DE10306992A1

DE10306992A1 - Verfahren zur quantitativen Messung von Liganden in der Probe gelöster Bindungsproteine

Info

Publication number: DE10306992A1
Application number: DE10306992A
Authority: DE
Inventors: Christian J. Dr. Strasburger; Martin Dr. Bidlingmaier; Zida Wu
Original assignee: KLINIKUM DER UNI MUENCHEN GROS; Klinikum Der Universitat Muenchen Grosshadern-Innenstadt
Current assignee: KLINIKUM DER UNI MUENCHEN GROS; Klinikum Der Universitat Muenchen Grosshadern-Innenstadt
Priority date: 2003-02-19
Filing date: 2003-02-19
Publication date: 2005-08-11
Also published as: WO2004074840A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Ligangen in der Probe gelöster oder suspendierter Bindungsproteine unter Verwendung spezifischer Antikörper, in dem Verfahren verwendbare Antikörper, Arzneimittel, Diagnostika sowie (Diagnostik-)Kits, enthaltend diese Antikörper, die Verwendung dieser Antikörper bei der quantitativen Analyse und in ausgewählten Indikationen sowie Verfahren zu deren Herstellung.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Liganden in der Probe gelöster oder suspendierter Bindungsproteine unter Verwendung spezifischer Antikörper, in dem Verfahren verwendbare Antikörper, Arzneimittel, Diagnostika sowie (Diagnostik-)Kits enthaltend diese Antikörper, die Verwendung dieser Antikörper bei der quantitativen Analyse und in ausgewählten Indikationen für therapeutische Zwecke sowie Verfahren zu deren Herstellung.
Die quantitative Bestimmung bestimmter chemischer Verbindungen aus einer Probe und insbesondere einer physiologisch in Körperflüssigkeiten – wie z.B. dem Blut – auftretenden Verbindung ist ein wichtiges diagnostisehes Hilfsmittel der Medizin. Viele dieser physiologischen Verbindungen, wie z.B. Hormone und andere Botenstoffe, binden spezifisch an sogenannte Bindungsproteine oder auch Rezeptoren, die vielfach selbst in der Flüssigkeit – wie z.B. dem Blut – gelöst oder suspendiert sind. Damit besteht aber beispielsweise die Gefahr, daß sich vor oder während der Bestimmung ein Komplex aus zu messender Verbindung (Ligand) und Bindungsprotein bildet und somit der Ligand einer Messung entzogen wird oder daß das Bindungsprotein zu Zwecken der Messung zugesetzten markierten Liganden der Messung entzieht. Damit kommt es häufig zu einer deutlichen Interferenz des Bindungsproteins in der quantitativen Messung und damit der Diagnostik. Ein besonders plakatives und wichtiges Beispiel für die Gefahr einer solchen Interferenz des Bindungsproteins ist die quantitative Bestimmung humanem Wachstumshormons.
Wachstumshormon (human growth hormone, hGH) ist ein Eiweißhormon, das von der Himanhangdrüse sezerniert wird. Neben der Bedeutung, die Wachstumshormon für das Längenwachstum von Kindern und Jugendlichen hat, ist es während des gesamten Lebens für die Regulation einer Vielzahl von Stoffwechselvorgängen essentiell. Bei Kindern und Erwachsenen gibt es Erkrankungen, bei denen die physiologische Regulation der Wachstumshormonsekretion gestört ist. Zu erwähnen sind insbesondere der Wachstumshormonmangel und de Wachstumshormonexzeß. Die Bestimmung der Konzentration von Wachstumshormon in Serumproben ist ein wesentliches diagnostisehes Werkzeug und wird daher in vielen medizinischen Laboratorien durchgeführt.
In der Regel werden für die Analyse der Wachstumshormonkonzentration sogenannte Immunoassays benutzt. Diese beruhen auf dem Prinzip der Interaktion von spezifischen Antikörpern mit einem Analyten. Es werden wahlweise auch kompetitive Assays verwendet (wie der Radioimmunoassay, RIA), bei denen markiertes Wachstumshormon mit dem in der Probe vorhandenen Wachstumshormon um die Bindung an einen Antikörper konkurriert und somit ein zur Konzentration des zu messenden Analyten umgekehrt proportionales Signal entsteht. Am häufigsten jedoch werden inzwischen Sandwich-Immunoassays eingesetzt, bei denen ein immobilisierter spezifischer Antikörper den Analyten bindet („Fangantikörper"), und ein zweiter, gegen ein unterschiedliches Epitop des Analyten gerichteter markierter Antikörper dann den nun immobilisierten Analyten bindet. Hierdurch entsteht ein Signal, das proportional zur Menge des gebundenen Analyten ist. Das bekannteste Beispiel dieser Meßmethode ist der „enryme linked immuno sorbent assay" (ELISA) mit einem kolorimetrischen Endpunkt, da regelmäßig das zur Messung nötige Photometer vorhanden ist. Andere Möglichkeiten der Signalgeneration sind Radioaktivität, Chemilumineszenz oder (zeitaufgelöste) Fluoreszenz.
Allen oben genannten Assaytechniken liegt das Prinzip der hochaffinen, spezifischen Bindung zwischen einem gegen ein bestimmtes Hormon – in diesem Fall Wachstumshormon – gerichteten Antikörper und dem Hormonmolekül in der zu analysierenden Probe zugrunde. Vergleichende Untersuchungen haben nun ergeben, daß bei der Messung von Wachstumshormon einer Probe in verschiedenen Laboratorien mit unterschiedlichen Methoden extrem starke Diskrepanzen für die in dieser Probe ermittelten Konzentrationen auftreten (1, 2, 5). Dies zeigt sich im übrigen auch regelmäßig bei den zentralen Ringversuchen der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie.
Zur Diagnose eines Wachstumshormonmangels werden die Ergebnisse verschiedener Stimulationstests herangezogen. Bei diesen Tests wird nach Stimulation der Wachstumshormonsekretion über einen Zeitraum von 1 bis 2 Stunden im Abstand von 15 bis 30 Minuten Blut entnommen und aus den Proben die Wachstumshormonsekretion bestimmt. Steigt die Waehstumshormonkonzentration in zwei unabhängigen Tests nicht über einen arbiträren, aber traditionell – z.B. in der Kinderheilkunde – bei ca. 10 ng/ml definierten „cut-off" -Wert an, gilt die Diagnose „Wachstumshormonmangel" als sehr wahrscheinlich und die Krankenkassen erstatten in der Regel die nachfolgenden Therapiekosten. Diese Kosten einer – potentiell lebenslänglich fortzuführenden – Therapie mit rekombinantem Wachstumshormon sind erheblich.
Durch die extremen Diskrepanzen der Wachstumshormonkonzentration, die bei Verwendung unterschiedlicher Methoden ermittelt wird, wird eine einheitliche, korrekte Diagnosestellung ungewöhnlich erschwert: Das Erreichen des „cut-off" -Wertes in einem Stimulationstest hängt wesentlich von dem Labor ab, in dem die Proben eines bestimmten Patienten gemessen werden bzw. von der dort verwendeten Methode. Dies hat erhebliche ökonomische Auswirkungen, jedoch auch Folgen, die die Patienten direkt betreffen: So können je nach Meßverfahren einzelne Patienten überflüssiger Weise einer Hormonersatztherapie unterzogen werden, während diese anderen – tatsächlich betroffenen Patienten – vorenthalten wird.
Zu dieser extremen Diskrepanz der Meßwerte tragen nach bisherigem Wissen verschiedene Faktoren bei, die jedoch alle in spezifischer Weise auf die oben erwähnte Interaktion zwischen Antigen (Wachstumshormon) und Antikörper einwirken: Wachstumshormon, das von der menschlichen Himanhangdrüse produziert wird, ist keine vollkommen homogene Substanz, sondern besteht aus verschiedenen Isoformen. Gerade wegen der hohen Spezifität, insbesondere der monoklonalen Antikörper, für ein genau definierbares Segment (Epitop) auf der Oberfläche des Wachstumshormonmoleküls sind nun Unterschiede in deren Reaktionsvermögen mit den diversen Isoformen des Hormons zu erwarten. Daher werden in den verschiedenen Assays je nach Epitop-Spezifität der verwendeten Antikörper unterschiedliche Anteile dieses Isoformspektrums mitgemessen. Auch aus diesem Grund spielt die Art des verwendeten Kalibrators (Standards) des jeweiligen Assays eine entscheidende Rolle: Die immer noch verwendete „Internationale Referenz-Präparation 80/505" ist eine aus humanen Hypophysen extrahierte Präparation, die ebenfalls aus verschiedenen Isoformen besteht, während die neuere „Intemationale Referenz-Präparation 88/624" rekombinanten Ursprungs ist und in reiner Form aus der 22000 Dalton großen Hauptisoform von Wachstumshormon besteht.
Der wesentliche Störfaktor für die Messung von Wachstumshormon, auf den sich die hier beschriebene Erfindung bezieht, ist das Vorhandensein eines hochaffnen Wachstumshormon-Bindungsproteins (hGH binding protein, hGHBP) in humanem Serum (2–4). Der Effekt dieses Bindungsproteins auf das Meßergebnis kann je nach verwendetem Assayprinzip (kompetitiver Assay oder Sandwich-Assay) zu falsch hohen oder falsch niedrigen Werten führen. Beim kompetitiven Assay kann einerseits markiertes hGH (als sogenannter „Tracer") durch das Bindungsprotein gebunden und somit dem Assayansatz entzogen werden, was zu falsch hohen Konzentrationsangaben führt. Andererseits kann das Bindungsprotein aber auch sterisch die Interaktion des spezifischen Antikörpers mit den Wachstumshormonmolekülen aus einer Serumprobe behindern und somit ebenfalls zu falsch niedrigen Konzentrationen im kompetitiven Assay führen. Hingegen führt diese sterische Behinderung der Interaktion zwischen Antikörper und Hormon beim Sandwich-Immunoassay in der Flegel zu falsch niedrigen Resultaten, da weniger Hormon oder weniger Detektionsantikörper gebunden wird. Besonders relevant wird der durch diesen Störfaktor entstehende Fehler bei den Meßergebnissen unter bestimmten physiologischen oder pathologischen Bedingungen, die mit einer Veränderung der hGHBP-Konzentration im Blut einhergehen, wie z.B. Schwangerschaften, in deren Verlauf es zu einem Anstieg des hGHBP kommt.
In Fachkreisen wird seit Jahren über das Problem der Variabilität der hGH-Messungen und die daraus folgenden Probleme bei der Diagnosestellung diskutiert. Lösungsansätre betreffen einerseits eine Vereinheitlichung des zu verwendenden Kalibrators, andererseits den Versuch, durch die Auswahl von Antikörpern, die hauptsächlich die 22000 Dalton große Hauptisoform von hGH erkennen, wenigstens hinsichtlich der gemessenen hGH-Isoform eine Homogenität der Assays herzustellen. Bislang sind jedoch keine Ansätze zur Lösung des Problems der Interferenz von hGHBP publiziert worden. Bei anderen Hormonen sowie anderen körpereigenen Substanzen werden vor Analyse, beispielsweise in einem Immunoassay, Ex traktionsverfahren angewendet, um die Bindungsproteine zu eliminieren, was jedoch einen erheblichen methodischen Mehraufwand bedeutet und zu erheblichen Meßungenauigkeiten führen kann. Insgesamt gibt es aber im Stand der Technik noch keine befriedigende Lösung der Problematik löslicher Bindungsproteine in zu analysierenden Proben.

Es ist daher Aufgabe der im folgenden beschriebenen Erfindung, die Interferenz von in der Probe mitgelöstem oder -suspendiertem Bindungsproteinen in quantitativen Messungen von deren Liganden auf einfache Art auszuschalten. Dieses geschieht durch eine Technik, mit deren Hilfe diese Testsysteme, insbesondere alle derzeit existierenden Assays für Wachstumshormon, unanfälliger für den Störfaktor des in bspw. Serumproben stets vorhandenen Bindungsproteins – wie hGHBP – gemacht werden können.

Daher ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines Liganden eines Bindungsproteins in einer Liganden und Bindungsprotein in gelöster oder suspendierter Form enthaltenden Probe, bei der der zu messenden Probe ein Antikörper A gegen das Bindungsprotein, der gegen die Bindungsstelle des Liganden auf dem Bindungsprotein gerichtet ist, zugesetzt wird.

Dabei zeigte es sich, daß die Bindung des spezisch gegen das Bindungsprotein gerichteten Antikörpers A an das Bindungsprotein exakt dort, wo auch der Ligand bindet, zu einer Verdrängung der Wachstumshormonmoleküle (Ligand) aus ihrer Bindung an hGHBP führt und dabei auch eine erneute Bindung des Liganden verhindert. Diese Verdrängung fällt natürlich umso stärker aus, je größer die Menge zugesetzten Antikörpers A, insbesondere im Verhältnis zum Bindungsprotein, ist, so daß meist ein großer Überschuß an Antikörper günstig ist. Das so "freigesetzte" Wachstumshormon kann nun ohne sterische Hemmung durch das Bindungsprotein quantitativ gemessen werden. Da der „Anti-Bindungsprotein- Antikörper" A selber nicht mit den zur Messung vom Liganden (bspw. hGH) evt. verwendeten „Anti-Liganden-Antikörpern" B interferiert, entfällt auch die Notwendigkeit einer vorgeschalteten Entfernung der Antikörper-A/Bindungsprotein-Komplexe aus der Probe. Vorteilhafterweise kann die Probe, abgesehen vom Zusatz des Antikörpers A und einer evtuellen Vorinkubation, genauso eingesetzt werden, wie für den jeweiligen Assay vom Hersteller beschrieben.

Unter Bindungsprotein im Sinne dieser Erfindung sind alle Proteine zu verstehen, die mit hoher Affinität einen hier zu messenden Liganden binden können. Die hier relevanten Bindungsproteine sind meist löslich bzw. liegen in der Probe als Suspension vor. Beispiele sind bestimmte lösliche Rezeptoren oder beispielsweise im Cytosol oder Blut auftretende Hormonbindungsprotein, wie Wachstumshormonbindungsprotein.

Unter „Ligand" im Sinne dieser Erfindung sind Verbindungen zu verstehen, die mit hoher Affinität an ein Bindungsprotein binden und deren Konzentration in bestimmten Assays gemessen werden kann und beispielsweise für medizinische Zwecke auch gemessen wird. Beispiele sind Botenstoffe, wie Hormone, Transmitter, bspw. Neurotransmitter, extrazelluläre Signalpeptide oder -proteine, Cytokine, Chemokine, Lymphokine etc.

Unter „Probe" im Sinne dieser Erfindung ist jede Art von zu untersuchender Lösung zu verstehen, insbesondere aber Lösungen medizinisch relevanter Substanzen, wie z.B. Blut, Lymphe, Serum, Urin, Liquor, auch in für die Probenbearbeitung aufbereiteter Form.

Unter „in gelöster oder suspendierter Form" ist im Sinne dieser Erfindung jede Form von Lösung des Bindungsproteins oder des Liganden im weiteren Sinne im Lösungsmittel zu verstehen. Damit sind auch Situationen umfaßt, in denen beispielsweise das Bindungsprotein am Rand oder jenseits des Ausfallens ist, aber eben doch noch Bestandteil der Lösung ist.

„Antikörper" sind im Sinne dieser Erfindung durch Vertebraten oder künstlich hergestellte Proteine oder evt. andere Strukturen, die mit hoher Affinität an eine bestimmte Oberflächenkonfirmation (Epitop) eines Antigens, also eines anderen Moleküls, binden, vorzugsweise mono- oder polyklonale (Teil)strukturen von Immunglobulinen (bspw. IgG, IgA, IgD, IgE) oder auch polyklonal monospezifische Antikörper. Typischerweise enthalten derartige Antikörper zumindest den variablen Teil von Immunglobulinen, ggf. auch mindestens eine Domäne des konstanten Teils von Immunglobulinen. In diesem Sinne sind bspw. auch F(ab)₂-Fragmente Antikörper im Sinne der vorliegenden Erfindung.

Dabei bedeutet ein Antikörper gegen das Bindungsprotein, der gegen die Bindungsstelle des Liganden auf dem Bindungsprotein gerichtet ist, daß der Antikörper als bindendes Epitop spezifisch die Bindungsstelle des Liganden auf dem Bindungsprotein mit hoher Affinität bindet.

Unter „quantitativer Bestimmung" ist generell jede dem Fachmann bekannte Art der Messung der Menge eines gelösten Analyten in einer Probe zu verstehen. Explizit gemeint ist damit z.B. die Quantifizierung über chromatographische Methoden mit einem mitlaufenden Standard und insbesondere die über die hochaffine Wechselwirkung zwischen Antikörper und Ligand (Antigen) erfolgende Quantifizierung durch kompetitive Assays oder Bindungsassays, wie z.B. einen Sandwich-Assay auch im ELISA-Format. Ein besonderer Vorteil dieser Erfindung ist es, daß das vorgestellte Verfahren des Antikörperzusatzes mit praktisch jedem bekannten – insbesondere kommerziell erhältlichen – Testkit bzw. Testsystem zur quantitativen Analyse des jeweiligen Analyten (Liganden) ohne größeren Aufwand kombiniert werden kann.

Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn in dem erfindungsgemäßen Verfahren der Antikörper A vor oder während, vorzugsweise vor, der quantitativen Bestimmung zugesetzt wird und/oder mit der Probe inkubiert wird.

Dabei versteht man unter Inkubation eine Reaktionsbedingung, bei der Reaktionspartner, hier Antikörper A und Bindungsprotein sowie sekundär auch der Ligand, miteinander eine Reaktion eingehen können. Die Inkubation ist meist zeitlich begrenzt, hier beispielsweise 6, 12, 18 oder 24 h. Insbesondere ist hier unter Inkubation die Vorinkubation – beispielsweise über 6, 12, 18 oder 24 h – zu verstehen, die vor Beginn der quantitativen Messung (beispielsweise mit einem kommerziell erhältlichen Testkit) erfolgt.

Ebenso ist es bevorzugt, wenn die im erfindungsgemäßen Verfahren gemessene Probe Körperflüssigkeit, vorzugsweise humane Körperflüssigkeit, insbesondere Blut bzw. humanes Blut, enthält.

Unter Körperflüssigkeit versteht man jede aus dem Körper eines Vertebraten, insbesondere eines Säugetieres, insbesondere eines Menschen gewonnene Flüssigkeit. Das wäre im Falle des Menschen beispielsweise Blut, Urin oder Lymphe, aber auch cytosolische Präparationen aus menschlichen Zellen.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Ligand ein physiologischer Ligand des physiologischen Bindungsproteins.

Die erfindungsgemäße Methode ist auch dann sinnvoll, wenn Ligand und/oder Bindungsprotein von außen (exogen) zugesetzt wurde, z.B. also nach Injektion oder anderweitiger Aufnahme von rekombinantem hGH bei Patienten oder Probanden. Damit besteht die Möglichkeit, ein erfindungsgemäßes Verfahren etwa zur Analyse von Proben bei Verdacht auf Do ping (z.B. im Hochleistungssport) mit hGH oder anderen Hormonen Beispiele für Liganden im Sinne der vorliegenden Erfindung einzusetzen, um nach erfindungsgemäßer Quantifizierung der bspw. hGH-Konzentration in der Probe (ohne verfälschende Einflüsse des/der jeweiligen Bindungsproteins/e) Dopingverdacht ausschließen oder begründen zu können. Auch bei pharmakokinetischen Analysen stören die Bindungsproteine, so daß auch diesbezüglich das künstlich zugeführte hGH gebunden wird, und damit Resultate zur bspw. hGH-Konzentration durch die Anwesenheit von Bindungsprotein verfälscht wird. Eine erfindungsgemäße Vorgehensweise kann auch in diesen Fällen Abhilfe schaffen.

Unter einem physiologischen Liganden ist ein Ligand im oben angegebenen Sinne zu verstehen, der ohne von außen zugesetzt zu sein im Körper eines Vertebraten insbesondere in einer Körperflüssigkeit auftritt. Entsprechendes gilt für das physiologische Bindungsprotein, wobei dieses auch der natürliche unter physiologischen Bedingungen auftretende Bindungsprotein des physiologischen Liganden ist.

Werter ist es bevorzugt, wenn das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Bindungsprotein löslich, vorzugsweise ein löslicher Rezeptor oder ein Hormonbindungsprotein, insbesondere ein Hormonbindungsprotein, ist.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Ligand eine peptidische Verbindung und/oder ein Hormon, vorzugsweise ein peptidisches Hormon, insbesondere ein Wachstumshormon.

Dabei versteht man unter peptidisch jede Verbindung, deren Bestandteile überwiegend über eine peptidische Bindung R1-NH-C(O)-R2 miteinander verknüpft sind.

Unter Hormon versteht man einen chemischen Botenstoff, der in Abstand zu seinem Synthese- und Freisetzungsort wirkt. Dabei werden Hormone vorzugsweise von endokrinen Drüsen, bspw. Hypophyse, Keimdrüsen oder Epiphyse, hergestellt. Beispiele sind Wachstumshormon oder luteinisierendes Hormon LTH, Insulin, Melatonin, Glucagon, Gastrin, Angiotensin, Substanz P, Interleukine, Vasopressin, Endorphine, Enkephaline, Relaxin oder der atrionatriuretische Faktor. Hormonbindungsproteine sind entsprechend Bindungsproteine (s.o.), die affin Hormone binden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Ligand humanes Wachstumshormon (human Growth Hormon/hGH) und das Bindungsprotein humanes Wachstumshormon-Bindungsprotein (human Growth hormon binding protein/hGHBP) und der Antikörper A ist gegen die Bindungsstelle des hGH auf dem hGHBP gerichtet.

Besonders bevorzugt ist es auch, wenn der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Antikörper A ein monoklonaler Antikörper bzw. ein single-chain Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, ist. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn der verwendete Antikörper A ZMC1 ist. ZMC1 ist ein monoklonaler Antikörper, der gegen die Bindungsstelle des humanen Growth hormones (hGH) auf dem humanen Growth hormone binding protein (hGHBP) gerichtet ist und wurde im Rahmen der Erfindung zur Lösung der Aufgabe optimiert. Dieser wurde mit Eingang vom 21. Januar 2003 anmelderseitig unter der Nummer DSM ACC2582 (vom Hinterleger zugeteiltes Bezugszeichen: ZMC1) nach Maßgabe des Budapester Vertrags bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) in Braunschweig (Deutschland, Maschenroder Weg 1b, 38124 Braunschweig) in lebensfähiger Form hinterlegt.

Dabei versteht man unter monoklonal insbesondere das Produkt eines künstlichen Konstrukts, in welchem eine Antikörper-produzierende Zelle (B-Zelle) mit einer immortalisierten Krebszelle fusioniert wird (Hybridom), was zu einer Hybridomzelle führt. Daraus sind spezifische Antikörper zu gewinnen, die alle ausschließlich auf ein Epitop gerichtet sind.

Werter ist es bevorzugt, wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die quantitative Bestimmung des Liganden unter Ausnutzung der Bindung des Liganden als Antigen an einen, vorzugsweise monoklonalen, Antikörper B erfolgt. Dabei ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn die quantitative Bestimmung über einen kompetitiven Bindungstest, vorzugsweise einen „radio-immuno assay" (RIA), erfolgt. Genauso günstig ist es auch, wenn die quantitative Bestimmung durch Messung eines in Abhängigkeit von der Konzentration des zu messenden Liganden ansteigenden Meßparameters erfolgt, vorzugsweise durch einen enzyme-linked immuno sorbent Assay (ELISA) und/oder durch einen entsprechenden Sandwich-Assay.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vor der quantitativen Bestimmung keine Abtrennung des Bindungsproteins aus der zu messenden Probe durchgeführt. Darunter versteht man insbesondere, daß es bei der vorliegenden Erfindung unnötig ist, das Bindungsprotein vor der quantitativen Analyse der Probe aus dieser zu extrahieren, wie dies im Stand der Technik bei anderen Hormonen durchgeführt werden muß. Dabei ist praktisch jede Form von Extraktion denkbar, bei der der zu messende Ligand – wie beispielsweise das Hormon – in der Probe verbleibt, während das Bindungsprotein abgetrennt wird, z.B. durch Fällung und/oder Filtration mit bestimmten Molekülgewichtsausschlußgrenzen, chromatographische Methoden, wie z.B. Affinitätschromatographie oder HPLC, Dialyse bei bestimmten Ligandengrößen etc. Aber genau darauf kann vorzugsweise bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens verzichtet werden, da durch die Wahl des Antikörpers A weder dieser noch der Komplex aus Antikörper A und Bindungsprotein an den zu messenden Liganden bindet und damit die Mes sung nicht mehr behindert oder verfälscht wird, auch wenn das komplexierte Bindungsprotein in der Probe verbleibt. Daran ändert auch der Einsatz hochaffiner Antikörper B zur quantitativen Messung nichts, da diese an den zu messenden Liganden und nicht den Antikörper A, das Bindungsprotein oder den Komplex aus beiden binden.

Dieser Vorteil tritt insbesondere bei einem besonders günstigen und bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren auf, bei dem der Antikörper A so zugegeben wird, daß der Antikörper A in der Probe nach Zugabe in einer höheren Konzentration als das Bindungsprotein vorliegt, vorzugsweise in einer mindestens um 50%, insbesondere mindestens um 100%, vorzugsweise mindestens um 200%, insbesondere mindestens um 400% höheren Konzentration.

Gerade diese Zugabe des Antikörpers A im Überschuß zum Bindungsprotein ist besonders günstig, da bei ausreichendem Überschuß des Antikörpers A sowohl alle Liganden aus dem Bindungsprotein vollständig verdrängt und somit meßbar werden, als auch das Bindungsprotein quantitativ komplexiert wird und damit bei der Bestimmung nicht mehr interferiert.

Die genaue, richtige und ausreichende Menge an spezifischem Antikörper A, die der Probe zur möglichst interferenzfreien quantitativen Messung des Liganden mindestens und evt. höchstens zugesetzt werden muß bzw. kann, kann vom Fachmann in wenigen einfachen Vorversuchen festgelegt werden. Die optimale Zugabe hängt natürlich von der Menge an Bindungsprotein in der Probe und evt. dem verwendeten quantitativen Testsystem ebenso ab wie möglicherweise von der Menge an zu messendem Liganden.

Die besonders bevorzugte Form des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von hGH unter Ausnutzung der affinen Bindung von hGH als Antigen an einen monoklonalen Antikör per B in einer humanes Blut enthaltenden Probe, in der hGH und hGHBP in gelöster oder suspendierter Form enthalten sind, bei der der zu messenden Probe der gegen die Bindungsstelle des hGH auf dem hGHBP gerichtete Antikörper A, vorzugsweise der hinterlegte monoklonale Antikörper ZMC 1, in deutlichem Überschuß gegenüber der Menge an hGHBP vor oder während, vorzugsweise vor, der quantitativen Bestimmung des hGH mittel Antikörper B zugesetzt wird und inkubiert wird.

Durch die Erfndung wird die Interferenz des Wachstumshormon-Bindungsproteins dadurch verhindert, daß ein spezifischer, gezielt gegen das Wachstumshormon-Bindungsprotein hergestellter und durch spezifische Experimente charakterisierter, vorzugsweise monoklonaler Antikörper, in hohem Überschuß zu der zu messenden Probe zugesetzt wird. Dieser monoklonale Antikörper (ZMC 1) wurde aufgrund seiner besonders bevorzugten Eigenschaft ausgewählt, daß er auf dem hGHBP-Molekül exakt dort bindet, wo das Wachstumshormonmolekül ebenfalls bindet. Hierdurch kommt es – wenn man den Antikörper im Überschuß zugibt – zu einer Verdrängung der Wachstumshormonmoleküle aus ihrer Bindung an hGHBP. Das so "freigesetzte" Wachstumshormon kann nun ohne sterische Hemmung durch das Bindungsprotein in jedem Immunoassay fur Wachstumshormon gemessen werden. Da der „Anti-Bindungsprotein-Antikörper" selber nicht mit den zur Messung von hGH verwendeten „Ant-Wachstumshormon-Antikörpern" interferiert, entfällt auch die Notwendigkeit einer vorgeschalteten Entfernung der Antikörper hGHBP-Komplexe aus der Probe. Praktisch wird der spezielle anti-hGHBP Antikörper ZMC 1 mit der hGH-verdrängenden Eigenschaft der Probe vor der Analyse zugesetzt und die Probe nach Vorinkubation, wie für den jeweiligen Assay vom Hersteller beschrieben, eingesetzt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Antikörper A gegen ein in Körperflüssigkeiten gelöstes oder suspendiertes physiologisches Bindungsprotein eines physiologischen Liganden, wobei der Antikörper A ge gen die Bindungsstelle des Liganden auf dem Bindungsprotein gerichtet ist.

Besonders bevorzugt ist es, wenn der erfindungsgemäße Antikörper A ein monoklonaler Antikörper und/oder ein single-chain Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, ist.

Der Begriff "Antikörper" umfaßt im vorliegenden Sinne allerdings sowohl polyklonale, insbesondere polyklonale monospezifische Antikörper (d.h. Antikörper mit verschiedenen variablen Regionen, die jedoch alle ein spezifisches Epitop erkennen), als auch monoklonale, chimärische Antikörper, anti-idiotypische Antikörper (gerichtet gegen erfindungsgemäße Antikörper), die alle in gebundener oder löslicher Form vorliegen und ggf. durch "Label" (bspw. Fluoreszenzmarker, Goldmarker, angekoppelte Enzyme) markiert sein können, sowie auch Fragmente der vorgenannten Antikörper. Neben den Fragmenten von erfindungsgemäßen Antikörpern in Alleinstellung können erfindungsgemäße Antikörper auch in rekombinanter Form als Fusionsproteine mit anderen (Protein)-Bestandteilen auftreten. Fragmente als solche oder Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern als Bestandteile von Fusionsproteinen werden typischerweise durch die Methoden enzymatischer Spaltung, der Protein-Synthese oder die dem Fachmann geläufigen Rekombinationsmethoden hergestellt. Als Antikörper werden nach der vorliegenden Erfindung also sowohl polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper bezeichnet.

Bei den polyklonalen Antikörpern handelt es sich um heterogene Mischungen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tieren hergestellt werden, die mit einem Antigen immunisiert worden sind. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im wesentlichen homogene Population von Anti körpern, die spezifisch gegen Antigene gerichtet sind, wobei die Antikörper im wesentlichen gleiche oder gleiche Epitop-Bindungsstellen aufweisen. Die verschiedenen Antikörpervarianten mit Monospezifität können den nachfolgend beschriebenen Immunglobulinklassen angehören, es kann sich also um Mischungen von verschiedenen Haupt- oder Subklas- sen handeln, bevorzugt handelt es sich um eine homogene Mischung von IgG-Antikörpern. Diese Homogenität kann durch einen zusätzliche Reinigungsschritt (Immunopräzipitation, Chromatographie, bspw. über gegen IgG gerichtete Antikörper), erreicht werden.

Monoklonale Antikörper können durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten werden (z. B. Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-397, (1975); US-Patent 4,376,110; Ausübel et al., Harlow und Lane "Antikörper": Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory (1988); Ausubel et al., (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)). Die in den vorgenannten Literaturstellen enthaltene Beschreibung wird als Bestandteil der vorliegenden Erfindung in die Offenbarung der vorliegenden Erfindung einbezogen.

Auch lassen sich gentechnisch manipulierte erfindungsgemäße Antikörper nach Verfahren, wie in den vorgenannten Druckschriften beschrieben, herstellen.

Erfindungsgemäße Antikörper können einer der folgenden Immunglobulinklassen angehören: IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und ggf. einer Unterklasse der vorgenannten Klassen, wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 oder IgGM. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG1/k oder IgG2b/k. Ein Hybridom-Zellklon, der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper produziert, kann in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung von großen Titern an monoklonalen Antikörpern erfolgt vorzugsweise in vivo oder in situ.

Bei den erfindungsgemäßen chimärische Antikörpern handelt es sich um Moleküle, die verschiedene Bestandteile enthalten, wobei diese sich aus verschiedenen Tierarten ableiten (z. B. Antikörper, die eine variable Region, die aus einem Mäuse-monoklonalen Antikörper abgeleitet ist, und eine konstante Region eines humanen Immunglobulins aufweisen): Chimärische Antikörper werden vorzugsweise eingesetzt, um einerseits die Immunogenizität bei der Anwendung zu reduzieren und andererseits die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, z.B. ergeben murine monoklonale Antikörper höhere Ausbeuten aus Hybridom-Zellinien, führen aber auch zu einer höheren Immunogenizität beim Menschen, so daß human/murine chimärische Antikörper vorzugsweise eingesetzt werden. Chimärische Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus dem Stand der Technik bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Sei. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al. Nature 312 643-646 (1984); Cabilly et al., EP-A-125023; Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., EP-A-171496; Morrion et al., EP A-173494; Neuberger et al., WO 86/01533; Kudo et al., EP-A-184187; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., WO 87/02671; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) und Har-low und Lane, Antikörper: A Laboratory Manual, wie oben zitiert. Diese Zitatstellen werden als zur Offenbarung gehörig in die vorliegende Erfindung einbezogen.

Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper ist ein Antikörper, der eine Determinante, die im allgemeinen mit der Antigenbindungsstelle eines erfindungsgemäßen Antikörpers assoziiert ist, erkennt. Ein antiidiotypischer Antikörper kann durch die Immunisierung eines Tieres der gleichen Art und des gleichen genetischen Typs (z.B. eines Mäusestamms) als Ausgangspunkt für einen monoklonalen Antikörper, gegen welchen ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper gerichtet ist, hergestellt werden. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers durch die Produktion eines Antikörpers, der gegen die idiotypischen Determinanten gerichtet ist (nämlich ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper), erkennen (U.S. 4,699,880). Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper kann auch als Immunogen eingesetzt werden, um eine Immunantwort in einem weiteren Tier hervorzurufen und um dort zur Produktion eines sog. antianti-idiotypischen Antikörpers zu führen. Der anti-anti-idiotypische Antikörper kann, muß aber nicht, bezüglich seiner Epitop-Konstruktion identisch mit dem originären monoklonalen Antikörper sein, der die anti-idiotypische Reaktion hervorgerufen hat. Auf diese Weise können durch die Verwendung von gegen idiotypische Determinanten eines monoklonalen Antikörpers gerichtete Antikörper andere Klone, die Antikörper von identischer Spezifität exprimieren, identifiziert werden.

Monoklonale Antikörper, die gegen ein in Körperflüssigkeiten gelöstes oder suspendiertes physiologisches Bindungsprotein eines physiologischen Liganden gerichtet sind, können eingesetzt werden, um die Bindung von anti-idiotypischen Antikörpern in entsprechenden Tieren, wie z. B. der BALB/c Maus, zu induzieren. Zellen aus der Milz einer solchen immunisierten Maus können verwendet werden, um anti-idiotypische Hybridom-Zellinien, die anti-idiotypische monoklonale Antikörper sekretieren, zu produzieren. Weiterhin können anti-idiotypische monoklonale Antikörper auch an einen Träger gekoppelt werden (KLH, "keyhole limpet hemocyanin") und dann verwendet werden, um weitere BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Die Sera dieser Mäuse enthalten dann anti-anti-idiotypische Antikörper, die die Bindungseigenschaften der originären monoklonalen Antikörper haben und spezifisch für ein in Körperflüssigkeiten gelöstes oder suspendiertes physiologisches Bindungsprotein eines physiologischen Liganden (s. bevorzugte Beispiele unten). Die anti-idiotypischen monoklonalen Antikörper haben auf diese Weise ihre eigenen idiotypischen Epitope oder "Idiotope", die strukturell mit dem zu untersuchenden Epitop ähnlich sind.

Die Bezeichnung "Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente derselben einschließen. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei dem Antigenkomplementären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Fab und F(ab')₂-Fragmente entbehren eines Fc-Fragments, wie etwa in einem intakten Antikörper vorhanden, so daß sie im Blutkreislauf schneller transportiert werden können und vergleichsweise weniger nicht-spezifische Gewebsbindung als intakte Antikörper aufweisen. Hierbei wird hervorgehoben, daß Fab und F(ab')₂ Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern bei einem erfindungsgemäßen Verfahren i.S. der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytisehe Spaltung hergestellt, indem Enzyme, wie z. B. Papain (zur Herstellung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab')₂, Fragmenten) verwendet werden, oder durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden.

Weiterhin kann ein erfindungsgemäßer Antikörper A auch weitere kovalent (oder nicht kovalent) angekoppelte Moleküle oder Gruppen aufweisen, bspw. eine Fluoreszenzmarkierung oder einen Label, bspw. einen Goldlabel, oder spezifische Epitope, die von Drittmolekülen erkannt werden können. Weiterhin kann ein erfindungsgemäßer Antikörper A auch bispezifisch sein, also mit seinen beiden Paratope unterschiedliche Epitope erkennen, vorzugsweise zwei verschiedene Epitope des gleichen Proteins oder Peptids (s.o.), ggf. können aber auch die beiden Paratope ihrer Struktur nach unterschiedlich sein, jedoch dasselbe Epitop oder zumindest überlappende Bereiche binden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Mischungen von erfindungsgemäßen Antikörpern im oben genannten Sinne, bspw. Mischungen monoklonaler Antikörper oder Mischungen von monoklonalen Antikörpern mit Antikörperfragmenten, Mischungen anti-idiotypischer Antikörper etc.

Es ist ebenfalls bevorzugt, wenn der o.g. Ligand, an dessen Bindungsstelle der erfindungsgemäße Antikörper A bindet, ein Peptid und/oder Hormon und/oder vorzugsweise humanem Ursprungs ist, ggf. auch gegen Fragmente nativer Poly- oder Oligopeptide gerichtet ist.

In einer bevorzugten Form des erfindungsgemäßen Antikörpers A ist der Antikörper A gegen die Bindungsstelle des humanen Growth hormones (hGH) auf dem humanen Growth hormone binding protein (hGHBP) gerichtet.

Besonders bevorzugt ist es, wenn der erfindungsgemäße Antikörper A der Antikörper ZMC1 ist, bspw. der bei der DSMZ hinterlegte Antikörper DSM ACC2582.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend einen erfindungsgemäßen Antikörper A sowie gegebenfalls weitere Wirkstoffe sowie Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

Dabei ist dieses Arzneimittel besonders geeignet, zur Behandlung eines Mangelzustandes eines der oben bereits genannten Liganden zu dienen, da durch den Antikörper A der Ligand freigesetzt werden kann oder seine Bindung durch Bindungsprotein verhindert werden kann, so daß beispielsweise der Plasmaspiegel an freiem Liganden ansteigt, bspw. im Falle einer erwnschten Erhöhung des Plasmatiters von hGH.

Das hGH-bindende Bindungsprotein (hGHBP) entspricht einem extrazellulären Fragment des hGH-Rezeptors. Erfindungsgemäß gegen hGHBP bindende Antikörper, die gegen dessen Bindungsstelle für hGH gerichtet sind, können also auch an den membranständigen hGH-Rezeptor binden und zwar entsprechend in einer solchen Weise, daß der hGH-Rezeptor für die Anlagerung von hGH blockiert ist. Damit können erfindungsgemäße Antikörper A grundsätzlich als Wachstumshormon-Rezeptor Antagonisten therapeutisch eingesetzt werden. Damit kann ein erfindungsgemäßer Antikörper zur Herstellung eines Arzneimittels dienen, das die physiologische Wirkung des humanen Wachstumshormons (hGH) inhibiert. Daher kann ein Arzneimittel, enthaltend einen oder mehr erfindungsgemäße Antikörper A (und ggf. wertere Hilfs- oder Zusatzstoffe), bei all jenen Erkrankungen zum therapeutischen Einsatz gelangen, bei denen die Wirkung von hGH in unphysiologischer, bspw. pathologischer Weise, gesteigert ist. Damit ergibt sich erfindungsgemäß auch die Verwendung entsprechender erfindungsgemäßer Antikörper A zur Behandlung (bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung) von all jenen Störungen, Erkrankungen oder Pathophysiologien, für die hGH-Exzeß ätiologisch ist. Bspw. kann ein derartiges Arzneimittel, enthaltend mindestens einen erfindungsgemäßen Antikörper A, oder ein erfindungsgemäßer Antikörper A zur Behandlung der Akromegalie eingesetzt werden.

Durch Gabe erfindungsgemäßer Antikörper A oder entsprechender erfindungsgemäßer Arzneimittel können auf diese Art und Weise die Wirkung von pathophysiologisch erhöhten extrazellulären Wachstumshormon-Konzentrationen blockiert werden, ohne dadurch die entsprechenden Serumkonzentrationen zu erniedrigen. Damit können mit einem erfindungsgemäßen Antikörper bspw. die Symptome von Hypophysenadenomen, die für eine gesteigerte Sekretion von Wachstumshormonen verantwortlich sind, behandelt werden.

Gegebenenfalls kann eine Therapie betroffener Patienten mit Hypophysenadenom in Kombination mit solchen Arzneimitteln oder Wirkstoffen durchgeführt werden, die die Sekretion von hGH verringern. Hierbei kann es sich bspw. um eine Behandlung mit Somatostatin-Analoga (bspw. Octreotid) und/oder Dopamin-Agonisten (bspw. Bromocriptin, Cabergolin) handeln. Alternativ können therapeutisch auch konventielle Verfahren, wie etwa neurochirurgische Intervention oder Bestrahlung, im Zusammenhang mit der Gabe von erfindungsgemäßen Arzneimitteln oer Antikörpern eingesetzt werden. Daneben sind auch weitere Antitumor-Substanzen (Chemotherapeutika) in einer derartigen Therapie einsetzbar.

Schließlich kann also ein erfindungsgemäßes Arzneimittel, enthaltend erfindungsgemäße Antikörper A auch weitere Substanzen, insbesondere Somatostatin-Analoga, Dopamin-Antagonisten und/oder antineoplastische Substanzen, enthalten oder aber separiert bspw. therapeutisch in einem Kit kombiniert, eingesetzt werden.

Darüber hinaus ist auch eine therapeutische Kombination erfindungsgemäßer Antikörper mit Pegvisomant (Deutsches Ärzteblatt, Jahrgang 98, Heft 9, 2001, A 532) denkbar, ebenso wie ein erfindungsgemäßes Arzneimittel, enthaltend erfindungsgemäßen Antikörper A und Pegvisomant und ggf. weitere Wirkstoffe (bspw. einen der oben genannten Wirkstoffe). Im Falle einer kombinierten Therapie, in einem Arzneimittel (enthaltend mindestens einen erfindungsgemäßen Antikörper A und Pegvisomant), könnte die langfristige Wirkung erfindungsgemäßer Antikörper A aufgrund deren längerer Halbwertszeit mit der kurzen Halbwertszeit des Rezeptorantagonisten Pegvisomant kombiniert werden.

Weitere Erkrankungen, bei denen ein erfindungsgemäßes Arzneimittel oder ein erfindungsgemäßer Antikörper eingesetzt werden können oder zur Herstellung eines Arzneimittels dienen könnten, sind insbesondere Diabetes mellitus (bspw. in Hinblick auf die bei einer Diabetes mellitus auftretenden mittelbar durch hGH vermittelten Retinopathie) oder auch als antitumurigenes Agens bei hGH-abhängigen Tumoren.

Typischerweise wird ein erfindungsgemäßer Antikörper als lyophilisiertes Pulver vorliegen, das zwischen 0,5 mg und 100 mg erfindungsgemäßen Antikörper A, und weitere Zusatzstoffe, bspw. Glycin, Manitol, und/oder Natriumphosphat Monohydrat aufweist. Dieses lyophilisierte Pulver wird in einer geeigneten wässrigen Lösung bereitgestellt und dann, bspw. subkutan ein- oder mehrfach täglich verabreicht.

Prinzipiell können die erfindungsgemäßen Arzneimittel als flüssige Arzneiformen insbesondere in Form von Injektionslösungen verabreicht werden.

Geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe sind z.B. Lösungs- oder Verdünnungsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsvermittler, Puffersubstanzen, Konservierungsmittel, sowie Farbstoffe, Füllstoffe, und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel parenteral, intrvasal, intravenös, intraperitoneal oder intramuskulär appliziert werden soll. Für alle parenteralen Applikationen eignen sich Zubereitungen in Form von Suspensionen und Lösungen sowie leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Diagnostikum enthaltend mindestens einen erfindungsgemäßen Antikörper sowie gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

Unter einem Diagnostikum versteht man eine Zubereitung oder Hilfsmittel mit deren Hilfe beispielsweise eine bestimmte Krankheit diagnostiziert werden kann.

Ein werterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit enthaltend voneinander getrennt mindestens eine erste Zubereitung enthaltend einen erfindungsgemäßen Antikörper und einen auf der Basis einer Antigen/Antikörper-Reaktion funktionierenden fertigen Testassay zur quantitativen Bestimmung eines Liganden, der in diesem Test als Antigen dient.

Unter einem Kit ist eine gemeinsam auftretende Form verschiedener Bestandteile in einer Verpackungsform zu verstehen. Hier ist es insbesondere ein Diagnostik-Kit, der die veschiedenen notwendigen Bestandteile zur quantitativen Analyse eines Liganden enthält.

Bevorzugt ist ein Kit, bei dem die erste Zubereitung einen Antikörper, der gegen die Bindungsstelle des humanen Growth hormones (hGH) auf dem humanen Growth hormone binding protein (hGHBP) gerichtet ist, enthält und/oder neben der ersten Zubereitung und dem auf der Basis einer Antige/Antikörper-Reaktion funktionierenden fertigen Testassay zur quantitativen Bestimmung eines Liganden auch eine Zubereitung zur Kalibrierung enthält.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßer Kit, in dem die erste Zubereitung den Antikörper ZMC1 (hinterlegt s.o.) enthält und/oder die Zubereitung zur Kalibrierung „Internationale Referenz-Präparation 88/624" oder „Internationale Referenz-Präparation 80/505", vorzugsweise „Internationale Referenz-Präparation 88/624" enthält und/oder der Antikörper in dem beiliegenden auf der Basis einer Antigen/Antikörper-Reaktion funktionierenden fertigen Testassay zur quantitativen Bestimmung eines Liganden (hGH) ein, vorzugsweise monoklonaler, Antikörper B gegen die 22 kDa große Hauptisoform des hGH ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Antikörpers zur, vorzugsweise quantitativen, Bestimmung eines physiologischen Liganden eines physiologischen Bindungsproteins.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Wachstumsstörungen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Antikörpers, also eines Antikörpers, der gegen ein Bindungsprotein für einen Liganden gerichtet ist, mit folgenden Schritten: (a) Immunisierung von Tieren mit rekombinant hergestelltem Bindungsprotein, (b) Isolierung von Immunzellen aus dem Tier, (c) Fusion mit Myelom-Zellinien zu Hybridomzellkulturen, (d) Selektion von Klonen mit hoher Spezifität für das Bindungsprotein. Die Immunisierung kann in allen für derartige Zwecke in Betracht kommenden Tieren erfolgen, also . bspw. bei Mäusen, Kaninchen, Schweinen, Pferden etc. Um solche Klone, die Antikörper gegen das Bindungsprotein (z.B. GHBP) produzieren, von erfindungsgemäßen Klonen (die Antikörper produzieren, die spezifisch gegen die Ligandenbindungsstelle des Bindungsproteins gerichtet sind) zu trennen, werden geeignete Medien (z.B. wells von Mikrotiterplatten, Polystyrolbeads, Plastikröhrchen) mit jeweils einem (unselektierten) anti-GHBP-Fangantikörper in einem Verfahrensschritt (e) beschichtet, und in einem Verfahrensschritt (f) werden das Bindungsprotein (z.B. GHBP) und nachfolgend der Ligand (z.B. hGH) hinzugegeben. Hierbei sollte der Ligand markiert sein (bspw. durch Biotinylierung, Label (radiaktiver Laber, Fluoreszenzmarker, Enzymmarker (Meerrettich-Peroxidase) etc.)) oder über einen entsprechenden anti-Ligand-Antikörper detektierbar sein, um die Eigenschaft des Liganden, an das Bindungsprotein in dem mit Fangantikörper beschichteten Behältnis, überprüfen zu können. Alternative Verfahren sind demnach bspw. Radioaktivität, Chemiluminiszenz, kolorimetrische Verfahren oder Enzymreaktion. Nach einem Waschschritt können solche "wells" oder „beads" identifiziert werden, die kein Signal nach Ligandenzugabe aufweisen. In diesem Fall blockiert der Fangantikörper die Ligandenbindungsstelle, die Bindungsstelle steht damit für die Ligandenbindung nicht mehr zur Verfügung, der Fangantikörper interferiert mit dem Liganden.

Schließlich kann ein erfindungsgemäßer Antikörper durch kompetitive Bindungsassays identifiziert werden. Hierzu wird, wie oben beschrieben, beschichtet, allerdings jedes „well" mit einem nicht spezifisch die Ligandenbindungsstelle erkennenden anti-Bindungsprotein-Antikörper. Nach Zugabe von Bindungsprotein wird in jedes „well" jeweils ein potentiell interessanter Antikörper (mit der Eigenschaft, die Ligandenbindungsstelle spezifisch zu erkennen) mit markiertem Liganden hinzugefügt. Mit zu- nehmender Konzentration des ligandenbindungsstellenspezifischen Antikörpers nimmt die Signalintensität des Liganden im „well" ab. Auf diese Weise können erfindungsgemäße Antikörper (bspw. gegen GHBP) selek- tiert werden.

Alternativ zur Herstellung mit Hilfe von Hybridomen können auch die sogenannten „phage display" Verfahren (Morphosys oder Cambridge Antibody Technologies) zum Einsatz kommen, um potentiell erfindungsgemäße Antikörper zu generieren und dann, wie oben beschrieben, zu selektieren.

Im folgenden Abschnitt wird die Erfindung weiter durch Ausführungsbeispiele erläutert, ohne sie darauf zu beschränken.
Ausführungsbeispiele und Abbildung
Abbildung:
1 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung in Ausführungsbeispiel 2. Die Ergebnisse belegen, daß die Zugabe des erfindungsgemäßen Antikörpers den negativen Störeinfluß, den hGHBP auf die Ergebnisse der hGH-Messung hat (falsch niedrige Werte in den getesteten Sandwichassays), dosisabhängig verrigern bzw. aufheben kann.
Ausführungsbeispiele
Ausführungsbeispiel 1:
Herstellung von Antikörper A (gegen hGHBP gerichtet)
Mehr als 20 Balb/c Mäuse wurden mit rekombinant hergestelltem hGHBP wiederholt nach dem allgemein bekannten Verfahren (siehe Beipackzettel Titermax^®) immunisiert. Bei Erreichen eines hohen Titers gegen hGHBP wurde die Milz den Tieren entnommen, und es wurden nach dem von Köhler und Milstein (Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 1975, Aug. 7; 256 (5517): 495-7) beschriebenen Verfahren durch Fusion mit einer Maus-Myelom-Zelllinie Hybridomzellkulturen hergestellt. Ebenfalls nach allgemein bekannten Verfahren (Limitierende Verdünnung (limited dilution), Sereening der Hybridomzellkultur-Überstände mit markiertem Antigen) wurden solche Klone selektiert, die monoklonale Antikörper hoher Affinität und Spezifität für hGHBP produzierten.
Die meisten der selektierten Klone waren gegen solche Epitope auf dem hGHBP-Molekül gerichtet, die außerhalb der Bindungsstelle für hGH liegen. Um erfindungsgemäße Antikörper A zu selektieren, die gegen ein Epitop innerhalb der Bindungsstelle gerichtet sind (nur ein solcher mAb ist für die erfindungsgemäße Anwendung anwendbar), wurde zunächst einer der vielen Antikörper, die hGHBP außerhalb der Bindungsstelle binden, eingesetzt. Dieser wurde dadurch identifiziert, daß alle monoklonalen Antikörper gegen GHBP (möglichst viele), z.B. jeweils in getrennte Vertiefungen (wells) einer Mikrotiterplatte (Polystyrolplatten mit hochadsorptiver Oberfläche) als Fangantikörper, aufgebracht wurden (alternativ können auch andere Verfahren, z.B. beschichtete Polystyrolbeads, beschichtete Plastikröhrchen etc., zum Einsatz kommen). Daraufhin wurde rekombinantes GHBP dazugegeben, welches an die Beschichtungsantikörper bindet – in zunächst noch unbekannter Ausrichtung (Bindung je nach Epitop innerhalb oder außerhalb der Hormon-Rezeptor-Interaktionsstelle). Schließlich wurde markiertes (in unserem Fall biotinyliertes) Wachstumshormon hinzugegeben, welches nun ausschließlich an die GHBP-Moleküle binden kann, deren Bindungsstelle frei zugänglich ist (d.h.; bei denen der Beschichtungsantikörper nicht mit der Wachstumshormonbindung interferiert). Die Messung gebundenen Antikörpers erfolgte durch die Zugabe von Streptavidin-Europium, welches an gebundenes biotinyliertes hGH bindet und in einem Fluorometer vermessen werden kann (zeitaufgelöste Fluoreszenz nach Zugabe von Enhancement-Solution). Alternativ kann dieser Schritt auch mit den analogen Methoden (Radioaktivität, Enzymreaktion/kolorimetrisches Verfahren oder Chemilumineszenz) durchgeführt werden.
Um nun einen Antikörper aufzufinden, der gegen die Bindungsstelle gerichtet ist, wurde eine Mikrotiterplatte mit einem der nach oben angegebenen Verfahren selektierten Antikörper gegen GHBP, der nicht mit der Bindung von hGH interferiert, beschichtet. Zugabe von GHBP bewirkte, daß die GHBP-Moleküle gerichtet gebunden werden, also mit einer frei zugänglichen Bindungsstelle für hGH. Nunmehr wurde biotinyliertes hGH zugegeben und zugleich alle anderen monoklonalen Antikörper gegen GHBP (natürlich wieder jeder Antikörper in eine eigene Vertiefung der Mikrotiterplatte). Wenn nun ein Antikörper gegen die Bindungsstelle gerichtet wäre, sollte er die Bindung von biotinyliertem hGH konzentrationsabhängig behindern, was an abfallender Signalintesität erkannt werden konnte (Detektionsverfahren in unserem Falle wieder zeitaufgelöste Fluoreszenz (Streptavidin-Europium). Zur Bestätigung wurde im umgekehrten Experiment versucht, biotinylierte Antikörper gegen GHBP durch Zugabe von unmarkiertem hGH zu verdrängen. Dies ist dann möglich, wenn der biotinylierte Antikörper mit dem nicht-markierten hGH um die Bindung an die Rezeptorbindungsstelle konkurriert, also das Epitop des mAbs innerhalb der hGH/hGH-Rezeptorinteraktionsstelle liegt.
Ausführungsbeispiel 2:
Nachweis der Wirksamkeit eines erfindungsgemäßen Antikörpers und der damit verbundenen Verbesserung allgemeiner quantitativer Meßmethoden bei störendem Bindungsprotein
Schafserum – das im Gegensatz zu den Seren anderer Spezies kein hochaffnes Wachstumshormon-Bindungsprotein enthält und somit das optimale „Kontrollmedium" abgibt – wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Wachstumshormon versetzt (verwendet wurde die Präparation 80/505, Endkonzentration 0,3/0,6/4 und 9 ng/ml). Danach wurden Aliquots dieser Seren mit unterschiedlichen Konzentrationen von rekombinantem humanem GHBP gemischt und für 24 Stunden bei 4°C inkubiert, um die Interaktion zwischen dem zugesetzten hGH und dem zugesetzten hGHBP zu ermöglichen. Somit wurden Serumproben mit definierten Konzentrationen von hGH und definierten Konzentrationen von hGHBP hergestellt. Diesen Proben wurde nun der erfindungsgemäße und hinterlegte anti-hGHBP-Antikörper ZMC 1 zugesetzt und für weitere 12 Stunden inkubiert und anschließend in 3 verschiedenen Immunoassays für hGH gemessen. Die Ergebnisse (siehe 1) belegen, daß die Zugabe des erfindungsgemäßen Antkörpers den negativen Störeinfluß, den hGHBP auf die Ergebnisse der hGH-Messung hat (falsch niedrige Werte in den getesteten Sandwichassays), dosisabhängig verringern bzw. aufheben kann.
Das Prinzip der Methode wurde bisher an drei verschiedenen Immunoassays erfolgreich getestet. Dabei konnten an humanen Serumproben die oben gezeigten Ergebnisse bestätigt werden. Je nach Immunoassay müssen die Konzentrationen des anti-hGHBP-Antikörpers angepaßt werden, um die interferenzfreie Messung von hGH zu ermöglichen. Damit ist eine grundsätzlich neue Anwendung von monoklonalen Antkörpern zur Blockade interferierender Bindungsproteine etabliert.

Literatur:

1. Chatelin P, Bouillat B, Cohen R, Sassolas G, Souberbielle JC, Ruitton A et al, Assay of growth hormone levels in human plasma using commercial kits: analysis of some factors influencing the results. Acta Paediatr Scand Suppl 1990;370:56-61; discussion 62,
2. Ebdrup L, Fisker S, Sorensen HH, Ranke MB, Orskov H. Variety in growth hormone determinations due to use of different immunoassays and to the Interference of growth hormonebinding protein, Horm Res 1999;51 (Suppl1); 20-6,
3. Fisker S, Ebdrup L, Orskov H. Influence of growth hormone binding protein on growth hormone estimation in different immunoassays. Scand J Clin Lab Invest: 1998;58(5);373-81,
4. Fisker S, Orskov H. Factors modifying growth hormone estimates in immunoassays. Horm Res 1996;46(4-5);183-7,
5. Jansson C, Boguszewski C, Rosberg S, Carlsson L, Albertsson-Wikland K. Growth hormone (GH) assays: Influence of standard preparations, GH isoforms, assay characteristics, and GH-binding protein. Clin Chem 1997;43(6 Pt 1):950-6.

Claims

Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines Liganden eines Bindungsproteins in einer Liganden und Bindungsprotein in gelöster oder suspendierter Form enthaltenden Probe, dadurch gekennzeichnet, daß der zu messenden Probe ein Antikörper A gegen das Bindungsprotein, der gegen die Bindungsstelle des Liganden auf dem Bindungsprotein gerichtet ist, zugesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper A vor oder während, vorzugsweise vor, der quantitativen Bestimmung zugesetzt wird und/oder mit der Probe inkubiert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Körperflüssigkeit, vorzugsweise humane Körperflüssigkeit, insbesondere Blut bzw. humanes Blut, enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein physiologischer Ligand des physiologischen Bindungsproteins ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindungsprotein löslich, vorzugsweise ein löslicher Rezeptor oder ein Hormonbindungsprotein, insbesondere ein Hormonbindungsprotein, ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand eine peptidische Verbindung und/oder ein Hormon, vorzugsweise ein peptidisches Hormon, insbesondere ein Wachstumshormon, ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand humanes Wachstumshormon (human Growth hormon/hGH) und das Bindungsprotein humanes Wachstumshormon-Bindungsprotein (human Growth hormon binding protein/hGHBP) ist und der Antikörper A gegen die Bindungsstelle des hGH auf dem hGHBP gerichtet ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper A ein monoklonaler Antikörper bzw. ein single-chain Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper A der monoklonale Antikörper ZMC 1 ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die quantitative Bestimmung des Liganden unter Ausnutzung der Bindung des Liganden als Antigen an einen, vorzugsweise monoklonalen, Antikörper B erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die quantitative Bestimmung über einen kompetitiven Bindungstest, vorzugsweise einen „radio-immuno assay" (RIA) erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die quantitative Bestimmung durch Messung eines in Abhängigkeit von der Konzentration des zu messenden Liganden ansteigenden Meßparameters erfolgt, vorzugsweise durch einen enzyme-linked immuno sorbent Assay (ELISA) und/oder durch einen Sandwich-Assay.
Verfahren gemäß einem der Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß vor der quantitativen Bestimmung keine Abtrennung des Bindungsproteins aus der zu messenden Probe erfolgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper A so zugegeben wird, daß der Antikörper A in der Probe in einer höheren Konzentration als das Bindungsprotein vorliegt, vorzugsweise in einer mindestens um 50%, insbesondere mindestens um 100%, vorzugsweise mindestens um 200%, insbesondere mindestens um 400% höheren Konzentration.
Antikörper A gegen ein in Körperflüssigkeiten gelöstes oder suspendiertes physiologisches Bindungsprotein eines physiologischen Liganden, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper A gegen die Bindungsstelle des Liganden auf dem Bindungsprotein gerichtet ist.
Antikörper A gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper A ein monoklonaler Antikörper und/oder ein singlechain Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, ist.
Antikörper A gemäß einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Peptid und/oder Hormon und/oder vorzugsweise humanem Ursprungs ist.
Antikörper A gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper A gegen die Bindungsstelle des humanen Growth hormones (hGH) auf dem humanen Growth hormone binding protein (hGHBP) gerichtet ist.
Antikörper A gemäß einem der Anspreche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper A der Antikörper ZMC1 ist.
Arzneimittel enthaltend einen Antikörper A gemäß einem der Ansprüiche 15 bis 19 sowie gegebenfalls weitere Wirkstoffe sowie Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Anspreche 15 bis 19 oder eines Arzneimittels nach Anspruch 20 zur Behandlung von Erkrankungen, Störungen oder Pathophysiologien, die auf hGH-Exzeß beruhen, bspw. Akromegalie.
Diagnostikum enthaltend mindestens einen Antikörper A gemäß einem der Anspreche 15 bis 19 sowie gegebenfalls Hilfsstoffe.
Kit enthaltend voneinander getrennt mindestens eine erste Zubereitung enthaltend einen Antikörper A gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19 und einen auf der Basis einer Antigen/Antikörper-Reaktion funktionierenden fertigen Testassay zur quantitativen Bestimmung eines Liganden, der in diesem Test als Antigen dient.
Kit gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Zubereitung einen Antikörper A gemäß Anspruch 18 enthält und/oder neben der ersten Zubereitung und dem auf der Basis einer Antigen/Antikörper-Reaktion funktionierenden fertigen Testassay zur quantitativen Bestimmung eines Liganden auch eine Zubereitung zur Kalibrierung enthält.
Kit gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Zubereitung den Antikörper ZMC1 enthält und/oder die Zubereitung zur Kalibrierung „Internationale Referenz-Präparation 88/624" oder „Internationale Referenz-Präparation 80/505", vorzugsweise „Inter nationale Referenz-Präparation 88/624° enthält und/oder der Antikörper B in dem auf der Basis einer Antigen/Antikörper-Reaktion funktionierenden fertigen Testassay zur quantitativen Bestimmung eines Liganden (hGH) ein, vorzugsweise monoklonaler, Antikörper gegen die 22 kDa große Hauptisoform des hGH ist.
Verwendung eines Antikörpers A gemäß einem der Ansprüche 15–19 zur, vorzugsweise quantitativen, Bestimmung eines physiologi- schen Liganden eines physiologischen Bindungsproteins.
Verwendung eines Antikörpers A gemäß Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Waehstumsstörungen.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers A gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19 mit folgenden Schritten: (a) Immunisierung von Tieren mit rekombinant hergestelltem Bindungsprotein, (b) Isolierung von Immunzellen aus dem Tier, (c) Fusion mit Myelom-Zellinien zu Hybridomzellkulturen, (d) Selektion von Klonen mit hoher Spezifität für das Bindungsprotein.