DE1142365B

DE1142365B - Verfahren zur Gewinnung von Nucleinsaeure und deren Salze aus Fischmilch

Info

Publication number: DE1142365B
Application number: DEV11306A
Authority: DE
Inventors: Roland Vercambre
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1955-10-05
Filing date: 1956-10-02
Publication date: 1963-01-17

Description

Verfahren zur Gewinnung von Nucleinsäure und deren Salze aus Fischmilch Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung reiner Nucleinsäure und deren Salzen aus frischer Fischmilch.
Es sind Verfahren zur Behandlung tierischer Rohstoffe bekannt, die zur Gewinnung von Nucleinsäure führen. Hierbei werden die tierischen Rohstoffe mit Natronlauge behandelt und die entstandenen Nucleinsäuresalzen durch Alkohol ausgefällt. Diese Verfahren führen zu einer verunreinigten Nucleinsäure. Wenn man eine reine Nucleinsäure erhalten will, muß man den tierischen Rohstoff einer Vorbehandlung unterwerfen, um die organischen und mineralischen Verunreinigungen zu entfernen, so daß die Gewinnung und Ausfällung der Nucleinsäure nur bei einem stark gereinigten Vorprodukt ausgeführt werden kann.
Es ist ein Verfahren zur Reinigung von Nucleinsäure bekannt, bei dem die in diesem Zusammenhang als Verunreinigungen anzusehenden Proteine durch Natriumchlorid und Essigsäure in mehr oder weniger konzentrierter Lösung ausgefällt werden. Die ausgefällten Proteine werden dann durch Aluminiumacetat absorbiert. Dieses bekannte Verfahren ist in wirtschaftlichem Maßstabe nur schwer zu realisieren und würde auch, wenn es auf industrieller Basis durchgeführt werden soll, beträchtlichen apparativen Aufwand erforderlich machen, und die Ausbeute, bezogen auf die zum Ausfällen benötigte Menge Natriumchlorid und Essigsäure, ist sehr gering.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von Nucleinsäure, wobei zerkleinerte frische Fischmilch in bekannter Weise mit einer Alkalilauge hydrolysiert und das entstandene Alkalisalz der Nucleinsäure durch Alkohol ausgefällt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nun dadurch gekennzeichnet, daß dieses Alkalisalz der Nucleinsäure in der Wärme mit einer Aufschlämmung von Calciumsulfat behandelt und nach Abtrennung der Ausfällungen aus der so gereinigten Lösung des Alkalisalzes der Nucleinsäure eine praktisch reine Nucleinsäure mittels einer Mischung aus Alkohol und Salzsäure ausgefällt wird.
Aus der erhaltenen Nucleinsäure können deren Salze dadurch hergestellt werden, daß eine alkoholische Suspension der Nucleinsäure mit einer alkoholischen Lösung von Natrium oder eines anorganischen Metallsalzes, wie Mangan-, Kupfer- oder Eisensulfat, Chlorkalk, Magnesium- oder Kobaltchlorid gemischt wird, so daß sich ein entsprechendes Metallsalz der Nucleinsäure durch doppelte Umsetzung ergibt.
Zur Ausführung des Verfahrens wird zunächst die frische Fischmilch zerkleinert und ein flüssiger Brei derselben hergestellt. Dieser Brei wird mit einer warmen konzentrierten Alkalilauge behandelt. Die Mischung wird langsam unter dem Einfluß der Hydrolyse flüssig, so daß nach Beendigung der Hydrolyse die gesamte breiförmige Masse in eine gefärbte Flüssigkeit verwandelt ist.
Man kühlt die Flüssigkeit bis auf ungefähr 40'= C ab und fällt das Alkalisalz der Nucleinsäure mit Alkohol aus. Danach wäscht man dasselbe durch Dekantieren und trennt die Nucleinsalze durch bekannte physikalische Mittel, z. B. durch Zentrifugieren oder unter Druck erfolgende Filterung ab.
Der noch nicht getrocknete Niederschlag wird in der Wärme mit einer Aufschlämmung von Calciumsulfat in Wasser gereinigt. Eine erste Filtrierung findet in der Wärme statt, um eine Verstopfung der Filter zu verhindern. Das Filtrat wird hierauf zweimal kalt filtriert, damit sämtliche in dem Alkalisalz der Nucleinsäure befindlichen Proteinreste beseitigt werden. Auf diese Weise erhält man eine leicht gefärbte Lösung, die das Alkalisalz der Nucleinsäure in praktisch reinem Zustand enthält.
Die Nucleinsäure wird aus der Lösung des Alkalinucleinats mittels salzsäurehaltigen Alkohols ausgefällt. Die Trennung erfolgt durch Abnutschen oder Zentrifugieren, danach wird mit Alkohol und Aceton gewaschen. Hierbei erhält man eine Thymonuclein.-säure, welche praktisch vollkommen rein ist.
Zur Herstellung der Salze der Nucleinsäure gibt man eine Suspension von Nucleinsäure in Alkohol in eine alkoholische Lösung eines Natriumsalzes oder eines sonstigen Metallsalzes. Das Nucleinsalz bildet sich unter doppelter Umsetzung und kann nach üblichem Verfahren abgetrennt werden.
Beispiel Es werden 500 kg frische Fischmilch so lange zerkleinert, bis ein flüssiger Brei gewonnen wird. Diesen flüssigen Brei behandelt man mit 85 1 Alkalilauge bei 36° Baume 1 Stunde bei 80° C. Während der Erwärmung wird die Mischung umgerührt, wobei sich der bei der Zugabe der Lauge anfänglich bildende Rückstand langsam verflüssigt, so daß nach Ablauf einer Stunde eine bräunliche Flüssigkeit vorliegt, die auf 40° C abgekühlt wird.
Danach schüttet man die Hydrolyseflüssigkeit in 650 1 80%igen Alkohol. Hierbei wird ein noch unreines Natriumsalz der Nucleinsäure ausgefällt, das sich rasch absetzt. Die darüberstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und der Niederschlag dreimal mit 80%igem Alkohol gewaschen.
Dieser noch nicht getrocknete Niederschlag wird in eine Aufschlämmung von 5,25 kg Calciumsulfat in 97 1 Wasser pro 75 kg Niederschlag eingemischt. Die Mischung wird energisch umgerührt und auf 80° C erhitzt. Danach wird in der Wärme filtriert und das erhaltene gekühlte Filtrat einer erneuten Filtrierung unterworfen. Hierbei erhält man eine klare goldgelbe Flüssigkeit.
8 Volumteile dieser Flüssigkeit werden in eine lauwarme Mischung von 16 Volumteilen 75- bis 80%igem Alkohol und 1,8 Volumteilen Salzsäure geschüttet. Nach intensiver Durchmischung wird die Nucleinsäure in Form eines weißen Niederschlages ausgefällt. Dieser wird gesammelt, durch Dekantierung von Alkohol gewaschen, abgenutscht oder zentrifugiert und dann erneut dreimal mit Alkohol und einmal mit Aceton gewaschen.
Das erhaltene Pulver der Thymonucleinsäure ist weiß, leicht und feinkörnig und enthält etwa 15 0/0 Stickstoff, 9,5% Phosphor und 7% Feuchtigkeit. Die Bioretprobe fällt negativ aus. Mit Natriumacetat entsteht eine stabile Lösung. Das Produkt weist keinerlei Verunreinigung durch organische oder mineralische Substanzen auf. Die Ausbeute beträgt je nach dem Gehalt des Rohproduktes durchschnittlich 3,25 % der verwendeten Menge frischer Heringsmilch.

Claims

PATENTANSPRCCHE: 1. Verfahren zur Gewinnung von Nucleinsäure und deren Salze durch Hydrolyse zerkleinerter frischer Fischmilch mit Alkalilauge, Ausfällen des entstandenen Alkalisalzes der Nucleinsäure mit Alkohol, Reinigung desselben und Isolierung der freien Säure, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkalisalz der Nucleinsäure mit einer Aufschlämmung von Calciumsulfat in der Wärme behandelt und nach Abtrennung der Ausfällungen aus der so gereinigten Lösung des Alkalisalzes der Nucleinsäure mittels einer Mischung aus Alkohol und Salzsäure reine Nucleinsäure abgeschieden und gegebenenfalls dann in deren Salze übergeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet. daß das mit Calciumsulfat behandelte Alkalisalz der Nucleinsäure zuerst in der Wärme und dann im abgekühlten Zustand filtriert wird.
3. Verfahren nach Anspruch I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure in alkoholischer Suspension mit einer alkoholischen Lösung von Natrium oder eines anorganischen Metallsalzes in das entsprechende Metallsalz der Nucleinsäure durch doppelte Umsetzung umgewandelt wird. In Betracht gezogene Druckschriften: »Journal of Biological Chemistry«. Bd. 192, 1951, S. 223/224, und Bd. 203, 1953, S. 167 bis 171; »Chemical abstracts«, Bd. 48, 1954, Sp. 11737 d; »Helvetica chimica Acta«. Bd. 33. 1.955. S. l523.