Verfahren zur Herstellung von Aracytidinphosphaten
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuartiger Oligonucleotide und cyclischer Oligonucleotide, die aus Einheiten von l-,8-D- -Arabinofuranosylcytosin (Aracytidin) bestehen.
Die erfindungsgemäss erhältlichen neuen Verbindungen können durch die folgenden Kurzformeln dargestellt werden (siehe H.G. Khorana und andere, J. Am. Chem.
Soc. 83, 675 (1961): denen n eine Zahl von 2 bis 8 ist, können dazu verwendet werden, um Aracytidinphosphatpolymere der Formel Ca(pca) fl , Ca(PCa)n" oder (Ca¯ ¯p)n"Ca (IV1) (IV2) (IV3)
EMI1.1
<tb> (I) <SEP> (Capll <SEP> Cap <SEP> (Ia) <SEP> r(Cap)n,¯lCap <SEP> 7
<tb> (11) <SEP> (CaP)ncap <SEP> (IIa) <SEP> r(CaP)nca <SEP> m
<tb> (III) <SEP> (pCa¯,,-),PCa <SEP> (liga) <SEP> r <SEP> pCa,---(pCa <SEP> - <SEP> - <SEP> -:
:111
<tb> worin Ca eine ein - bzw. zweiwertige 1-,B-D-Arabino- furanosylcytosineinheit, p einen ein - bzw. zweiwertigen Phosphorsäurerest, der esterartig an die ihm benachbarte(n) Arabinofuranosylcytosineinheit(en) gebunden ist, n eine ganze Zahl von 1 bis 8 und n' eine ganze Zahl von 1 bis 4 bedeutet, und worin jedes Ca, das vor einem nicht hochgestellten p steht (Cap), mit diesem in 3'-Stellung verknüpft ist, jedes Ca, das vor einem hochgestellten p steht (CaP), mit diesem in 2'-Stellung verknüpft ist, jedes Ca, von dem eine ausgezogene und eine gestrichelte Linie zu dem hinter ihm stehenden p aus geht(Ca-o- p), mit diesem p entweder in 2'- oder 3'-Stellung verknüpft ist, und jedes Ca, das hinter einem hochgestellten oder nicht hochgestellten p steht (PCa; pCa;
; pCE .. ), mit diesem in 5'-Stellung verknüpft ist, wobei die Angaben vor und hinter bei den Formeln I, II und III in Richtung von links nach rechts und bei den Formeln Ia, IIa und IIIa im Uhrzeigersinn zu verstehen sind.
Die nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch I hergestellten Produkte der Formeln I, II und III, bei worin n" eine ganze Zahl von 2 bis 8 bedeutet, herzustellen, indem man die Aracytidinphosphatpolymeren der Formel I, II oder III mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt.
Das in den Formeln mit Ca bezeichnete 1-p-D-Ara- binofuranosylcytosin (Aracytidin) weist folgende Formel auf:
EMI1.2
Die langgestreckten, waagrecht liegenden Klammern in den Formeln I, IIa und IIIa symbolisieren ein cyclisches Oligonucleotid und gleichzeitig die zwei Bindungspunkte, die durch die Enden der vertikalen Linien der Klammer angezeigt werden. Ist in Formel I, z.B. n=2, so erhält man für die Formel I CapCapCap, was ananzeigt, dass die Phosphorsäureeinheiten nach 3' - > 5 - > 3' - > 5' - > 3' verbunden sind, da < (p nach dem ersten Ca Bindung in 3'-Stellung und vor dem zweiten Ca eine Bindung in 5'-Stellung verknüpft ist.
In Formel (Ia) ist die gleiche Anordnung enthalten mit der Ausnahme, dass die in der 3'-Stellung der endständigen Ca-Gruppe verbundene Phosphatgruppe zur vorderen 5'-Stellung der ersten Ca-Einheit führt, wie es die Klammer angibt. Demgemäss sind die ausgeschriebenen Formeln für (I) und (Ia) und für n = 2 bzw. n' = 3 die folgenden:
EMI2.1
(I) für n 1 2 (la) für n w 3
CapCapCap fCapCapCaPl
Die Formeln II und Jla entsprechen den Formeln I und la und unlerscheiden sich nur dadurch, dass die Bindungen darin von 2' - > 5' anstelle von 3' - > 5' wie in I und Ia führen.
In den Formeln Iii und Illa ist die erste Ca-Einheit mit der Phosphatgruppe in 5'-Stellung verbunden (ap vor dem Ca). Diese Phosphatgruppe ist in 2'- oder 3' Stellung mit der nächsten Ca-Einheit verbunden, was durch eine untere gestrichelte Linie im Fallc der 3'-Bindung und eine ausgezogene obere Linie für die 2'-Bindung angezeigt ist. Die zweite Ca-Gruppe besitzt ebenfalls eine 5"Phosphatgruppe, durch die sie entweder mit der 2'- oder der 3'-Stellung der dritten Ca-Gruppe verbunden ist.
Demgemäss sind die Bindungen von 5' - > 3' oder 2' usw., wobei die 5' - 3'-Bindung vorherrscht (60 bis 80%). Die endständige 5'-Phosphatgruppe kann mit der 2'- oder 3'-Stellung der ersten Ca-Einheit verbunden sein. wobei die Ringstruktur gebildet wird (IIIa).
Wenn n = 2 ist, die Bindung zwischen den ersten beiden Ca-Einheiten von 5' - > 2' und diejenige zwischen der mittleren und der endständigen Ca-Einheit von 5' - > 3' geht. kiinnen diese Verbindungen folgendermassen ver anschaulicht werden, wenn die dritte und erste Ca-Ein heit durch eine 5' - > 3'-Bindung vereinigt sind (Tri- nucleotide 111 und IIIa):
EMI3.1
(III) wenn n w 2 (Illa) wenn n " 2 pCapCaPCa pCapCaPCa@
Schliesslich sind die Produkte IVI, 1V2 und 1V2 ana log zu den Produkten I, II und III, besitzen jedoch keine endständige Phosphatgruppe.
Im folgenden werden die abgekürzten Formeln, die wie oben definiert und veranschaulicht sind, oft benutzt.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch ge kennzeichnet, dass man 2'-, 3'- oder 5'-Phosphat des N4-Benzoyl- 1 -f3-D-Arabinofuranosylcytosins in Gegen wart eines Kondensationsmittels, vorzugsweise Carbodi imide, aromatische Sulfonylchloride, insbesondere Di cyclohexylcarbodiimid, sich verestern lässt, das Reaktionsprodukt mit Essigsäureanhydrid und Tri-n-butylamin und nacher mit methanolischem Ammoniak behandelt, das Produkt mit Triäthylaminbicarbonat als das Triäthylaminsalz des betreffenden Aracytidinphosphats chromatographisch isoliert und dieses Salz mit einem sauren Austauscherharz zur Gewinnung der entsprechen den freien Aracytidinphosphate behandelt.
Verbindungen des Typs I und Ia werden erhalten, wenn das Ausgangsmaterial N4-Benzoyl- l-ss-D-arabin- furanosylcytosin-3'-phosphat ist. Wenn das Phosphat ein 2'-Phosphat war, werden die Verbindungen der Formeln II und IIa erhalten; und wenn die Verbindungen 5'-Phosphat waren, erhält man Produkte der Formeln III und IIIa. Um Verbindungen der Formel IVI, 1V oder 1V3 zu erhalten, können die Verbindungen der Formeln I, II oder II mit bakterieller alkalischer Phos phatase behandelt werden, wie es in den Beispielen erläutert ist. Die bakterielle alkalische Phosphatase hydrolysiert nur einfach veresterte Phosphatgruppen.
Die neuen Oligonucleotide und die cyclischen Oligo nucleotide der Formeln 1, Ia, II, IIa, lII, Illa, IVI. IV., und 1V2 zeigen insbesondere eine bedeutende cytotoxi sche Wirksamkeit in vitro, vor allem gegen KB-Tumorzellen und Viren, speziell gegen die verschiedenen Arten von Herpes, Coe und Vacciniaviren. Im Gegensatz zu Cytosinarabinosid-2'-phosphat, 3'-phosphat oder 5'-phosphat werden die neuen Produkte nur sehr langsam durch menschliche Leberdesaminase entaminiert, so dass sie bei organischer Verabreichung eine verlängerte Wirk samkeit behalten. In ähnlicher Weise werden die neuen Aracytidinphosphate langsam abgebaut, so dass im Körper eine konstante Quelle für Cytosinarabinosid anwesens ist.
Bei äusserlicher Anwendung können diese Verbindungen zur Reinigung von Glaswaren und Instrumenten benutzt werden, die zur Züchtung von Gewebekulturen in der Viren- und Tumorforschung Verwendung gefunden haben. sowie zum Waschen ausgeschnittenen Tumorgewebes, das zur Transplantation auf Tiere bestimmt ist, um das Wachstum von Tumorzellen zu behindern, welches anderenfalls Umgebungsgewebe infiziert oder an andere Teile des Tierkörpers transportiert wird. Die Antivirus-Aktivität kann ebenfalls zur Herstellung von virophagen.-freien Kulturen von Mikroorganismen verwendet werden, beispielsweise virophagenfreie, Antibiotika produzierende Kulturen von Streptomyces. Insbesondere kann die Antivirus-Aktivität zur Behandlung von Herpes Keratitis im Auge von virusinfizierten Haustieren verwendet werden.
Die Herstellung der Ausgangsverbindungen, nämlich N4-geschützte 1- p - D - Arabinofuranosylcytosin -2'- phos- phate, -3'-phosphate oder 5'-phosphate, kann nach den folgenden Präparationen erfolgen.
Die folgenden Präparationen und Beispiele sollen das erfindungsgemässe Verfahren veranschaulichen.
In den nun zu beschreibenden Synthesen werden verschiedene Ionenaustauscherharze (Dow Chemical) verwendet, die folgendermassen beschrieben werden können.
Dowex 50 X 8 Dowex 50 X 8 ist ein stark saures Kationaustau scherharz, das aus kerngebundenen Sulfonsäure-Austauschgruppen besteht, die an eine Polystyrol-Struktur gebunden sind, wobei das Polystyrol mit etwa 8% Divi nylbenzol vernetzt ist.
< (Dowex 50W X 8 Dowex 50W X 8 , bei der das Harz eine weisse (W) Farbe anstatt der gelbbraunen Farbe des Dowex 50 X 8 besitzt.
Dowex I X 8 Dover 1 X 8 ist ein starkbasisches Anionaustauscherharz mit quaternären Ammonium-Austauschergruppen. die an eine Polystyrol-Struktur gebunden sind.
Dowex AG I X 8 Dowex AG 1 X 8 ist eine besonders gereinigte und geformte Art von aDowex 1 X 8 , die von den Bio-Rod-Laboratorien, Richmond, Kalifornien, geliefert wird.
Präparation I
1-(5' -0-Triplzenyllethyl-,8-D-arahinofuranosyl)-cytosin
Zu einer Lösung von 10 g l-p-D-Arabinofuranosyl- cytosin-hydroclllorid in 200 ml Pyridin wurden 12 g Tri phenylehlormethan gegeben. Die Reaktionsmischung wurde darauf bei Zimmertemperatur (23 bis 26 C) eine Woche lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann unter Rühren in 3 1 Eiswasser gegeben, wonach sich das I - (5'- 0- Triphenylmethyl-p-D-arabinofuranosyl)-cytosin als Öl abscheidet.
Das Öl kristallisierte beim Stehen mit Wasser über Nacht, und die Kristalle wurden durch Filtration gewonnen, danach zerkleinert, gründlich mit Wasser gewaschen und an der Luft bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Der so erhaltene Feststoff wurde mit 200 ml kochendem Heptan zerrieben und nach Trocknung in 1 Liter kochendes Aceton unter Zugabe von 1 g Aktivkohle ( < (Darco G-60 ) überführt. Die heisse Suspension wurde zur Entfernung der Aktivkohle filtriert, und das Filtrat wurde auf einem Dampfbad auf ein Volumen von etwa 75 ml eingeengt, das nach Abkühlen auf Zimmertemperatur ein kristallines Produkt ausschied. Dieses wurde durch Filtrieren auf einer Glasfritte gewonnen und mit 25 ml eiskaltem Aceton gewasehen.
Nach Trocknen erhielt man 13 g 1-(5'-.O-Tri- phenylmethyl- 1 -p-D-arabinofuranosyl)cytosin mit einem Schmelzpunkt von 227,5 bis 2280 C (Zersetzung).
Präparation 2 Nb -Benzoyl-1-(5'-0-triphenylnzethy!- -arabino f uranosyl)-cytosin
Ein Gemisch aus 5.0 g (10.3 mMol) 1-(5'-O-Triphenylmethyl-p-D-arabinofuranosyl)cytosin, 35 ml trockenem Pyridin und 5 ml Benzoylchlorid wurde bei Zimmertemperatur (24 bis 260 C) etwa 20 Stunden lang gerührt. Die so erhaltene Reaktionsmisckung wurde dann in 400 ml kaltes Wasser gegossen und bei Zimmertemperatur 18 Stunden lang gerührt. Der wässerige Anteil wurde dann dekanticrt und das verbleibende gummiar tige Material zweimal durch Dekantierung mit Wasser gewaschen. Der Gummi und die Feststoffe wurden in
300 ml Methylenchlorid gelöst, und diese Lösung wurde zweimal mit 50-ml-Portionen Wasser und zweimal mit
50 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen.
Die Methylenchloridlösung wurde dann über 10 g was serfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Filtrat wurde dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde in 400 ml aboslutem Methanol und 200 ml trockenem Tetrahydro furan aufgenommen.
Die entstandene Lösung wurde auf 00 C mit Eis ge kühlt. Danach wurde die kalte Lösung mit 10 ml 25% igem Natriummethoxyd in Methanol behandelt. Nach
30 Minuten bei 00 C wurden 110 ml Dowex 50W X 8 -
Pyridiniumharz zugegeben, wobei das pH der Lösung auf etwa 7 fiel. Die Suspension wurde vom Harz abfil triert, das Harz mit 250-ml-Portionen Methanol gewa schen und die vereinigten Waschflüssigkeiten und das
Filtrat unter reduziertem Druck bei 300 zur Trockne ge bracht. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge
Benzol gelöst und die Benzollösung auf eine Kolonne mit Silikagel (58 X 4,8 cm) mit einem Säurenvolumen von 1 Liter gegeben. Die Kolonne wurde dann mit
20 Portionen von je 100 ml 2%igem Methanol in Ben zol eluiert, gefolgt von 40 Portionen von je 100 ml
5%igem Methanol in Benzol.
Die Fraktionen 31 - 41 enthielten das Produkt, wie durch Dünnschichtchromato- graphie bewiesen wurde. Diese Reaktionen wurden ver einigt, Aceton wurde zugegeben und die Mischung durch
Zugabe von aSkellysolve B -Hexanen in Mikroknöllchen zur Kristallisation gebracht. Die Ausfällung wurde aus einem Gemisch von Aceton und aSkellysolve B -Hexa- nen umkristallisiert, wobei reines N4-Benzoyl-l-(5'-O-tri- phenylmethyl-ss-D-arabinofuranosyl)cytosin mit einem
Schmelzpunkt von 210,5 bis 211,50 C, anfiel.
Analyse für C3.H31ON3:
Berechnet: C 71,90 H 5,32 N 7,19
Gefunden: C 71,41 H 5,59 N 7,46
Präparation 3 N4-Benzoyl-l -(S'-O-triphenylmethyl-(p-D-arabino- furanosyl)cytosin-2'-phosphat und N4-Benzoyl-l-(S'-O-triphenylmethyl-fi-D arabino- furanosyl)cytosin-3'-phosphat
Eine Lösung von 590 mg N4-Benzoyl- 1-(5'-O-triphe- nylmethyl-p-D-arabinofuranosyl)cytosin in 10 ml Pyridin, welches 1,5 ml einer molaren Lösung von 2-Cyanäthyl phosphat (1,5 mMol) enthielt, wurde im Vakuum bei
400 C verdampft. Die Verdampfung mit Pyridin wurde zweimal wiederholt, wonach der Rückstand in 5 ml ge reinigtem Pyridin aufgenommen wurde.
Nach Zugabe von 600 mg Dicyelohexylcarbodiimid wurde die Lösung bei Zimmertemperatur zwei Tage lang im Dunkeln ge schüttelt. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 5 ml Wasser gegeben und die Lösung dann bei Zimmertem peratur 2 bis 3 Stunden lang gerührt. Das Unlösliche wurde abfiltriert und mit 1,2 ml Pyridin gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden zweimal mit ( < Skellysolve B
Hexanen gewaschen. Die Skellysolve B -Hexane wur den unter vermindertem Druck entfernt und die ver bleibende Pyridinlösung auf Eistemperatur abgekühlt.
Diese Lösung wurde danach mit 6,5 ml 2 n-Natriumhy droxyd in Wasser 20 Minuten lang bei Temperaturen von etwa 0 C behandelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 15 ml Pyridiniumharz < (Dowex 50W X 8 zu Ende gebracht. Die harzfreie Lösung und 3 Waschanteile von je 5 ml 50%igem wässrigem Pyridin wurden vereinigt und dann unter vermindertem Druck bei 400 C zur Trockne gebracht. Die erhaltenen rohen Stoffe, eine Mischung aus dem 2'- und dem 3'-Phosphat des N4-Ben zoyl- 1 -(5'- 0- triphenylmethyl-,8-D-arabinofuranosyl)cyto- sins, wurden für die nächste Rappe nicht getrennt.
Präparation 4 N - -flenzoyl- uranosylcytosn-2'- phosphat und N4 -ssenzoyl- 1 -p -D-ara binofuranosylcytosin phosphat
Die gesamte, nach Präparation 3 erhaltene Mischung aus den 2'- und 3'-Phosphaten von N4-Benzoyl-1-(5'-O -tripllenylmethyl - ,B - D - arabinofuranosyl)cytosin wurden mit 30ml 80%iger wässriger Essigsäure aufgenommen, und diese Reaktionsmischung wurde bei Zimmertemperatur 56 Stunden lang stehengelassen. Die wässrige Essigsäure wurde dann bei 400 C im Vakuum abgedampft, und der trockene Rückstand wurde in 100 mol Wasser suspendiert und vom Tritylalkohol abfiltriert.
Das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockne gebracht und ergab ein hellgelbes gummiartiges Material, das gemäss Dünnschichtchromatographie zwei Hauptprodukte enthielt: N -Benzoyl - 1 - - D-arabinofuranosylcytosin-2'- phosphat und 3'-phosphat.
Dieser Rückstand wurde danach mit 3 ml gesättigtem wasserfreiem ammoniakalischem Methanol aufgenommen, und die Lösung wurde 18 Stunden lang bei Zimmertemperatur (22 bis 250 C) stehengelassen. Das Lösungsmittel und das Ammoniak wurden dann unter vermindertem Druck entfernt und der entstandene Rückstand in einem sehr kleinen Volumen Wasser aufgenommen. Die Lösung wurde an einer mit < (Dowex AG 1 X 8 (Formiat) beschickter Chromatographierkolonne mit den Abmessungen 2,8 auf 24 cm chromatographiert, zuerst mit 2 Liter einer 0,1 molaren Ameisensäure, danach mit 5 Liter einer 0,02molaren Ameisensäure eluiert, und es wurden Fraktionen von 20 ml gesammelt.
Die Fraktionen, die das 2'-Phosphat enthielten, erschienen zuerst, wie durch das NMR-Spektrum und die erwartete Retention des Produktes bestimmt wurde. Diese Fraktionen wurden kombiniert, gefriergetrocknet und aus Wasser umkristallisiert, wobei man l-,-D-Arabinofuranosylcyto- sin-2'-phosphat mit ).max bei pH5 von 274 mlu erhielt.
In den späteren Fraktionen erschien das l-f3-D-Arabino- furanosylcytosin-3'-phosphat.
Das so erhaltene 1 --D-Arabinofuranosylcytosin-2'- -phosphat (und getrennt davon erhaltene l-P-D-Arabino- furanosylcytosin-3'-phosphat) wurde in Pyridinlösung 24 Stunden ]ang bei Zimmertemperatur mit Benzoylchlorid behandelt. Die Reaktionsmischung wurde in kaltes Wasser gegossen und bei Zimmertemperatur 18 Stunden lang gerührt. Die erhaltenen festen Rückstände wurden gesammelt, wiederholt mit Wasser gewaschen und ohne weitere Reinigung mit einer 2normalen Lösung von Natriumhydroxyd in wässrigem Äthanol bei 0 C 20 Minuten lang verseift. Die Reaktionsmischung wurde dann schnell angesäuert, die Feststoffe abfiltriert und wiederholt mit Wasser gewaschen.
Der erhaltene Stoff wurde aus Methylenchlorid umkristallisiert, und man erhielt N4- Benzoyl - 1 - p-D-arabinofuranosylcytosin-2'- phosphat (und das N4-Benzoyl- 1 -3-D-arabinofuranosylcytosin-3'- -phosphat aus dem Ausgangsmaterial 3'-Phosphat).
Präparation 5 N4-Benzoyl-l -(2 ' ,3' -d -O-benzoyl -ss-D-arabino- furanosyl)cytosin
Ein Gemisch aus 6,2 g 1-(5'-O-Triphenylmethyl-ss- -arabinofuranosyl(cytosin, 40 ml trockenem Pyridin und 6 mol Benzoylchlorid wurde bei Zimmertemperatur (24 bis 260 C) etwa 20 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in 500 ml kaltes Wasser gegossen und bei Zimmertemperatur 3 Stunden lang gerührt. Der wässrige Anteil wurde dekantiert und das zurückbleibende gummiartige Material zweimal mit Wasser unter Dekantierung gewaschen. Der Gummi und die Feststoffe wurden in 150 ml Methylenchlorid gelöst, und diese Lösung wurde zweimal mit 50-ml-Portionen Wasser und einmal mit 50ml einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen.
Die Methylenchloridlösung wurde dann über 10 g wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, welches auf einer Glasfritte ausgebreitet war. Das Trockenmittel wurde dann mit 20 ml Methylenchlorid gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat vereinigt. Die Methylenchloridlösung wurde anschliessend bei 400 C im Vakuum verdampft. Der erhaltene Rückstand wurde in 50 ml Chloroform gelöst und unter Rühren mit 6,7 mol bromwasserstoffhaltigem Eisessig (30% HBr) behandelt.
Nach 3 Minuten wurde die Reaktionsmischung im Vakuum auf etwa 10 ml bei 400 C eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 10 ml Chloroform verdünnt und auf eine Chromatographierkolonne mit 100 g Silikagel (Volumen 180ml) gegeben. Das verwendete Silikagel war Kieselsäure nach Brinkman für Chromatographiezwecke mit kohlenwasserstoff-stabilisiertem Chloroform. Die Kolonne wurde anschliessend mit 540ml Äthanol-stabilisiertem Chloroform mit einer Durchflussgeschwindigkeit von etwa 3,5 ml pro Minute eluiert. Der Ablauf wurde verworfen. Die Kolonne wurde anschliessend mit 1,2 Liter Äthanol eluiert, das mit Chloroform stabilisiert war und zu dem 3 Vol.-% Methanol gegeben waren, und zwar mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 3,5 ml pro Minute. Das Eluat dieser Behandlung wurde in Fraktionen von 20 ml gesammelt.
Jede Fraktion wurde auf Triphe nylcarbinol oder Triphenylmethyläther untersucht, indem ein Tropfen jeder Fraktion auf ein Blatt chromatographisches Papier (Whatman Nr. 40) aufgetragen und auf Ultraviolettabsorption, gefolgt vom Besprühen des Papiers mit 50%iger wässriger Schwefelsäure, untersucht wurde. Auf der Grundlage der Ergebnisse dieser chromatographischen Prüfung wurden die Fraktionen 25 bis 43 vereinigt, mit 200 ml Wasser gewaschen welches 0,5 ml Pyridin enthielt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand wurde umkristallisiert, indem er in Äthylacetat gelöst und die Lösung mit Skellysolve B -Hexanen versetzt wurde, bis eine Kristallisation begann, worauf das Gefäss auf 40 C abgekühlt wurde.
Man erhielt 3 Anschüsse an Kristallen, welche alle homogen waren, wie es durch Dünnschichtchromatographie an Silikagel mit 10% Methanol und 90% Benzol bestimmt wurde. Die Ausbeute betrug 1,45g, 0,49g und 0,740g, insgesamt 3,13 g (44%) an N4-Benzoyl-1-(2',3'-di-O-benzoyl-ss-D- -arabinofuranosyl)cytosin mit einem Schmelzpunkt von 177,5 bis 1780 C.
Analyse für C30H5NO8:
Berechnet: C 64,90 H 4,50 N 7,57
Gefunden: C 63,95 H 4,67 N 7,29
Präparation 6
N4 -Benzoyl-1 -p-D-arabinofuranosylcytosin-5' -phosphat
Es wurde eine Lösung aus 50 mMol Pyridinium-2 -cyanäthylphosphat in 10 ml trockenem Pyridin hergestellt und dazu 2,77 g N4-Benzoyl-1-(2',3'-di-O-benzoyl p-D-arabinofuranosyl)cytosin gegeben, worauf die Lösung zur Trockne gebracht wurde. Die Mischung wurde dann in 25 ml Pyridin gelöst, 3,09 g (150 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben und die Mischung bei Zimmertemperatur 51/2 Tage lang geschüttelt. Dann wurden etwa 15 ml Wasser zugegeben und die Mischung zweimal mit Skellysolve B -Hexanen extrahiert und von der. unlöslichen Harnstoffverbindung abfiltriert.
Die Lösung wurde dann mit Pyridin auf 40 ml verdünnt, mit Eis auf etwa OOC gekühlt und an Natriumhydroxyd durch Zugabe von 40 ml eiskalter 2n-Natriumhydroxydlösung auf etwa Normalität eingestellt. Die Reaktion wurde nach 20 Minuten durch Zugabe eines Überschusses an Pyridiniumharz Dowex 50 X 8 zu Ende gebracht. Das Harz wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen, und die Waschwässer und das Filtrat wurden unter reduziertem Druck auf etwa 25 ml eingedampft, wonach man 200 mg Ammoniumbicarbonat zugab. Die Fällung in der 25 ml Lösung wurde durch Filtration entfernt.
Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck eingedampft und der Rückstand in einem Lösungsmittel aufgenommen, das aus 2 Teilen einer 1 molaren Ammoniumacetatiösung von pH 6 und 5 Teilen Isopropylalkohol bestand, und dann an einer Cellulosesäule mit einem Säulenvolumen von 1850 ml adsorbiert. Die Kolonne wurde dann mit einem Lösungsmittelgemisch eluiert, das aus 2 Teilen einer molaren wässrigen Ammoniumacetatlösung und 5 Teilen Isopropylalkohol bestand. Die ersten 600 ml des Eluats wurden verworfen. Dann wurden insgesamt 325 Fraktionen von je 20 ml gesammelt.
Die vereinigten Fraktionen 55-110 enthielten ungefähr 90% der Theorie an N4-Benzoyl-1-3- -arabinofuranosylcytosin 5'-phosphat. Diese Fraktionen wurden in Gegenwart von 10 ml Pyridin auf ein kleines Volumen eingeengt, der Rückstand mit Wasser auf 50 ml verdünnt und das Produkt an einer Kolonne adsorbiert, die mit dem Pyridiniumharz Dowex 50W X 8 beschickt war. Die Kolonne wurde dann mit 3 1 entsalztem Wasser eluiert. Das gesamte Eluat wurde unter vermindertem Druck eingedampft und mit Io/,igem wässrigem Pyridin 4 mal verdünnt und wieder eingedampft.
Schliesslich wurde der Rückstand in verdünntem wässrigem Pyridin aufgenommen und aus diesem Lösungsmittel zweimal gefriergetrocknet, wonach man 1,81 g (70%) N4-Benzoyl -D-arabinofuranosylcytosin-5'-phosphat als weissen Feststoff erhielt.
Analyse für C16H18N3O8P H20 Pyridin:
Berechnet: P 5,95. Gefunden: P 6,06.
Nach 72 stündigem Erhitzen dieses Solvates auf 1000C im Vakuum (15 torr) erhielt man N4-Benzoyl-l-p -D-arabinofuranosylcytosin-5 '-phosphat.
Beispiel I
Kondensationsprodukte von N4-Benzoyl- 1 p-D-arabi- nofuranosylcytosin-3'-phosphat und deren Umwandlung zu Produkten von 1 -p-D-Arabinofuranosylcytosin-3 -phos- phat und deren Triäthylaminsalzen.
EMI7.1
Eine Lösung von 1 mMol N4-Benzoyl-1-,3-D-arabino- furanosylcytosin-3'-phosphat in wenig Wasser enthaltendem Pyridin wurde unter vermindertem Druck mehrere Male mit wasserfreiem gereinigten Pyridin zur Trockne eingedampft. Der gummiartige Rückstand wurde in 0,5 ml gereinigtem Pyridin aufgenommen und mit 520 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 0,5 ml Pyridin versetzt. Die Suspension wurde 5 Minuten lang kräftig geschüttelt, und der Kolben mit der Reaktionsmischung wurde bei Zimmertemperatur 6 Tage lang im Dunkeln aufbewahrt. Nach dieser Zeit wurde die Reaktion durch Zugabe von 15 ml 50%igem wässrigem Pyridin zu Ende gebracht und die Suspension über Nacht gerührt. Der unlösliche Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert, und nichtreagiertes Dicyclohexyldicarbodiimid wurde mit Äther extrahiert. Die wässrige Pyridinlösung wurde bei 300C im Vakuum zur Trockne gebracht.
Der so erhaltene Rückstand wurde durch Eindampfen mit wasserfreiem Pyridin weiter getrocknet, und das entstandene Produkt wurde in 10 ml wasserfreiem Pyridin, 2,5 ml Essigsäureanhydrid und 0,68 ml Tri-n-butyl -amin aufgenommen. Die Lösung wurde im Dunkeln und bei Zimmertemperatur (etwa 240C) 3 Tage lang geschüttelt. Dann wurde kaltes Wasser zugegeben, bis die Lö sung trüb wurde, und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur 20 Stunden lang gerührt. Danach wurden
10 ml Pyridin zugegeben und die Lösung unter vermindertem Druck wieder bei 300C zur Trockne gebracht.
Der getrocknete Stoff wurde sechsmal mit verdünntem wässrigem Pyridin eingedampft, um den Rückstand von Pyridiniumacetat zu befreien. Das entstehende gummiartige Material wurde danach in 50 ml konzentriertem wasserfreiem methanolischem Ammoniak aufgenommen und 70 Stunden lang auf 40C gekühlt. Das Lösungsmittel und Ammoniak wurden aus dem Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck entfernt und das entstandene
Benzamid durch Verreiben mit Äther extrahiert. Darauf wurde der Rückstand in einer 0,02-molaren Triäthylaminbicarbonatlösung vom pH 7,5 suspendiert, von unlösli chem Material abfiltriert und an einer Kolonne mit Di äthylaminoäthyl-cellulose in der Carbonatform adsorbiert.
Die Kolonne hatte die Abmessungen von 3,8 X 30 cm.
Die Kolonne wurde unter Einhaltung eines Salzgradienten eluiert, indem man eine Lösung aus 8 1 0,02-molarem Triäthylaminbicarbonat (pH 7,5) und 8 1 einer wässrigen, 0,5-molaren Natriumchloridlösung verwendete. Es wurden Fraktionen von je 20 ml genommen. Die Kolonne wurde bei 270 mp, mit einem Ultraviolettprüfer nach Vanguard der Type 10560 D überwacht. Die verschiedenen Polymere wurden nach ihren Molekulargewichten gewonnen, d.h. zuerst wurde das nichtreagierte Mononucleotid als Triäthylaminsalz erhalten, dann die Di, Trinucleotide usw. als Bis-Triäthylaminsalze, Tris-triäthylaminsalze usw. Die cyclischen Polymere erschienen vor den geradkettigen Polymeren ausser im Falle des cyclischen Monomers, des Triäthylaminsalzes des cyclischen Phosphats (3', 5') von Aracytidin.
Aus diesen Salzen erhielt man das freie Produkt durch Zugabe eines Überschusses des Formiat-Austauscherharzes aDowex 1 X 8 , durch Filtrieren und Eluieren des Harzes mit molarer Ameisensäure. Die erhaltene wässrige Ameisensäurelösung wird gefriergetrocknet, wobei die freie Säure als weisses Pulver erhalten wird.
Auf diese Art werden die Di-, Tri-, Tetra-, Penta-, Hexa-, Hepta- und Octanucleotide als Polytriäthylaminsalze hergestellt und gewonnen nach folgendem Schema: CapCap[(C2Hs)3N]2; 1P,H4 = 271 mCI (210 OD-Einheiten) CapCap[(C2Hs)3N]2; 1PH4 = 271 ml( ( 45 OD-Einheiten) CapCapCap Tris(triäthylamin)-Salz CapCapCap Tris(triäthylamin)-Salz CapCapCapCap Tetra(triäthylamin)-Salz CapCapCapCap Tetra(triäthylamin)-Salz und die den Formeln I und Ia entsprechenden Polytri äthylaminsalze. Diese Salze werden durch Behandlung mit einem Überschuss an Harz aDowex 1 X 8 in seiner Formiat-Form oder mit ähnlichen Harzen in die freien Oligonucleotide überführt.
Beispiel 2 Polymere von l-p-D-Arabinofuranosylcytosin-2'-phosphat (Polymere des Aracytidin-2' -phosphats)
Nach Art des Beispiels 1 wurde 1 -p-D-Arabinofurano- sylcytosin-2'-phosphat mit Dicyclohexylcarbodiimid und anschliessend mit Tri-(n-butyl)amin und Essigsäureanhydrid behandelt, weiterhin mit methanolischem Ammoniak und mit Triäthylaminbicarbonat extrahiert, und lieferte die Polymere des Aracytidin-2'-phosphats in Form ihrer Triäthylaminsalze, wie sie durch die Formeln II und IIa wiedergegeben sind. Die BehandlungXer Tri äthylaminsalze mit dem Harz aDowex 1 X 8 als For miat wie in Beispiel 1 ergab die freie Säure, nämlich Ara cytosin2' 5'-phosphat-Polymere und cyclische Poly mere.
Beispiel 3
Polymere des Aracytidin-5'-phosphats
Nach Beispiel 1 wurde N4-Benzoylara-cytidin-5' -phosphat mit Dicyclohexylcarbodiimid polymerisiert, mit Tri-n-butylamin und Essigsäureanhydrid behandelt, danach mit methanolischem Ammoniak versetzt und schliesslich mit Triäthylaminbicarbonat extrahiert und lieferte die Verbindungen der Formeln III und IIIa in Form ihrer Triäthylaminsalze.
Die Behandlung der Triäthylaminsalze der Formeln
III und IIIa mit dem Harz aDowex 1 X 8 in Form des
Formiats wie in Beispiel 1 ergab die freien Nucleotide.
Beispiel 4
Abbau von CapCap mit bakterieller alkalischer Phos phatase (BAP) zu CapCa
EMI8.1
CapCap CapCa
12 OD-Einheiten (272 mlp) Aracytidin [3' o 5']-aracytidin 3'-phosphat in 0,10 ml Wasser wurden mit 0,02 ml bakterieller alkalischer Phosphatase (Wothington Biochemicals, 10:1 mit destilliertem Wasser verdünnt) 2 Stunden lang in 0,02 ml eines Puffers aus einer molaren Lösung von Tn.s-(hydroxymethyl)aminomethan-hydrochlo- rid bei pH 9,0 und bei 370C behandelt. Die gesamte Lösung wurde dann auf ein 15 cm breites Papierblatt (Whatman 3MM) gestrichen und über Nacht papierchromatographisch mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropylalkohol, konzentriertem Ammoniumhydroxyd und Wasser im Verhältnis von 7:1: 2 entwickelt.
Es wurde beim Betrachten des trockenen Blattes unter Ultraviolettlicht ein einziges ultraviolettaktives Produkt mit einem Rf-Wert von 0,31 gefunden. Dieses Produkt war Aracytidin [3' + 5']-aracytidin-(CapCa)-ammoniumsalz, welches mit 3,0 ml Wasser extrahiert wurde, wonach eine Lösung mit einem Smax von 272 mX, entstand, die 7,6 OD-Einheiten enthielt.
Auf die in Beispiel 4 angegebene Art können andere Produkte der Beispiele 1, 2 und 3 an ihren endständigen Phosphatgruppen mit bakterieller alkalischer Phosphatase entphosphoryliert werden, um die Verbindungen der Formeln Im;1, IV2 und IV, zu liefern.
PATENTANSPRUCH I
Verfahren zur Herstellung von Aracytidinphosphaten, die einer der folgenden Formeln entsprechen:
EMI9.1
<tb> (I) <SEP> (Cap)n <SEP> Cap <SEP> (Ia) <SEP> F(CaP)flI1CaP <SEP> 7
<tb> (11) <SEP> (Ca )nCap <SEP> (IIa) <SEP> r(CaP)nCa <SEP> C
<tb> (III) <SEP> (pCa,,,-),.PCa <SEP> (liga) <SEP> r <SEP> pca <SEP> (Pca---'n <SEP> l
<tb> worin Ca eine ein-bzw. zweiwertige 1-ss-D-Arabinofurano- sylcytosineinheit, p einen ein-bzw.
zweiwertigen Phosphorsäurerest, der esterartig an die ihm benachbarten Arabinofuranosylcytosineinheiten gebunden ist, n eine ganze Zahl von 1 bis 8 und n' eine ganze Zahl von 1 bis 4 bedeutet, und worin jedes Ca, das vor einem nicht hochgestellten p steht (Cap), mit diesem in 3'-Stellung verknüpft ist, jedes Ca, das vor einem hochgestellten p steht (Cap), mit diesem in 2'-Stellung verknüpft ist, jedes Ca, von dem eine ausgezogene und eine gestrichelte Linie zu dem hinter ihm stehenden p ausgeht (Ca - p), mit die- sem p entweder in 2'- oder in 3'-Stellung verknüpft ist, und jedes Ca, das hinter einem hochgestellten oder nicht hochgestellten p steht (pCa;
pCa; pCaN ), mit diesem in 5'-Stellung verknüpft ist, wobei die Angaben vor und hinter bei den Formeln I, II und III in Richtung von links nach rechts und bei den Formeln Ia, IIa und IIIa im Uhrzeigersinn zu verstehen sind, dadurch gekennzeichnet, dass man 2'-, 3'- oder 5'-Phosphat des N4-Ben zoyl-1-,8-D-arabinofuranosylcytosins in Gegenwart eines Kodensationsmittels sich verestern lässt, das Reaktionsprodukt mit Essigsäureanhydrid und Tri-n-butylamin und nachher mit methanolischem Ammoniak behandelt, das Produkt mit Triäthylaminbicarbonat als das Triäthyl
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