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Verfahren zur Reinigung kristallinen Insulins Die vorliegende Erfindung
bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung kristallinen Insulins von damit vermischten
amorphen oder mikrokristallinen Bestandteilen.
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Es ist bekannt, daß in verschiedenen, sogar sehr reinen Insulinpräparaten
amorphe oder mikrokristalline, fremde Bestandteile anwesend sind, und es sind auch
schon mehrere Verfahren zur Abtrennung dieser Verunreinigungen vorgeschlagen worden,
die jedoch alle sehr umständlich sind. So wird in der USA.-Patentschrift 2 826 534
und in der französischen Patentschrift 1106 298 ein Verfahren beschrieben,
bei dem eine wäßrige Säurelösung eines Insulinpräparates durch langsames Hinzufügen
einer Base alkalisch gemacht und darauf das Insulin durch Erniedrigung des PH-Wertes
auf 5,3 bis 5,9 präzipitiert wird. Das -so erhaltene Insulin ist aber amorph und
muß zur Herstellung kristallinen Insulins erst weiter verarbeitet werden.
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In der deutschen Auslegeschrift 1036 469 ist beschrieben, daß ein
kristallines Insulinpräparat gereinigt werden kann, indem man eine wäßrige Lösung
desselben bei einem PH-Wert von 4,0 bis 5,5 in Gegenwart von weniger als 1 Gewichtsprozent
eines Alkali- oder Ammoniumsalzes einer einbasischen Mineralsäure mit einem organischen
Lösungsmittel versetzt und nach Abfiltrieren der gefällten Verunreinigungen das
gereinigte Insulin aus dem Filtrat in bekannter Weise isoliert.
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Es wurde nun gefunden, daß kristallines Insulin, das mit amorphen
oder mikrokristallinen fremden Bestandteilen gemischt ist, auf überraschend einfache
Weise von fremden Bestandteilen gereinigt werden kann, indem das unreine kristalline
Insulin mit Wasser gewaschen wird, das mittels einer schwachen Säure oder eines
Puffergemisches auf einen PH-Wert zwischen 3,8 und 4,3 gebracht wird.
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Auf diese Weise erübrigt sich ein umständliches, selektives Sedimentationsverfahren,
das nur bei einer weitgehenden Reinigung des Kristallisats gute Ergebnisse liefern
kann, und darüber hinaus werden Verluste beim Auflösen vermieden.
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Außerdem ergab es sich, daß die Gewichtsverringerung des Kristallisats
im Vergleich zu der Zunahme an biologischer Aktivität überraschend gering war. Es
wurde gefunden, daß z. B. ausgehend von 10 g Insulin mit einer Aktivität von 24
I. E. 9,5 g reines Insulin mit einer Aktivität von 27 I. E. erhalten wurde. Durch
biologische Prüfungen wurde bestätigt, daß bei Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens unter anderem der sogenannte hyperglycämische Faktor, d. h. die Verunreinigung,
die beim Verabreichen von Insulin anfangs eine Zunahme des Blutzuckergehalts hervorruft,
weggewaschen wird.
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Die Waschflüssigkeit wird vorzugsweise auf einem pH-Wert zwischen
4,0 und 4"3 gehalten, da unter diesen Verhältnissen, sogar wenn das kristalline
Insulin während sehr langer Zeit in der Flüssigkeit bleibt, kein Insulin gelöst
wird.
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Obgleich das Verfahren nach der Erfindung auch für die Reinigung von
Kristallisaten mit einem sehr hohen Gehalt, an fremden Bestandteilen von Bedeutung
ist, ist es in besonderem Maße anwendbar zur Herstellung kristallinen Insulins mit
einer sehr hohen biologischen Aktivität aus Kristallisaten mit einer Aktivität von
mindestens 22 I. E. pro Milligramm. Solche Kristallisate können auf jede bekannte
Weise erhalten worden sein.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann in der Weise durchgeführt werden,
daß ein Kristallisat aus einer Lösung von amorphem Insulin von der Mutterlauge getrennt
und in einer wäßrigen Flüssigkeit suspendiert wird, die mittels einer schwachen
Säure oder eines Puffers auf den PH-Wert zwischen 3,8 und 4,3 gebracht worden ist.
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Nach dem einige Zeit dauernden Rühren wird das reine Kristallisat
ausgeschieden, mit einem Puffer mit einem pH von 5,9, dann mit destilliertem Wasser
und darauf gegebenenfalls mit Alkohol, Aceton und Äther gewaschen.
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Das abfiltrierte rohe Kristallisat kann z. B. auch in destilliertem
Wasser, 50 bis 500 ml pro 10 g Kristallisat,
aufgenommen werden,
worauf die Flüssigkeit mittels Essigsäure auf den gewünschten PH-Wert gebracht wird.
Es ist empfehlenswert, um schnelles Auswaschen fremder Bestandteile zu erzielen,
das rohe Kristallisat unmittelbar nach dem Abtrennen aus der Mutterlauge mit der
Waschflüssigkeit nach der Erfindung zu waschen. Das rohe Kristallisat wird z. B.
abfiltriert, das zunächst mit destilliertem Wasser und darauf mit einer Pufferlösung
z. B. Ammoniumacetat-, Zitrat- oder Ammoniumphosphat oder Natriumphosphat gewaschen
wird. Es ist auch möglich, die abfiltrierte Mutterlauge des rohen Kristallisats
bis zu einem pH-Wert zwischen 3,8 bis 4,3 anzusäuern, welche Flüssigkeit beim Waschen
gemäß der Erfindung benutzt wird.
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Es ist schließlich auch möglich, die Flüssigkeit, in der sich das
rohe Kristallisat nach der Kristallisierung befindet, vorzugsweise nach dem Entfernen
des größten Teiles der oberhalb des Kristallisats vorhandenen Flüssigkeit, nachdem
die Kristallisierung bei einem PH von 5,5 bis 6,5 vollzogen worden ist, anzusäuern.
Nach Filtrierung und Waschen mit destilliertem Wasser wird ein von amorphen Bestandteilen
befreites kristallines Insulin mit einer stark erhöhten biologischen Aktivität erhalten.
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Beispiel I 80 g amorphes Insulin, das aus Rinderpankreas gewonnen
und in Form eines isoelektrischen Niederschlags mit einer biologischen Aktivität
von 18 I. E. pro Milligramm erhalten worden ist, wurde in 41 destilliertem Wasser
gelöst, dem 90 ml Essigsäure und 800 mg Zink in Form von Zinkacetat zugesetzt wurde.
Die Lösung wurde filtriert, und das Filter wurde mit 11 destilliertem Wasser nachgespült,
dem 10 ml Essigsäure zugesetzt worden war. Das Spülwasser wurde der Lösung zugesetzt
und damit vermischt. Unter Rühren wurden 31 destillierten Wassers zugesetzt, das
eine solche Menge Ammoniak (130 bis 140 ml 25 % Ammoniak) enthielt, daß der pH-Wert
nach vollständiger Mischung sich auf 5,9 einstellte.
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Nach Beendigung der Kristallisierung wurde die klare Mutterlauge scharf
abgehebert. Der Niederschlag wurde in 0,51 destilliertem Wasser homogen suspendiert.
Unter Rühren wurde eine solche Menge 30% Essigsäure zugesetzt, daß der pH-Wert 4,05
betrug. Eine mikroskopische Prüfung bestätigte, daß die Suspension frei von amorphem
Material war. Die Kristalle wurden abfiltriert und einmal mit einem Puffer gewaschen,
der durch Neutralisierung einer 2% Essigsäurelösung mit Ammoniak bis zu einem pH-Wert
von 5,9 hergestellt war. Darauf wurden die Kristalle dreimal mit destilliertem Wasser,
zweimal mit 9611/o Äthylalkohol und einmal mit Äther gewaschen. Nach dem Trocknen
ergaben sich 68 g Kristalle mit einer Aktivität von 23 I. E. pro Milligramm bei
einem Feuchtigkeitsgrad von 5019. Das gelöste amorphe Material wurde durch
Zusatz von Ammoniak bis zu einem pH-Wert von 5,9 niedergeschlagen. Die Aktivität
des trockenen Niederschlags betrug 3 I. E. pro Milligramm. Beispiel 1I 5 g mangelhaft
kristallisierten Rinderinsulins mit einer biologischen Aktivität von 22,6 I. E.
pro Milligramm bei einem Feuchtigkeitsgehalt von 7% wurde in 200 ml 2% Essigsäurelösung
in destilliertem Wasser gelöst, dem 2 mg Zn in Form von Zinkacetat zugesetzt war.
Die Lösung wurde klar ausfiltriert, und das Filter wurde mit 50 ml 20.:ö Essigsäure
in destilliertem Wasser nachgespült. Das Spülwasser wurde der Lösung zugesetzt und
damit vermischt. Unter Rühren wurden 250 ml verdünnter Ammoniak zugesetzt, so daß
der pff-Wert nach vollständiger Mischung 5,95 war. Nach Beendigung der Kristallisierung
wurde die klare Mutterlauge scharf abgehebert, und das Kristallisat wurde homogen
in 30 ml destilliertem Wasser suspendiert. Unter Rühren wurde eine solche Menge
30% Essigsäure in destilliertem Wasser zugesetzt, daß der pH-Wert 4,2 betrug. Durch
mikroskopische Prüfung wurde bestätigt, daß alles amorphe Material gelöst worden
war. Die Kristalle wurden abfiltriert und einmal mit 10 ml der Mutterlauge, dreimal
mit 10 ml destilliertem Wasser, zweimal mit 25 ml 99 % Aceton und einmal mit Äther
gewaschen. Nach dem Trocknen wurden 4,6 g regelmäßiger Kristalle mit einer Aktivität
von 25,7 I. E. bei einem Feuchtigkeitsgehalt von 5 % erhalten. Der Zinkgehalt betrug
0,32 0/0. Das amorphe Material wurde durch Zusatz von Ammoniak bis zu einem PH-Wert
von 5,9 niedergeschlagen. Nach dem Trocknen dieses Niederschlags ergab es sich,
daß dieser eine Aktivität von etwa 1 I. E. pro Milligramm hatte, die auf biologischem
Wege schwer genau festgestellt werden kann.