aktivkohle mit lo/oigem
wäßrigem Ammoniak) wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei gleichzeitig das
Ammoniak abdestilliert wird. Zum Konzentrat werden zwei äquivalente Anteile (bezogen
auf die im Konzentrat enthaltenen Nucleotide) Natriumhydroxydlösung gegeben. Die
Mischung wird unter vermindertem Druck eingeengt und das Konzentrat mit Methanol
versetzt, wobei sich 6,8 g der gewünschten Mischung von Natriumsalzen abscheiden.
Beispiel 5 Die auf die in Beispiel l erläuterte Weise erhaltene Suspension der Bariumsalzmischung
von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure wird mit 20 cm3 der Natriumform eines stark
sauren Sulfonsäure-Kationenaustauschharzes (»Amberlite IR-120«) ge, schüttelt, um
das Bariumsalz löslich zu machen und in das Natriumsalz umzuwandeln. Nach Entfernung
des
Harzes durch Filtration wird die Lösung unter vermindertem Druck eingeengt und mit
Methanol versetzt, wobei 4,6 g der gewünschten Mischung von Natriumsalzen von 5'-Inosinsäure
und 5'-Guanylsäure erhalten werden.
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Beispiel 6 Das auf die in Beispiel 2 erläuterte Weise mit verdünntem
ammoniakalischem Methanol von der Aktivkohle abgetrennte Eluat wird unter vermindertem
Druck eingeengt, um das Ammoniak und Methanol zu entfernen. Zum Rückstand werden
2 Äquivalente Natriumhydroxyd (bezogen auf die im Konzentrat enthaltenen Nucleotide)
gegeben. Die Mischung wird unter vermindertem Druck weiter eingeengt und dann mit
Methanol versetzt. Erhalten werden 4,8 g einer Mischung der Natriumsalze von 5'-Inosinsäure
und 5'-Guanylsäure.