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WO2003040679A2 - Reversible bindung eines fluorophors an eine oberfläche zur detektion von ligat-ligand-assoziationsereingnissen durch fluoreszenz-quenchen - Google Patents

Reversible bindung eines fluorophors an eine oberfläche zur detektion von ligat-ligand-assoziationsereingnissen durch fluoreszenz-quenchen Download PDF

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WO2003040679A2
WO2003040679A2 PCT/DE2002/004147 DE0204147W WO03040679A2 WO 2003040679 A2 WO2003040679 A2 WO 2003040679A2 DE 0204147 W DE0204147 W DE 0204147W WO 03040679 A2 WO03040679 A2 WO 03040679A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
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modified
fluorophore
ligates
ligate
ligand
Prior art date
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PCT/DE2002/004147
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English (en)
French (fr)
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WO2003040679A3 (de
Inventor
Gerhard Hartwich
Thomas KRATZMÜLLER
Herbert Wieder
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Original Assignee
Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Publication of WO2003040679A3 publication Critical patent/WO2003040679A3/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of ligate-ligand association events by fluorescence quenching.
  • Immunoassays and increasingly sequence analysis of DNA and RNA are used in disease diagnosis, in toxicological test procedures, in genetic research and development, as well as in the agricultural and pharmaceutical sectors.
  • serial methods with autoradiographic or optical detection parallel detection methods using array technology, so-called DNA or protein chips, are increasingly being used. With these parallel methods, too, the detection is based on optical, radiographic, mass spectrometric or electrochemical methods.
  • probe oligonucleotides For gene analysis on a chip, a library of known DNA sequences ("probe oligonucleotides”) is fixed in an ordered grid on one surface, so that the probe oligonucleotides.
  • Target oligonucleotides present in the test solution, the sequences of which are complementary to certain probe oligonucleotides on the chip, can be identified by
  • Radio label e.g. 32 P
  • a fluorescent dye e.g. fluorescein, Cy3 TM or
  • Fluorescence scanners are increasingly using radio labels.
  • the fluorescence scanners currently available on the market enable the detection of
  • Fluorophore in the subattomole range Fluorophore in the subattomole range.
  • labeled targets to detect hybridization events has some drawbacks.
  • the marking must take place before the actual measurement, which means an additional synthesis step and thus additional work. It is also difficult to ensure homogeneous marking of the sample material.
  • stringent washing conditions are necessary in order to remove non-specific or non-specifically bound material following hybridization.
  • targets antibodies or antigen or DNA fragment
  • the targets do not have to be modified with a detection label and after the hybridization no complicated washing steps are necessary are.
  • the probe molecules are labeled with appropriate fluorescent dyes.
  • the so-called molecular beacons work according to this principle. These single-stranded oligonucleotides have a hairpin structure (stem-and-loop) and carry a fluorophore (e.g. Fluorescein, TexasRed®) at one end of the sequence and a suitable fluorescence quencher (e.g. DABCYL) at the other end of the sequence. Due to the special geometric arrangement, the fluorescent group and the unit that leads to the quenching of the fluorescence are located in close proximity to one another. Therefore the probes show only an extremely low fluorescence.
  • a fluorophore e.g. Fluorescein, TexasRed®
  • DABCYL fluorescence quencher
  • gold nanoparticles are also used as efficient quenchers (cf. Nature Biotech. Vol. 19, 2001, page 365).
  • the quenching of fluorescence by metals is based primarily on a radiationless energy transfer from the dye molecule to the metal.
  • a greater sensitivity is observed when using gold nanoparticles than with organic quenchers.
  • dyes are efficiently quenched into the near infrared range.
  • a disadvantage of this method is that gold nanoparticles at temperatures are no longer stable above 50 ° C. Another disadvantage is that this method is limited to the investigation of solutions and therefore only a few sequences can be examined at the same time, so the degree of parallelization of this approach is low.
  • the object of the present invention is therefore to create a method for the detection of ligate-ligand association events by fluorescence quenching which does not have the disadvantages of the prior art.
  • PNA Peptide nucleic acid synthetic DNA or RNA in which the Sugar-phosphate unit is replaced by an amino acid.
  • synthetic DNA or RNA in which the Sugar-phosphate unit is replaced by an amino acid.
  • Nucleic acid contains two or more covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g. adenine or guanine).
  • the term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, e.g. on the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analogous structures (e.g. phosphoramide, thio-phosphate or dithio-phosphate backbone).
  • An essential feature of a nucleic acid in the sense of the present invention is the ability for sequence-specific binding of naturally occurring cDNA or RNA.
  • Nucleic acid oligomer Nucleic acid of unspecified base length (e.g. nucleic acid octamer: A nucleic acid with any backbone in which 8 pyrimidine or purine bases are covalently bound to one another). ns oligomer Nucleic acid oligomer
  • Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer.
  • Oligonucleotide equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer for example a DNA, PNA or RNA fragment of a base length not specified in more detail.
  • Mismatch To form the Watson-Crick structure of double-stranded oligonucleotides, the two single strands hybridize in such a way that the base A (or C) of one strand forms hydrogen bonds with the base T (or G) of the other strand (for RNA, T is by uracil ) replaced. Any other base pairing does not form hydrogen bonds, distorts the structure and is referred to as a "mismatch". ss Single Strand ds double Strand
  • Antibody complex binding partner of an antigen is Antibody complex binding partner of an antigen.
  • Antigen complex binding partner of an antibody is Antigen complex binding partner of an antibody.
  • Receptor complex binding partner of a hormone Association constant for the association of ligate and ligand.
  • Fluorophore chemical compound that is able to emit a longer-wave (red-shifted) fluorescent light when excited with light.
  • Fluorophores fluorescent dyes
  • UV ultraviolet
  • VIS visible
  • IR infrared
  • the absorption and emission maxima are usually shifted by 15 to 40 nm (Stokes shift).
  • Fluorescein resorcin phthalein fluorescent dye
  • Rhodamine 6G Basic Red 1 fluorescent dye
  • Texas Red® fluorescent dye from Molecular Probes, Inc.
  • Quench surface conductive (metal) surface that can quench fluorescence through an energy transfer (especially gold, silver, copper surfaces etc.)
  • EDTA ethylenediamine tetraacetate (sodium salt) ligand Term for molecules that are specifically bound by ligates;
  • ligands in the context of the present invention are substrates, cofactors or coenzymes of a protein (enzyme), antibodies (as ligand of an antigen), antigens (as ligand of an antibody), receptors (as ligand of a hormone), hormones (as ligand of a receptor) ) or nucleic acid oligomers (as ligand of the complementary nucleic acid oligomer).
  • Ligate Term for (macro) molecule with specific recognition and binding sites for the formation of a complex with a ligand (template).
  • linkers are commercially available as alkyl, alkenyl, alkynyl, hetero-alkyl, hetero-alkenyl or hetero-alkynyl chains, the chain being derivatized at two points with (identical or different) reactive groups. These groups form a covalent one in simple / known chemical reactions with the corresponding reaction partner chemical bond.
  • the reactive groups can also be photoactivatable, ie the reactive groups are only activated by light of certain or any wavelength.
  • Preferred linkers are those of chain length 1-60, in particular chain length 5-40, the chain length here being the shortest continuous connection between the structures to be connected, i.e. between the two molecules or between a surface atom, a surface molecule or a surface molecule group and another Molecule.
  • Spacer linker which is covalently bonded via the reactive groups to one or both of the structures to be connected (see linker).
  • Preferred spacers are those of chain length 1-60, in particular chain length 5-40, the chain length being the shortest continuous connection between the structures to be connected.
  • the terminal phosphate group of the oligonucleotide is esterified at the 3 'end with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 to PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH, the SS bond being cleaved homolytically and each causes an Au-SR bond.
  • the probe oligonucleotide carries a covalently linked fluorophore (FP) such as Cy3 TM, Cy5 TM, Texas Red®, Rhodamine 6G, fluorescein etc.
  • FP covalently linked fluorophore
  • Au-S- (CH 2 ) 2 -ds-oligo-Au-S- (CH 2 ) 2 -ss-oligo-FP hybridizes with the oligonucleotide complementary to ss-oligo FP.
  • the present invention relates to a method for the detection of ligate-ligand association events by fluorescence quenching, which comprises providing a modified surface as a first step.
  • the modification of the surface consists in the attachment of at least one type of modified ligate, the ligates being modified by attachment of at least one type of fluorophore, the Fluorophore forms a reversible bond with the modified surface.
  • the further steps of the method according to the invention are providing a sample with ligands, bringing the sample into contact with the modified surface, detection of the fluorescence of the fluorophore and comparison of the detected fluorescence intensity with reference values.
  • a comparison of the detected fluorescence intensities with reference values is required in the method according to the invention.
  • These reference values can already exist from previous measurements and therefore do not need to be detected in the most general case in the course of the method according to the invention.
  • the reference values should ideally be determined under exactly the same external conditions as the actual measured values of the fluorescence intensities, according to a preferred embodiment of the present invention, a first detection of the fluorescence of the fluorophore is carried out before the targets (sample) come into contact with the modified surface , The values obtained in this way are then used as reference values.
  • a normalization measurement is also carried out.
  • sites are applied to the modified surface to which a very specific degree of association can be assigned after adding the sample.
  • the signal obtained during the detection is then characteristic of this particular degree of association and can be used to normalize the signals from the test sites.
  • the present invention namely also encompasses methods in which a modified surface is used which has been modified by binding at least two types of modified ligates.
  • the different types of ligates are bound to the surface in spatially essentially separated areas.
  • “Substantially separated areas” are understood to mean areas of the surface that are largely modified by binding a certain type of ligate. Only in areas in which two such essentially separated areas adjoin one another can spatial mixing of different types of ligate occur.
  • the ligand is added to the sample before the sample is brought into contact with the modified surface, the ligand being a binding partner with a high association constant with a particular type of ligate, which is used in a particular Area (Site T 100 ) is bound to the surface.
  • the ligand is added to the sample in an amount that is greater than the amount of ligand that is necessary to fully associate the ligates of the T 100 sites.
  • the last step of this method is the comparison of the values obtained in the detection of the fluorescence of the fluorophore with the value obtained for the region T 10 o.
  • the value obtained for the area T 100 thus corresponds to the value when the association is complete (100%).
  • a modified surface which has been modified by attaching at least three types of ligates.
  • the different types of ligates are bound to the surface in spatially essentially separated areas.
  • at least one type of ligate is bound to the surface in a certain area (site T 0 ), from which it is known that there is no binding partner with a high association constant in the sample, that is to say the corresponding association partner or ligand does not appear in the sample ,
  • a ligand is added to the sample before the sample is brought into contact with the modified surface, the ligand being a binding partner with a high association constant with a certain type of ligate, which occurs in a certain region (site T 10 o) is bound to the surface.
  • the ligand is added to the sample in an amount that is greater than the amount of ligand that is necessary to fully associate the ligates of the T 10 o sites.
  • the last step of this method is the comparison of the values obtained in the detection of the fluorescence of the fluorophore with the value obtained for the area T 100 and with the value obtained for the area T 0 .
  • the value obtained for the area To corresponds to the value in the absence of association (0%).
  • At least one further type of ligand is added to the sample before the sample is brought into contact with the modified surface, it being known that this ligand is not contained in the original sample.
  • This further type of ligand has an association constant> 0 to a type of ligate that is bound to the surface in a certain region (site T n ).
  • the ligand is added to the sample in such an amount that after contacting the sample with the modified surface, n% of the ligates of the site T n are in an associated form.
  • the last step of this method is the comparison of the values obtained in the detection of the fluorescence of the fluorophore with the value obtained for the area T 100 , with the value obtained for the area T 0 and with those for the areas T n values obtained.
  • the value obtained for a particular test site T n thus corresponds to the value in the presence of n% ligate-ligand associates based on the total number of ligates of the type.
  • the amount of ligand which has to be brought into contact with the modified surface in order to bring about an n% association at the site T n can be determined by the person skilled in the art by simple routine tests. For this purpose, for example after detection of the values for T 0 and T 0 o, a calibrated measurement is carried out, in which the signal intensity is determined by (different) detection labels with which the ligate and the ligand are equipped. The ratio of the intensities of the ligand label signal to the ligate label signal corresponds to n%.
  • the present invention also includes a kit for carrying out a method for the detection of ligate-ligand association events by fluorescence quenching.
  • the kit comprises a modified surface, the modification being the attachment of at least one type of modified ligate, the ligates being modified by attachment of at least one type of fluorophore and the fluorophore having a reversible bond with the modified surface.
  • the kit comprises a modified surface, the modification consisting in the attachment of at least one type of modified ligate, the ligates being modified by attachment of at least one type of fluorophore and the fluorophore being modified by attachment of at least one chemical group, which forms a reversible bond with the modified surface.
  • the reference values are already included in the kit, so that the fluorescence of the fluorophore only has to be detected once by the end user. The values obtained in this detection then only need to be compared with the existing reference values.
  • the kit comprises a modified surface which has at least one area T 0 and at least one area T-100.
  • the modified surface additionally comprises at least one region T n .
  • modified fluorophores can also be used in the process according to the invention. According to a preferred embodiment, fluorophores are therefore used which are modified by attachment of at least one chemical group, the chemical group forming a reversible bond with the modified surface.
  • a chemical group that forms a reversible bond with the modified surface can not only be attached directly to the fluorophore, but also to the ligates.
  • ligates are used which are additionally modified by attachment of at least one chemical group, the chemical group forming a reversible bond with the modified surface.
  • Particularly favorable conditions for detecting the difference in the fluorescence intensity of ligand / ligate associates and ligates exist when the fluorophore is as close as possible to the modified surface.
  • the modified surface is additionally modified by attachment of chemical groups and at the same time the ligates are modified with chemical groups, because then the chemical groups bound to the surface with the chemical groups attached to the ligates have a reversible bond can enter into.
  • surface denotes any carrier material which is suitable for carrying fluorophore-derivatized ligates directly or after appropriate chemical modification, which are covalently immobilized on the surface and whose fluorescence is close to the surface (in approx. 1 to 50 ⁇ Distance to the surface) is significantly reduced by fluorescence quenching (radiation-free energy transfer between the fluorophore as emitter and the surface as absorber) (> 10% of the expected fluorescence intensity of the fluorophore in the absence of the surface under otherwise identical conditions). Gold and silver are particularly suitable as quench surface material.
  • the term surface is independent of the spatial dimensions of the surface and also includes nanoparticles (particles or clusters of a few individual to several hundred thousand surface atoms or molecules).
  • the surface can also be attached to a solid support such as e.g. Glass, metal or plastic are bound.
  • ligate molecules in particular biopolymers such as nucleic acid oligomers or antigens or antibodies
  • the immobilization can be carried out, for example, covalently via hydroxyl, epoxy, amino or carboxy groups of the support material with thiol, hydroxyl, amino or carboxyl groups which are naturally present on the ligate or are attached to the ligate by derivatization.
  • the ligate can be used directly or via a linker / spacer are connected to the surface atoms or molecules of a surface.
  • the ligate can be anchored by the methods customary in immunoassays, for example by using biotinylated ligates for non-covalent immobilization on avidin or streptavidin-modified surfaces.
  • nucleic acid oligomers are used as ligates, the chemical modification of the probe nucleic acid oligomers with a surface anchor group can already be introduced in the course of automated solid phase synthesis or in separate reaction steps.
  • the nucleic acid oligomer is also linked directly or via a linker / spacer to the surface atoms or molecules of a surface of the type described above. This binding can be carried out in various ways known from the prior art (cf. for example Hartwich, G .: ELECTROCHEMICAL DETECTION OF
  • nucleic acid oligomers When connecting the nucleic acid oligomers, care must be taken that they are either bound to the surface completely without additional co-adsorbate or, if a co-adsorbate appears necessary, that it forms a layer as thin as possible above the surface. Either a direct attachment of the nucleic acid oligomer to the surface must be carried out or it must be coated together with short-chain co-adsorbates such as e.g. short chain thiols. Co-adsorbates of chain length 1 to 30, particularly preferably chain length 1 to 20, in particular chain length 1 to 10 are preferred.
  • a particular disadvantage in this connection is the binding of the nucleic acid oligomers in the form of a surface-biotin-avidin-biotin-oligomer compound.
  • the fluorophore is always covered by a very thick layer of biotin Avidin-biotin is shielded from the surface, which is associated with corresponding disadvantages in the detection of fluorescence.
  • ligands Molecules that specifically interact with the ligate (probe) immobilized on a surface to form a complex are referred to as ligands.
  • ligands in the context of the present invention are substrates, cofactors or coenzymes as complex binding partners of a protein (enzyme), antibodies (as complex binding partners of an antigen), antigens (as complex binding partners of an antibody), receptors (as complex binding partners of a hormone), hormones (as complex binding partners) a receptor) or nucleic acid oligomers (as a complex binding partner of the complementary nucleic acid oligomer).
  • fluorescent dyes such as e.g. Texas Red®, rhodamine dyes, cyanine dyes such as Cy3 TM, Cy5 TM, fluorescein etc (see Fluka, Amersham and Molecular Probes catalog) are used.
  • Fluorescence quenching is the deactivation of an electronically excited species via a radiationless process. Deactivation can take place by means of impacts or by radiation-free energy transfer to metals. The energy released is dissipated as thermal energy. Gold is an example of a metal that has the ability to quench fluorescence. The quenching has a strong dependence on the distance of the fluorophore from the surface functioning as a fluorescence quencher (inversely proportional to a higher (third to sixth) power of the distance). The effect of fluorescence quenching can therefore only be measured at distances of less than 100 to 200 A. In the range greater than approx. 200 A, further changes in distance no longer lead to a measurable increase in the fluorescence intensity. Brief description of the drawings
  • Fig. 2 is a schematic representation of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by specific interactions between groups on the fluorophore and the modified surface.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events known from the prior art by means of “molecular beacons”.
  • the single-stranded oligonucleotides have a hairpin structure 101 (hairpin, stem-and-loop), carry a fluorophore at one end of the sequence
  • fluorescence quencher 103 e.g. DABCYL
  • the fluorescent group and the unit that leads to the quenching of the fluorescence are located in close proximity to one another. Therefore the probes show only an extremely low fluorescence.
  • the hybridization takes place in this area. This leads to a change in the conformation and the separation of fluorophore and quencher, which can be observed as a strong increase in fluorescence 106.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by specific interactions between groups 206 on the fluorophore 102 and the modified surface. Due to specific interactions between groups 206 on the fluorophore 102 and corresponding groups 207 on the surface 203, the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is in a compressed form. The hybridization with the complementary nucleic acid oligomer strand 202 (target) increases the distance 205 between the fluorescent dye molecule 102 and the metal surface 203 functioning as a quencher. This leads to a strong increase in the fluorescence intensity (see bar chart in FIG. 2). ,
  • nucleic acid-oligomer probes with different sequences are used tied to a support using the immobilization techniques described above.
  • the hybridization event of any target nucleic acid oligomer or (fragmented) target DNA is to be detected, for example in order to detect mutations in the target and to be demonstrated in a sequence-specific manner.
  • the surface atoms or molecules of a defined area are linked on a surface with DNA / RNA / PNA nucleic acid oligomers of known but any sequence, as described above.
  • the DNA chip can also be derivatized with a single probe oligonucleotide.
  • Nucleic acid oligomers eg DNA, RNA or PNA fragments
  • a base length of 3 to 70 preferably a length of 5 to 60, particularly preferably a length of 10 to 50, particularly preferably a length of 12 to 40, are used as probe nucleic acid oligomers used.
  • the target oligonucleotides can also comprise a larger number of bases, ie they can be longer than the probe oligonucleotides.
  • the expression “nucleic acid oligomer complementary to the probe oligonucleotide” is understood to mean a nucleic acid oligomer which has a base sequence which is complementary to the probe oligonucleotide in a partial region. The remaining portion (s) of the nucleic acid oligomer then protrude at the end (s) of the probe oligonucleotide beyond its base chain.
  • a reference measurement e.g. with a fluorescence scanner, the fluorescence intensity of the fluorophore-labeled probe oligonucleotides is determined in the single-stranded state.
  • the (as concentrated as possible) test solution with target oligonucleotide (s) is added to the surface with immobilized probe oligonucleotides.
  • Hybridization occurs only in the case in which the solution contains target nucleic acid oligomer strands which are complementary to the probe-nucleic acid oligomers bound to the surface or at least in many areas complementary.
  • the fluorescence intensity in the hybridized, double-stranded state is determined in a second fluorescence measurement.
  • a sequence-specific hybridization event can be performed by fluorescence-based methods such as e.g. Fluorescence microscopy or measurements with fluorescence scanners can be detected.
  • the difference between the reference measurement and the second measurement for each test site is proportional to the number of complementary (or in many areas complementary) target oligonucleotides originally present in the test solution for the respective test site.
  • the reference measurement can be omitted if the size of the reference signal is known beforehand (e.g. from previous measurements etc.).
  • a specific geometric arrangement of the probe nucleic acid oligomer relative to the modified surface can be achieved through specific interactions between groups on the dye that are naturally already present on the dye or that are introduced by chemical modification, and the (optionally modified) surface.
  • a geometrical arrangement can be realized by attaching suitable molecular groups to the dye (e.g. complexing groups such as bipyridyl groups or diamino groups), which can enter into a specific interaction that is stable under suitable conditions (e.g. complex formation) with corresponding groups. where the fluorophore is close to the surface in the non-hybridized state.
  • the single-stranded probe nucleic acid oligomer is therefore in a form which is characterized by a small distance between the fluorophore and the quenching metal surface (low fluorescence intensity).
  • the distance changes as a result of the hybridization with the complementary nucleic acid oligomer strand (target) between the fluorescent dye molecule and the metal surface acting as quencher in such a way that the distance increases, the quenching decreases and a higher intensity of the fluorescence can be observed after the hybridization (see FIG. 2).
  • n nucleotide (nt) long nucleic acid probe (DNA, RNA or PNA, for example a 20 nucleotide long oligo) is near one of its ends (3 'or 5' end) directly or via any spacer a reactive group for covalent anchoring to the surface, e.g. as a 3'-thiol-modified probe oligonucleotide, in which the terminal thiol modification serves as a reactive group for binding to gold.
  • Other covalent anchoring options arise e.g. from amine-modified ligate oligonucleotide, which is used for anchoring to surface-bonded carboxylic acid functions (e.g.
  • thiols such as mercaptopropionic acid and activation e.g. as an active ester.
  • a fluorophore is covalently attached (see Example 1), which is modified with a functional group (e.g. a fatty acid, a bipyridyl group or a diamino group).
  • a functional group e.g. a fatty acid, a bipyridyl group or a diamino group.
  • Probe nucleic acid oligomers attached to the - or, if appropriate, derivatized - surface
  • a bifunctional linker for example a suitable diamino thiol compound or a mercaptopropionic acid activated as an active ester and then reacting with a corresponding triamino compound
  • the surface modified in this way is brought into contact with the corresponding bifunctional linker in solution (for example a suitable diaminothiol compound or a mercaptopropionic acid activated as an active ester and subsequent reaction with a corresponding triamino compound in phosphate buffer / EtOH mixtures in the case of thiol-modified probe oligonucleotides) binds the bifunctional linker via its reactive group to the surface, which may be correspondingly derivatized (see section "binding of the ligate to the surface").
  • a suitable diaminothiol compound or a mercaptopropionic acid activated as an active ester and subsequent reaction with a corresponding triamino compound in phosphate buffer / EtOH mixtures in the case of thiol-modified probe oligonucleotides
  • the (residual) fluorescence of the fluorophore on the probe oligonucleotide is detected by a suitable method, e.g. by fluorescence measurement with a fluorescence scanner using specific interactions between functional groups on the dye and, if appropriate, correspondingly functionalized groups on the gold surface.
  • a suitable method e.g. by fluorescence measurement with a fluorescence scanner using specific interactions between functional groups on the dye and, if appropriate, correspondingly functionalized groups on the gold surface.
  • One embodiment is e.g. bipyridyl groups attached to the dye molecule or in its vicinity, which enter into relatively stable interactions with the gold surface under suitable conditions.
  • a further embodiment are diamino groups attached to or in the vicinity of the dye molecule, which enter into a relatively stable interaction via a complex bond generated by copper (II) or nickel (II) to corresponding diamino groups attached to the gold surface.
  • a further embodiment are hydrophobic alkyl chains attached to the dye molecule (for example by binding a fatty acid), which enter into relatively stable interactions via hydrophobic interactions with the likewise hydrophobic gold surface.
  • the dissolved target is then added, potential hybridization events are made possible under suitable conditions known to the person skilled in the art (arbitrary, freely selectable stringency conditions of the parameters potential temperature / salt / chaotropic salts etc. for the hybridization) and the measurement is repeated to detect the fluorophore.
  • the difference in the measurement signal is proportional to the number of hybridization events between probe nucleic acid oligomer on the surface and suitable target nucleic acid oligomer in the test solution.
  • the described method can be used for a target type (eg a specific target oligonucleotide type with a known sequence) on a surface or - if different probe types are used for each test site - for several target types (same ligand groups as eg several different target Oligonucleotide types or different antibody types, antigen types etc., but also mixtures thereof) can be used.
  • a target type eg a specific target oligonucleotide type with a known sequence
  • target types eg several different target Oligonucleotide types or different antibody types, antigen types etc., but also mixtures thereof
  • oligonucleotide synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA / RNA synthesizer) according to the synthesis protocols recommended by the manufacturer for a 1.0 ⁇ mol synthesis.
  • the oxidation steps are carried out with a 0.02 M iodine solution in order to avoid oxidative cleavage of the disulfide bridge.
  • Modifications to the 5 'position of the oligonucleotides are carried out with a coupling step that is extended to 5 min.
  • the amino modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) is built into the sequences with the respective standard protocol. The coupling efficiencies are determined online during the synthesis via the DMT cation concentration photometrically or conductometrically.
  • the oligonucleotides are deprotected with concentrated ammonia (30%) at 37 ° C for 16 h.
  • the oligonucleotides are purified using RP-HPL chromatography according to standard protocols (eluent: 0.1 M triethylammonium acetate buffer, acetonitrile), and the characterization is carried out using MALDI-TOF MS.
  • the amine-modified oligonucleotides are coupled to the corresponding activated fluorophores (eg fluorescein isothiocyanate) in accordance with conditions known to the person skilled in the art.
  • the coupling can take place both before and after the oligonucleotides have been bound to the surface.
  • oligonucleotide synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA / RNA synthesizer) according to the synthesis protocols recommended by the manufacturer for a 1.0 ⁇ mol synthesis.
  • the oxidation steps are carried out with a 0.02 M iodine solution in order to avoid oxidative cleavage of the disulfide bridge.
  • Modifications to the 5 'position of the oligonucleotides are carried out with a coupling step which is extended to 5 min.
  • the fluorophores are incorporated in the synthesizer in the penultimate coupling step as phosphoramidites (fluorescein-phosphoramidites Glen Research 10-1963) in the sequences with the respective standard protocol.
  • the amino modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) is incorporated in the sequences with the respective standard protocol in the last coupling step.
  • the coupling efficiencies are determined online during the synthesis via the DMT cation concentration photometrically or conductometrically.
  • a fatty acid or an ethylenediamine function for example as ethylenediamine-N, N'-diacetic acid
  • the bipyridyl group for example as 2,2'-bipyridine-4,4'-dicarboxylic acid
  • the quench surface (here: gold plate) is treated with a double-modified 20 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 esterified to PO- (CH 2 ) 2 - SS- (CH 2 ) 2 -OH; modification 2: at the 5 'end is a fluorophore and an ethylenediamine group (see Ex. 2) installed according to the respective standard protocol) in 5x10 "5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) with the addition of approx.
  • 5 molar buffer solution phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7
  • the free bifunctional thiol present at the same time in the incubation solution is also co-adsorbed by forming an Au-S bond (incubation step).
  • this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
  • a state is then achieved by adding soluble nickel salts (e.g. Ni (II) chloride) or other suitable metal ions (such as copper) through the formation of a complex using the complex formation properties of the diamino group on the fluorophore and the diamino group on the surface , in which the fluorophore is in a geometric arrangement close to the surface.
  • soluble nickel salts e.g. Ni (II) chloride
  • suitable metal ions such as copper
  • the quench surface (here: gold plate) is treated with a double-modified 20 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 esterified to PO- (CH 2 ) 2 - SS- (CH 2 ) 2 -OH; modification 2: at the 5 'end is a modified fluorophore and an ethylenediamine group (see example 2) Incorporated according to the respective standard protocol) in 5x10 "5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) for 0.5 - 24 h.
  • the disulfide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS - (CH 2 ) 2 -OH of the oligonucleotide cleaved homolytically, the spacer forming a covalent Au-S bond with Au atoms on the surface, which leads to coadsorption of the ss-oligonucleotide and the cleaved 2-hydroxy-mercaptoethanol.
  • this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
  • the gold surface thus modified is then completed with an approximately 10 "5 to 10 " 1 molar diaminothiol compound (or other suitable thiols or disulfides of suitable chain length, such as mercaptopropionic acid activated as an active ester, to which a triamino group is then coupled) wetted and incubated for 0.5 - 24 h.
  • the free thiol compound covers the free gold surface remaining after the incubation step by forming an Au-S bond.
  • Ni (II) chloride soluble nickel salts
  • suitable metal ions such as copper
  • An alternative production of Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-FP consists in the derivatization of the gold surface with the probe oligonucleotide (incubation step) without subsequent loading.
  • the quench surface here: gold plate
  • the quench surface is treated with a double-modified 20 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 esterified to PO- (CH 2 ) 2 - SS- (CH 2 ) 2 -OH; modification 2: at the 5 'end is a modified fluorophore and a bipyridyl group (see example 2) Incorporated according to the respective standard protocol) in 5x10 "5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) for 0.5 - 24 h.
  • the disulfide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS - (CH 2 ) 2 -OH of the oligonucleotide cleaved homolytically, the spacer forming a covalent Au-S bond with Au atoms on the surface, which leads to coadsorption of the ss-oligonucleotide and the cleaved 2-hydroxy-mercaptoethanol.
  • this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
  • the bipyridyl group attached to the fluorophore or in its vicinity interacts with the unmodified gold surface, whereby a geometrical arrangement is achieved in which the fluorophore is present close to the surface.
  • Another alternative preparation of Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-FP consists in the derivatization of the gold surface with the probe oligonucleotide (incubation step) without subsequent loading.
  • the quench surface (here: gold plate) is treated with a double-modified 20 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 esterified to PO- (CH 2 ) 2 - SS- (CH 2 ) 2 -OH; modification 2: at the 5 'end is a modified fluorophore and an alkyl chain (e.g. as a fatty acid unit, cf.
  • an alkyl chain e.g. as a fatty acid unit, cf.
  • Example 2 built in according to the respective standard protocol) in 5x10 "5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) for 0.5-24 h.
  • 5 molar buffer solution phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7
  • the disulfide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH of the oligonucleotide cleaved homolytically, whereby the spacer forms a covalent Au-S bond with Au atoms on the surface, which leads to coadsorption of the ss-oligonucleotide and the cleaved 2-hydroxy- mercaptoethanols is coming.
  • this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
  • the gold surface can also be correspondingly hydrophobically modified by coadsorption (see Example 3) or subsequent coating (see Example 4) with hydrophobic alkylthiols (e.g. propanethiol or other thiols or disulfides of a suitable chain length).
  • hydrophobic alkylthiols e.g. propanethiol or other thiols or disulfides of a suitable chain length.
  • the fatty acid unit attached to or in the vicinity of the fluorophore interacts with the hydrophobic gold surface, whereby a geometric arrangement is achieved in which the fluorophore is present close to the surface.
  • the probe surface is produced analogously to Examples 3-6.
  • a modified oligonucleotide of the sequence 5'-fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '[C 3 -SSC 3 -OH] is immobilized on gold (50 ⁇ mol oligonucleotide in phosphate buffer (K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 500 mM, pH 7) and in the form Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-Fluorescein the fluorescence intensity of the surface was determined with a fluorescence scanner from Lavision Biotech for the measurement of fluorescence in the presence of liquid media 150 ⁇ l of the medium are placed on the gold surface and then covered with a cover glass, or alternatively Hybriwells or imaging chambers can be used.

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen, das als ersten Schritt das Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche umfasst. Die Modifikation der Oberfläche besteht dabei in der Anbindung wenigstens einer Art von modifiziert Ligaten (201), wobei die Ligaten (201) durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor (102) modifiziert sind, wobei der Fluorophor (102) mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht. Die weiteren Schritte des erfindungsgemässen Verfahrens sind Bereistellen einer Probe mit Liganden, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors und Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensität mit Referenzwerten.

Description

Reversible Bindung eines Fluorophors an eine Oberfläche zur Detektion von Ligat- Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand- Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen.
Stand der Technik
In der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor werden Immunoassays und zunehmend auch die Sequenzanalyse von DNA und RNA eingesetzt. Neben den bekannten seriellen Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion finden zunehmend parallele Detektionsverfahren mittels Array-Technologie, sogenannten DNA- oder Protein-Chips, Verwendung. Auch bei diesen parallelen Verfahren beruht die Detektion auf optischen, radiographischen, massenspektrometrischen oder elektrochemischen Methoden.
Zur Genanalyse auf einem Chip wird auf einer Oberfläche eine Bibliothek bekannter DNA- Sequenzen ("Sonden-Oligonukleotide") in einem geordneten Raster fixiert, so dass die
Position jeder individuellen DNA-Sequenz bekannt ist. In der Untersuchungslösung anwesende Fragmente aktiver Gene ("Target-Oligonukleotide"), deren Sequenzen zu bestimmten Sonden-Oligonukleotiden auf dem Chip komplementär sind, können durch
Nachweis der entsprechenden Hybridisierungsereignisse auf dem Chip identifiziert werden. Im Allgemeinen erfolgt die Analyse über optische (oder autoradiographische)
Detektionsverfahren unter Verwendung von Target-Oligonukleotiden, die mit einem
Radiolabel (z.B. 32P) oder einem Fluoreszenzfarbstoff (z.B. Fluorescein, Cy3™ oder
Cy5™) markiert sind. Die Verwendung von Fluoreszenzlabel und entsprechenden
Fluoreszenz-Scannern überwiegt dabei zunehmend die Anwendung von Radiolabel. Die zur Zeit auf dem Markt erhältlichen Fluoreszenz-Scanner ermöglichen den Nachweis von
Fluorophoren im Subattomol-Bereich. Die Verwendung von markierten Targets zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen beinhaltet jedoch einige Nachteile. Zum einen muss die Markierung vor der eigentlichen Messung erfolgen, was einen zusätzlichen Syntheseschritt und damit zusätzlichen Arbeitsaufwand bedeutet. Zudem ist es schwierig, eine homogene Markierung des Probenmaterials zu gewährleisten. Außerdem sind stringente Waschbedingungen notwendig, um im Anschluss an eine Hybridisierung nicht oder unspezifisch gebundenes Material zu entfernen.
Sowohl für die Protein- als auch für die DNA-Analyse ist es daher wünschenswert und für den Anwender vorteilhaft, wenn die Targets (Antikörper bzw. Antigen oder DNA- Fragment) nicht mit einem Detektionslabel modifiziert werden müssen und nach der Hybridisierung keine komplizierten Waschschritte notwendig sind.
Die Nachteile der Markierung des Probenmaterials mit radioaktiven Elementen oder Fluoreszenzfarbstoffen können umgangen werden, wenn an Stelle der Targets die Sondenmoleküle mit entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Nach diesem Prinzip funktionieren die sogenannten molekularen Leuchten (molecular beacons). Diese einsträngigen Oligonukleotide weisen eine Haarnadelstruktur (hairpin, stem-and-loop) auf und tragen am einen Ende der Sequenz einen Fluorophor (z.B. Fluorescein, TexasRed®) und am anderen Ende der Sequenz einen geeigneten Fluoreszenzlöscher (z.B. DABCYL). Durch die spezielle geometrische Anordnung befinden sich die fluoreszierende Gruppe und die Einheit, die zur Löschung der Fluoreszenz führt, in räumlicher Nähe zueinander. Daher zeigen die Sonden nur eine äußerst geringe Fluoreszenz. In Gegenwart der entsprechenden zur Sequenz der Schlinge (loop) komplementären Sequenz (Target) erfolgt die Hybridisierung in diesem Bereich. Dies führt zu einer Änderung der Konformation und zur Trennung von Fluorophor und Quencher, was als starke Zunahme der Fluoreszenz beobachtet werden kann.
Neben organischen Molekülen (wie DABCYL) werden auch Gold-Nanopartikel als effiziente Quencher eingesetzt (vgl. Nature Biotech. Vol. 19, 2001, Seite 365). Das Quenchen der Fluoreszenz durch Metalle beruht primär auf einem strahlungslosen Energietransfer vom Farbstoffmolekül zum Metall. Bei Verwendung von Gold- Nanopartikeln wird eine größere Sensitivität beobachtet als bei organischen Quenchem. Außerdem werden Farbstoffe bis in den nahen Infrarot-Bereich effizient gequencht. Ein Nachteil dieser Methode liegt allerdings darin, dass Gold-Nanopartikel bei Temperaturen über 50°C nicht mehr stabil sind. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass diese Methode auf die Untersuchung von Lösungen beschränkt ist und daher nur wenige Sequenzen zur gleichen Zeit untersucht werden können, der Parallelisierungsgrad dieses Ansatzes also gering ist.
Obwohl es also viele Detektionsmöglichkeiten für Ligat-Ligand-Assoziate gibt, ist der Bedarf an einfachen, kostengünstigen, problemlos durchzuführenden und verlässlichen Detektionsprinzipien vor allem im Bereich der weniger dichten Array-Technologien (DNA- und Protein-Chips mit wenigen einzelnen bzw. bis zu mehreren hunderttausend Test- Sites pro cm2 z.B. für sogenannte POC (Point of Care)- Systeme bzw. für high throughput screening - HTS - Systeme) hoch.
Darstellung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Detektion von Ligat- Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen zu schaffen, welches die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren gemäß unabhängigem Patentanspruch 1 und den Kit gemäß unabhängigem Patentanspruch 24 gelöst.
Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:
Genetik
DNA Desoxyribonukleinsäure
RNA Ribonukleinsäure
PNA Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat-Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat-Einheit durch die -NH-(CH2)2- N(COCH2-Base)-CH2CO- Einheit hybridisiert PNA mit DNA.)
A Adenin
G Guanin
C Cytosin
T Thymin u Uracil
Base A, G, T, C oder U
Bp Basenpaar
Nukleinsäure wweenniiggsstteennss zzwweei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z.B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin- Basen, wie z.B. auf das Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z.B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit zur sequenzspezifischen Bindung natürlich vorkommender cDNA oder RNA. nt Nukleotid
Nukleinsäure-Oligomer Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z.B. Nukleinsäure-Oktamer: Eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei der 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind). ns-Oligomer Nukleinsäure-Oligomer
Oligomer Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z.B. ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge. Oligo Abkürzung für Oligonukleotid. Mismatch Zur Ausbildung der Watson-Crick-Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet. ss Single Strand (Einzelstrang) ds double Strand (Doppelstrang)
Substrat, Cofaktor, Komplexbindungspartner eines Proteins (Enzyms). Coenzym
Antikörper Komplexbindungspartner eines Antigens.
Antigen Komplexbindungspartner eines Antikörpers.
Rezeptor Komplexbindungspartner eines Hormons. Assoziationskonstante für die Assoziation von Ligat und Ligand.
Substanzen
Fluorophor chemische Verbindung (chemische Substanz), die in der Lage ist, bei Anregung mit Licht ein längerwelliges (rotverschobenes) Fluoreszenzlicht abzugeben. Fluorophore (Fluoreszenzfarbstoffe) können Licht in einem Wellenlängenbereich vom ultravioletten (UV) über den sichtbaren (VIS) bis hin zum infraroten (IR) Bereich absorbieren. Die Absorptions- und Emissionsmaxima sind in der Regel um 15 bis 40 nm verschoben (Stokes-Shift).
FP Fluorophor Cy3™ δ.δ'-disulfo-l .l'di^carbopenteny -S.S.S'^'-tetramethyl- indodicarbocyanin
(Fluoreszenzfarbstoff der Firma Amersham Life Science, Inc.)
Cy5 TM 5,5\7,7'-tetrasulfo-1 , 1 'd -carbopenteny -S.S^.S etramethyl- benzindodicarbocyanin
(Fluoreszenzfarbstoff der Firma Amersham Life Science, Inc.)
Fluorescein Resorcinphtalein (Fluoreszenzfarbstoff)
Rhodamin 6G Basic Red 1 (Fluoreszenzfarbstoff)
Texas Red® Fluoreszenzfarbstoff der Firma Molecular Probes, Inc.
DABCYL 4-((4'-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure
Fluoreszenzlöschung strahlungsloser Energietransfer
Fluoreszenz-Quenchen Fluoreszenzlöschung
Quench-Oberfläche leitende (Metall)-Oberfläche, die durch einen Energietransfer Fluoreszenz löschen kann (insbesondere Gold-, Silber-, Kupfer- Oberflächen usw. )
EDTA Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz) Ligand Bezeichnung für Moleküle, die von Ligaten spezifisch gebunden werden; Beispiele von Liganden im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Ligand eines Antigens), Antigene (als Ligand eines Antikörpers), Rezeptoren (als Ligand eines Hormons), Hormone (als Ligand eines Rezeptors) oder Nukleinsäure-Oligomere (als Ligand des komplementären Nukleinsäure-Oligomers).
Ligat Bezeichnung für (Makro-) Molekül, an dem sich spezifische Erkennungs- und Bindungsstellen für die Ausbildung eines Komplexes mit einem Liganden befinden (Template).
Linker molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit dem entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1 - 60, insbesondere der Kettenlänge 5 - 40, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, einem Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Spacer Linker, der über die reaktiven Gruppen an eine oder beide der zu verbindenden Strukturen (siehe Linker) kovalent angebunden ist. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1 - 60, insbesondere der Kettenlänge 5 - 40, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.
Modifizierte Oberflächen/Elektroden
Au-S-(CH2)2-ss-oligo- Gold-Oberfläche mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus FP derivatisiertem Einzelstrang-Oligonukleotid. Hierbei ist die endständige Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3' Ende mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert, wobei die S-S Bindung homolytisch gespalten wird und je eine Au-S-R Bindung bewirkt. Am freien Ende trägt das Sonden- Oligonukleotid einen kovalent angebunden Fluorophor (FP) wie z.B. Cy3™, Cy5™, Texas Red®, Rhodamin 6G, Fluorescein etc.
Au-S-(CH2)2-ds-oligo- Au-S-(CH2)2-ss-oligo-FP hybridisiert mit dem zu ss-oligo FP komplementären Oligonukleotid.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand- Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen, das als ersten Schritt das Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche umfasst. Die Modifikation der Oberfläche besteht dabei in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten, wobei die Ligaten durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind, wobei der Fluorophor mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht. Die weiteren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Bereitstellen einer Probe mit Liganden, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors und Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensität mit Referenzwerten.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensitäten mit Referenzwerten erforderlich. Diese Referenzwerte können aus vorangegangenen Messungen bereits vorliegen und brauchen daher im allgemeinsten Fall nicht im Laufe des erfindungsgemäßen Verfahrens detektiert werden. Da die Referenzwerte aber im Idealfall unter exakt den gleichen äußeren Bedingungen bestimmt werden sollen wie die eigentlichen Messwerte der Fluoreszenzintensitäten, wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vor dem Inkontaktbringen der Targets (Probe) mit der modifizierten Oberfläche eine erste Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors durchgeführt. Die so erhaltenen Werte werden dann als Referenzwerte verwendet.
Gemäß den nachfolgend geschilderten, besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird zusätzlich eine Normierungsmessung durchgeführt. Auf der modifizierten Oberfläche sind in diesen Fällen Sites aufgebracht, denen nach Zugabe der Probe ein ganz bestimmter Assoziationsgrad zugeordnet werden kann. Das bei der Detektion erhaltene Signal ist dann für diesen bestimmten Grad an Assoziation charakteristisch und kann zur Normierung der Signale der Test-Sites herangezogen werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst nämlich auch Verfahren, in denen eine modifizierte Oberfläche verwendet wird, die durch Anbindung von wenigstens zwei Arten von modifizierten Ligaten modifiziert wurde. Die verschiedenen Arten von Ligaten sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. Unter "im wesentlichen abgetrennten Bereichen" werden Bereiche der Oberfläche verstanden, die ganz überwiegend durch Anbindung einer bestimmten Art von Ligat modifiziert sind. Lediglich in Gebieten, in denen zwei solche im wesentlichen abgetrennte Bereiche aneinander grenzen, kann es zu einer räumlichen Vermischung von verschiedenen Ligat- Arten kommen. In dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einem Liganden zu der Probe, wobei der Ligand ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von Ligaten ist, die in einem bestimmten Bereich (Site T100) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Der Ligand wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Liganden, die notwendig ist, um die Ligaten der T100-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T10o erhaltenen Wert. Der für den Bereich T100 erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei vollständiger Assoziation (100%).
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine modifizierte Oberfläche verwendet, die durch Anbindung von wenigstens drei Arten von Ligaten modifiziert wurde. Die verschiedenen Arten von Ligaten sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. Dabei ist wenigstens eine Art von Ligat in einem bestimmten Bereich (Site T0) an die Oberfläche gebunden, von dem bekannt ist, dass in der Probe kein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante enthalten ist, also der entsprechende Assoziationspartner bzw. Ligand nicht in der Probe vorkommt. Auch in diesem besonders bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einem Liganden zu der Probe, wobei der Ligand ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von Ligaten ist, die in einem bestimmten Bereich (Site T10o) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Der Ligand wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Liganden, die notwendig ist, um die Ligaten der T10o-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T100 erhaltenen Wert und mit dem für den Bereich T0 erhaltenen Wert. Der für den Bereich To erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei fehlender Assoziation (0%).
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der oben geschilderten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von wenigstens einer weiteren Art von Ligand zu der Probe, wobei bekannt ist, dass dieser Ligand in der ursprünglichen Probe nicht enthalten ist. Diese weitere Art von Ligand weist eine Assoziationskonstante >0 zu einer Art von Ligaten auf, die in einem bestimmten Bereich (Site Tn) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Der Ligand wird in einer solchen Menge zu der Probe gegeben, dass nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche n% der Ligaten des Sites Tn in assoziierter Form vorliegen. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T100 erhaltenen Wert, mit dem für den Bereich T0 erhaltenen Wert und mit den für die Bereiche Tn erhaltenen Werten. Der für ein bestimmtes Test-Site Tn erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei Vorliegen von n% Ligat-Ligand-Assoziaten bezogen auf die Gesamtzahl an Ligaten der entsprechend Art.
Die Menge an Ligand, die mit der modifizierten Oberfläche in Kontakt gebracht werden muss, um eine n%ige Assoziation am Site Tn zu bewirken, kann vom Fachmann durch einfache Routineuntersuchungen bestimmt werden. Dazu wird z.B. nach Detektion der Werte für T0 und T 0o eine kalibrierte Messung durchgeführt, bei der die Signalintensität von (unterschiedlichen) Detektionslabel bestimmt wird, mit denen der Ligat und der Ligand ausgestattet sind. Das Verhältnis der Intensitäten von Ligand-Label-Signal zu Ligat-Label-Signal entspricht n%.
Wird eine genügende Anzahl an Sites Tn auf der modifizierten Oberfläche aufgebracht, so kann eine Normierungskurve mit hoher Genauigkeit aufgenommen werden. Die Normierung der Messungen der eigentlichen Test-Sites mit Hilfe dieser Normierungskurve verbessert die Reproduzierbarkeit der Analytik mit Hilfe der Chip-Technologie deutlich.
Es soll darauf hingewiesen werden, dass das Auffinden eines Liganden, der nicht in der Probe enthalten ist, insbesondere im Fall der Verwendung von Nukleinsäure-Oligomeren als Liganden und Ligaten keinerlei Probleme bereitet, da auch die umfangreichsten Genome immer noch eine genügende Auswahl an nicht vorhandenen Sequenzen bieten. Für den Fall, dass sich die nicht vorhandene Sequenz von einer anwesenden Sequenz nur durch eine Base unterscheidet, muss der Hybridisierungsschritt unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Bevorzugt werden aber Sequenzen verwendet, die sich deutlich, also in mehreren Basen, von den in der Probe anwesenden Sequenzen unterscheiden. Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn für die Test-Sites und für die Normierungssites Oligonukleotide mit der gleichen oder zumindest einer ähnlichen Zahl an Basen verwendet werden.
Daneben umfasst die vorliegende Erfindung auch einen Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz- Quenchen. Der Kit umfasst eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten besteht, wobei die Ligaten durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind und wobei der Fluorophor mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten besteht, wobei die Ligaten durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind und wobei der Fluorophor durch Anbindung wenigstens einer chemischen Gruppe modifiziert ist, die mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Referenzwerte von dem Kit bereits umfasst, sodass die Fluoreszenz des Fluorophors vom Endverbraucher nur einmal detektiert werden muss. Die bei dieser Detektion erhaltenen Werte brauchen dann nur mit den bereits vorhandenen Referenzwerten verglichen zu werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Kit eine modifizierte Oberfläche, die wenigstens einen Bereich T0 und wenigstens einen Bereich T-ioo aufweist. Besonders bevorzugt werden Ausführungsformen, wonach die modifizierte Oberfläche zusätzlich wenigstens einen Bereich Tn umfasst.
Sind an dem Fluorophor in seiner unmodifizierten Form keine Gruppen vorhanden, die mit der modifizierten Oberfläche eine ausreichende Bindungsfähigkeit aufweisen, so können auch modifizierte Fluorophore in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden also Fluorophore verwendet, die durch Anbindung wenigstens einer chemischen Gruppe modifiziert sind, wobei die chemische Gruppe mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht.
Eine chemische Gruppe, die mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht, kann nicht nur direkt an den Fluorophor angebunden werden, sondern auch an den Ligaten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Ligaten verwendet, die zusätzlich durch Anbindung wenigstens einer chemischen Gruppe modifiziert sind, wobei die chemische Gruppe mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht. Besonders günstige Bedingungen zur Detektion der Differenz der Fluoreszenzintensität von Ligand/Ligat-Assoziaten und Ligaten bestehen dann, wenn der Fluorophor sich möglichst nahe an der modifizierten Oberfläche befindet. Diese Bedingung ist insbesondere dann erfüllt, wenn Ligaten verwendet werden, die zusätzlich durch Anbindung wenigstens einer chemische Gruppe modifiziert sind, wobei die chemische Gruppe mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht und die chemische Gruppe z.B. durch 10 chemische Bindungen von dem Fluorophor getrennt ist. In diesem Fall befindet sich die chemische Gruppe also in räumlicher Nähe zu dem Fluorophor, womit sich wiederum nach Ausbildung der reversiblen Bindung zwischen chemischer Gruppe und modifizierter Oberfläche der Fluorophor in räumlicher Nähe zu der modifizierten Oberfläche befindet.
Besonders günstige Bedingungen sind dann zu erwarten, wenn die modifizierte Oberfläche zusätzlich durch Anbindung von chemischen Gruppen modifiziert ist und zugleich die Ligaten mit chemischen Gruppen modifiziert sind, weil dann die an die Oberfläche gebundenen chemischen Gruppen mit den an den Ligaten angebundenen chemischen Gruppen eine reversible Bindung eingehen können.
Die Quench-Oberfläche
Mit dem Begriff "Oberfläche" wird jedes Trägermaterial bezeichnet, das geeignet ist, direkt oder nach entsprechender chemischer Modifizierung Fluorophor-derivatisierte Ligaten zu tragen, die kovalent an der Oberfläche immobilisiert sind und deren Fluoreszenz nahe an der Oberfläche (in ca. 1 bis 50 Ä Abstand zur Oberfläche) durch Fluoreszenzlöschung (strahlungsloser Energietransfer zwischen dem Fluorophor als Emitter und der Oberfläche als Absorber) signifikant (>10% der erwarteten Fluoreszenzintensität des Fluorophors in Abwesenheit der Oberfläche bei ansonsten gleichen Bedingungen) reduziert wird. Insbesondere sind Gold und Silber als Quench-Oberflächenmaterial geeignet. Die Bezeichnung Oberfläche ist unabhängig von den räumlichen Dimensionen der Oberfläche und beinhaltet auch Nanopartikel (Partikel oder Cluster aus wenigen einzelnen bis mehreren hunderttausend Oberflächen-Atomen oder -Molekülen). Die Oberfläche kann zusätzlich an einen festen Träger wie z.B. Glas, Metall oder Plastik gebunden vorliegen.
Bindung des Ligaten an die Oberfläche
Verfahren zur Immobilisierung von Ligat-Molekülen, insbesondere Biopolymeren wie Nukleinsäure-Oligomeren oder Antigenen bzw. Antikörpern an einer Oberfläche sind dem Fachmann bekannt. Die Immobilisierung kann z.B. kovalent über Hydroxyl-, Epoxid-, Amino- oder Carboxygruppen des Trägermaterials mit natürlicherweise am Ligat vorhandenen oder durch Derivatisierung am Ligat angebrachten Thiol-, Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppen erfolgen. Der Ligat kann direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche verbunden werden. Daneben kann der Ligat durch die bei Immunoassays üblichen Methoden verankert werden wie z.B. durch Verwendung von biotinylierten Ligaten zur nicht-kovalenten Immobilisierung an Avidin oder Streptavidin-modifizierten Oberflächen. Bei Verwendung von Nukleinsäure- Oligomeren als Ligaten kann die chemische Modifikation der Sonden-Nukleinsäure- Oligomere mit einer Oberflächen-Ankergruppe bereits im Verlauf der automatisierten Festphasensynthese oder aber in gesonderten Reaktionsschritten eingeführt werden. Dabei wird auch das Nukleinsäure-Oligomer direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf verschiedene, aus dem Stand der Technik bekannten Arten durchgeführt werden (vgl. z.B. Hartwich, G.: ELEKTROCHEMISCHE DETEKTION VON
SEQUENZSPEZIFISCHEN NUKLEINSÄUREOLIGOMERHYBRIDISIERUNGSEREIGNISSEN (1999), WO 00/42217).
Bei der Anbindung der Nukleinsäure-Oligomere an die Oberflächen ist auf einen besonders wichtigen Punkt zu achten. Grundsätzlich herrschen zur Detektion der Differenz der Fluoreszenzintensität von hybridisierten Nukleinsäure-Oligomeren und einsträngigen Nukleinsäure-Oligomeren dann besonders günstige Bedingungen, wenn der Fluorophor sich in nur einem der Zustände "hybridisiert" oder "nicht hybridisiert" möglichst nahe an der modifizierten Oberfläche befindet. Das Ausmaß des Quench- Vorgangs verändert sich ja bekanntermaßen mit einer höheren (dritte bis sechste) Potenz des Abstandes zwischen Quench-Oberfläche und Fluorophor. Solche besonders günstigen Bedingungen können nur mit speziellen Anbindungstechniken erreicht werden. Es muss bei der Anbindung der Nukleinsäure-Oligomere darauf geachtet werden, dass diese entweder völlig ohne weiteres Co-Adsorbat an die Oberfläche gebunden werden oder, falls ein Co-Adsorbat notwendig erscheint, dass dieses eine möglichst dünne Schicht über der Oberfläche ausbildet. Es muss also entweder eine direkte Anbindung des Nukleinsäure-Oligomers an die Oberfläche erfolgen oder eine Belegung zusammen mit möglichst kurzkettigen Co-Adsorbaten wie z.B. kurzkettigen Thiolen. Bevorzugt werden Co-Adsorbate der Kettenlänge 1 bis 30, besonders bevorzugt der Kettenlänge 1 bis 20, insbesondere der Kettenlänge 1 bis 10.
Insbesondere nachteilig ist in diesem Zusammenhang eine Anbindung der Nukleinsäure- Oligomere in Form einer Verbindung Oberfläche-Biotin-Avidin-Biotin-Oligomer. Bei einer solchen Anbindung ist der Fluorophor immer durch eine sehr dicke Schicht aus Biotin- Avidin-Biotin von der Oberfläche abgeschirmt, was mit entsprechenden Nachteilen in der Detektion der Fluoreszenz einhergeht.
Liganden (Targets)
Als Liganden werden Moleküle bezeichnet, die spezifisch mit dem an einer Oberfläche immobilisierten Ligaten (Sonde) unter Ausbildung eines Komplexes wechselwirken. Beispiele von Liganden im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme als Komplexbindungspartner eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Komplexbindungspartner eines Antigens), Antigene (als Komplexbindungspartner eines Antikörpers), Rezeptoren (als Komplexbindungspartner eines Hormons), Hormone (als Komplexbindungspartner eines Rezeptors) oder Nukleinsäure-Oligomere (als Komplexbindungspartner des komplementären Nukleinsäure-Oligomers).
Fluorophore
Als Fluorophore werden kommerziell erhältliche Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B. Texas Red®, Rhodamin-Farbstoffe, Cyaninfarbstoffe wie z.B. Cy3™, Cy5™, Fluorescein etc (vgl. Fluka, Amersham und Molecular Probes Katalog) verwendet.
Fluoreszenzlöschung
Mit Fluoreszenzlöschung wird die Deaktivierung einer elektronisch angeregten Spezies über einen strahlungslosen Prozess bezeichnet. Die Deaktivierung kann durch Stöße oder auch durch strahlungslose Energieübertragung auf Metalle erfolgen. Die freiwerdende Energie wird als thermische Energie dissipiert. Gold ist ein Beispiel für ein Metall, das die Fähigkeit zur Fluoreszenzlöschung besitzt. Die Löschung weist eine starke Abhängigkeit vom Abstand des Fluorophors von der als Fluoreszenzlöscher fungierenden Oberfläche auf (umgekehrt proportional zu einer höheren (dritte bis sechste) Potenz des Abstands). Der Effekt der Fluoreszenzlöschung ist daher nur bei Abständen kleiner 100 bis 200 A messbar. Im Bereich größer als ca. 200 A führen weitere Abstandsänderungen nicht mehr zu einer messbaren Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen mittels "Molecular Beacons";
Fig. 2 eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch spezifische Wechselwirkungen zwischen Gruppen am Fluorophor und der modifizierten Oberfläche.
Bezugszeichenliste
101 : Sonde in Form einer Haarnadel ("hairpin")
102: Fluorophor
103: Fluoreszenz-Löscher
104: Target
105: Fluoreszenzlöschung 106: Fluoreszenz
201: einsträngige Oligomer-Sonde
202: Sonde hybridisiert mit Target
203: Oberfläche (z.B. Gold)
204: Abstand des Fluorophor zur Goldoberfläche vor der Hybridisierung 205: Abstand des Fluorophor zur Goldoberfläche nach der Hybridisierung
206: Molekülgruppe am Fluorophor, die spezifische Wechselwirkungen mit entsprechenden Gruppen an der Oberfläche eingeht
207: Molekülgruppe an der Oberfläche, die spezifische Wechselwirkungen mit entsprechenden Gruppen am Fluorophor eingeht
Die Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der aus dem Stand der Technik bekannten Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen mittels "Molecular Beacons". Die einsträngigen Oligonukleotide weisen eine Haarnadelstruktur 101 (hairpin, stem-and-loop) auf, tragen am einen Ende der Sequenz einen Fluorophor
102 (z.B. Fluorescein, TexasRed®) und am anderen Ende der Sequenz einen geeigneten Fluoreszenzlöscher 103 (z.B. DABCYL). Durch die spezielle geometrische Anordnung befinden sich die fluoreszierende Gruppe und die Einheit, die zur Löschung der Fluoreszenz führt, in räumlicher Nähe zueinander. Daher zeigen die Sonden nur eine äußerst geringe Fluoreszenz. In Gegenwart der entsprechenden zur Sequenz der Schlinge (loop) komplementären Sequenz 104 (Target) erfolgt die Hybridisierung in diesem Bereich. Dies führt zu einer Änderung der Konformation und zur Trennung von Fluorophor und Quencher, was als starke Zunahme der Fluoreszenz 106 beobachtet werden kann.
Die Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure- Oligomer-Hybridisierungsereignissen durch spezifische Wechselwirkungen zwischen Gruppen 206 am Fluorophor 102 und der modifizierten Oberfläche. Durch spezifische Wechslwirkungen zwischen Gruppen 206 am Fluorophor 102 und entsprechenden Gruppen 207 an der Oberfläche 203 liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure- Oligomer 201 in einer komprimierten Form vor. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) vergrößert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül 102 und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche 203. Dadurch kommt es zu einer starken Zunahme der Fluoreszenzintensität (siehe Balkendiagramm der Figur 2).
Wege zur Ausführung der Erfindung
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion von Ligat / Ligand Assoziaten am Beispiel der Nukleinsäure-Hybridisierung (Ligat: Sonden-Oligonukleotid, Ligand: zum Sonden-Oligonukleotid komplementäres DNA-Teilstück) erläutert. Das geschilderte Verfahren ist für den Fachmann ohne weiteres auf die Detektion anderer Ligat / Ligand-Assoziate, wie sie im Abschnitt "Liganden (Targets)" erwähnt wurden, zu übertragen.
Um die Vorteile der DNA-Chip-Technologie auf die Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybriden durch Modulation des Fluoreszenzquenchens anzuwenden, werden verschiedene modifizierte Nukleinsäure-Oligomer-Sonden unterschiedlicher Sequenz mit den oben beschriebenen Immobilisierungstechniken an einen Träger gebunden. Mit der Anordnung der Nukleinsäure-Oligomer-Sonden bekannter Sequenz an jeder Position der Oberfläche, einem DNA-Array, soll das Hybridisierungsereignis eines beliebigen Target- Nukleinsäure-Oligomers oder einer (fragmentierten) Target-DNA detektiert werden, um z.B. Mutationen im Target aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer Oberfläche die Oberflächenatome oder -moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-/RNA-/PNA-Nukleinsäure-Oligomeren bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. In einer allgemeinsten Ausführungsform kann der DNA-Chip auch mit einem einzigen Sonden-Oligonukleotid derivatisiert werden. Als Sonden-Nukleinsäure-Oligomere werden Nukleinsäure- Oligomere (z.B. DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 70, bevorzugt der Länge 5 bis 60, besonders bevorzugt der Länge 10 bis 50, insbesondere bevorzugt der Länge 12 bis 40 verwendet.
An dieser Stelle sei erwähnt, dass die Target-Oligonukleotide auch eine größere Anzahl an Basen umfassen können, also länger sein können, als die Sonden-Oligonukleotide. In diesem Fall wird unter dem Ausdruck "zum Sonden-Oligonukleotid komplementäres Nukleinsäure-Oligomer" ein Nukleinsäure-Oligomer verstanden, das eine Basensequenz aufweist, die in einem Teilbereich zu dem Sonden-Oligonukleotid komplementär ist. Der/die restlichen Abschnitte des Nukleinsäure-Oligomers ragen dann an dem/den Enden des Sonden-Oligonukleotids über dessen Basenkette hinaus.
An den so bereitgestellten Oberflächen mit immobilisierten und Fluorophor-markierten Sonden-Oligonukleotiden wird in einer Referenzmessung, z.B. mit einem Fluoreszenz- Scanner, die Fluoreszenzintensität der Fluorophor-markierten Sonden-Oligonukleotide im einsträngigen Zustand bestimmt.
Im nächsten Schritt wird die (möglichst konzentrierte) Untersuchungslösung mit Target- Oligonukleotid(en) zur Oberfläche mit immobilisierten Sonden-Oligonukleotiden gegeben. Dabei kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Target- Nukleinsäure-Oligomer-Stränge enthält, die zu den an die Oberfläche gebundenen Sonden-Nukleinsäure-Oligomeren komplementär oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind. Nach der Hybridisierung zwischen Sonde und Target wird in einer zweiten Fluoreszenzmessung die Fluoreszenzintensität im hybridisierten, doppelsträngigen Zustand bestimmt.
Aufgrund der Hybridisierung von Sonden-Nukleinsäure-Oligomer und dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang (Target) verändert sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Aufgrund des veränderten Abstandes erfährt auch das Ausmaß des Quench-Vorgangs und damit die Intensität der Fluoreszenz eine starke Änderung. Somit kann ein sequenzspezifisches Hybridisierungsereignis durch fluoreszenzbasierte Verfahren wie z.B. Fluoreszenzmikroskopie oder Messungen mit Fluoreszenz-Scanner detektiert werden.
Die Differenz aus Referenzmessung und zweiter Messung je Test-Site ist proportional zur Anzahl der ursprünglich in der Untersuchungslösung für das jeweilige Test-Site vorhandenen komplementären (bzw. in weiten Bereichen komplementären) Target- Oligonukleotide.
Gemäß einem alternativen Verfahren kann die Referenzmessung weggelassen werden, wenn die Größe des Referenzsignals vorher (z.B. durch vorausgegangene Messungen etc.) hinlänglich genau bekannt ist.
Durch spezifische Wechselwirkungen zwischen Gruppen am Farbstoff, die natürlicherweise bereits am Farbstoff vorhanden sind oder die durch eine chemische Modifikation eingeführt werden, und der (gegebenenfalls modifizierten) Oberfläche kann eine bestimmte geometrische Anordnung des Sonden-Nukleinsäure-Oligomers relativ zur modifizierten Oberfläche erreicht werden. Durch das Anbringen von geeigneten Molekülgruppen am Farbstoff (z.B. komplexierende Gruppen wie Bipyridyl-Gruppen oder Diamino-Gruppen), die eine unter geeigneten Bedingung stabile spezifische Wechselwirkung (z.B. Komplexbildung) mit entsprechenden Gruppen an der Oberfläche eingehen können, lässt sich eine geometrische Anordnung realisieren, bei der der Fluorophor im nichthybridisierten Zustand nahe an der Oberfläche vorliegt. Vor der Hybridisierung liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer also in einer Form vor, die durch einen geringen Abstand von Fluorophor und quenchender Metalloberfläche charakterisiert ist (geringe Fluoreszenzintensität). Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang (Target) verändert sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche dahingehend, dass es durch die Vergrößerung des Abstands zu einer Verringerung des Quenchens kommt und eine höhere Intensität der Fluoreszenz nach der Hybridisierung beobachtet werden kann (siehe Figur 2).
Ausführungsformen
Die n Nukleotide (nt) lange Nukleinsäure-Sonde (DNA, RNA oder PNA, z.B. ein 20 Nukleotide langes Oligo) ist in der Nähe eines ihrer Enden (3'- oder 5'-Ende) direkt oder über einen (beliebigen) Spacer mit einer reaktiven Gruppe zur kovalenten Verankerung an der Oberfläche versehen, z.B. als 3'-Thiol-modifiziertes Sonden-Oligonukleotid, bei dem die endständige Thiolmodifikation als reaktive Gruppe zur Anbindung an Gold dient. Weitere kovalente Verankerungsmöglichkeiten ergeben sich z.B. aus aminmodifiziertem Ligat-Oligonukleotid, das zur Verankerung an oberflächlich gebundene Carbonsäurefunktionen (z.B. über säurefunktionalisierte Thiole wie Mercaptopropionsäure und eine Aktivierung z.B. als Aktivester) verwendet wird. In der Nähe des anderen Terminus des Sondenoligonukleotids ist ein Fluorophor kovalent angebunden (vgl. Beispiel 1), der mit einer funktionellen Gruppe (z.B. einer Fettsäure, einer Bipyridyl- Gruppe oder einer Diamino-Gruppe) modifiziert ist. Die so modifizierte Nukleinsäure- Sonde wird
(i) in Puffer (z.B. 10 - 500 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1mM EDTA) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des
Sonden-Nukleinsäureoligomers an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche angebunden oder
(ii) in Gegenwart eines bifunktionalen Linkers (z.B. einer geeigneten Diamino- thiolverbindung oder einer als Aktivester aktivierten Mercaptopropionsäure und anschließender Reaktion mit einer entsprechenden Triaminoverbindung) in Puffer (z.B. 100 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1 mM EDTA, 0,1 - 1 M NaCI) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers gemeinsam mit dem bifunktionalen Linker an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte -
Oberfläche angebunden, wobei darauf geachtet wird, dass genügend bifunktionaler Linker geeigneter Kettenlänge zugesetzt wird (etwa 0.1 bis 10 facher Überschuss), um zwischen den einzelnen Sonden-Oligonukleotiden genügend Freiraum für eine Hybridisierung mit dem Target-Oligonukleotid zur Verfügung zu stellen oder
(iii) in Puffer (z.B. 10 - 350 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1 mM EDTA) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche angebunden. Anschließend wird die so modifizierte Oberfläche mit dem entsprechenden bifunktionalen Linker in Lösung (z.B. einer geeigneten Diaminothiolverbindung oder einer als Aktivester aktivierten Mercaptopropionsäure und anschließender Reaktion mit einer entsprechenden Triaminoverbindung in Phosphat-Puffer/EtOH-Mischungen bei Thiol- modifizierten Sondenoligonukleotiden) in Kontakt gebracht, wobei der bifunktionale Linker über seine reaktive Gruppe an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche anbindet (vgl. Abschnitt "Bindung des Ligaten an die Oberfläche").
Die (Rest-) Fluoreszenz des Fluorophors am Sonden-Oligonukleotid wird durch ein geeignetes Verfahren detektiert, z.B. durch Fluoreszenzmessung mit einem Fluoreszenz- Scanner unter Nutzung spezifischer Wechselwirkungen zwischen funktioneilen Gruppen am Farbstoff und gegebenenfalls entsprechend funktionalisierten Gruppen an der Goldoberfläche. Eine Ausführungsform sind z.B. am Farbstoffmolekül oder in dessen Nähe angebrachte Bipyridyl-Gruppen, die mit der Goldoberfläche unter geeigneten Bedingungen relativ stabile Wechselwirkungen eingehen. Eine weitere Ausführungsform sind am Farbstoffmolekül oder in dessen Nähe angebrachte Diaminogruppen, die über eine durch Kupfer(ll) oder Nickel(ll) erzeugte Komplexbindung an entsprechende an der Goldoberfläche angebrachte Diaminogruppen eine relativ stabile Wechselwirkung eingehen.
Eine weitere Ausführungsform sind am Farbstoffmolekül angebrachte hydrophobe Alkylketten (z.B. über Anbindung einer Fettsäure), die über hydrophobe Wechselwirkungen mit der ebenfalls hydrophoben Goldoberfläche relativ stabile Wechselwirkungen eingehen. Anschließend wird das gelöste Target zugegeben, potentielle Hybridisierungsereignisse werden unter geeigneten, dem Fachmann bekannten Bedingungen ermöglicht (beliebige, frei wählbare Stringenzbedingungen der Parameter Potential Temperatur/Salz/chaotrope Salze etc. für die Hybridisierung) und die Messung zur Detektion des Fluorophors wiederholt.
Der Unterschied im Messsignal (Zunahme der Fluoreszenzintensität nach der Hybridisierung, vgl. Fig. 2) ist proportional zur Anzahl der Hybridisierungsereignisse zwischen Sonden-Nukleinsäureoligomer auf der Oberfläche und passendem Target- Nukleinsäure-Oligomer in der Untersuchungslösung.
Das beschriebene Verfahren kann für eine Targetart (z.B. eine bestimmte Targetoligonukleotid-Art mit bekannter Sequenz) an einer Oberfläche oder - bei Verwendung jeweils verschiedener Sonden-Arten für jedes Test-Site - für mehrere Target- Arten (gleiche Ligandengruppen wie z.B. mehrere verschiedene Target-Oligonukleotid- Arten oder verschiedene Antikörper-Arten, Antigen-Arten etc., aber auch Mischungen davon) angewendet werden.
Beispiel 1
Darstellung der aminomodifizierten Oligonukleotide zur Verankerung auf modifizierten Goldoberflächen als Ligat- bzw. Sondenoligonukleotide
Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid- Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 M lodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird in die Sequenzen mit den jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT- Kationen-Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt. Die Oligonukleotide werden mit konzentriertem Ammoniak (30%) bei 37 °C 16 h entschützt. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt mittels RP-HPL Chromatographie nach Standardprotokollen (Laufmittel: 0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer, Acetonitril), die Charakterisierung mittels MALDI-TOF MS. Die aminmodifizierten Oligonukleotide werden mit an die entsprechenden aktivierten Fluorophore (z.B. Fluoresceinisothiocyanat) gemäß dem Fachmann bekannten Bedingungen gekoppelt. Die Kopplung kann sowohl vor als auch nach der Anbindung der Oligonukleotide an die Oberfläche erfolgen.
Beispiel 2
Darstellung der fluorophormodifizietten Oligonukleotide zur Verankerung auf modifizierten Goldoberflächen als Ligat- bzw. Sondenoligonukleotide
Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid- Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 M lodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5 '-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Die Fluorophore werden am Synthesizer beim vorletzten Kopplungsschritt als Phosphoramidite (Fluorescein- Phosphoramidite Glen Research 10-1963) in die Sequenzen mit dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird beim letzten Kopplungsschritt in die Sequenzen mit den jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT- Kationen-Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt.
Anschließend wird an die Aminogruppe eine Fettsäure oder eine Ethylendiamin-Funktion (z.B. als Ethylendiamin-N,N'-diessigsäure) oder die Bipyridyl-Gruppe (z.B. als 2,2' Bipyridin-4,4'dicarbonsäure) über entsprechende Aktivester-Verfahren angebunden. Beispiel 3
Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP
Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2- S-S-(CH2)2-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist ein Fluorophor und eine Ethylendiamin-Gruppe (vgl. Bsp. 2) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5x10"5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) mit Zusatz von ca. 10"5 bis 10"1 molarer Diaminothiol-Verbindung (oder anderen geeigneten Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge wie z.B. als Aktivester aktivierte Mercaptopropionsäure, an die anschließend eine Triamino-Gruppe angekoppelt wird) 0,5 - 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer Koads rption des ss- Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie bifunktionelle Thiol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt). Statt des Einzelstrang- Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
Anschließend wird durch Zugabe von löslichen Nickel-Salzen (z.B. Ni (II) Chlorid) oder anderen geeigneten Metall-Ionen (wie z.B. Kupfer) über die Bildung eines Komplexes unter Nutzung der Komplexbildungseigenschaften der Diaminogruppe am Fluorophor und der Diaminogruppe an der Oberfläche ein Zustand erreicht, bei dem der Fluorophor in einer geometrischen Anordnung nahe an der Oberfläche vorliegt.
Beispiel 4
Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-SfCH^∑-ss-oligo-FP
Die alternative Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP gliedert sich in 2 Teilabschnitte, nämlich der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten bifunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt).
Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1 : die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2- S-S-(CH2)2-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist ein modifizierter Fluorophor und eine Ethylendiamin-Gruppe (vgl. Beispiel 2) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5x10"5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 0,5 - 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S- (CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au- Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy- mercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
Anschließend wird die so modifizierte Gold-Oberfläche mit einer ca. 10"5 bis 10"1 molaren Diaminothiol-Verbindung (oder anderen geeigneten Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge wie z.B. als Aktivester aktivierte Mercaptopropionsäure, an die anschließend eine Triamino-Gruppe angekoppelt wird) komplett benetzt und 0,5 - 24 h inkubiert. Die freie Thiolverbindung belegt die nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold- Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S Bindung.
Anschließend wird durch Zugabe von löslichen Nickel-Salzen (z.B. Ni (II) Chlorid) oder anderen geeigneten Metall-Ionen (wie z.B. Kupfer) ein Zustand erreicht, bei dem der Fluorophor in einer geometrischen Anordnung nahe an der Oberfläche vorliegt (vgl. Beispiel 4).
Beispiel 5
Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP
Eine alternative Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP besteht in der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) ohne Nachbelegung. Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1 : die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2- S-S-(CH2)2-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist ein modifizierter Fluorophor und eine Bipyridyl-Gruppe (vgl. Beispiel 2) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5x10"5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 0,5 - 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S- (CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au- Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy- mercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
Die am Fluorophor oder in dessen Nähe angebrachte Bipyridyl-Gruppe geht mit der unmodifizierten Goldoberfläche eine Wechselwirkung ein, wodurch eine geometrische Anordnung erreicht wird, bei der der Fluorophor nahe an der Oberfläche vorliegt.
Beispiel 6
Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP
Eine weitere alternative Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP besteht in der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) ohne Nachbelegung.
Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1 : die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2- S-S-(CH2)2-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist ein modifizierter Fluorophor und eine Alkylkette (z.B. als Fettsäureeinheit, vgl. Beispiel 2) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5x10"5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 0,5 - 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy- mercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
Alternativ dazu kann die Goldoberfläche auch durch Koadsorption (vgl. Beispiel 3) oder Nachbelegung (vgl. Beispiel 4) mit hydrophoben Alkylthiolen (z.B. Propanthiol oder anderen Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge) entsprechend hydrophob modifiziert werden.
Die am Fluorophor oder in dessen Nähe angebrachte Fettsäureeinheit geht mit der hydrophoben Goldoberfläche Wechselwirkungen ein, wodurch eine geometrische Anordnung erreicht wird, bei der der Fluorophor nahe an der Oberfläche vorliegt.
Beispiel 7
Fluoreszenz-Intensitätsmessungen am System Au-ss-oligo-Fluorescein bzw. am System Au-ds-oligo-Fluorescein in Gegenwart von flüssigen Medien
Die Sonden-Oberfläche wird analog zu den Beispielen 3 - 6 hergestellt. Dazu wird ein modifiziertes Oligonukleotid der Sequenz 5'-Fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' [C3-S-S-C3-OH] auf Gold immobilisiert (50 μmol Oligonukleotid in Phosphat-Puffer (K2HPO4/KH2PO4 500 mM, pH 7) und in der Form Au-S(CH2)2-ss-oligo-Fluorescein die Fluoreszenzintensität der Oberfläche mit einem Fluoreszenz-Scanner der Firma Lavision Biotech bestimmt. Zur Messung der Fluoreszenz in Gegenwart von flüssigen Medien werden 150 μl des Mediums auf die Goldoberfläche gegeben und anschließend mit einem Deckglas abgedeckt. Alternativ können auch Hybriwells oder Imaging Chambers verwendet werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten (201) besteht und wobei die Ligaten (201) durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor (102) modifiziert sind, wobei der Fluorophor mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht, b) Bereitstellen einer Probe mit Liganden, c) Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, d) Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors (102), e) Vergleich der in Schritt d) detektierten Fluoreszenzintensität mit Referenzwerten.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei nach Schritt a) und vor Schritt c) der Schritt
b3) erste Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors (102)
durchgeführt wird und in Schπtt e) die in Schritt d) erhaltenen Werte mit den in Schritt b3) erhaltenen Referenzwerten verglichen werden.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei als Schritt a) der Schritt
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens zwei Arten von modifizierten Ligaten (201) besteht und die verschiedenen Arten von modifizierten Ligaten (201) in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden sind und wobei die Ligaten (201) durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind, wobei der Fluorophor (102) mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht,
durchgeführt wird, nach Schritt b) und vor Schritt c) die Schritte b-i) Zusatz von einem Liganden zu der Probe, wobei der Ligand ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante eines in einem bestimmten Bereich T10o an die Oberfläche gebundenen modifizierten Ligaten (201) ist, wobei der Ligand in einer Menge zugegeben wird, die größer ist als die Menge an Liganden, die notwendig ist, um die modifizierten Ligaten (201) der T10o- Sites vollständig zu assoziieren
und
b3) erste Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors (102)
durchgeführt werden und in Schritt e) die in Schritt d) erhaltenen Werte mit dem in Schritt b3) für den Bereich T100 erhaltenen Wert und den in Schritt b3) erhaltenen Referenzwerten verglichen werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei als Schritt a) der Schritt
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens drei Arten von modifizierten Ligaten (201) besteht und die verschiedenen Arten von modifizierten Ligaten in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden sind, wobei wenigstens eine Art von modifiziertem Ligat (201) in einem bestimmten Bereich T0 an die Oberfläche angebunden ist, und wobei in der Probe kein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu diesem modifizierten Ligaten enthalten ist sind und wobei die Ligaten durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor (102) modifiziert sind, wobei der Fluorophor (102) mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht,
durchgeführt wird und in Schritt e) die in Schritt d) erhaltenen Werte mit dem in Schritt b3) für den Bereich T100 erhaltenen Wert, mit dem in Schritt b3) für den Bereich T0 erhaltenen Wert und mit den in Schritt b3) erhaltenen Referenzwerten verglichen werden.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei vor Schritt c) der Schritt b2) Zusatz von wenigstens einer weiteren Art von Ligand zu der Probe, wobei der Ligand in der in Schritt b) bereitgestellten Probe nicht enthalten ist und der Ligand eine Assoziationskonstante >0 zu einem in einem bestimmten Bereich Tn an die Oberfläche gebundenen modifizierten Ligaten aufweist, wobei der Ligand in einer Menge zugegeben wird, dass nach Schritt c) n% der modifizierten Ligaten in dem Bereich Tn in assoziierter Form vorliegen
durchgeführt wird und in Schritt e) die in Schritt d) erhaltenen Werte mit dem in Schritt b3) für den Bereich Tι00 erhaltenen Wert, mit dem in Schritt b3) für den Bereich T0 erhaltenen Wert, mit den in Schritt b3) für die Bereiche Tn erhaltenen Werten und mit den in Schritt b3) erhaltenen Referenzwerten verglichen werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Fluorophor (102) durch Anbindung wenigstens einer chemischen Gruppe (206) modifiziert ist, die mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ligaten (201) zusätzlich durch Anbindung wenigstens einer chemischen Gruppe modifiziert sind, die mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die modifizierte Oberfläche zusätzlich durch Anbindung von chemischen Gruppen (207) modifiziert ist, wobei die an die Oberfläche gebundenen chemischen Gruppen (207) mit den an den Ligaten (201) angebundenen chemischen Gruppen eine reversible Bindung eingehen.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die modifizierte Oberfläche zusätzlich durch Anbindung von chemischen Gruppen (207) modifiziert ist, wobei die an die Oberfläche gebundenen chemischen Gruppen (207) mit dem Fluorophor (102) eine reversible Bindung eingehen.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die an die Oberfläche gebundenen chemischen Gruppen (207) mit den an den Fluorophor gebundenen chemischen Gruppen (206) eine reversible Bindung eingehen.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Fluorophor durch Anbindung wenigstens einer Bipyridyl-Gruppe oder durch Anbindung wenigstens einer Diamino-Gruppe modifiziert ist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Ligat zusätzlich durch Anbindung wenigstens einer Bipyridyl-Gruppe oder durch Anbindung wenigstens einer Diamino-Gruppe modifiziert ist.
13. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 12, wobei die modifizierte Oberfläche zusätzlich durch Anbindung von Diamino-Gruppen modifiziert ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei nach Schritt a) und vor Schritt c) der Schritt
a-i) Inkontaktbringen einer Lösung eines Kupfer(ll)- oder Nickel(ll)-Salzes mit der modifizierten Oberfläche
durchgeführt wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Fluorophor (102) Texas Red, ein Rhodamin-Farbstoff, insbesondere Rhodamin G6 (Basic Red 1),
Fluorescein (Resorcinphtalein), oder ein Cyaninfarbstoff, insbesondere 5,5 -disulfo- 1 , di(-carbopentenyl)-3,3,3\3 etramethyl-indodicarbocyanin (Cy3™) oder 5,5\7,7"- tetrasulfo-1 , 1 "d -carbopenteny -S.S^.S'-tetramethyl-benzindodicarbocyanin (Cy5™) verwendet wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der modifizierten Oberfläche um eine wenigstens eine Modifikation tragende Oberfläche aus einem Metall oder einer Metalllegierung handelt, insbesondere aus einem Metall ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gold, Silber, Kupfer und deren Mischungen.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Liganden Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme und als Ligaten Proteine oder Enzyme verwendet werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei als Liganden Antikörper und als Ligaten Antigene verwendet werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei als Liganden Antigene und als Ligaten Antikörper verwendet werden.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei als Liganden Rezeptoren und als Ligaten Hormone verwendet werden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei als Liganden Hormone und als Ligaten Rezeptoren verwendet werden.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei als Liganden Nukleinsäure- Oligomere und als Ligaten dazu komplementäre Nukleinsäure-Oligomere verwendet werden.
23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die als Ligaten verwendeten Nukleinsäure- Oligomere 3 bis 70 Basen, insbesondere 5 bis 60 Basen, besonders bevorzugt 10 bis 50 Basen, insbesondere bevorzugt 12 bis 40 Basen umfassen.
24. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 23 umfassend eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten (201) besteht, wobei die Ligaten (201) durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor (102) modifiziert sind und wobei der Fluorophor (102) mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht.
25. Kit nach Anspruch 24, wobei wobei der Fluorophor (102) durch Anbindung wenigstens einer chemischen Gruppe (206) modifiziert ist, die mit der modifizierten Oberfläche eine reversible Bindung eingeht.
26. Kit nach Anspruch 24 oder 25, wobei der Kit zusätzlich ein Kupfer(ll)- oder Nickel(ll)- Salz oder eine Lösung eines Kupfer(ll)- oder Nickel(ll)-Salzes umfasst.
27. Kit nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei der Kit zusätzlich Referenzwerte zum Vergleich mit den bei der Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors (102) in einem
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 23 erhaltenen Werten umfasst.
28. Kit nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei die modifizierte Oberfläche wenigstens einen Bereich T0 und wenigstens einen Bereich T100 umfasst.
29. Kit nach Anspruch 28, wobei die modifizierte Oberfläche zusätzlich wenigstens einen Bereich Tn umfasst.
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