DE1197194B

DE1197194B - Manufacture of the anti-tumor agent Actinogan

Info

Publication number: DE1197194B
Application number: DEB62582A
Authority: DE
Inventors: Henry Schmitz; Irving R Hooper; Joseph Lein; Bernard Heinemann
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1960-06-08
Filing date: 1961-05-20
Publication date: 1965-07-22

Description

Herstellung des tumorhemmenden Wirkstoffs Actinogan Die Erfindung betrifft die Herstellung und Gewinnung eines neuen Actinogan genannten Polysaccharidkomplexes, der tumorhemmende Eigenschaften besitzt. Das Actinogan wird gemäß der Erfindung erzeugt, wenn man als Mikroorganismus Nocardia humifera nov. spec. Nocardia humifera ATCC 13 748 unter üblichen submersen aeroben Bedingungen züchtet.Production of the anti-tumor agent Actinogan The invention relates to the production and extraction of a new polysaccharide complex called Actinogan, which has anti-tumor properties. The actinogan is according to the invention generated when the microorganism Nocardia humifera nov. spec. Nocardia humifera ATCC 13,748 grows under conventional submerged aerobic conditions.

Zur Gewinnung des Actinogans selbst kann dieses in üblicher Weise aus der Gärbrühe abgetrennt werden.To obtain the actinogan itself, this can be done in the usual way separated from the fermentation broth.

Eine Kultur des Mikroorganismus Nocardia humifera nv. spec. wurde in der American Type Culture Collection, Washington D. C., hinterlegt und in die ständige Sammlung von Mikroorganismen als ATCC 13 748 aufgenommen. Dieser Organismus wurde aus einer im Staate Colorado, USA.,- -aufgenommenen Bodenprobe isoliert. Er ist durch die Entwicklung eines mäßigen bis starken Nährbodenwachstums gekennzeichnet, das leicht in stäbchenähnliche Teile zerbricht. Das Fehlen der Bildung eines Luftmycels auf einer Vielzahl von Medien ist für diese Kultur gleichfalls charakteristisch. Das anfängliche Wachstum ist farblos bis weiß, weich und feucht. Sowie die Kultur altert, wird das Wachstum schmutzigweiß bis graugelbbraun, aufgerichtet, knötchenförmig bis faltig, von teigig bis lederartiger Konsistenz, während die Ränder faserig werden. Ein hellgelbes bis leicht braunes lösliches Pigment kann in Proteinmedien gebildet werden. Gelegentlich entwickeln alte Kulturen kleine isolierte Flecken oder Abschnitte einer sehr. dünnen, samtartigen weißen bis leicht grauen Ausblühung auf gewissen Medien durch die Ausbreitung des vegetativen Mycels in die kurzen aufgerichteten Fasern an der Luft. Ein übermäßiges Wachstum tritt bei 22 bis 37° C auf. Ein begrenztes Wachstum findet bei 42° C statt. Bei 50° C findet kein Wachstum mehr statt.A culture of the microorganism Nocardia humifera nv. spec. became deposited in the American Type Culture Collection, Washington D. C., and in the permanent collection of microorganisms included as ATCC 13 748. This organism was isolated from a soil sample taken in the state of Colorado, USA. He is characterized by the development of moderate to strong nutrient soil growth, that breaks easily into stick-like pieces. The absence of the formation of an air mycelium on a variety of media is also characteristic of this culture. The initial growth is colorless to white, soft and moist. As well as the culture as it ages, the growth becomes dirty white to gray-yellow-brown, erect, nodular to wrinkled, from doughy to leathery consistency, while the edges become fibrous. A light yellow to slightly brown soluble pigment can be formed in protein media will. Occasionally, ancient cultures develop small isolated patches or sections one very. thin, velvety white to slightly gray efflorescence on certain Media through the spread of the vegetative mycelium in the short erect Fibers in the air. Overgrowth occurs at 22 to 37 ° C. A limited one Growth takes place at 42 ° C. At 50 ° C there is no longer any growth.

Die mikroskopische Prüfung der bei 28° C gezüchteten Nocardia humifera auf Standardmedien, wie Herz-Infusions-Agar, Trypticase-Sojabohnen-Agar und Glucose-Hefeextrakt-Agar zeigt, daß das Nährbodenwachstum anfänglich fadenförmig und nicht durch Scheidewände unterteilt mit zahlreichen Seitenästen nahezu rechtwinklig zur Hauptachse ist. Das Mycel unterteilt sich rasch in große, uneinheitliche Abschnitte durch die Bildung von transversal verlaufenden Scheidewänden und durch die Kondensation des Cytoplasmas innerhalb der Fäden. Diese großen Einheiten zerspalten sich in kurze, grampositive, nicht säurefeste, nicht frei bewegliche, pleomorphe Stäbchen von 0,7 bis 6,0 -0,5 bis 0,7 Mikron innerhalb von 2 bis 3 Tagen. Häufig entwickeln die kleineren Stäbchen ausgerichtete Schwellungen, die den Eindruck von Doppelkokken erwecken. Gramgefärbte Kulturzubereitungen zeigen, daß das Cyctoplasma innerhalb der Stäbchen häufig zu verschiedenen stark gefärbten Kokkeneinheiten kondensieren kann. Diese Einheiten bleiben gewöhnlich innerhalb der Zellwand auch in alten Kulturen und liegen nicht in größerer Anzahl als freie Kokkenkörper vor. Keime werden an den Seitenflächen einiger Zellen gebildet. Vergrößerte Zellen und Zellketten bis zu 1,5 Mikron Breite werden in beschränktem Maße gebildet.The microscopic examination of the Nocardia humifera grown at 28 ° C on standard media such as heart infusion agar, trypticase soybean agar and glucose yeast extract agar shows that the growth of the nutrient medium is initially thread-like and not divided by partitions with numerous side branches almost at right angles to Main axis is. The mycelium rapidly divides into large, inconsistent sections through the formation of transverse partitions and the condensation of the cytoplasm within the filaments. These large units split into short, gram-positive, non-acid-fast, non-free-moving, pleomorphic rods of 0.7 to 6.0-0.5 to 0.7 microns within 2 to 3 days. Often the smaller rods develop aligned swellings that give the impression of double cocci. Gram-stained culture preparations show that the cytoplasm within the rods can often condense to form various strongly colored cocci units. These units usually remain within the cell wall even in ancient cultures and are not present in greater numbers than free coke bodies. Germs form on the side surfaces of some cells. Enlarged cells and cell chains up to 1.5 microns wide are formed to a limited extent.

Eine Sporophorenbildung wird kaum beobachtet. Die Sporophorenbildung in Kulturen des Nocardia humifera ist schwierig zu beobachten. Einige isolierte Büschel offener bis geschlossener Spiralen von drei bis fünf Windungen wurden auf zwei Medien festgestellt, von denen beide einen Nährstoffmangel für die Kultur darstellen, d. h. Pridhams und Gottliebs Grundmedium mit Sucrose oder Natriumacetat als einzige Quelle für Kohlenstoff. Die Conidien sind ellipsenförmig bis rechteckig mit abgerundeten Enden und einer Größe von 0,7 bis 1,2 - 1,2 bis 1,8 Mikron.The formation of sporophores is hardly observed. The formation of sporophores in cultures of the Nocardia humifera is difficult to observe. Some isolated Clusters of open to closed spirals of three to five turns were found two media found both of which are nutritionally deficient represent for the culture, d. H. Pridham's and Gottlieb's basic medium with sucrose or sodium acetate as the sole source of carbon. The conidia are elliptical to rectangular with rounded ends and a size from 0.7 to 1.2 to 1.2 to 1.8 microns.

Die Gattung Nocardia wird in zwei Hauptgruppen gemäß dem Klassifikationssystem von Nocardia von Waksman und Henrici in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7. Ausgabe), 1957, und Actinomycetes, Bd. II, von W a k s m a n, S. A., 1961, eingeteilt. Gruppe I enthält nach der Beschreibung diejenigen Mikroorganismen, die »teilweise säurebeständige Organismen mit stark brechenden Zellen darstellen, nicht proteolytisch und im allgemeinen nicht diastatisch und fähig zur Verwertung von Paraffin« sind. Nocardia humifera ist in Gelatine und Milch proteolytisch, diastatisch und nicht säurebeständig und gehört deshalb nicht in diese Gruppe. Gruppe 1I wird beschrieben als »nicht säurebeständige Organismen mit schwachbrechenden Zellen; keine deutliche Bildung von Kokken; diastatisch«. Diese Gruppe wird weiter in zwei Abschnitte eingeteilt: einen »nicht proteolytischen Teil«, der Nocardia humifera ausschließen würde, und einen »proteolytischen Teil«, der dreizehn Arten enthält. Ein sorgfältiger Vergleich mit den Beschreibungen dieser dreizehn Arten zeigte, daß Nocardia humifera ATCC 13 748 recht stark dem Nocardia fiavescens (Jensen, 1931), Waksman und Henrici, 1948, ähnelt. Die Bildung von spiralförmigen Sporophoren durch Nocardia humifera macht es möglich, diesen von Nocardia flavescens zu unterscheiden und wird deshalb als neue Art betrachtet. Wachstum und biochemische Reaktion Den folgenden Wachstumsangaben liegt eine 14-tägige Beobachtungszeit zugrunde bei Vorliegen verschiedener Medien und einer Temperatur von 28° C. Sofern nicht anders angegeben, beruhen alle Kulturbeschreibungen auf Beobachtungen eines Wachstums, das dadurch erzielt wurde, daß eine Nähr-Agar-Oberfläche nach dem »Cross-hatsch«-Verfahren beimpft wurde, die lebhaft wachsende vegetative Zellen aufwies. Der Impfstoff wurde dadurch hergestellt, daß man die Kultur in einer Trypton-Hefeextraktbrühe im »Rotary«-Schüttler 48 Stunden lang bei einer Temperatur von 26 ± 1° C wachsen ließ. Tomatenpaste-Haferme-Agar Substratwachstum üppig, graubräunlich bis grau, zopfförmig, teigig bis lederartig Luft-Mycel ..... Keines, gelegentlich Entwick- lung kleiner Flecken und/oder Abschnitte eines dünnen, weißen Belages Rückseite (reverse) ...... braun Lösliches Pigment hellbraun Großkolonie .... graubraun, flach bis erhaben, zopfförmig mit radialen Fur- chen, Mitte häufig zu einem Punkt erhöht, wellenförmiger Rand, teigig bis lederartig, Ko- lonie stark am Substrat hängend Benett-Agar Substratwachstum mäßig bis üppig, farblos bis blaßgelborangebraun, teigig, knotig bis wabenförmig (viele anastomose Grate und Falten) Luftmycel ...... keines Rückseite ....... farblos bis blaßgelborange Lösliches Pigment blaßgelborange Großkolonie .... farblos bis blaßgelbbraun, er- höht, Oberfläche wabenförmig, Rand gewellt, teigig, Wachstum gewöhnlich nicht stark am Sub- strat hängend Higkey und Tresner-Agar Substratwachstum üppig, farblos bis blaß leder- farben, lederartig, Zopfform Luftmycel ...... keines Rückseite ....... verschiedene Schattierungen in lederfarbig Lösliches Pigment sehr schwach braun Czapek-Agar-Lösung Substratwachstum spärlich, farblos bis weiß, flach, glatt bis leicht knotig, faserig Luftmycel ...... keines Rückseite ....... farblos Lösliches Pigment keines Anorganisches Salz-Stärke-Agar Substratwachstum mäßig, weißlich bis blaß schmutziggelb, teigig bis leder- artig, knotig zu zopfförmig Luftmycel ...... keines Rückseite ....... weißlich bis blaßgrünlichgelb Lösliches Pigment keines Bemerkung: Medium klar (2- bis 3-mm-Zone). Hefeextraktagar Wachstum ähnlich wie auf Bennett-Agar. Textrose-Trypton-Agar Wachstum ähnlich wie auf Bennett Agar. Glycerin-Asparagin-Agar Substratwachstum mäßig, schwach, orange, glatt bis leicht geraubt, lederartig Luftmycel ...... keines Rückseite ....... blaßlederfarben Lösliches Pigment keines Dextrose-Asparagin-Agar Substratwachstum mäßig, schwach weiß bis blaß- orangebraun, raub bis stark ge- faltet (wabenförmig), teigig bis lederartig Luftmycel ...... keines Rückseite ....... schwach weiß bis blaßorange- braun Lösliches Pigment nur ganz schwach braun Casein-Agar (Magermilch) Substratwachstum mäßig, bis üppig, weiß bis blaß- gelblederfarbig, weich, leicht gerauht bis knotenförmig, Kante ist nicht faserig Luftmycel ...... keines Rückseite ....... gelborange Lösliches Pigment blaßgelb Bemerkung: Positive Caseinhydrolyse 3 bis 5 mm nach 3 Tagen Kla zone mit Klärung des Substrates nach 7 bis 10 Tagen. Tyrosin-Agar Substratwachstum mäßig, graubräunlich, knotig bis zopfförmig, teigig Luftmycel ...... keines, gelegentlich entwickeln sich kleine Flecken und/oder Abschnitte eines dünnen, weißen bis leicht grauen Belages auf der Oberfläche Rückseite ....... dunkelrötlich, braun Lösliches Pigment Substrat verfärbt sich zu einem dunklen Rnthrann Bemerkung: Tyrosinkristalle gelöst. Kohlehydratsäure Xylose . . . . . . . . . kein Wachstum Lactose . . . . . . . . . kein Wachstum Maltose ........ positiv Mannose ....... positiv Adonit ......... positiv Arabinose ...... kein Wachstum Galactose ....... positiv Glucose ........ positiv Glycerin ........ positiv Inosit .......... positiv Mannit ......... positiv Raffinose ....... kein Wachstum Rhamnose ...... kein Wachstum Sorbit .......... positiv Schafsblut-Agar Citrat Üppiges Wachstum, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment, Blut-Haemolyse - nach 72 Stunden (1- bis 2-mm-Zone) - schwach positiv. Kohlenstoffverwertung Auf Pridhams anorganischen Agar als Grundmedium konnte Wachstum festgestellt werden bei 28' C in einem Zeitraum von 10 Tagen bei Vorliegen von nur folgenden Kohlenstoffquellen: Glukose, Calctose, Fruktose, Maltose, d-Mannit, Sorbit, Dextrin, Stärke, Glyzerin, Inosit, Natriumcitrat, Natriumsccinat (gering).The genus Nocardia is divided into two main groups according to the classification system of Nocardia by Waksman and Henrici in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7th Edition), 1957, and Actinomycetes, Vol. II, by W aksman, SA, 1961. According to the description, group I contains those microorganisms that are "partially acid-resistant organisms with strongly breaking cells, not proteolytic and generally not diastatic and capable of utilizing paraffin". Nocardia humifera is proteolytic, diastatic and not acid-resistant in gelatine and milk and therefore does not belong to this group. Group 1I is described as “non-acid-resistant organisms with weakly refractive cells; no distinct formation of cocci; diastatic «. This group is further divided into two sections: a "non-proteolytic part" which would exclude Nocardia humifera, and a "proteolytic part" which contains thirteen species. Careful comparison with the descriptions of these thirteen species showed that Nocardia humifera ATCC 13,748 is quite similar to Nocardia fiavescens (Jensen, 1931), Waksman and Henrici, 1948. The formation of spiral sporophores by Nocardia humifera makes it possible to distinguish it from Nocardia flavescens and is therefore considered a new species. Growth and biochemical reaction The following growth information is based on a 14-day observation period in the presence of various media and a temperature of 28 ° C. Unless otherwise stated, all culture descriptions are based on observations of growth that was achieved by using a nutrient agar Surface was inoculated by the "cross-hatsch" method, which showed vigorously growing vegetative cells. The vaccine was prepared by growing the culture in a tryptone yeast extract broth in the "Rotary" shaker for 48 hours at a temperature of 26 ± 1 ° C. Tomato paste oat agar Substrate growth lush, gray-brownish to gray, pigtail-shaped, doughy to leathery Aerial mycelium ..... none, occasionally developing development of small spots and / or Sections of a thin, white covering back (reverse) ...... brown Soluble pigment light brown Large colony .... gray-brown, flat to raised, tufted with radial fur chen, middle often to one Point raised, wavy Edge, doughy to leathery, co- lonie strongly attached to the substrate Benett agar Substrate growth moderate to profuse, colorless to pale yellow-orange-brown, doughy, nodular to honeycomb (many anastomosis ridges and folds) Aerial mycelium ...... none Reverse ....... colorless to pale yellow-orange Soluble pigment pale yellow orange Large colony .... colorless to pale yellow-brown, high, honeycomb surface, Wavy edge, doughy, growth usually not strong on the sub- strat hanging Higkey and Tresner agar Substrate growth lush, colorless to pale leather- colors, leathery, braid shape Aerial mycelium ...... none Back ....... different shades in leather-colored Soluble pigment very pale brown Czapek agar solution Substrate growth sparse, colorless to white, flat, smooth to slightly knotty, fibrous Aerial mycelium ...... none Back ....... colorless Soluble pigment none Inorganic salt and starch agar Substrate growth moderate, whitish to pale dirty yellow, pasty to leather like, nodular to plait-shaped Aerial mycelium ...... none Reverse ....... whitish to pale greenish yellow Soluble pigment none Note: Medium clear (2 to 3 mm zone). Yeast Extract Agar Growth similar to Bennett Agar. Textrose Tryptone Agar Growth similar to Bennett Agar. Glycerine asparagine agar Substrate growth moderate, weak, orange, smooth to slightly stolen, leathery Aerial mycelium ...... none Back ....... pale leather-colored Soluble pigment none Dextrose Asparagine Agar Substrate growth moderate, pale white to pale orange-brown, rough to heavily folds (honeycomb), doughy to leathery Aerial mycelium ...... none Back ....... pale white to pale orange Brown Soluble pigment only very light brown Casein agar (skimmed milk) Substrate growth moderate to lush, white to pale yellow leather colored, soft, light roughened to knot-shaped, edge is not fibrous Aerial mycelium ...... none Back ....... yellow-orange Soluble pigment pale yellow Note: positive casein hydrolysis 3 to 5 mm after 3 days of the klazone with clarification of the substrate after 7 to 10 days. Tyrosine agar Substrate growth moderate, gray-brownish, nodular to pigtail-shaped, doughy Aerial mycelium ...... none, develop occasionally small spots and / or Sections of a thin white to a slightly gray coating the surface Back ....... dark reddish, brown Soluble pigment substrate turns into a discoloration dark rnthrann Note: tyrosine crystals dissolved. Carbohydrate xylose. . . . . . . . . no growth lactose. . . . . . . . . no growth maltose ........ positive mannose ....... positive adonit ......... positive arabinose ...... no growth galactose ....... positive Glucose ........ positive glycerine ........ positive inositol .......... positive mannitol ......... positive raffinose ...... . no growth rhamnose ...... no growth sorbitol .......... positive sheep blood agar citrate Lush growth, no aerial mycelium, no soluble pigment, blood haemolysis - after 72 hours (1st to 2nd -mm zone) - weakly positive. Carbon utilization On Pridham's inorganic agar as the basic medium, growth could be determined at 28 ° C in a period of 10 days with the presence of only the following carbon sources: glucose, calctose, fructose, maltose, d-mannitol, sorbitol, dextrin, starch, glycerine, inositol, Sodium citrate, sodium succinate (low).

Kein Wachstum wurde festgestellt auf Rhamnose, Sucrose, Lactose, Xylose, Raffinose, Cellubiose, Inulin, Dulcit, Natriumacetat, Natriumoxyalat, Natriumsalicylat und Natriumtartrat. Sauerstoffbedarf aerob; wächst nicht anaerob Stickstoff- verwertung ... Nitrat und Ammoniumsalze, Asparagin und Pepton werden verwertet Cellulose, Paraffin (Schmelzpunkt 56 bis 58°C) .. Phenol, m-Cresol und o-Cresol werden in einem Grundsalz- medium nicht verwertet, das entweder Nitrat oder Am- moniumsalze als Stickstoffquelle enthält Schwefelwasser- stoff . . . . . . . . . nicht erzeugt Acetylmethyl- carbinol ...... nicht erzeugt Catalase ........ positiv Gelatine . . . .. .. . 70- bis 100°/oige Verflüssigung in 14 bis 21 Tagen, es wird kein lösliches Pigment gebildet Stickstoff- verwertung ... Nitrite werden aus Nitraten ge- bildet Stärkehydrolyse positiv Kartoffelpfropfen 1- bis 2wöchiges Wachstum feucht, glatt bis leicht gerunzelt, cremefarben, kein Luftmycel gebildet, Farbe des Nährbodens unverändert 3wöchentliches Wachstum auf- recht, faltig, cremefarben bis gelblichbraun, einige verbreitete Hügel eines weißen Luftmycels, Farbe des Nährbodens unver- ändert Lackmusmilch ... 2 Tage bei 28°C-keine Farb- veränderung, keine Peptonisie- rung oder Koagulation 8 Tage - Wachstum als weißer vegetativer Ring, positive Pep- tonisierung und Koagulation, PI-1 6,8 21 Tage - dasselbe wie bei 8 Tagen Der Herstellung des Actinogans durch Fermentation, ihrer Gewinnung und Reinigung folgte ein Invivo-Antitumorversuch unter Benutzung von Sarcoma-180 (S-180) an Mäusen. Dieses Untersuchungsverfahren hält sich streng an die bei D. A.Clarke, (»Mouse Sarcoma 180«, Cancer Research, Supple, Nr. 3, S.14 bis 17, 1955) beschriebenen. Die In-vivo-S-180-Untersuchungen wurden mit einer Experimentiergruppe von fünfzig Mäusen, denen Stückchen gleicher Größe (etwa 2 bis 3 mm3) eines Tumors von einem Spender stammend eingepflanzt wurden, gemacht. Diese fünfzig Mäuse sind stets- gleicher Abstammung (Swiss-Webster), von gleichem Geschlecht, Herkunft und Gewicht (20±2 g). Sie werden aufgeteilt in acht Behandlungsgruppen von je fünf Mäusen und eine Kontrollgruppe mit zehn Tieren. 24 Stunden nach erfolgter Implantation des Tumors beginnt man die Versuchsmäuse mit dem Versuchsmittel gegen Tumor intraperitonal zu injizieren und setzt das zweimal täglich fort, bis insgesamt dreizehn Injektionen erreicht sind. Verdünnte Brühe oder Festsuspensionen werden in einer einheitlichen Volummenge von 0,5 ml »Locke-Ringer-Salz« verabreicht. Die zehn Kontrollmäuse erhalten nur dreizehn Injektionen mit »Locke-Ringer-Salz«. Am achten Tag nach der Implantation wird die Tumorgröße ausgewertet, indem man die Maße durch die Haut des Tieres in ihrer längsten Ausdehnung und senkrecht dazu mit Meßzirkel mißt. Der durchschnittliche Durchmesser des Tumors der behandelten Tiere wird bestimmt und mit den Maßen der Kontrolltiere verglichen. Das Verhältnis behandelte (treated) Tiere zu Kontrolltieren (control) (TIC) der durchschnittlichen Abmessung wird in der Weise.echnet, daß der Grad der durch die Behandlung erzielten Hemmwirkung in Augenschein tritt. Eine gründliche statistische Untersuchung hat ein Verhältnis TIC = 0,75 als brauchbaren maximalen Meßpunkt für die Wirksamkeit erkennen lassen.' Um alle möglicherweise verspätet auftretende Erscheinungen zu : beobachten, wurden nach Einstellung der Behandlung die Tiere in einigen Fällen mehrere Wochen zurückbehalten, um die weitere Entwicklung des Tumors festzustellen. In beinahe allen Fällen begannen die durch die Behandlung aufgehaltenen Tumore wieder zu wachsen, und zwar in einem Maße, daß sie sehr rasch die Geschwulstgröße der Kontrolltiere erreichten. In seltenen Fällen tritt ein Rückgang des Tumors und völlige Heilung des Versuchstieres als Folge der Behandlung ein. Die Fälle einer spontanen Regression machen bei S-180 5 bis 10 % aus; die zurückbleibenden Tumorgeschwülste wachsen sehr rasch und töten das betreffende Tier in einem Zeitraum von etwa 3 Wochen. Die besten verfügbaren Antitumormittel können zu einer über 50 % völligen Regression bei mit diesem Tumor behafteten und behandelten Mäusen führen. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung: Beisniel 1 Die Medien (1; 2) wurden in 100-ml-Mengen in 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben bereitet und im Autoklav bei etwa 6,8 kg (15 pounds) behandelt. Für eine 2%ige Impfung wurde ein vegetatives Wachstum von 30 Stunden der amerikanischen Kultur 13 748 verwendet. Die Fermentationen wurden in einem Rotaryschüttler bei 27° C durchgeführt. Die Aktivität gegen Tumor der in Schüttelflaschen fermentierten Brühe nach 72 Stunden betrug: S-180 bei 32x: TIC = 0,55. (1) Impfmedium Glukose .................... 2,00/0 (NH4)2S04 . . . . . . . . : . . . . . . . . . 0,3% ZnS04 # 7 H$0 . . . . . . . . . . . . . . . 0,003% Maismehlweichwasser . . . . . . . . 1,0 0% (V(V) Pharmamedium . . . . . . . . . . 1,00/0 CaCOe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,00/0 (2) Produktionsmedium Cerelose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,00/0 NaCI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5% Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . 3,0% CaCOs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,3% Beispiel 2 In einem Fermentationstank mit einem Fassungsvermögen von etwa 45001 (1000 Gallonen) wurden dieselben Bedingungen eingehalten, was die Medien, die Temperatur und die Impfung betrifft, wie bei der Schüttelflaschenfermentation.No growth was noted on rhamnose, sucrose, lactose, xylose, raffinose, cellubiose, inulin, dulcitol, sodium acetate, sodium oxyalate, sodium salicylate and sodium tartrate. Aerobic oxygen demand; does not grow anaerobically nitrogen recovery ... nitrate and ammonium salts, Asparagine and peptone become recovered Cellulose, paraffin (Melting point 56 to 58 ° C) .. phenol, m-cresol and o-cresol are in a basic salt medium not used, the either nitrate or am- monium salts as a nitrogen source contains Sulphurous water material . . . . . . . . . not generated Acetylmethyl carbinol ...... not produced Catalase ........ positive Gelatin. . . .. ... 70 to 100% liquefaction in 14 to 21 days, there will be no soluble pigment formed nitrogen recovery ... nitrites are produced from nitrates forms Starch hydrolysis positive Potato plugs 1 to 2 week growth moist, smooth to slightly wrinkled, cream-colored, no aerial mycelium formed, color of the medium unchanged 3-weekly growth on right, wrinkled, cream-colored to yellowish brown, some common Hill of a white air mycelium, Color of the culture medium changes Litmus milk ... 2 days at 28 ° C-no color- change, no peptonization tion or coagulation 8 days - growth as whiter vegetative ring, positive pep toning and coagulation, PI-1 6.8 21 days - the same as with 8 days The production of the actinogan by fermentation, its recovery and purification was followed by an in vivo antitumor test using Sarcoma-180 (S-180) on mice. This test method adheres strictly to that described by DAClarke, ("Mouse Sarcoma 180", Cancer Research, Supple, No. 3, pages 14 to 17, 1955). The in vivo S-180 studies were performed with an experimental group of fifty mice implanted with bits of the same size (about 2 to 3 mm 3) of tumor derived from a donor. These fifty mice are always of the same origin (Swiss-Webster), of the same sex, origin and weight (20 ± 2 g). They are divided into eight treatment groups of five mice each and a control group of ten animals. 24 hours after the tumor has been implanted, the test mice are started to be injected intraperitoneally with the test agent against tumor and this is continued twice a day until a total of thirteen injections are achieved. Diluted broth or solid suspensions are administered in a uniform volume of 0.5 ml of "Locke-Ringer Salt". The ten control mice received only thirteen injections of "Locke-Ringer salt". On the eighth day after the implantation, the tumor size is evaluated by measuring the dimensions through the skin of the animal in its longest extent and perpendicular to it with measuring calipers. The mean diameter of the tumor in the treated animals is determined and compared with the dimensions of the control animals. The ratio of treated animals to control animals (TIC) of average dimension is calculated in such a way that the degree of inhibitory effect achieved by the treatment is evident. A thorough statistical investigation has shown a ratio of TIC = 0.75 as a useful maximum measuring point for effectiveness. In order to observe all possible late appearances: after the treatment was discontinued, the animals were in some cases kept for several weeks in order to determine the further development of the tumor. In almost all cases the tumors arrested by the treatment began to grow again, to the extent that they very quickly reached the tumor size of the control animals. In rare cases, the tumor regresses and the test animal heals completely as a result of the treatment. Spontaneous regression cases are 5 to 10% in S-180; the tumor growths that remain grow very rapidly and kill the animal in question within a period of about 3 weeks. The best anti-tumor agents available can result in over 50% total regression in mice afflicted and treated with this tumor. The following examples illustrate the invention: Example 1 The media (1; 2) were prepared in 100 ml quantities in 500 ml Erlenmeyer flasks and autoclaved at about 6.8 kg (15 pounds). A 30 hour vegetative growth of American culture 13,748 was used for a 2% inoculation. The fermentations were carried out in a rotary shaker at 27 ° C. The anti-tumor activity of the broth fermented in shake flasks after 72 hours was: S-180 at 32x: TIC = 0.55. (1) Inoculation medium glucose .................... 2.00 / 0 (NH4) 2S04. . . . . . . . :. . . . . . . . . 0.3% ZnS04 # 7 H $ 0. . . . . . . . . . . . . . . 0.003% cornmeal softening water. . . . . . . . 1.0 0% (V (V) pharmaceutical medium.......... 1.00 / 0 CaCOe...................... 1, 00/0 (2) Cerelose production medium...................... 3.00 / 0 NaCl................ ....... 0.5% soybean meal.............. 3.0% CaCOs............................................................ 0.3% Example 2 In a fermentation tank of about 45001 (1000 gallons) capacity, the same media, temperature, and inoculation conditions were used as the shake bottle fermentation.

Die Aktivität gegen Tumore betrug bei der im Tank fermentierten Brühe nach 70 Stunden: vs. S-180 bei 64x: TIC = 0,37.The activity against tumors for the broth fermented in the tank after 70 hours was: vs. S-180 for 64x: TIC = 0.37.

»64x« bedeutet dabei, daß die Brühe untersucht wurde, nachdem sie mit 63 Volumeinheiten eines Pufferungsmittels verdünnt worden war."64x" means that the broth was examined after it had been diluted with 63 volume units of a buffering agent.

Es wurde festgestellt, daß der aktive Bestandteil »Actinogan« durch Aceton oder Ammoniumsulfat ausgefällt wurde. Weder Aktivkohle (1% charcoal) noch das carboxylische Kationenaustauschharz IRC-50 (Na) beseitigte die Aktivität. AMBERLITE IRC-50® ist ein im Handel befindliches Kationenausstauschharz vom carboxylischen Typ und stellt ein Copolymer aus Methacrylsäure und Divinylbenzol dar, wobei Divinylbenzol einen 21/z- bis 5o/oigen Bestandteil des Harzes ausmacht. Zinkchlorid fällte unwirksame Verunreinigungen aus, Protamin ergab ein wirksames Festes. Durch Celluloseacetatmembranen dialysierte die Aktivität nicht.It was found that the active ingredient "actinogan" by Acetone or ammonium sulfate was precipitated. Neither activated carbon (1% charcoal) nor the carboxylic cation exchange resin IRC-50 (Na) eliminated the activity. AMBERLITE IRC-50® is a commercially available cation exchange resin from the carboxylic acid Type and represents a copolymer of methacrylic acid and divinylbenzene, whereby divinylbenzene makes up a 21/2 to 5o / o part of the resin. Zinc chloride precipitated ineffective Impurities out, protamine gave an effective feast. Through cellulose acetate membranes did not dialyze the activity.

Das Ausfällen bei verschiedenen pH-Werten ergab aktive Präcipitate und Supernatante bei einer Indikation der maximalen Unlöslichkeit bei 9,5 pH.The precipitation at different pH values resulted in active precipitates and supernatants for an indication of maximum insolubility at 9.5 pH.

Aktive Präcipitate wurden entweder aus 4 Volumeinheiten Aceton oder gesättigtem Ammoniumsulfat mit Methanol bereitet, der unlösliche Anteil wurde in Wasser gelöst und dialysiert und die sich ergebende Lösung durch Zusetzen von Alkohol fraktionell ausgefällt. Das Feste war aktiv vs. S-180 bei 8 mkd (TIC = 0,54), zeigte aber keine Aktivität in vitro gegen B. subtilis bei 6 oder 8 pH, Stath. aureus oder E. coli noch auf Spektralplättchen bei 10 oder 50 mg/ml. Das Ultraviolettabsorptionsbild zeigte eine breite Schulter zwischen 260 und 280 m[,.Active precipitates were prepared either from 4 volume units of acetone or saturated ammonium sulfate with methanol, the insoluble fraction was dissolved in water and dialyzed, and the resulting solution was fractionally precipitated by adding alcohol. The solid was active vs. S-180 at 8 mkd (TIC = 0.54) but showed no in vitro activity against B. subtilis at 6 or 8 pH, Stath. aureus or E. coli still on spectral plates at 10 or 50 mg / ml. The ultraviolet absorption image showed a broad shoulder between 260 and 280 m.

Acetonpulver wurden durch wiederholtes Durchpassieren durch SEPHADEXƒ G 25,G 50 und G 75 gereinigt. Letztere sind im Handel befindliche verzweigte Dextranpolymere, die mit Wasser ein Gel bilden, als Molekularsiebe dienen und Polyglykosemoleküle absorbieren unterhalb einem Molekulargewicht von 3000, 7000 bzw. 10 000. Dabei waren die Fraktionen mit den größten Molekülen die am meisten aktiv wirkenden. Diese wurden darauf mittels Chromatographie und Kolonnen mit modifizierter Cellulose, die als Anionaustauscher dienen, gereinigt.Acetone powder was passed through SEPHADEXƒ G 25, G 50 and G 75 cleaned. The latter are commercially available branched dextran polymers, which form a gel with water, serve as molecular sieves and polyglycose molecules absorb below a molecular weight of 3000, 7000 and 10,000 respectively the fractions with the largest molecules the most active ones. These were then by means of chromatography and columns with modified cellulose, which as Serving anion exchangers, purified.

Die aus den modifizierten Cellulosekolonnen mit Pufferlösungen eluierten Fraktionen wurden im Gefrierverfahren getrocknet und ergaben farblose Pulver, die eine Wirksamkeit zeigten gegen Tumore S-180, Ca 755 und Ehrlichsche Asciten bei einer Dosis von 1 bis 2 mg/kg/täglich verabreicht an Tumor tragende Mäuse. Das Material zeigte sich positiv in Molisch-, Anthron-, Tauberschen Resorcinol - und Anilin-Acetat-Testen. Negativ waren die Barfoed-, Benedict- und Seliwanoff-Versuche. Das Material entfärbte weiterhin Brom und alkalinische Permanganatlösung. Ninhydrin- und Sakaguchi-Versuche verliefen positiv, die Elson-Morgan- und Morgan-Elson-Versuche verliefen schwach positiv, und der Xanthoproteintest war negativ.The eluted from the modified cellulose columns with buffer solutions Fractions were freeze-dried to give colorless powders that showed activity against tumors S-180, Ca 755 and Ehrlich's ascites at a dose of 1 to 2 mg / kg / daily administered to tumor-bearing mice. The material showed positive in Molisch, Anthron, Tauber's resorcinol - and aniline acetate testing. The Barfoed, Benedict and Seliwanoff attempts were negative. The material continued to discolor bromine and alkaline permanganate solution. Ninhydrin and Sakaguchi trials were positive, the Elson-Morgan and Morgan-Elson trials were weak positive and the xanthoprotein test was negative.

Der wirksame Bestandteil Actinogan scheint eher ein Kohlehydratgroßmolekül als ein Peptid zu sein und läßt sich durch einige, aber nicht alle Protein-Fällungsmittel ausfällen. Der Stoff ist unter Laboratoriumsbedingungen gegen pH-Schwankungen zwischen 4 und 9 und Erhitzen auf 50° C ziemlich stabil, wird aber bei 100° C inaktiv und weist ein Molekulargewicht von über 7000 bis 10 000 auf, was dadurch erkennbar wurde, daß er auf Sephadex G 75 (ein verzweigtes Dextrangel, das Stoffe mit einem Molekulargewicht, das höher als 7000 bis 10 000 ausschließt) nicht zurückgehalten werden konnte.The active ingredient Actinogan appears to be more of a large carbohydrate molecule considered to be a peptide and can be precipitated by some but not all protein precipitants fail. Under laboratory conditions, the substance is resistant to pH fluctuations between 4 and 9 and heating to 50 ° C fairly stable, but becomes inactive at 100 ° C and has a molecular weight of over 7000 to 10,000, which was evident from that he is on Sephadex G 75 (a branched dextran gel that contains substances with a molecular weight, that excludes more than 7,000 to 10,000) could not be withheld.

Das nun folgende Beispiel dient nur der Erläuterung, stellt keine Einschränkung der Erfindung dar und illustriert die Gewinnung des erfindungsgemäßen Polysaccharids aus einer Fermentationsbrühe.The following example is only for explanation purposes and does not represent any Limitation of the invention and illustrates the production of the invention Polysaccharide from a fermentation broth.

Beispiel 3 Isolierung und Reinigung des Actinogans Eine nach vorstehendem Verfahren gewonnene Brühe wurde zentrifugiert, die so erhaltene klare Brühe mit Ammoniumsulfat abgesättigt und das ausgefällte rohe Actinogan durch Zentrifugieren abgetrennt. Hierauf wurde das rohe Actinogan in einer sehr kleinen Menge destillierten Wassers aufgelöst und dann 6 Stunden lang im Celluloseacetatrohr gegen Leitungswassers dialysiert. Teile der Lösung wurden im Gefrierverfahren getrocknet (festes G 21) oder unter Zusatz von 4 Volumteilen Aceton verdünnt (festes G 23).Example 3 Isolation and Purification of the Actinogans One according to the above The broth obtained from the method was centrifuged, the clear broth thus obtained with Saturated ammonium sulfate and the precipitated crude actinogan by centrifugation severed. The crude actinogan was then distilled in a very small amount Dissolved water and then for 6 hours in the cellulose acetate tube against tap water dialyzed. Parts of the solution were dried in the freeze process (solid G 21) or diluted with the addition of 4 parts by volume of acetone (solid G 23).

Das Feste, das durch Ausfällen mit Aceton erhalten wurde, wurde in einer minimal Menge Wasser aufgelöst und durch eine Kolonne mit SEPHADEX@ G 25 geleitet. Eine Kolonne mit einem Durchmesser von etwa 7,62 cm und einer Länge von etwa 18,0 cm, die ein aus 100 g SEPHADEXƒ G 25 bereitetes Gel enthielt, wurde mit 180 ml einer gesättigten Lösung aus zweimal gefälltem Festmaterial (G 23) beschickt. Die ersten 200 ml des Ausflusses wurden verworfen, und die nächsten 200 ml wurden im Gefrierverfahren getrocknet (Ergebnis: festes Actinogan, Muster G 27).The solid obtained by precipitation with acetone was in dissolved in a minimal amount of water and passed through a column with SEPHADEX @ G 25. A column about 7.62 cm in diameter and about 18.0 cm in length cm, which contained a gel prepared from 100 g SEPHADEXƒ G 25, was added 180 ml of a saturated solution of twice precipitated solid material (G 23) are charged. The first 200 ml of the effluent was discarded and the next 200 ml became Freeze dried (result: solid actinogan, sample G 27).

Bei einem Versuch, die Molekularsiebkolonnen für eine weitere Reinigung auszunutzen, wurde ein Gel mit größerer Porengröße (G 50) eingesetzt. SEPHADEXƒ G 50 absorbiert Polyglucose Moleküle unter einem Molekulargewicht von 7000. Die Fraktionen mit den größten Molekülen zeigten die größte Wirksamkeit, doch wiesen selbst die Fraktionen mit den kleinsten Molekülen noch eine gewisse Aktivität auf (G 36-41). Die Wirksamkeit nach dem S-180-Versuch bei Mäusen ergab folgende Resultate: Wirksamkeit (T/C-Verhältnis) Dosis 32 16 8 I 4 2 1 I 0,5 Untersuchtes Material (fest) Am. Sulfat ppte. G 21 . . . . . . . . . . . . . . . . . - toxisch 0,52 0,83 - - - Am. sulfat ppte. G 23 . . . . . . . . . . . . . . . . . toxisch -28 0,20 0,68 0,85 - - SEPHADEX® 3000 G 27 . . . . . . . . . . . . . . toxisch toxisch toxisch 0,09 0,45 0,73 0,86 Molekulargewicht von SEPHADEX-Fraktionen Größer als 7000 G 36 . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - 0,19 0,37 - - Größer als 3000 G 37 . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - 0,07 0,45 - - Annähernd gleich 3000 G 38 . . . . . . . . . . . - - toxisch - 0,57 - - Niedriger als 3000 G 38 . . . . . . . . . . . . . . . - - toxisch - 0,65 - - Letztes Eluat G 41 . . . . . . . . . . ... . . . . . . . - - 0,81 - - - - * Milligramm Actinogan je Kilogramm Maus je Tag. Ein Strich in der Tabelle bedeutet, daß mit dieser Dosis kein Test ge- macht wurde. Die Ausgangsbrühe ergab folgendes T/C-Verhältnis (Verdünnung in Klammern): toxisch (1/32); 0,75 (1/64) und 0,91 (1/25).In an attempt to use the molecular sieve columns for further purification, a gel with a larger pore size (G 50) was used. SEPHADEXƒ G 50 absorbs polyglucose molecules below a molecular weight of 7000. The fractions with the largest molecules showed the greatest effectiveness, but even the fractions with the smallest molecules still showed a certain activity (G 36-41). The effectiveness after the S-180 experiment in mice gave the following results: Effectiveness (T / C ratio) dose 32 16 8 I 4 2 1 I 0.5 Examined material (solid) At the. Sulfate ppte. G 21. . . . . . . . . . . . . . . . . - toxic 0.52 0.83 - - - At the. sulfate ppte. G 23. . . . . . . . . . . . . . . . . toxic -28 0.20 0.68 0.85 - - SEPHADEX® 3000 G 27. . . . . . . . . . . . . . toxic toxic toxic 0.09 0.45 0.73 0.86 Molecular weight from SEPHADEX parliamentary groups Greater than 7000 G 36. . . . . . . . . . . . . . . . . - - - 0.19 0.37 - - Greater than 3000 G 37. . . . . . . . . . . . . . . . . - - - 0.07 0.45 - - Almost equal to 3000 G 38. . . . . . . . . . . - - toxic - 0.57 - - Lower than 3000 G 38. . . . . . . . . . . . . . . - - toxic - 0.65 - - Last eluate G 41. . . . . . . . . . ... . . . . . . - - 0.81 - - - - * Milligrams of actinogan per kilogram of mouse per day. A dash in the table means that no test was possible with this dose. was made. The starting broth gave the following T / C ratio (dilution in brackets): toxic (1/32); 0.75 (1/64) and 0.91 (1/25).

Die Substanz Actinogan stimuliert die Abwehrkräfte und stimuliert die Bildung von Abwehrkörpern! Wenn also ein »schwaches« Antigen zur Bildung von Antikörpern gegeben ist, führt die Verabreichung von Actinogan zu einer gesteigerten Bildung der Antikörper. Dieser Umstand ist wertvoll bei der Suche nach einem schwachen, aber nichttoxischen Antibioticum. Actinogan ist eine wertvolle Hilfe beim Studium der Faktoren, die mit der Abwehrkraft des Gastkörpers, der Bildung von Antikörpern, der Entfernung von Teilchen aus dem Blutstrom durch das Reticuloendothelialsystem und dem Verhältnis zwischen diesem System und aufkommenden Infektionen. Auf diese Weise dient Actinogan der Erforschung des Körpermechanismus in ähnlicher Weise wie die Anwendung von bakteriellen Endotoxinen. Actinogan ist außerdem geeignet, verhältnismäßig unwirksame antibakterielle Mittel zu potenzieren, insbesondere Antibiotika, in der Weise, daß eine größere Wirksamkeit vermittelt wird oder die Möglichkeit einer schwächeren Dosierung gegeben wird.The actinogan substance stimulates and stimulates the body's defenses the formation of defense bodies! So if a "weak" antigen is used to produce Antibodies is given, the administration of Actinogan leads to an increased Formation of antibodies. This fact is valuable when looking for a weak, but non-toxic antibiotic. Actinogan is a valuable aid to study the factors associated with the host body's immune system, the formation of antibodies, the removal of particles from the bloodstream by the reticuloendothelial system and the relationship between this system and emerging infections. To this Actinogan is used to research the body's mechanism in a similar way to the use of bacterial endotoxins. Actinogan is also suitable, proportionate potentiate ineffective antibacterial agents, especially antibiotics, in the Way that a greater effectiveness is conveyed or the possibility of a weaker one Dosage is given.

Die Substanz Actinogan ist ein wertvolles Mittel, gewisse Tumore rückläufig zu machen. Tritt eine solche Regression bei Tieren auf, so kann derselbe Tumor-»strain« nicht mehr implantiert werden. Man hat so auf eine praktische, einfache Art ein einzigartiges Testtier erhalten, z. B. eines, das gegenüber diesem besonderen Tumor »resistent« ist. Für die wissenschaftliche Erforschung einiger biochemischer und physiologischer Vorgänge wird ein Paar sonst offensichtlich gleicher Tiere zur Verfügung gestellt, eines, das,tumorresistent, und eines (das unbehandelte Kontrolltier), das nicht resistent ist.The actinogan substance is a valuable means of reducing certain tumors close. If such a regression occurs in animals, the same tumor "strain" can no longer be implanted. Man did so in a practical, simple way Kind receive a unique test animal, e.g. B. one that is opposite this particular Tumor is "resistant". For scientific research into some biochemical and physiological processes, a pair of animals that are otherwise obviously the same will become Provided, one that, tumor-resistant, and one (the untreated control animal), that is not resistant.

Die Substanz Actinogan ist wertvoll für Mensch und Tier und bewirkt eine teilweise oder völlige Regression gewisser Tumore.The actinogan substance is valuable for humans and animals and has an effect partial or total regression of certain tumors.

Die Substanz Actinogan ist wertvoll für Mensch und Tier bei gleichzeitiger Verabreichung mit autologen Tumorvaccinen. Das erfindungsgemäße Produkt besitzt außerdem die Fähigkeit, die Eigenresistenz des Wirtskörpers gegen Infektionen zu erhöhen, wie im folgendem Versuch gezeigt wird.The substance actinogan is valuable for humans and animals at the same time Administration with autologous tumor vaccines. The product according to the invention possesses also the ability to increase the host body's own resistance to infection as shown in the following experiment.

Das erfindungsgemäße Produkt wurde 3 Tagelang einmal täglich in die peritoneal Höhlung der männlichen weißen Maus (18 bis 20 g) injiziert. Am dritten Tage unmittelbar nach der dritten Einspritzung wurde die Maus mit Staphylococcus aureus (zwei gegen Benzylpenicillin und Tetracycline hochresistente Isolate) infiziert. Es wurde eine Suspension der Kokken in Schweinemagensaft (5 %) intraperitonal injiziert. Die Wirkung wird beurteilt nach dem Weiterleben und dem Tod der Mäuse. Die Ergebneisse zeigt die untenstehende Tabelle: Produkt Organismus Ergebnis Dosis (Infektion Verhältnis drei tägliche zum Zeitpunkt Tod zu Injektionen der Einspritzung) Gesamtzahl Mäuse 5,0 0.-5 1,0 Staph. aureus 0 : 5 0,1 (1633-2) 1: 5 0 10: 10 5,0 0 : 5 1,0 Staph. aureus 0 : 5 0,1 (52-75) 2 : 5 0 9:10 Wie Versuche ergaben, zeigte das Produkt keine Schutzwirkung, wenn nur eine Dosis zum Zeitpunkt der Infektion gegeben wurde. Versuche mit überlebenden Mäusen (s. oben), die erneut infiziert wurden, zeigten, daß die Schutzwirkung bei Behandlung mehrfacher Dosen mindestens 6 Tage lang noch vorhielt. Der vorstehende Versuch kann auch als Untersuchungsmethode für das erfindungsgemäße Produkt angewendet werden.The product of the present invention was injected into the peritoneal cavity of the male white mouse (18 to 20 g) once a day for 3 days. On the third day immediately after the third injection, the mouse was infected with Staphylococcus aureus (two isolates highly resistant to benzylpenicillin and tetracyclines). A suspension of the cocci in pig gastric juice (5%) was injected intraperitoneally. The effect is assessed after the survival and death of the mice. The results are shown in the table below: Product organism result dose (Infection ratio three daily at the time of death Injections of Injection) Total number Mice 5.0 0-5 1.0 staph. aureus 0: 5 0.1 (1633-2) 1: 5 0 10: 10 5.0 0: 5 1.0 staph. aureus 0: 5 0.1 (52-75) 2: 5 0 9:10 Tests have shown that the product showed no protective effect if only one dose was given at the time of infection. Experiments with surviving mice (see above) that were re-infected showed that the protective effect persisted for at least 6 days after treatment with multiple doses. The above experiment can also be used as a test method for the product according to the invention.

Claims

Claim: The use of the Nocardia humifera nov. spec. ATCC 13,748 under submerged aerobic conditions in an aqueous carbohydrate solution at a temperature of about 22 to about 37 ° C until a substantial one is produced Activity against Sarcoma 180 in this medium to produce the anti-tumor Active ingredient Actinogan under normal submerged aerobic conditions and extraction of the actinogans from the fermentation liquid and, if necessary, its purification in the usual way Way.