DE2018588A1

DE2018588A1 - Verfahren zur Isolierung und Reim gung von Insulin

Info

Publication number: DE2018588A1
Application number: DE19702018588
Authority: DE
Inventors: Indianapolis Ind Jackson Richard Lee (V St A ) P
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1969-12-05
Filing date: 1970-04-17
Publication date: 1971-06-09
Also published as: CA918565A; DK127165B; GB1269185A; US3719655A; NL154423B; SE371745B; FR2045435A5; NL7005291A

Description

PATENTANWÄLTE'

...DR..W.. PFEIFFER

DR. F. VOITH ENLEITNER " * ':' " ' " " "'■

8 MÜNCHEN 23 '

UNGERERSTR. 25 - TEL. 39 02 36

82 331

Eli Iälly and Company, Indianapolis, Indiana, V.St.A. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Insulin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Insulin.

Kristalline Pormen von Insulin sind mehrfach bescbrie«· ': ben worden, zum Beispiel "von Abel, Proc. Nat. Aead., Sei. 12, 132 (1926); Biochem. J. 28, 1592-1602 (1934)? und 29, 1048-1054 (1935)} USA-Patentschrift 2 .143 590; _r· Harrington und Scott, Biochem. J. 23, 384 (1929); * und USA-Patentschrift 2 819 999 und 2 836 542. Eine Über- . sieht wurde von Schlichtkrull, "Insulin Crystals", Verlag Ejnar Munksgaard, Kopenhagen, Dänemark, 1958, ver- ' öffentlicht. Diese und andere Veröffentlichungen führten zu der Auffassung, daß Insulin nur in Gegenwart bestimmter zweiwertiger Kationen, von denen Zink, Cobalt, Cadmium, Nickel, Kupfer, Eisen und Mangan ausdrücklich genannt ' sind, Kristalle bildet. In der Veröffentlichung von '■■ Schlichtkrull sind jedccb Insulinkristalle unbekannter * Zusammensetzung beschrieben, die als Bhombendodeoaeäer,, vorliegen.

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ORlGtNAL INSPECTED

• ¹Vl

lach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden in guter Ausbaute die- yqü Schlictitkrull beschriebenen Rhombendodecaederkristalle von Insulin und neuartige Octadecaederkristalle VOB Insulin erhalten«, Seit der Entdeckung des Insulins als Komponente'des Pankreas im Jahre 1921 wird die Entwicklung ; von Methoden zur Reinigung von Insulin mit "beträchtlichem Aufwand betrieben..' '

E¹Ur gegenwärtig angewandte technische Verfahren zur Reinigung von Insulin sind eine..oder mehrere Salzfällungen "bei verschiedener Salzkonzenträtion, eine oder mehrere isoelektrische Fällungen un.d wenigstens eine Zinkkristallisation typisch.

In der USA-Patentschrift 1 469 994 ist ein Reinigungsverfahren "beschrieben, "bei dem die Verunreinigungen, die in einem wässrigen Pankreasextrakt enthalten sind, "bei ihrem isoelektrischen Punkt gefällt werden. Bas Insulin verbleibt nach Entfernung der liederschläge in dem Extrakt.

In der USA-Patentschrift 1 520 673 ist die isoelektrische Fällung von Insulin aus einem wässrigen Pankreasextrakt bei etwa pH 4 bis etwa pH 7, vorzugsweise zwischen etwa pH 4»5 und pH 5,5» beschrieben, ein Verfahren, das immer noch in der Technik zur Reinigung von Insulin.angewandt wird.

In der USA-Patentschrift' 1 866 56'9 ist ein Verfahren zur Reinigung von Insulin durch Behandlung eines praktisch wasserfreien insulinhaltigen Materials mit wasserfreiem Ammoniaks, Abfiltrieren der so erhaltenen lösung von dem unlöslichen Rückstand und Verdampfen des Ammoniaks aus dem Piltrat beschrieben, wodurch ein weißes amorphes Insulinprodukt erhalten wird.

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In der USA-Patentschrift 1 547 515 ist das erste Verfahren zum Aussalzen von Insulin aus einem Extraktionslösungsmittel durch Zusatz von Natriumchlorid beschrieben.

In. der USA-Patentschrift 2 449 076 ist ein differentielles Aussalζverfahren zur 'Insulinreinigung durch Aussalzen von Insulin aus einem neutralisierten Extrakt durch Zusatz von Natriumchlorid, Filtrieren, Wiederauflösen des Rückstands und erneutes Aussalzen des Insulins unter Anwendung einer niedrigeren Natriumchloridkonzentration angegeben. Die vorgeschlagenen Natriumchloridkonzentrationen liegen zwischen 25 und 15 Gewichtsprozent.

Die USA-Patentschrift 2 529 152 beschreibt ein Verfahren zur Abtrennung von Fetten aus Insulin durch teilweise Verdampfung des Alkohols "aus einem wässrigen insulinhaltigen Säure-Alkohol-Extrakt und Abtrennen der Fettfraktion, die in der verbleibenden Mischung unlöslich ■ ist.

In der USA-Patentschrift 2 648 622 ist die Fällung von Insulin in Form von zusammengeballten Fäserchen beschrieben. Vorher isolierte Fäserchen werden zum Animpfen wässriger insulinhaltiger Lösungen verwendet, um das Insulin daraus auszufällen. Die Insulinfäserchen werden durch Filtrieren oder Zentrifugieren isoliert.

In der USA-Patentschrift 2 663 666 ist ein Verfahren zur Insulinreinigung beschrieben, bei dem die Azidität eines wässrigen Pankreasextrakts nacheinander auf pH 4,0 bis 5,5, pH 7,0 bis 8,5 und pH 3,0 bis 3,5 eingestellt, die nach äeder Einstellung erhaltene Mischung filtriert und der bei jeder Filtration erhaltene Rückstand, der aus den unerwünschten sauren und basischen Komponenten des Extrakts besteht, verworfen wird. Das Insulin wird dann aus dem letzten FiItrat gewonnen. -

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In der USA-Patentschrift 2 636 228 wird die Fällung von Zink-Insulin aus einem Zitronensäure-Zitrat-Puffer als Maßnahme zur Abtrennung von Insulin von einem glycogenolytischen Faktor vorgeschlagen.

In der .USA-Patentschrift 2 878 159 ist ein Verfahren zur Reinigung von Insulin durch Überleiten eines wässrigen Pankreasextrakts über ein Kationenaustauscherharz vom Carbonsäuretyp beschrieben. In der USA-Patentschrift 3 069 323 ist die Verwendung eines Aminocellulose-Anionenaustauscherharzes in einem ähnlichen Verfahren angegeben.

Die Erfindung bezweckt ein Verfahren, mit dem Insulin in beträchtlich höheren Ausbeuten und in reiner Form, verglichen mit bekannten Verfahren, erbalten wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von Insulin aus einem wässrigen insulinhaltigen Pankreasextrakt oder anderen wässrigen insulinhaltigen lösungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Basizität der insulinhaltigen lösung auf etwa pH 7,2 bis etwa pH 10,0 und die Alkalikationen- oder Ammoniumkationenkonzentration auf eine etwa 0,2 bis etwa 1,0 m Konzentration dieser Kationen einstellt und dadurch die Kristallisation des Alkali- oder Ammonium-Insulins veranlaßt.

Das Alkali- oder Ammonium-Insulin, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in hoher Ausbeute auskristallisiert, kann durch Filtrieren, Dekantieren oder Zentrifugieren abgetrennt werden. Das Salz kristallisiert in der Octadecaeder- oder Dodecaederkristallform und ist wasserlöslich. Die isolierte Kristallform wird von der Insulinkonzentration und der Basizität der Mutterlauge sowie durch das Altern der Kristalle vor der Abtrennung beeinflußt.

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Etwa 1 Kation pro Insulinmolekül wird in die Kristallstruktur eingebaut» Das kristalline "Produkt kann ohne weitere Reinigung zur Herstellung von handelsüblichen Zink-Insulinpräparaten verwendet werden.·

Die Kristalle gehören offenbar dem isometrischen oder kubischen System an, wobei die 12 Kanten eines Würfels . während des Kristallwachsturns abgestumpft werden.

In den beigefügten Zeichnungen zeigt Figur 1 die Kristalle, die erhalten werden, wenn eine. Abstumpfung nur in sehr geringem Maß stattgefunden hat. Figur 2 zeigt Kristalle, bdi denen eine stärkere Abstumpfung erfolgt ist, und Figur 3 zeigt Kristalle, bei denen die ursprünglichen V/ürfelflachen während der Kristallisation verschwunden sind. Die in Figur 3 dargestellten Kristalle sind anscheinend mit den Kristallen unbekannter Zusammensetzung identisch, die von Scblichtkrull,. loc. cit. beschrieben wurden.

Bei einer typischen Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Insulin-Salzkuchen, der die durch Aussalzen von Insulin aus einem neutralisierten Pankreasextrakt erhaltenen Peststoffe enthält, als Quelle für Insulin verwendet. Alternativ kann jede wässrige saure Lösung mit einem Gehalt von etwa 1 bis etwa 100 mg Insulin pro ml lösung, die praktisch frei von den zweiwertigen Ionen ist, welche bekanntermaßen mit Insulin kristallisieren, dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen werden.

Es leuchtet ein, daß das erfindungsgemäße Verfahren auch mit einer basischen Insul'inlösung durchgeführt werden kann. Wegen der Unbeständigkeit das Insulinmoleküls unter basischen Bedingungen ist eine solche Arbeitsweise jedoch nicht das Verfahren der Wahl,

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Das erfindungsgemäße Verfahren, das von insulinbaltigen Feststoffen oder wässrig-sauren insulinfcaltigen Lösungen ausgeht, wird, im folgenden näher beschrieben. Wenn das Ausgangsmaterial ein Feststoff ist, wird dieser in einer wässrigen Lösung mit einem pH-Wert von etwa 1,5 bis etwa 4,5.gelöst, so daß eine Endkonzentration von etwa 1 bis etwa 100 mg Feststoffe pro ml Lösung erzielt wird. Die wässrige insulinbaltige Lösung wird mit etwa 0,2 m bis etwa 1,0 m wässriger Alkalihydroxid- oder Ammoniumhydroxidlösung versetzt, bis ein pH-Wert von etwa 7,2 bis 10,0, vorzugsweise von'etwa 7_}8 bis 8,6 erreicht ist. Nötigenfalls wird ein Salz des betreffenden Kations züge-

J) setzt, damit eine Kationenendkonzentratlon von etwa 0,2 m bis etwa 1,0 m, vorzugsweise etwa 0,5 m erzielt wird. Während der Zugabe der Base fällt das Insulin etwa beim isoelektrischen Punkt als Zwitterion aus und löst sich anschließend oberhalb etwa pH 7 wieder auf. Die maximale Ausbeute an kristallinem Insulinsalz wird erzielt, wenn die Basizität etwa pH 8,2 nahe kozmrt. Die Ausbeute ist bei Raumtemperatur oder nahe bei Bauxatemperatur liegenden Temperaturen optimal und nimmt bei niedrigeren Temperaturen ab. Die Kristallisation ist je nadi den .angewandten Bedingungen und der Qualität und Quantität de3 Ausgangsmaterials, wie noch näher erläutert wird, in etwa 1/4 bis etwa 72 Stun-

k den beendet. Das auskristallisierte Insulin wird durch Dekantieren oder Filtrieren von der wässrigen. Mutterlauge abgetrennt.

Nach Abtrennung des kristallinen Produkts wird die Mutterlauge mit etwa 1/10 Volumen Alkohol verdünnt und auf pH 5,2 eingestellt, um die isoelektrisch Ausfällung des in der Lösung verbliebenen Insulins herbeizuführen. Der erhaltene Niederschlag wird abgetrennt und in Säure ge~ löst, und das Kristallisationsverfahreii wird zur Gewinnung weiterer Insulinmengen wiederholt.

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Die isolierten insulinkristalle, die etwa 90 5^ des in der. ursprünglichen Lösung enthaltenen Insulins ausmachen, können wieder in Wasser gelöst und ohne weitere Reinigung zur Hersteilung von Zink-Insulin oder irgendeines anderen üblichen Insulinpräparats verwendet werden. Solche handeisüblichen Präparate sind beispielsweise PZI (Protamin-Zink- -Insulin)t öle Lente-Insulin-Präparate und sogenanntes "reguläres Insulin¹¹. Alternativ können die Kristalle vor der Zink-Insulinkristallisatiön nach jeder anerkannten Reinigungsmethode weiter gereinigt werden.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Kristalle weisen entweder 12 oder 18 Flächen auf und werden der isometrischen Kristallklasse zugeordnet. Isometrische Kristalle weisen drei gleiche Achsen auf, die aufeinander senkrecht stehen.

Normalerweise wird etwa 1 Kation pro Insulinmolekül in die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Kristalle eingebaut. Weitere Mengen von Kationen, die bei manchen Versuchschargen gefunden werden, scheinen · aus dem Einbau von Natriumchlorid in das Kristallgitter zu stammen. Diese Erscheinung ist bei Kristallen allgemein bekannt.

Im Gegensatz zu den Insulinkristallen, die Zink, Kupfer, Cadmium, Mangan, Cobalt, Eisen, Nickel oder ähnliche mehrwertige Ionen enthalten, lösen sich die erfindungsgeraäß erhältlichen Kristalle rasch in Wasser auf. Die Kristalle sind jedoch nicht hygroskopisch oder zerfließen nicht, wenn sie mit feuchter Luft unter normalen atmosphärischen Bedingungen in Berührung kommen. Sie können mit Äther oder Alkohol/Äther gewaschen und an der Luft oder im Vakuum getrocknet werden. Im trockenen Zustand können.sie in einem geschlossenen Behälter lange Zeit ohne Aktivitätsverlust gelagert werden. '

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Die gute Löslichkeit der hierin beschriebenen Kristalle ist für die Herstellung von Insulinlösungen zur weiteren Reinigung nach typischen Herstellungsverfahren vorteilhafte Diese weitere Reinigung kann in einer Adsorption an Ionenaustauscherharzen mit anschließender Elution oder in einer selektiven Filtration durch ein Molekularsieb besteben. Die gute Löslichkeit ist ferner für die Herstellung von Zubereitungen für die Verabreichung vorteilhaft. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erbältliche Insulin ist ebenso gut wirksam wie das zur Zeit handelsübliche Zink-Insulin.

" Wässrige Lösungen, die zum Auflösen von rohen Insulinpräparaten vor dem erfindungsgemäßen Kristallisationsverfahren geeignet sind, können aus verdünnten wässrigen Lösungen von anorganischen Säuren, zum Beispiel Salzsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, von organischen Säuren, zum Beispiel Essigsäure, Zitronensäure oder Propionsäure, oder von Mischungen der genannten Säuren mit pH-Werten zwischen etwa 1,5 und 4,5 bestehen.

Die Basifizierung kann mit wässrigen Lösungen von Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid, Kaiiumhydroxid, Cäsiumhydroxid, Rubidiumhydroxid oder Ammoniumhydroxid mit den oben definierten Konzentrationen erfolgen.

Salze oder deren wässrige Lösungen, die zur Erhöhung der Kationenkonzentration bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zugesetzt werden können, sind lösliche organische und anorganische Salze, die aus dem gleichen Kation, wie es zur Basifizierung verwendet wird, und irgendeinem geeigneten Anion bestehen. Vorzugsweise sind die Anionen die gleichen Anionen, die bereits in der Lösung enthalten sind, beispielsweise infolge der Auflösung des Insulinsalzkuchens in einer wässrigen Säurelösung. Wenn also beispielsweise der Salzkuoben

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in. Salzsäure gelöst wird und Natrium-Insulinkristalle gewünscht werden, kann die Basifizierung durch Zusatz einer wässrigen Natriumhydroxidlösung erfolgen und die Kationenkonzontration durch Zusatz von Natriumchlorid oder einer wässrigen Lösung davon eingestellt werden. Wenn das Insulin in Essigsäure gelöst wird und Kalium-Insulinkristalle gewünscht werden, kann die Basifizierung durch Zusatz einer wässrigen Kaliumhydroxidlösung erfolgen, und die Kationenkonzentration durch Zusatz von Kaliumacetat oder einer wässrigen Lösung davon erhöht werden.

Konservierungsmittel, zum Beispiel Phenol oder Methylp-hydroxybenzoat, Sequestriermittel,, zum Beispiel Tetra-natriumäthylendiamintetraacetat, und kleine Volumenmengen organischer mit Wasser mischbarer Lösungsmittel verändern die Art oder Ausbeute des nach dem erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Produkts nicht.

Die folgende Tabelle I zeigt den Einfluß des pH-Werts auf die Insulinausheute bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. In der Tabelle gibt Spalte 1 den pH-Wert der kristallisierenden Lösung, Spalte 2 die zur Erzielung einer maximalen Insulinkristallisation erforderliche-Zeit und Spalte 3 die Insulinausbeute in mg Natrium-Insulin pro 0,45 kg (1 pound) extrahiertem Pankreas an. In allen Beispielen wurde das Natrium-Insulin durch Basifizierung aliquoter Teile einer wässrigen Essigsäurelösung von Pankreasextrakt mit wässriger- 1 η Natriumhyd'roxidlösung bis zu dem angegebenen pH-Wert und anschließende Aufbewahrung der basischen Lösung bei ungefähr Raumtemperatur während der angegebenen Zeit vor Isolierung des kristallinen Produkts hergestellt.

247 20 1k

Tabelle I

pH zu maximalen Kristallisation erforderliche Zeit

Ausbeute in mg/0,45 kg ( 1 pound)*Pankreas

7,0	2 Tage
7,4	1 Tag
7,8	75 Minuten
ä,2	5 Minuten
8,6	5-10 Minuten
9,0	1 Tag.
9.4	' 2 Tage
9,8	4-5 Tage .
10,2	—

11,3 32,8 55,5 46,9 43,7 41,7 32,5 46,8 0,0

Die folgende Tabelle II zeigt die Ergebnisse von Vergleichsversuchen, bei denen die Insulinreinigung entweder nach dem erfindungsgemäßen Verfahren oder nach gegenwärtig üblichen Keinigungsmethoden mit iaoelektrischer Fällung und Zinkkristallisation durchgeführt wurde. Bis Vergleichsergebniase stammen aus Versuchen, die mit aliquoten Insulinproben der gleichen wässrigen Säurelösung von Pankreasextrakt durchgeführt wurden. In der Tabelle gibt Spalte 1 die Chargennummer und die Herkunft des Insulins, Spalte 2 die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielte Insulinausbeute als Natrium-Insulin und Spalte 3 die nach dem bekannten Verfahren erzielte Insulinausbeute, an-

"l

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WSFECTEO

1A ■■	Schwein	45,9
1B	Schwein	48,2
10	Schwein	^N · 63,1
2	Schwein	71,2
3 ·	Schwein	62,3
4	Schwein	69,3
5	Rind	92,5
6	Rind	122

* Tabelle II

I .Ausbeute in mg/0,45kg Ausbeute in

L „ ι ^₊ (1 pound) Pankreas, mg/0,45 kg (1

Charge Herkunft _neu£ _{Methode p}°_un<J) Pankreas,

bekannte Methode

48,7 48,7 48,7 48,7 48,7 48,7 120

120

Durch die folgenden Beispiele wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert.

-Beispiel 1

Das feste Material, das durch Extraktion von etwa 148 kg (329 pounds) Schweinepankreasund Fällung der darin enthaltenen insulinhaltigen Fraktion mit 2,2 I.U.Insulin/mg erhalten wird, wird in 2 η wässriger Salzsäure gelöst, so daß ein Gesamtvolumen von 27 Liter Lösung erhalten wird. Die Lösung wird filtriert, und- der Rückstand wird verworfen. Das Filtrat wird mit 0,1 η wässriger Natriumhydroxidlösung auf pH 5»5 eingestellt, die Mischung wird durch Zentrifugieren getrennt* und die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Der Rückstand wird in 695 ml 0,5 η wässriger Essigsäure gelöst, wodurch eine Lösung mit einem pH von 3,6 und einem Gehalt von 4,8 % (Gewicht/Volumen) an Feststoffen mit 13,0 I.U./mg erhalten wird. Dann wird wässrige 1 η Natriumhydroxidlösung bis pH 8,2 zugesetzt. Die Kristallisation beginnt in etwa 15 Minuten und ist nach etwa 18 Stunden

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, ·ΑΟ ORIGINAL,

langem Rühren der Lösung bei etwa Raumtemperatur beendet. Die Natrium-Insulinkristalle werden durch Zentrifugieren isoliert. Ausbeute: 51»1 mg/0,45 kg ( 1 pound) extrahiertem Pankreas. Die überstehende Flüssigkeit wird in 1/10 Voluinenteil Äthanol eingeführt, bis. pH 5,2 angesäuert und über Nacht in der Kälte aufbewahrt. Der entstandene Insulinniederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und in 326 ml 0,5 η wässriger Essigsäure gelöst (4,18jS(Gewicht/Volumen) Peststoffe). Durch Basizifierung bis pH 8,2 werden weitere 11,2 mg Natrium-Insulinkristalle pro 0,45 kg (1 pound) Pankreas in 2 Fraktionen erhalten. Gesamtausbeute: etwa 138 mg/kg extrahierter Pankreas (62,3 mg/pound).

Beispiele 2-4 :

Das feste .Material, das durch Extraktion von etwa 68 kg (150 pounds) Schweinepankreas und Fällung der darin enthaltenen insulinhaltigen Fraktion erhalten wird, wird in 2 η wässriger Salzsäure gelöst, so daß ein Gesamtvolumen von 11,9 Liter Lösung erhalten wird. Die Lösung enthält 10,2 mg Feststoffe pro ml. Die Lösung wird mit 1/10 Volumenteil Äthanol versetzt und mit 3 η wässriger Natriuinhydroxidlösung auf pH 5»2 eingestellt..Der entstehende Niederschlag wird unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfe abfiltriert. Der Filterkuchen wird mit wässriger Salzsäure vom pH 2 extrahiert, der Extrakt wird filtriert und der Rückstand wird verworfen. Das Filtrat (165 ml) wird mit 1 η Natriumhydroxid (13,0 ml erforderlich) auf pH 8,2 eingestellt und mit 3,63 g Natriumchlorid versetzt. Die Natriumionengesamtkonzentratiön beträgt 0,45 m. Die Kristallisation beginnt sofort und ist in etwa 18 Stunden beendet. Die Kristalle werden abzentrifugiert, zweimal mit absolutem Alkohol und einrnai mit Äther gewaschen und im Vakuum ge-

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trocknet. Ausbeute: etwa 99 mg/kg extrahierter Pankreas (44,9 mg/pound). Gehalt: 24,30 £" 0,40 I.Uv/mg.

Die vorstehend beschriebene Arbeitsweise wird mit verschiedenen Natriumionenkonzentrationen wiederholt, die durch Zugabe verschiedener Mengen festen natriumchlorids eingestellt werdend ■ .· ' .

Bei einer 0,55 m Natriumionenkonzentration beträgt die Ausbeute etwa 114 mg/kg Pankreas (51,5 mg/pound). Gehalt: 24,97 i 0,52 I.U./mg. -■ '

Bei einer 0,65 m Natriumionenkonzentration beträgt die Ausbeute etwa 117 mg/kg Pankreas (53,0 mg/pound), Gehalt: 23,60+ 1,00 I.U./mg.

Beispiels

Die Arbeitsweise von Beispiel 2 wird -mit der Ausnahme wiederholt, daß 0,5 η Phosphorsäure zur Extraktion des Filterkuchens verwendet wird, der durch Filtrieren des bei pH 5,2 gefällten Niederschlags erhalten wird. Die Natriumionenendkonzentration in der kristallisierenden Lösung beträgt 0,46 m. Ausbeute: etwa 106 mg/kg Pankreas (48,2 mg/pound). Gehalt: 22,70 I.U./mg.

-■ - :;"ΐ f ■ " ■ - " ■

Beispiel 6

Die Arbeiteweise von Beispiel 2 wird"mit der Ausnahme wiederholt, daß 0,5 η Schwefelsäure zur Extraktion des Filterkuchens vorwendet w^ird, der durch Filtrieren des bei pH 5,2 gefällten Niedenchlags erhalten wird.· Die Natriumionenendkonzentration in der Kristallisationslösung beträgt 0,31m. Ausbeute etwa 100 mg/kg Pankreas (45,3 mg/pound). Gehalt: 23,85Ί 0,15 I.U./mg*

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SAD

' B e i s ρ i e 1 7

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß 1 η wässrige Lithiurahydroxidlösung zur Einstellung der sauren Lösung, die durch Extraktion des bei pH 5,2 erhaltenen Niederschlags erhalten wird, auf pH 8,2 verwendet wird. Ausbeute: etwa 27,3 mg/kg Pankreas (12,4 mg/pound). Gehalt: 21,05 I.U./mg.

Beispiel 8

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß 1 η wässrige Kaliumhydroxidlösung zur Einstellung der sauren Lösung, die durch Extraktion des bei pH 5,2 gefällten Niederschlags erhalten wird, auf pH 8,2 verwendet wird. Ausbeute: etwa 26,5 mg/kg Pankreas (12,0 mg/pound). Gehalt: 22,25 I.U./mg.

-.Beispiel '9

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß 1 η wässrige Ammoniumhydroxidlösung zur Einstellung der sauren Lösung, die durch Extraktion des bei pH 5,2 gefällten Niederschlags erhalten wird, auf pH 8,2 verwendet wird,. Ausbeute: etwa 89 mg/kg Pankreas (40,2 mg/pound). Gehalt: 20,15 I.U./mg.

Beispiele .10-12

Die Arbeitsweise der Beispiele 1, 8 und 9 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß festes Material verwendet wird, das durch Extraktion von Rinderpankreas statt von Schweine pankreas erhalten wurde. Die Insulinausbeute„ die bei fixierung der wässrigen Essigsäurelösung, die durch Extraktion des bei pH 5,2 gefällten Niederschlags qt-

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halten wird, mit Natriumhydroxid erzielt wird, beträgt etwa 202 mg/kg Pankreas (91,5 mg/pound) Gehalt: 22,70 -2,40 I.U./mg.

Die Insulinausbeute, die bei Basifizierurig des aauren Extrakts mii Xaliumhydroxid erzielt wird, beträgt etwa 178 mg/kg Pankreas (80,7 mg/pound). Gehalt: 23,68 1,39 I.V./mg.'

Die Insulinausbeute, die bei Basifizierung des sauren Extrakts Kit Ammoniümnydroxid erzielt wird, beträgt etwa 109 rag/kg Pankreas (49,1 mg/pound). Gehalt: 23,68-1,92

Be i s ρ i e 1 13

Das feste iiaterial, das durch Extraktion von etwa 9 kg (20 pounds) Hinderpankreas und Fällung der darin enthaltenen insulinhaltigen Fraktion erhalten wird, wird in 1,89 Liter 0,5 η wässriger Essigsäure; gelöst, so daß eine Lösung mit einem pH-Wert von 3,6 und einem Gehalt von 4,2 f> (Gewicht/Volumen ) Feststoffen' mit 2,2 I.U./mg erhalten wird. Dann wird wässrige 1 η Natriumhydrpxidlösung bis pH 8,2 zugegeben. Die Lösung wirdeine Stunde lang gerührt und dann mit 60,0 g Natriumchlorid versetzt. Die Kristallisation beginnt in etwa 15 Minuten und ist nach e twa 18 Stunden langem Rühren der Lösung bei etwa Raumtemperatur beendet. Die Natrium-Insulinkristalle werden durch Zentrifugieren isoliert. Ausbeute: etwa . 98,5 agAg extrahierter. Pankreas (44,7 mg/pound). Zur Erhöhung der Natriuiaionenkonzentration der überstehenden Flüssigkeit auf 1,0 m wird weiteres Natriumchlorid zugesetzt. Daraus kristallisieren weitere 11,2 mg Natrium-

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Insulinkristalle pro 0,45 kg (1 pound) Pankreas aus. Gesamtausbe,ute: etwa 11.8 mg/kg extrahierter Pankreas (53,1-mg/pound).

Durch die Isolierung und Reinigung von Insulin durch Kristallisieren der Alkali- oder Ammonium-Insulinkristalle nach dem erfindungsgeraäßen Verfahren wird eine höhere Ausbeute an reinerem Insulin als nach bekannten Verfahren erzielt, bei denen eine isoelektrische Fällung oder Zink-Insulinkristallisation angewandt wird. Nach dein erfindungsgemäßen Verfahren kann ein rohes Insulinpräparat, das nur 2 bis 5 internationale Einheiten (I.II.) Insulinaktivität pro mg Feststoffe enthält, in einem einzigen. Fällungs-Filtrations-Arbeitsgang unter Gewinnung von 90 bis 95 % ' des Insulins aus einem wässrig-sauren Pankreasextrakt zu einem Produkt mit einer Aktivität von etwa 22 bis 26. I.U./ mg gereinigt werden.

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Claims

- ί7 - · P ate ή t a. η a φ r ü e h »01B588

1. Verfahren zur Meinigung von Insulin aus einem wässrigen insulinhaltigeh Pankreasextrakt oder anderen wässrigen insülinhaltigen Lösungen, dadurch .gekennzeichnet, daß man die Basizität der insulinhaltigen Lösung auf etwa pH 7,2 bis etwa 10,0 und die Alkalikationen- oder-AmffioniumkationenkönzentratiQh auf eine etwa 0,2 bis etwa 1,0 m Konzentration dieser iCatiönen einstellt und dadurch die Kristallisation des Alkali- oder Ammonium-Insulins veranlait. .

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das auskristallisierte Alkali- oder Ammonium-Insulin von der Mutterlauge durch Filtrieren, Dekantieren oder Zentrifugieren abtrennt. .

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Ammonium-Insulin auskristallisiert,

4. Verfahren nach Anspruch*1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkaliionen Natrium-, Kalium·*· oder Lithiumionen verwendet.

3* Verfahren■nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man latrium-Insulin auskristalliaiert.

INSPECTED

L e e f s e i t e