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DE10320351A1 - Verfahren zum validierten Aufbau von Arrays - Google Patents

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DE10320351A1
DE10320351A1 DE10320351A DE10320351A DE10320351A1 DE 10320351 A1 DE10320351 A1 DE 10320351A1 DE 10320351 A DE10320351 A DE 10320351A DE 10320351 A DE10320351 A DE 10320351A DE 10320351 A1 DE10320351 A1 DE 10320351A1
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synthesis
type
compounds
linker
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DE10320351A
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English (en)
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Ramon Dipl.-Chem. Dr. Güimil
Matthias Dipl.-Chem. Dr. Scheffler
Barbro Beijer
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Febit Holding GmbH
Original Assignee
Febit AG
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Publication date
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Priority to AU2003294947A priority patent/AU2003294947A1/en
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Validierung der Synthese von Arrays, insbesondere von Biopolymeren, durch schrittweisen Aufbau aus geschützten und markierten Synthesebausteinen.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Validierung der Synthese von Arrays, insbesondere von Biopolymeren, durch schrittweisen Aufbau aus geschützten und markierten Synthesebausteinen.
  • Nach dem derzeitigen Stand der Technik werden die Rezeptoren (Sonden) eines Arrays durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkung immobilisiert oder in situ auf der festen Phase synthetisiert. Die Bausteine eines chemischen Polymerisationsprozesses werden generell als "Synthone" bezeichnet. Die funktionellen Gruppen eines Synthons erlauben eine zielgerichtete chemische Reaktion mit geeigneten anderen funktionellen Gruppen an einem zweiten Synthon. In aller Regel sind diese reaktiven Zentren durch sogenannte Schutzgruppen maskiert, die in einer geeigneten chemischen Umgebung gezielt entfernt werden können, wodurch eine Steuerung des Syntheseprozesses möglich wird, da nur solche funktionellen Gruppen umgesetzt werden, die keine Schutzgruppe tragen. Abhängig von der jeweiligen Synthesestrategie können Schutzgruppen im Allgemeinen durch eine Änderung chemischer oder physikochemischer Umgebungsparameter, wie dem Redoxpotential, dem pH-Wert oder der Temperatur, aber auch durch den Eintrag elektromagnetischer Energie, z.B. durch Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge, entfernt werden.
  • Für die sequenzspezifische Synthese von Oligomeren, wie Oligonukleotiden, Oligonukleotidderivaten, Peptiden oder Kohlenhydraten, die aus unterschiedlichen, jedoch endlich vielen Monomereinheiten aufgebaut sind, hat sich die von Merryfield eingeführte, sequenzielle Polymerisation durch Kondensation an einer festen Phase bewährt (R. B. Merryfield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2154; R. B. Merryfield (1965) Science 150: 179–185). Die Synthese nach Merryfield beginnt an einer trägergebundenen funktionellen Gruppe, die eine Schutzgruppe tragen kann und sich durch deren Entfernung aktivieren lässt. Dadurch wird die Kopplung eines in Lösung zugeführten, nächsten Monomers gestattet, dass nach erfolgter Polymerisation durch Kondensation seinerseits als Ausgangspunkt für einen weiteren Polymerisationsschritt zur Verfügung steht. Die sukzessive Wiederholung von Aktivierung und nachfolgender Polymerisation durch Kondensation führt schließlich zur Synthese des gewünschten Oligomeren.
  • Die Produkte einer konventionellen festphasengestützten (Bio-) Polymersynthese werden durch Spaltung einer Sollbruchstelle, z.B. durch Hydrolyse eines Oxalats oder Succinats, von der festen Phase abgetrennt und sind damit den bekannten Analysemethoden, wie z.B. NMR, HPLC, CE, MS, Phosphorimager etc., zugänglich. Durch Kombination eines spaltbaren Spaceramidits (Sollbruchstelle = Ester, Sulfone etc.) und eines fluoreszierenden verzweigten Phosphoramidits lässt sich die oben beschriebene Strategie im Sinne eines Baukastenansatzes auch auf Arrays übertragen. Die Spaltprodukte sind 3'-fluoreszensmarkiert. Auf diese Weise kann man Rückschlüsse auf die Kopplungseffizienz ziehen [ US 6,238,862 B1, J. Burmeister, A. Azzawi, G. v. Kiedrowski, Tethedron Lett. 1995, 3667–68]. Das gleiche Ergebnis wird erzielt, wenn ein trifunktionelles Molekül eingesetzt wird, welches eine Funktionalität für die Polymersynthese, eine für eine Markierung und eine zum Verankern auf der festen Phase bereitstellt. Die dritte Funktionalität besitzt darüber hinaus auch noch eine labile Bindung [ US 5,290,925 ].
  • Eine weitere Möglichkeit zur Qualitätskontrolle besteht darin, zusätzliche spaltbare phosphatgruppenmarkierte Phosphoramidite an die 5'-Enden zu kondensieren. Das Signal der Reportergruppe wird dann zur Qualitätskontrolle der Synthese herangezogen. Nach Abspaltung der Reportergruppe erhält man 5'-phosphorylierte Sonden [Beier, WO 00/15837].
  • Das Verfahren zur Herstellung konfektionierter chemischer Oberflächen, welches in WO 01/36086 beschrieben ist, hat zur Aufgabe funktionelle Gruppen in situ, also während des Funktionalisierungsprozesses einzuführen, und dem späteren Anwendungsprozess angepasst eine Oberfläche spezifischer chemischer bzw. physikochemischer Eigenschaften bereitzustellen.
  • Andere Verfahren verwenden "Starburst"-Dendrimere um die Anzahl an Reaktionsorten zu erhöhen, wodurch es schließlich zu einer Erhöhung der Dichte an funktionellen Gruppen auf der Oberfläche und mittelbar zu einer Verbesserung des Detektionssignals (M. Beier, J. D. Hoheisel (1999) Nucleic Acids Res. 27: 970–1977) kommt oder bessere Signal-Rauschverhältnisse erzielt werden (Niemeyer et al. (2000), Chembiochem. 2: 685–694).
  • Durch Verwendung sogenannter inverser Synthone, hierbei handelt es sich um Nukleoside, die an ihren 5'-Hydroxyfunktionen eine Phosphoramidit- und an ihren 3'-Hydroxyfunktionen eine Schutzgruppe, z.B. DMT oder Nppoc, tragen, wird es möglich die chemische Oligonukleotidsynthese in der natürlichen 5'→3' Richtung durchzuführen. Durch die geänderte Orientierung auf der Array-Oberfläche wird ein weiteres Anwendungsgebiet für DNA/RNA Microarrays erschlossen. Es ermöglicht u.a. die enzymatische Kettenverlängerung durch Polymerasen [WO 00/61594; WO 01/55451; M. C.Pirrung, Org. Lett. 2001, 3,8,1105–1108].
  • Für eine in situ Array-Synthese ist eine ortsspezifische Deprotektion einzelner Schutzgruppen zwingend notwendig. Eine Möglichkeit zur ortsaufgelösten Synthese nutzt den Prozess der Photolithographie und soll am Beispiel der DNA-Synthese erläutert werden: Bei der lichtgesteuerten Synthese von Nukleinsäure-Chips finden fotolabile Nukleosid-Derivate Verwendung. Hierbei findet der Kettenaufbau der Nukleinsäure-Fragmente üblicherweise mittels Phosphoramidit-Synthonen statt. Die Bausteine tragen jeweils eine temporäre Fotoschutzgruppe, die durch Lichteinstrahlung entfernt werden kann. Das Syntheseprinzip sieht eine zyklische Abfolge von Kondensations- und Deprotektions-Schritten (durch Licht) vor. Die Effizienz, mit der eine solche lichtgesteuerte Synthese erfolgen kann, wird im Wesentlichen durch die verwendeten fotolabilen Schutzgruppen, insbesondere durch die Effizienz, mit der diese im Bestrahlungsschritt entfernt werden können, bestimmt.
  • Bei den bislang zur lichtgesteuerten Synthese verwendeten Fotoschutzgruppen handelt es sich üblicherweise um die Schutzgruppen NVOC (S. P. A. Fodor et al., Science 251 (1991), 767 ff.), MeNPOC (A. C. Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994), 5022 ff.), DMBOC (M. C. Pirrung, J. Chem. 60 (1995), 1116 ff.) und NPPOC (A. Hassan et al., Tetrahedron 53 (1997), 4247 ff.). Weitere bekannte fotolabile Schutzgruppen in der Nukleosid- bzw. Nukleotidchemie sind o-Nitrobenzyl-Gruppen und ihre Derivate (vgl. z.B. Pillai, Org. Photochem. 9 (1987), 225; Walker et al., J. Am. Chem.Soc. 110 (1988), 7170). Als weitere fotolabile Schutzgruppen wurden die 2-(o-Nitrophenyl)ethyl-Gruppe (Pfleiderer et al., In: "Biosphosphates and their Analogues – Synthesis, Structure, Metabolism and Activity", ELSEVIER Science Publishers B.V. Amsterdam (1987), 133 ff.) sowie Derivate davon (WO 97/4434, WO 96/18634, WO 02/20150) vorgeschlagen.
  • Die gegenwärtig für die lichtgesteuerte Synthese von Nukleinsäuren verwendeten fotolabilen Schutzgruppen (z.B. NVOC, MeNPOC, NPPOC) zeichnen sich im Allgemeinen durch einen vergleichsweise niedrigen Absorptionskoeffizienten bei der Wellenlänge der Lichteinstrahlung aus. Die Bestrahlung der fotolabilen Nukleosid-Derivate erfolgt üblicherweise mit Hg-Hochdrucklampen bei einer Wellenlänge von 365 nm. Der niedrige Absorptionskoeffizient der verwendeten fotolabilen Schutzgruppe bei dieser Wellenlänge hat zur Folge, dass nur ein sehr geringer Anteil des eingestrahlten Lichts zur Anregung der Moleküle verwertet werden kann. Des Weiteren handelt es sich bei den verwendeten fotolabilen Schutzgruppen zumeist um farblose Derivate. Dies wiederum hat zur Folge, dass es während der Synthese nicht möglich ist, mit einfachen spektroskopischen Methoden zu detektieren, ob die fotolabile Schutzgruppe sich noch am Nukleosid-Derivat befindet oder bereits teilweise oder vollständig durch den Lichteintrag abstrahiert worden ist. Es lässt sich somit der Vorgang der Abstraktion nur schwer oder gar nicht verfolgen.
  • Eine Weiterentwicklung des photolithographischen Prozesses stellt die Verwendung fluoreszierender fotolabiler Schutzgruppen dar. Bei den benzylischen photolabilen Schutzgruppen werden Moleküle des Typs ArCR1R2-OC(O)X verwendet, wobei Ar ein kondensierter Aromat, z.B. Pyren und R1R2 substituierte Aromaten sein können. Die Fluoreszenz der Pymoc-Gruppe wird zur Abschätzung der Funktionalisierungsdichte herangezogen [WO 98/39348]. Eine andere Vorgehensweise stellt die Markierung von Nitrobenzylderivaten dar [C. Muller et al, Helv. Chim Acta 2001, 84, 3735–3740]. Die Fluoreszenzsignale des Coumarins lassen sich zur Qualitätskontrolle heranziehen.
  • Eine Alternative zur Photolithographie stellt die DNA-Synthese dar, die auf Tandemschutzgruppen basiert. Man erhält diesen Schutzgruppentyp durch Kombination zweier für die Nukleotidchemie etablierter Schutzgruppen, z. B. einer photolabilen Nppoc-(2-[2-Nitrophenyl]-propyloxycarbonylchlorid) und einer säurelabilen Dimethoxytritylgruppe, und den sich daraus ableitenden Derivaten ( DE 101 32 025.6 , DE 102 60 591.2 und PCT EP 02/07389). Durch die Abspaltung des farbigen Tritylkations der zweistufigen Schutzgruppen, welches einen wesentlich höheren Absorptionskoeffizienten besitzt als die Abspaltungsprodukte bei anderen Fotoentschützungsprozessen auf Benzyl- bzw. Nitrobenzylbasis, eröffnet sich weiterhin die Möglichkeit zur direkten online Prozesskontrolle. Dies führt zu einer Verbesserung bei der Qualitätskontrolle für Biochips.
  • Das Bestreben, die Eigenschaften der Tritylschutzgruppe zu beeinflussen, hat eine lange Tradition [A. Taunton-Rigby et al., J. Org. Chem. 1972, 37, 956–964]. Einige Arbeitsgruppen haben den hydrophoben Charakter für die Reinigung anhand der RP-Chromatographie verstärkt [R. Ramage et al. Tetrahedron Lett. 34 (1993) 7133; H. Seliger et al., Angew. Chem. 1981, 93, 709], andere haben die exocyclischen Gruppen so variiert, dass sich die Abspaltungsbedingungen umkehrten (basenlabile Trityle) [M. Sekine et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 1985, 58, 336; M. Sekine et al., J. Am. Soc. 1986, 108, 4581] oder sich unter besonders schonenden Bedingungen, z.B. Hydrazinolyse von 4-(9-Fluorenenylmethoxyoxycarbonyl)oxy- bzw. amino-4',4''-dimethoxytriyl, abspalten ließen [E. Happ et al., Nucleosides and Nucleotides 1988, 7, 813–816.]. Die fluorenmarkierten Tritylverbindungen dienen streng als Schutzgruppe mit unüblichen Labilitätseigenschaften.
  • Weiterhin können die Nachweisgrenzen der tritylhaltigen Nukleotide und Oligonucleotide bei HPLC oder DC, durch Pyreneinbau in das Tritylgerüst, herabgesetzt werden. Diese Verbindung entspricht dem Typ: Pm-C*, wobei Pm eine Schutzgruppe P ist, die eine Markierung m, z.B. einen Fluoreszenzfarbstoff, tragen kann und C* eine zu schützende funktionelle Gruppe ist, die der 5'-Hydroxygruppe eines Nucleosids entspricht [J. L. Fourrey et al. Tetrahedron Lett., 1987, 28, 5157].
  • Das Patent US 5,410,068 beschreibt einen ähnlichen Ansatz, um biologische Verbindungen für die Erkennung, Trennung und Reinigung umkehrbar zu modifizieren. Es werden fluoreszenzmarkierte Tritylgruppen des Typs M-L-P-C* beschrieben. M ist eine Markierung, die zur Erkennung des Moleküls herangezogen wird, L ist ein Spacer, P eine Tritylschutzgruppe und C* die funktionelle Gruppe eines Biomoleküls.
  • Bei der arraygestüzten Polymersynthese von zum Teil komplexen Substanzbibliotheken, steht man in der Regel vor dem Problem, dass erst die Synthese durchgeführt wird und dann im Nachhinein erfährt man, ob die Synthese erfolgreich verlaufen ist. Erschwerend kommt hinzu, dass die Oberflächen der in situ erzeugen Arrays mitunter schwer zugänglich sein können. Dies kann die Qualitätskontrolle durch Standard-Oberflächenanalysemethoden erheblich beeinträchtigen. Aus wirtschaftlichen Gründen wäre es daher wünschenswert, ein Verfahren zu besitzen, das eine frühzeitige Qualitätsaussage, noch während der Prozessierung, ermöglicht.
    •
  • Eine der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, ein Verfahren zur Herstellung von festphasengebundenen Arrays zu entwickeln, welches eine verbesserte Qualitätskontrolle gegenüber den Verfahren des Standes der Technik erlaubt.
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines beschichteten Trägers, umfassend die Schritte:
    • (a) Bereitstellen eines Trägers, der an seiner Oberfläche reaktive Gruppen aufweist,
    • (b) Aufbauen einer funktionalisierten Oberfläche auf dem Träger durch schrittweise Synthese eines Rezeptors, umfassend ein Linker- und ein Sondenelement aus Synthonbausteinen,
    dadurch gekennzeichnet, dass der Syntheseprozess (i) durch Einführung von einem oder mehreren Synthonbausteinen mit mindestens einer nachweisbaren Markierungsgruppe in das Linkerelement und (ii) durch Einführung von einem oder mehreren Synthonbausteinen mit mindestens einer nachweisbaren Markierungsgruppe in das Sondenelement des Rezeptors überwacht wird.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, bei dem die Qualität der Arrayoberfläche überprüft, vorzugsweise aber nicht beeinflusst wird, und ein oder mehrere oder alle folgenden Schritte einer Biopolymersynthese online verfolgt werden können, d.h. zur Effizienzerhöhung können ein oder mehrere Schritte, z.B. der erste, der n-te, der 2n-te, vorletzte oder/und letzte etc. Schritt, bei der Linker- und Sondensynthese überprüft werden.
  • Der erfindungsgemäße Syntheseprozess umfasst die Einführung von einem oder mehreren Synthonbausteinen mit mindestens einer nachweisbaren Markierungsgruppe in das Linkerelement und die Einführung von einem oder mehrere Synthonbausteinen mit mindestens einer nachweisbaren Markierungsgruppe in das Sondenelement des Rezeptors. Dabei kann beispielsweise beim Aufbau des Linker- oder/und des Sondenelements jeweils ein einziger markierter Synthonbaustein oder mehrere markierte Syntonbausteine, z.B. zwei, drei, vier etc. markierte Syntonbausteine, verwendet werden. Gegebenenfalls können sämtliche Synthonbausteine für die Synthese des Linkerelements oder/und des Sondenelements mindestens eine nachweisbare Markierungsgruppe enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden der erste und der dritte Schritt beim Aufbau des Linkerelements oder/und des Sondenelements mit einem markierten Synthonbaustein durchgeführt. Schritte ohne Verwendung markierter Synthonbausteine können auf konventionelle Weise durchgeführt werden.
  • Neben der Funktionalisierungsdichte, die mit der späteren Sondendichte direkt korreliert, ist eine gleichförmige Verteilung der funktionellen Gruppen von entscheidender Bedeutung. Für die Beurteilung der Homogenität lässt sich eine Vielzahl von Markierungen in die Synthesen der Biopolymere, z.B. Nukleinsäuren, wie DNA oder RNA, Nukleinsäureanaloga, wie PNA oder LNA, Oligonukleotide (unabhängig von der Syntheserichtung), Saccharide, Kohlenhydrate, Peptide, Proteine sowie weitere Mischformen, aber auch Derivaten aus der kombinatorischen Chemie, integrieren. Die Synthese der Biopolymere kann in beliebiger Richtung erfolgen, z.B. in 5'→3'- oder/und in 3'→5'-Richtung für Nukleinsäuren. Zur Analyse können dementsprechend optische Methoden, wie Absorption, Emission/Lichtbeugung, Lichtstreuung oder Ellipsometrie, aber auch andere Methoden, wie Radioaktivität, Plasmonenresonanz oder elektronische Methoden, wie Elektronenbeugung oder elektrische Signale etc., herangezogen werden. Die Analysenmethoden, die sich in ein System zur Synthese von Arrays bzw. Biochip-Trägern gemäß WO 00/13018 integrieren lassen, sind dabei besonders bevorzugt.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können Synthonbausteine verwendet werden, die mehrere nebeneinander nachweisbare Markierungsgruppen enthalten. So können zur Einführung in das Linkerelement Markierungsgruppen verwendet werden, die neben den Markierungsgruppen zur Einführung in das Sondenelement nachweisbar sind.
  • Die Synthese des Linkerelements und die Synthese des Sondenelements gemäß vorliegender Erfindung umfasst vorzugsweise jeweils mehrere Schritte, wobei die jeweiligen Elemente aus mehreren Synthonbausteinen aufgebaut werden. Das Linkerelement wird aus einem oder mehreren nichtfunktionellen Synthonbausteinen aufgebaut, die verschieden von den funktionellen Synthonbausteinen für das Sondenelement sind. Bevorzugte Beispiele für Linkersynthone sind Alkylreste, Oligoethylenglycolreste oder Kombinationen aus Alkyl- und Arylresten.
  • Die auf dem Träger synthetisierten Linkermoleküle enthalten funktionelle Gruppen, die die Kopplung weiterer Linker-Synthon-Bausteine oder – nach Beendigung der Linkersynthese – von Sonden oder Sonden-Bausteinen ermöglicht. Die funktionellen Gruppen der Linkermoleküle können beispielsweise ausgewählt werden aus -OR, -NR2, -SR, -PO3R2, -CN, -SCN, -COR' und -OCOR', worin R H oder eine Schutzgruppe bedeutet und R' H oder eine Schutzgruppe oder -OR, -NR2 oder -SR bedeutet. Weiterhin können R und R' für Alkyl, Aryl, Alkenyl und/oder Allylreste und/oder weitere nützliche organische Reste stehen.
  • Nach beendeter Linkersynthese erfolgt die Kopplung von Sonden, die ebenfalls durch schrittweise Synthese aus Synthese-Bausteinen je nach verwendeter Synthesestrategie, z.B. Peptid-, Oligonukleotid- oder Kohlenhydratsynthese an der Festphase oder durch ortsspezifische und/oder nichtortsspezifische Immobilisierung von kompletten Sonden erfolgen kann. Besonders bevorzugte Bausteine für die Oligonukleotidsynthese sind Phosphoramidite.
  • Der Träger kann grundsätzlich beliebig ausgewählt werden, z.B. aus Partikeln, insbesondere magnetischen Partikeln, Mikrotiterplatten und mikrofluidischen Trägern (wie z.B. fluidischen Mikroprozessoren) und kann eine Oberfläche ausgewählt aus Glas, Metallen, Halbmetallen, Metalloxiden oder Kunststoff aufweisen. Besonders bevorzugt sind die in PCT/EP 99/06315 offenbarten Mikropartikel und die in PCT/EP 99/06316 und PCT/EP 99/06317 offenbarten Träger mit planaren bzw. mit Mikrokanälen (Querschnitt z.B. 10–1000 μm) versehenen Oberflächen. Auf die Offenbarung der genannten Dokumente wird ausdrücklich Bezug genommen.
  • Die Synthese der Rezeptormoleküle kann auf der gesamten Oberfläche des Trägers oder aber ortsspezifisch an ausgewählten Reaktionsorten stattfinden.
  • Bei mindestens einem der Synthonbausteine zur Einführung in das Linkerelement und mindestens einen der Synthonbausteine zur Einführung in das Sondenelement verwendet man nachweisbare Markierungsgruppen. Gegebenenfalls können sämtliche Synthonbausteine für die Synthese des Linkerelements bzw. des Sondenelements mindestens eine nachweisbare Markierungsgruppe enthalten.
  • Die Abspaltung nachweisbarer Markierungsgruppen kann während oder/und nach der Synthese des Linkerelements bzw. des Sondenelements erfolgen. Unterschiedliche Markierungsgruppen können zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Verfahrens abgespalten werden.
  • Folgende Verbindungstypen kommen vorzugsweise im erfindungsrelevanten Verfahren zum Einsatz. Bei der Oberflächenkontrolle für den Einbau in das Linkerelement können insbesondere Verbindungen der folgenden Gruppe I (Typen I–VII) herangezogen werden:
    Typ I: Pm-C*
    Typ II: M-L-Pm-C*
    Typ III: Pm-L-V (L'-H-L''-M)-L'''-C*
    Typ IV: Pm'Pm-L-V(L'-H-L''-M)-L'''-C*
    Typ V: M-L-Pm'Pm-L-V(L'-H-L''-M)-L'''-C*
    Typ VI: Pm'Pm-C*
    Typ VII: M-L-Pm'Pm-C*
  • Pm bedeutet eine Schutzgruppe P, die eine Markierung m zur Detektion tragen kann, wobei die Markierungen M oder/und m gegebenenfalls über einen Linker mit P gebunden sind, und die Schutzgruppe und Markierungen kompatibel zur Synthesechemie sind.
  • Pm' ist eine zu Pm orthogonale Schutzgruppe, die eine Markierung m' zur Detektion tragen kann. Die Schutzgruppe Pm' kann unter Bedingungen selektiv abgespalten werden, bei denen die Schutzgruppe Pm stabil ist. Beispielsweise kann Pm' eine photochemisch durch Belichtung abspaltbare Schutzgruppe und Pm eine durch chemische Methoden, z.B. Säure- oder Basebehandlung, abspaltbare Schutzgruppe sein.
  • M, m und m' sind Markierungen, die zur Detektion herangezogen werden können. Dabei sind M, m und gegebenenfalls m' unabhängig detektierbar.
  • Sie können gegebenenfalls auch unabhängig abspaltbar sein, z.B. bei den Verbindungen der Typen III, IV oder VI. Die Markierungen sind zweckmäßigerweise auch kompatibel zur Synthesechemie.
  • L bis L''' bedeuten beliebige Spacer, z.B. organische Gruppen, wie etwa Alkylengruppen, die gegebenenfalls Heteroatome, wie O, N, P und S, enthalten können.
  • H bedeutet eine spaltbare Gruppe, z.B. eine Ester-, Disulfid-, Sulfon- oder Diolgruppe.
  • V bedeutet ein trifunktionelles Molekül/Atom, wie etwa ein Nukleosid, Trihydroxyalkyl oder Dihydroxyaminoalkyl.
  • C* bedeutet eine funktionelle Gruppe oder eine funktionalisierte Trägeroberfläche, insbesondere einen Linkerbaustein.
  • Die Verbindungen der Typen II bis VII enthalten üblicherweise mehrere Markierungsgruppen, M, m oder/und m'. Es werden jedoch auch solche Verbindungen erfasst, die nur eine Markierungsgruppe tragen, d.h. in den Verbindungen muss beispielsweise die Schutzgruppe Pm keine Markierungsgrupe enthalten, sofern die Verbindung mindestens eine andere Markierungsgruppe, z.B. M, enthält.
  • Von den Verbindungen der Gruppe I sind Verbindungen der Typen I oder/und II besonders bevorzugt.
  • Bei der Sondenkontrolle für den Einbau in das Sondenelement können insbesondere Verbindungen der folgenden Gruppe II (Typen I, II und VI–X) herangezogen werden:
    Typ I: Pm-C*
    Typ II: M-L-Pm-C*
    Typ VI: Pm'Pm-C*
    Typ VII: M-L-Pm'Pm-C*
    Typ VIII: Pm-L-H-L'-C*
    Typ IX: Pm'Pm-L-H-L'C*
    Typ X: M-L-Pm'Pm-L-H-L''-C*
  • Pm bedeutet eine Schutzgruppe (P), die eine Markierung (m) zur Detektion tragen kann, wobei die Markierung M (m) gegebenenfalls über einen Linker mit (P) gebunden ist, und die Schutzgruppe und Markierung kompatibel zur Synthesechemie sind.
  • Pm' ist eine zu Pm orthogonale Schutzgruppe, die eine Markierung (m') zur Detektion trägt. Die Schutzgruppe Pm' kann unter Bedingungen selektiv abgespalten werden, bei denen die Schutzgruppe Pm stabil ist. Beispielsweise kann Pm eine photochemisch durch Belichtung abspaltbare Schutzgruppe und Pm' eine durch chemische Methoden, z.B. Säure- oder Basebehandlung, abspaltbare Schutzgruppe sein.
  • M, m und m' sind Markierungen, die zur Detektion herangezogen werden können. Dabei sind M, m und gegebenenfalls m' unabhängig detektierbar. Sie können auch unabhängig abspaltbar sein. Die Markierungen sind zweckmäßigerweise auch kompatibel zur Synthesechemie.
  • L bis L'' bedeuten beliebige Spacer, z.B. organische Gruppen, wie etwa Alkylengruppen, die gegebenenfalls Heteroatome, wie O, N, P und S, enthalten können.
  • H bedeutet eine spaltbare Gruppe, z.B. eine Ester-, Disulfid-, Sulfon- oder Diolgruppe.
  • C* bedeutet einen Sondenbaustein, z.B. ein Nukleotid, ein Nukleotidanalog, eine Aminosäure, ein Aminosäureanalog etc.
  • Die Verbindungen der Typen II und VI bis X enthalten eine oder mehrere Markierungsgruppen, d.h. die Schutzgruppe Pm oder/und Pm' muss keine Markierungsgruppe enthalten, sofern die Verbindung mindestens eine andere Markierungsgruppe enthält.
  • Von den Verbindungen der Gruppe II sind die Typen I oder/und II besonders bevorzugt.
  • Um das erfindungsgemäße Verfahren zu erläutern, sollen die einzelnen Typen an allgemeinen Beispielen aus der Phosphoramiditchemie und später an konkreten Ausführungsformen veranschaulicht werden. Die beschriebenen Verbindungen sind so markiert, dass anhand der Emission ihrer ein bis drei Fluoreszenzmarkierungen, und zum Teil anhand ihrer Absorption, eine Qualitätsbeurteilung möglich ist. Selbstverständlich lassen sich die Ausführungen auch auf andere Synthesestrategien oder/und Markierungsgruppen übertragen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform ist wie folgt: Zunächst wird ein markiertes Synthon an die Funktionalität der Trägeroberfläche kondensiert. Nach der Fluoreszenzbestimmung werden die Markierungen entweder beim nächsten Deprotektionsschritt, im Sinne einer schrittweisen Biopolymersynthese, abgespalten, oder am Ende der Synthese entfernt, so dass sie das Detektionssignal der Hybridisierung nicht verfälschen können.
  • Im Falle von tritylhaltigen Schutzgruppen bzw. von markierten Photoschutzgruppen kommt eine Zweitanalytik, die spektroskopische Analyse der farbigen Tritylkationen bzw. der nun farbigen (im Vergleich zu den Abspaltungsprodukten der konventionelle Photoschutzgruppen) bzw. eventuell fluoreszierenden Abspaltungsprodukte des Photoentschützungsprozesses, zum Tragen. Die gewonnenen Daten werden mit einem Bewertungskriterium verglichen und nach einer positiven Beurteilung weiter prozessiert.
  • Bei den Verbindungstypen, z.B. Phosphoramiditen III–V, handelt es sich um Verbindungen die mehrere Qualitätssicherungsmethoden gleichzeitig zugänglich machen können: Homogenitätsprüfung erfolgt durch Markierung M bzw. m, die unabhängig voneinander nachweisbar sein können, z.B. zwei Fluoreszenzfarbstoffe oder Fluoreszenz in Kombination mit radioaktiver Markierung, wobei m und M, die Teil der Pm'Pm-, Pm- und M-L-Pm'Pm-Gruppen sind, vor dem nächsten Kopplungsschritt abgespalten werden. Die Markierungsgruppen können gegebenenfalls, z.B. bei Verbindungen der Typen III und/oder IV, auch zu einem späteren Zeitpunkt, z.B. bei der finalen Deblockierung, entfernt werden. Zweckmäßigerweise werden alle Markierungsgruppen bis zur finalen Deblockierung entfernt, so dass ihr Signal nicht mit dem Messsignal auf dem Träger in Wechselwirkung treten kann.
  • Baut man die Ausgangsgruppen der Pm'Pm, Pm und M-L-Pm'Pm Abspaltungsprodukte, die eine spektroskopische online Prozesskontrolle ermöglichen, in Nukleosidphosphoramidite ein, so erhält man die Verbindungen, die für eine Sondenqualitätskontrolle herangezogen werden können.
  • Folgende bevorzugte Beispiele für die einzelnen Typen von Verbindungen kommen in Frage:
    Figure 00150001
    Figure 00160001
  • Die Methoden der konventionellen Qualitätskontrolle für Polymersynthesen (CE, HPLC, MS etc.) lassen sich im Wesentlichen unter Berücksichtigung des dreidimensionalen Aufbaus von Arrays und insbesondere durch Verwendung von Molekülen des Typs VIII–X auf die Produkte aus der Arraysynthese übertragen, vorausgesetzt, dass der Funktionalisierungsprozess der Oberfläche eine hinreicheichend hohe Funktionalisierungsdichte liefert.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Struktur (XI):
    Figure 00160002
    worin M eine polycyclische Aryl- oder Heteroarylgruppe ist, A1 und A2 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus H, O, OR, NHR oder NR2, worin R eine C1-C20-Kohlenwasserstoffgruppe ist, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome tragen kann, z.B. eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylgruppe und C* eine funktionelle Gruppe, z.B. ein Linker- oder Sondensynthonbaustein, ist. Die Gruppe M ist vorzugsweise eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit mindestens 3 oder 4 kondensierten Ringen, z.B. eine Pyrengruppe. Weiterhin ist M vorzugsweise eine fluoreszierende Markierungsgruppe, z. B. ein Coumarin, ein Pyren, Cy5, Cy3, ein Rhodamin oder ein fluoreszierendes Nanopartikel. Gegebenenfalls kann M über einen Spacer mit dem Grundgerüst verbunden sein.
  • Vorzugsweise ist mindestens einer der Reste A1 und A2 NHR oder NR2. Besonders bevorzugt ist mindestens einer von A1 und A2 eine Dialkylaminogruppe, wobei die Alkylreste 1 bis 20 C-Atome aufweisen. Verbindungen (XI), bei denen A1 oder/und A2 eine NHR oder NR2-Gruppe ist, zeigen überraschenderweise eine höhere Hydrolyselabilität und somit eine bessere Abspaltbarkeit sowie eine höhere Farbintensität.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Struktur (XII):
    Figure 00170001
    worin M' eine Markierungsgruppe ist, Y eine Bindung oder ein Spacer mit einer Kettenlänge von bis zu 20 C-Atomen und gegebenenfalls einen oder mehreren Heteroatomen ist, A1 und A2 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus H, O, OR, NHR oder NR2, worin R eine C1-C20-Kohlenwasserstoffgruppe ist, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome tragen kann, z.B. eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylgruppe und C* eine funktionelle Gruppe, z.B. ein Linker- oder Sondensynthonbaustein, ist. Vorzugsweise ist M' eine fluoreszierende Markierungsgruppe, z.B. eine Coumaringruppe ... .
  • Mindestens einer der Reste A1 und A2 ist NHR oder NR2, besonders bevorzugt sind A1 oder/und A2 eine Dialkylaminogruppe, wobei ein Alkylrest bis zu 20 C-Atome enthalten kann.
  • Bei den Verbindungen (XII) stellt Y vorzugsweise eine nicht-photolabilie Struktur dar, d.h. die Gruppe M' kann nicht durch Belichtung vom Grundgerüst der Verbindung abgespalten werden.
  • Die Verbindungen (XI) und (XII) stellen bevorzugte Beispiele für Syntonbausteine zur Verwendung in einem Verfahren, wie zuvor beschrieben, dar.
    •
  • Ein Ausführungsbeispiel für eine photolabile Schutzgruppe, die z.B. als Gruppe Pm in Verbindungen des Typs I eingesetzt werden kann, ist in 1 gezeigt. Es handelt sich um eine intramolekular triplettsensibilisierte o-Nitrophenylethyl-Photoschutzgruppe, die einen Pyrenrest trägt. Weitere geeignete Gruppen diese Typs sind z.B. in DE 102 60 592.0 beschrieben.
  • 2 zeigt Verbindungen des Typs M-L-Pm-C*, die z.B. für Verbindungen des Typs II eingesetzt werden können. Pm ist eine gegebenenfalls substituierte Tritylgruppe, an die eine Markierung M gegebenenfalls über einen Linker gekoppelt ist.
  • Die 3 bis 12 zeigen Beispiele für Verbindungen des Typs III (Pm-L-V (L'-H-L''-M)-L'''-C*) und deren Synthese. Hierbei handelt es sich um trifunktionelle Moleküle, welche eine Funktionalität für die Polymersynthese, eine für eine Markierung M und eine zum Verankern auf der festen Phase bereit stellen. Die zweite Funktionalität zwischen Markierung und trifunktionellem Moleküle besitzt eine labile Bindung. Für Pm kommen folgende Schutzgruppen bzw. Schutzgruppentypen in Frage: DMT-, Nppoc-, eine zweistufige, eine fluoreszierende zweistufige bzw. eine fluoreszenzmarkierte zweistufige Schutzgruppe.
  • 13 zeigt eine Verbindung des Typs VI (Pm'Pm-C*), bei der es sich um eine fluoreszierende zweistufige Schutzgruppe handelt.
  • In 14 ist eine Verbindung des Typs VII (M-L-Pm'Pm-C*) gezeigt, bei des sich ebenfalls um eine fluoreszenzmarkierte zweistufige Schutzgruppe handelt. Pm ist die Tritylgruppe, die über einen Linker mit einer Coumaringruppe (M) gekoppelt ist. Weiterhin sind photoaktivierbare NppoC-Gruppen (Pm') an der Tritylgruppe vorhanden.
  • 15 zeigt eine Verbindung des Typs IX (Pm'Pm-L-H-L'-C*). Es handelt sich um eine fluoreszierende zweistufige Schutzgruppe und einen Spacer, der durch eine Sollbruchstelle H(OCO-CH2-CH2-CO-O) unterbrochen ist.

Claims (31)

  1. Verfahren zur Herstellung eines beschichteten Trägers, umfassend die Schritte: – Bereitstellen eines Trägers, der an seiner Oberfläche reaktive Gruppen aufweist, – Aufbauen einer funktionalisierten Oberfläche auf dem Träger durch schrittweise Synthese eines Rezeptors, umfassend ein Linker- und ein Sondenelement aus Synthonbausteinen, dadurch gekennzeichnet, dass der Syntheseprozess (i) durch Einführung von einem oder mehreren Synthonbausteinen mit mindestens einer nachweisbaren Markierungsgruppe in das Linkerelement und (ii) durch Einführung von einem oder mehreren Synthonbausteinen mit mindestens einer nachweisbaren Markierungsgruppe in das Sondenelement des Rezeptors überwacht wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Synthonbausteine verwendet, die eine Markierungsgruppe enthalten.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Synthonbausteine verwendet, die mehrere nebeneinander nachweisbare Markierungsgruppen enthalten.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Markierungsgruppen zur Einführung in das Linkerelement neben Markierungsgruppen zur Einführung in das Sondenelement nachweisbar sind.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass einer, zwei, drei oder sämtliche Synthonbausteine für die Synthese des Linkerelements mindestens eine nachweisbare Markierungsgruppe enthalten.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass einer, zwei, drei oder sämtliche Synthonbausteine für die Synthese des Sondenelements mindestens eine nachweisbare Markierungsgruppe enthalten.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Syntheseprozess online überwacht wird.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenelemente des Rezeptors ausgewählt werden aus Nukleinsäuren (in beliebigen Syntheserichtungen, wie DNA oder RNA, Nukleinsäureanaloga, wie PNA oder LNA, Kohlenhydraten, Peptiden, Derivaten der kombinatorischen Chemie und Kombinationen davon.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Überwachung eine optische Messung umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Messung eine Bestimmung von Absorption, Emission, Lichtbeugung, Lichtstreuung oder Ellipsometrie umfasst.
  11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Überwachung eine Messung von Radioaktivität umfasst.
  12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Überwachung eine Messung von Plasmonenresonanz umfasst.
  13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Überwachung eine elektronische Messung umfasst.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die elektronische Messung eine Bestimmung von Elektronenbeugung oder elektrischen Signalen umfasst.
  15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man den Aufbau des Trägers in einer integrierten Synthese/Analyse-Vorrichtung durchführt.
  16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens einen trifunktionellen Synthonbaustein zum Aufbau des Linkers oder/und der Sonde verwendet.
  17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens einen Synthonbaustein für den Einbau in das Linkerelement ausgewählt aus einer der Verbindungen (Typen I bis VII) verwendet: Typ I: Pm-C* Typ II: M-L-Pm-C* Typ III: Pm-L-V (L'-H-L''-M)-L'''-C* Typ IV: Pm'Pm-L-V(L'-H-L''-M)-L'''-C* Typ V: M-L-Pm'Pm-L-V(L'-H-L''-M)-L'''-C* Typ VI: Pm'Pm-C* Typ VII: M-L-Pm'Pm-C* worin Pm eine Schutzgruppe P bedeutet, die eine Markierung m zur Detektion tragen kann, wobei die Schutzgruppe und Markierung kompatibel zur Synthesechemie sind, Pm' eine zu Pm orthogonale Schutzgruppe P bedeutet, die eine Markierung m' zur Detektion tragen kann, wobei M eine Markierung bedeutet, die zur Detektion herangezogen werden kann, wobei m, M und gegebenenfalls m' unabhängig detektierbar sind, und wobei die Markierungen kompatibel zur Synthesechemie sind, L-L''' beliebige Spacer bedeuten, z.B. organische Gruppen, H eine spaltbare Gruppe bedeutet, V ein trifunktionelles Molekül/Atom bedeutet und C* eine funktionelle Gruppe oder eine funktionalisierte Trägeroberfläche bedeutet.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine der Verbindungen der Typen (I) oder/und (II) verwendet.
  19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass C* einen Linkerbaustein bedeutet.
  20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens einen Synthonbaustein für den Einbau in das Sondenelement ausgewählt aus einer der Verbindungen der Typen (I, II oder VI bis X) verwendet: Typ I: Pm-C* Typ II: M-L-Pm-C* Typ VI: Pm'Pm-C Typ VII: M-L-Pm'Pm-C* Typ VIII: Pm-L-H-L'-C* Typ IX: Pm'Pm-L-H-L'C* Typ X: M-L-Pm'Pm-L-H-L''-C* worin Pm eine Schutzgruppe P bedeutet, die eine Markierung m zur Detektion tragen kann, wobei die Schutzgruppe und Markierung kompatibel zur Synthesechemie sind, Pm' eine zu Pm orthogonale Schutzgruppe P ist, die eine Markierung m' zur Detektion tragen kann, wobei die Schutzgruppe und die Markierung kompatibel zur Synthesechemie sind, M eine Markierung bedeutet, die zur Detektion herangezogen werden kann, wobei m, M und gegebenenfalls m' unabhängig detektierbar sind, und wobei die Markierungen kompatibel zur Synthesechemie sind, L-L'' beliebige Spacer bedeuten, H eine spaltbare Gruppe bedeutet und C* einen Sondenbaustein bedeutet.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine der Verbindungen der Typen (I) oder/und (II) verwendet.
  22. Verbindungen der allgemeinen Struktur (XI):
    Figure 00250001
    worin M eine polycyclische Aryl- oder Heteroarylgruppe ist, A1 und A2 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus H, O, OR, NHR oder NR2, worin R eine C1-C20-Kohlenwasserstoffgruppe ist, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome tragen kann, z.B. eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylgruppe und C* eine funktionelle Gruppe ist.
  23. Verbindungen nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass M eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit mindestens 3 oder 4 kondensierten Ringen ist.
  24. Verbindungen nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass M eine Pyrengruppe, ... ist.
  25. Verbindungen nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer von A1 und A2 NHR oder NR2 ist.
  26. Verbindungen der allgemeinen Struktur (XII):
    Figure 00260001
    worin M' eine Markierungsgruppe ist, Y eine Bindung oder ein Spacer mit einer Kettenlänge von bis zu 20 C-Atomen und gegebenenfalls ein oder mehreren Heteroatomen ist, A1 und A2 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus H, O, OR, NHR oder NR2, worin R eine C1-C20-Kohlenwasserstoffgruppe ist, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome tragen kann, z.B. eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylgruppe und C* eine funktionelle Gruppe ist.
  27. Verbindungen nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass M' eine fluoreszierende Markierungsgruppe ist.
  28. Verbindungen nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass M' Coumarin, Fluorescein, Pyren, Cy5, Cy3, Rhodamin oder ein Nanopartikel ist.
  29. Verbindungen nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer von A1 und A2 NHR oder NR2 ist.
  30. Verbindungen nach einem der Ansprüche 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass Y eine nicht-photolabile Struktur umfasst.
  31. Verwendung von Verbindungen nach einem der Ansprüche 22 bis 30 als Synthonbausteine in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21.
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