DE112004001863T5

DE112004001863T5 - Verfahren und Verwendung von Bindungskomponenten zur Verbesserung der Testspezifität

Info

Publication number: DE112004001863T5
Application number: DE112004001863T
Authority: DE
Inventors: Thomas L. El Cajon Cantor
Original assignee: Scantibodies Laboratory Inc
Current assignee: Scantibodies Laboratory Inc
Priority date: 2003-10-03
Filing date: 2004-10-04
Publication date: 2006-09-07
Also published as: WO2005035720A3; WO2005035720A2; US20050170443A1

Abstract

Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit, umfassend
(a) Inkontaktbringen einer Probe, die einen Analyten und/oder eine interferierende Einheit enthält oder vermeintlich enthält, mit einer blockierenden Bindungskomponente, wobei man die blockierende Bindungskomponente an die interferierende Einheit, nicht jedoch an den Analyten binden lässt, falls der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorhanden ist/sind;
(b) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wobei man die Indikator-Bindungskomponente an den Analyten, nicht aber an die interferierende Einheit spezifisch binden lässt, was darauf zurückzuführen ist, dass die blockierende Bindungskomponente bereits daran gebunden ist; und
(c) Nachweis der Bindung zwischen dem Analyten und der Indikator-Bindungskomponente, um die Gegenwart und/oder Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen,
wobei der Analyt ein Fragment, ein Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist und Schritt (a) vor oder gleichzeitig mit Schritt (b) durchgeführt wird.

Description

PRIORITÄTSANSPRUCH
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der U.S. „Provisional" Patentanmeldungen mit den Nummern 60/508,547, eingereicht am 3. Oktober 2003 und 60/573,475, eingereicht am 21. Mai 2004 gemäß 35 U.S.C. § 119(e). Der Inhalt dieser Anmeldungen ist hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit inkorporiert.
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis eines Analyten von Interessen, ohne einen ähnlichen Analyten oder eine ähnliche Einheit nachzuweisen.
HINTERGRUND
Analyten wie Parathormon (PTH) haben in ihrer Geschichte Probleme bereitet, wenn es um ihre genaue Bestimmung ging, was auf das häufige Vorkommen von interferierenden Einheiten und der niedrigen endogenen Konzentrationen vieler Analyte zurückzuführen ist. Diese Einheiten umfassen üblicherweise Moleküle mit beträchtlicher Homologie zu dem Analyten von Interesse und interferieren daher, weil sie durch die Testreagenzien gebunden und/oder nachgewiesen werden. Manchmal ist es von Interesse, zwei Analyten durch Verwendung eines spezifischen Assays für einen der beiden Analyten und einen anderen nicht-spezifischen Test zu messen, der die Summe (oder Gesamtmenge) der zwei Analyten misst. In diesen Fällen wird die in dem spezifischen Test gemessene Konzentration des Analyten subtrahiert von den nicht-spezifischen Testwerten der Summe der zwei Analyte. Der nicht in dem spezifischen Test gemessene Analyt stellt die Differenz zwischen dem spezifischen Testwert und dem nicht-spezifischen Testwert dar. Im Falle von PTH wird dieses Substraktionsverfahren verwendet, um die Konzentration von 7-84 PTH aus der Differenz zwischen dem 1-84 PTH (gemessen in einem spezifischen Test) und Gesamt-PTH (gemessen in einem nicht-spezifischen Test) abzuleiten. Diese Art an Substraktionsverfahren wird ebenfalls verwendet, um die Konzentration von LDL aus der Differenz zwischen HDL- (gemessen in einem spezifischen Test) und Gesamt-Cholesterol- (gemessen in einem nicht-spezifischen Test) Konzentrationen abzuleiten. Eine wichtige Voraussetzung zum Erhalt eines genauen Analytenwertes aus der Differenz zwischen dem spezifischen Testwert und dem nicht-spezifischen oder Gesamttestwert liegt darin, dass beide Analyten durch den nicht-spezifischen (oder Gesamt-) Test gemessen werden müssen. Gleiche Konzentrationen der beiden Analyten müssen gleiche Messwerte in dem nicht-spezifischen (oder Gesamt-) Test ergeben. Beispielsweise müssen 100 pgm/ml 7-84 PTH einen Testwert in dem nicht-spezifischen Gesamttest ergeben, der dem entspricht, welcher mit 100 pgm/ml 1-84 PTH in dem selben nichtspezifischen Gesamttest erhalten würde. Dieser äquimolare Nachweis stellt manchmal eine Herausforderung dar und diese Herausforderung ist Grundlage für das Bedürfnis, direkte Messungen durch spezifische Tests anstelle der Substraktionsmethode einzusetzen.
1-84 PTH wird allgemein als wichtiger Analyt zur Bewertung des Kalziummetabolismus und des Turnover-Status der Knochen in einem Lebewesen eingestuft. In ähnlicher Weise weist 7-84 PTH bedeutsame biologische Aktivitäten auf, die antagonistisch zu 1-84 PTH wirken. Messungen mit diesem Hormon sind daher wichtig, insbesondere bei Patienten mit Nierenerkrankungen im Endstadium (um die den Knochenstatus zu bewerten). Siehe zum Beispiel Faugere, M-C., et al., Kidney Int. (2001) 60:1460-8; Waller, S.C., et al., L. Am. Soc. Nephrol. (2003) 14:694; Divieti, P., et al., Endocrinology (2002) 143(1):171-6; Sneddon, W.B., et al., J. Biol. Chem. (2003) 278(44):43787-96; Langub, M., et al., Endocrinology (2003) 144(4):1135-38. Während es Methoden gibt, 1-84 PTH direkt zu messen, werden gegenwärtig lediglich indirekte Methoden eingesetzt, um 7-84 PTH-Werte zu messen, da 7-84 PTH ein Teil von 1-84 PTH ist. Daher werden Verfahren zur Messung von 7-84 PTH oder einem Fragment von PTH oft auch 1-84 PTH nachweisen.
Des gegenwärtige Verfahren zur Messung von 7-84 PTH oder einem anderen PTH-Fragment involviert zwei Messungen. Zunächst wird 1-84 PTH in einer Probe mit einem hochspezifischen 1-84 PTH-Test gemessen, beispielsweise dem Zyklase-Aktivierungs-PTH (CAP, auch als vollständiges PTH bezeichnet)-Test, hergestellt von Scantibody Laboratories, Inc. (Santee, CA). Der nächste Schritt besteht darin, die Probe mit einem Gesamt-PTH-Test (bezeichnet als Test auf „intaktes" PTH, wobei jedoch diese Tests auf „intaktes" PTH in der Vergangenheit tatsächlich eine Messung sowohl von 1-84 PTH plus 7-84 PTH und anderen PTH-Fragmenten, sofern vorhanden, umfassten) auf 1-84 PTH plus 7-84 PTH oder ein anderes PTH-Fragment zu testen (oder Gesamt-PTH zu messen). Der Gesamt-PTH-Test misst oft nichtspezifisch 1-84 PDH und kann auch eines oder mehrere PTH-Fragmente verschiedener Größe messen. 7-84 PTH jedoch ist am häufigsten verwendet worden, um die nicht-Spezifität dieser sogenannten Tests auf „intaktes" PTH für die in „ESRD"-Patienten gefundenen PDH-Fragmente zu demonstrieren. Da die Werte für intaktes PTH in ESRD-Patienten größer sind als die spezifischen 1-84 PTH-Testwerte und dar über HPLC ein Peak in ESRD-Patienten entdeckt wurde, der aufgrund der zurückgelegten Strecke dem von 7-84 PTH entspricht, wird angenommen, dass ESRD-Patienten hohe Konzentrationen von 7-84 PTH aufweisen. Anschließend wird die 7-84 PTH-Menge dadurch erhalten, dass der 1-84 PTH-Wert von dem Gesamt-PTH-Wert subtrahiert wird. Da der 1-84 PTH-Testwert lediglich 1-84 PTH misst, könnte dieser „7-84 PTH"-Testwert theoretisch aus jeglichen PTH-Fragmentmengen von PTH_2-84 bis PTH_28-84 bestehen, obwohl die Gegenwart von PTH-Fragmenten (außer dem 7-84 PTH) innerhalb dieses Bereichs nicht zwingend dargelegt wurde.
Das Verhältnis von 1-84 PTH zu 7-84 PTH (und/oder einem anderen PTH-Fragment) hat sich im Vergleich zu anderen Markern als genauerer Ersatzmarker für die Knochen-Biopsieanalyse erwiesen. Zur vorliegenden Offenbarung hat folgende Entdeckung geführt: Die Substraktionsmethode amplifiziert Variationen in dem 1-84 PTH/-7-84 PTH-Verhältnis, die durch kleinere prozentuale Unterschiede in den großen Gesamt-PTH-Testwerten verglichen zu kleineren 1-84 PTH-Testwerten für die selben Proben verursacht werden, die in großen Variationen des berechneten 7-84 PTH-Wertes (und/oder eines anderen Fragmentes) des PTH-Wertes resultieren. Zumindest aus diesem Grunde wird hiermit eine direkte 7-84 PTH-Messung bevorzugt. Diese gewünschte Präferenz ist analog zu dem ähnlichen Bedarf, HDL direkt zu messen, anstatt die gemessenen LDL-Werte von Gesamtcholesterol zu subtrahieren, um das Verhältnis von HDL zu LDL für die klinische Bewertung auf ein Arterioskleroserisiko zu berechnen. Dieser Bedarf ist durch die rasche Annahme der direkten HDL-Messungen durch die klinische Gemeinschaft belegt, als die direkte Messmethode verfügbar wurde.
Die direkte Messung von 7-84 PTH ist problematisch, da die auf dem 7-84 PTH-Molekül befindlichen Epitope auch auf dem 1-84 PTH-Molekül vorkommen, wodurch die gleichzeitige Messung von 1-84 PTH notwendig wird, wann immer 7-84 PTH gemessen wird. Die gemeinsamen Epitope von 1-84 PTH und 7-84 PTH (zusammen mit anderen PTH-Fragmenten) haben die direkte Messung von 7-84 PTH ohne die Messung von 1-84 PTH verhindert.
In den 1970er Jahren war bekannt, dass die Nebenschilddrüse PTH-Fragmente bei erhöhten Serumkalziumwerten ausschüttet, obwohl die Funktion dieser Fragmente damals nicht verstanden wurde. Vor kurzem ist nachgewiesen worden, dass das 7-84 PTH-Fragment der biologischen Aktivität von PTH entgegengesetzt ist, was den Umsatz der Knochen, die Resorption, den erhöhten Kalziumgehalt des Blutes und die Osteoclastenproliferation betrifft. Faugere et al. haben gezeigt, dass das Verhältnis von 1-84 PTH zu der wahrscheinlichen 7-84 PTH-Menge mit steigenden Calciumwerten im Serum abnimmt. Es ist ferner nachgewiesen worden, dass 7-84 PTH vermutlich von der Nebenschilddrüse gebildet wird. Vor den nun vorliegenden Beobachtungen ist vermutet worden, dass es lediglich eine Form von 1-84 PTH gibt. Des weiteren war bis vor kurzem das Verständnis zu 1-84 PTH und den verschiedenen PTH-Fragmenten stark durch die Verfügbarkeit von lediglich dem Test auf „intaktes" PTH stark beschränkt, der sowohl 1-84 wie auch 7-84 PTH (und andere Fragmente des PTH) misst.
Die heterogene immunologische Natur zirkulierenden PTHs hat in den letzten 40 Jahren dazu geführt, dass Spezifitäten andauernd PTH-Tests durch solche mit verbesserten ersetzt wurden. Unter normalen kalzämischen Bedingungen wird dieses aus 20% hPTh(1-84), der biologisch aktiven Form des Hormons auf dem PTH/PTHrP-Rezeptor, und 80% Carboxy-terminalem (C) Fragment zusammengesetzt, bis vor kurzem als biologisch inaktiv angesehen (D'Amour P, et al., Am. J. Physiol. 1986;251 (Endo Metab):E680-E687; D'Amour P, et al., J Clin. Endocrinol. Metab. 1992;75:525-532; Brossard JH, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1996;81:3923-3929). Bei Nierenversagen (RF) werden C-PTH-Fragmente angehäuft, da diese in normalen Individuen hauptsächlich durch die Niere entfernt werden (D'Amour P, et al., Endocrinology 1985;117:127-134). Es ist vorgetragen worden, dass diese C-PTH-Fragmente mehr als 95% des zirkulierenden PTH ausmachen (siehe Brossard JH, et al., supra). Studien in Menschen haben ferner die Existenz kleinerer C-PTH-Fragmente gezeigt (D'Amour P, et al., J Immunoassay 1989;10:191-205) und vor kurzem auch von größeren C-PTH-Fragmenten mit einer teilweise konservierten amino-terminalen Struktur, die als nicht-(1-84)PTH bezeichnet wird. Vergleiche Brossard JH, et al., J Clin Endocrinol Metab supra; Brossard JH, et al. J Clin Endocrinol Metab 1993;77:413-419; Lepage R, et al., Clin Chem 1998;44:805-809; Brossard JH, et al., Clin Chem 2000;46:697-703. Die zuletzt genannten Fragmente wurden durch HPLC-Analyse von zirkulierendem PTH entdeckt, was zu jener Zeit als Test auf „intaktes" (I)-PTH angesehen wurde (D'Amour P, et al., Endocrinology, supra; Brossard JH, et al., J Clin Endocrinol Metab 1993;77:413-419; Lepage R, et al., Clin Chem 1998;44:805-809; Brossard JH, et al., Clin Chem 2000;46:697-703). Nicht-(1-84)PTH ist verantwortlich für 10% der C-PTH-Fragmente und für 20% der I-PTH-Immunreaktivität in normalen Individuen (NI) (D'Amour P et al., J Immunoassay, supra). In RF-Patienten ist es auch für mehr als 10% der C-PTH-Fragmente verantwortlich, jedoch auch für mehr als 45% der I-PTH-Immunreaktivität (D'Amour P, et al., Endocrinology, supra: Lepage R, et al., Clin Chem 1998;44:805-809; Brossard JH, et al., Clin Chem 2000;46:697-703).
Die Wichtigkeit von C-PTH-Fragmenten in der mit PTH befassten Biologie ist in kürzlich veröffentlichten Studien, die nachstehen zitiert werden, offenbart worden. Menschliches PTH(7-84), ein Ersatz für nicht-(1-84)PTH und zu einem geringeren Ausmaß kleinere C-PTH-Fragmente haben hypokalzämische, hypophosphatämische und hypophosphaturische Effekte wie in einem thyreoparathyreoidectomisierten Rattenmodell gezeigt und hPTH(7-84) steuert dem hyperkalzämischen Einfluss von hPTH(1-84) und hPTH(1-34) im selben Modell entgegen (Slatopolsky E, et al., Kidney Int 2000;58:753-761; Nguyen-Yamamoto L, et al., Endocrinology 2001;142:1386-1392). Darüber hinaus ist hPTH(7-84) in vitro ein starker Inhibitor der Knochenresorption, die durch hPTH(1-84) und hPTH(1-34) und andere PTH-„Agonisten" induziert wird. Vergleiche Divieti P, et al., Endocrinology 2002;143:171-176. Sowohl hPTH(7-84) und hPTH(39-84) haben eine Aktivität gezeigt, die mit ihrer Rolle als Inhibitoren von Vitamin-D-induzierter Osteoclastogenese übereinstimmt; vergleiche oben. Diese biologischen Wirkungen von C-PTH-Fragmenten sind unabhängig von dem Typ 1 PTH/PTHrP-Rezeptor und Studien zeigen, dass ihre Aktivität durch einen C-PTH-Rezeptor vermittelt wird; vergleiche oben; Nguyen-Yamamoto L, et al., Endocrinology 2001 (supra).
Dementsprechend besteht ein Bedarf im Stand der Technik für ein Verfahren zur Messung von 7-84 PTH und/oder einem anderen PTH-Fragment, ohne dass 1-84 PTH gemessen wird. Es besteht ebenfalls ein Bedarf im Stand der Technik zur Identifizierung und/oder Messung einer neuen molekularen Form von PTH (nfPTH). Darüber hinaus hat der hier genannte Erfinder erkannt, dass andere interessierende Analyten im Stand der Technik bekannt sind, deren Messung durch verschiedene interferierende Einheiten gestört wird, die eine Homologie mit dem interessierenden Analyten beibehalten und oft mit den heute bekannten Reagenzien kreuzreagieren; er stellt hier nützliche Mittel zur genauen und ausschließlichen Messung dieser Analyten bereit, ohne dass auch die interferierenden Einheiten gemessen werden. Die vorliegende Erfindung bedient diese und andere verwandte Bedürfnisse aus dem Stand der Technik.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
In einer häufig verwendeten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit, umfassend (a) Inkontaktbringen einer Probe, die einen Analyten und/oder eine interferierende Einheit enthält oder vermeintlich enthält, mit einer blockierenden Bindungskomponente, wobei man die blockierende Bindungskomponente an die interferierende Einheit, nicht jedoch an den Analyten binden lässt, falls der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorhanden ist/sind; (b) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wobei man die Indikator-Bindungskomponente an den Analyten, nicht aber an die interferierende Einheit spezifisch binden lässt, was darauf zurückzuführen ist, dass die blockierende Bindungskomponente bereits daran gebunden ist; und (c) Nachweis der Bindung zwischen dem Analyten und der Indikator-Bindungskomponente, um die Gegenwart und/oder Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen, wobei der Analyt ein Fragment, ein Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist und Schritt (a) vor oder gleichzeitig mit Schritt (b) durchgeführt wird. Häufig werden die Schritte des Inkontaktbringens der Probe mit einer markierten Indikator- Bindungskomponente und des Inkontaktbringens der Probe mit einer Test-Festphasen-Bindungskomponente nach dem Schritt umfassend das Inkontakbringen der Probe mit der blockierenden Bindungskomponente durchgeführt. Ebenfalls häufig umfasst das Verfahren weiterhin eine Test-Festphasen-Bindungskomponente, wobei man die Test-Festphasen-Bindungskomponente mit der Probe in Kontakt bringt und spezifisch an den Analyten binden lässt, bevor die Bindung zwischen dem Analyten und der Indikator-Bindungskomponente nachgewiesen wird.
In einer weiteren häufig angewendeten Ausführungsform weist die interferierende Einheit ein Epitop auf, das weder als Teil noch im Ganzen auf dem Analyten vorkommt auf der Basis des Status des Analyten als ein Fragment der interferierenden Einheit und wobei die blockierende Bindungskomponente spezifisch für dieses Epitop ist. Oft enthält die interferierende Einheit ein anderes Epitop, das mit dem ersten Epitop überlappt, wobei dieses andere Epitop auf dem Analyten vorkommt und wobei die Indikator-Bindungskomponente spezifisch für dieses andere Epitop ist.
Häufig umfasst der Nachweis des interessierenden Analyten die Bestimmung der 7-84 PTH-Menge in einer Probe. Wenn nötig umfasst der Nachweis des interessierenden Analyten die Bestimmung der Menge eines anderen PTH-Fragments als 7-84 PTH oder eines zusätzlichen Fragmentes in der Probe. Ebenfalls häufig umfasst das Verfahren ferner die Bestimmung der Gesamt-PTH-Menge in der Probe, wobei die 7-84 PTH-Menge von der Gesamt-PTH-Menge substrahiert wird, wodurch die Menge an 1-84 PTH in der Probe erhalten wird. Eine Auswahl von zwei Werten aus der 7-84-Menge, der Gesamt-PTH-Menge und der 1-84 PTH-Menge werden häufig im Verhältnis zueinander verglichen. Die Verhältnis oder Mengen werden oft in der Diagnose, Überwachung oder als Leitfaden für die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung eingesetzt.
In einer weiteren häufig eingesetzten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit bereitgestellt, das umfasst: a) Inkontaktbringen einer Probe, die einen Analyten und/oder eine interferierende Einheit enthält oder vermeintlich enthält, mit einer isolierenden Bindungskomponente, wobei man die isolierende Bindungskomponente an die interferierende Einheit, nicht jedoch an den Analyten binden lässt, falls der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorhanden ist/sind, wobei die interferierende Einheit durch Bindung an die isolierende Bindungskomponente aus der löslichen Phase der Probe entfernt wird; b) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wobei man die Indikator-Bindungskomponente an den Analyten, nicht aber an die interferierende Einheit binden lässt, und d) Nachweis der Bindung zwischen dem Analyten und der Indikator-Bindungskomponente, um die Gegenwart und/oder Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen, wobei der Analyt ein Fragment, ein Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist und Schritt (a) vor Schritt (b) durchgeführt wird. Häufig handelt es sich dabei um ein Verfahren, ferner umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einer Test-Festphasen-Bindungskomponente, wodurch eine spezifische Bindung der Test-Bindungskomponente an den Analyten, nicht aber an die interferierende Einheit ermöglicht wird.
Häufig wird die interferierende Einheit aus der Lösung durch Bildung eines interferierende Einheit-Komplexes entfernt, welcher nach Kontakt der Probe mit einer Komplex-bildenden Bindungskomponente, die an die isolierende Bindungskomponente binden kann, geformt wird. Oft wird ferner ein Verfahren eingesetzt, weiter umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einer nicht-spezifischen Immunglobulin-Zusammensetzung, die aus der selben Art wie die isolierende Bindungskomponente stammt, wobei die Komplex-bildende Bindungskomponente ferner an die nicht-spezifische Immunglobulin- Zusammensetzung binden kann, wodurch weiterhin der interferierende Einheit-Komplex gebildet wird. Die isolierende Bindungskomponente umfasst eine aus der Maus stammende Zusammensetzung monoklonaler Antikörper, wobei die nicht-spezifische Immunglobulin-Zusammensetzung Maus-Immunglobulin umfasst und wobei die zweite Immunglobulin-Zusammensetzung Ziege-anti-Maus-Immunglobulin umfasst. Gelegentlich stammt das nicht-spezifische Immunglobulin nicht aus derselben Art wie die isolierende (Isolations-) Bindungskomponente und die Komplex-bildende Bindungskomponente kann eine Zusammensetzung sein, die gegebenenfalls zusätzlich zu der Fähigkeit zur Bindung der isolierenden Bindungskomponente die Fähigkeit zur Bindung an das nicht-spezifische Immunglobulin aufweist.
In einer weiteren häufigen Ausführungsform umfasst die isolierende Bindungskomponente ein Partikel (beispielsweise umfassend Agarose, Zellulose, Glasfaser, Magnetpartikel, Prastikoberflächen, eine Mikrotiterplatte, einen Glas-Objektträger, eine Nitrozellulosemembran, ein Zellulosederivat, ein Latexkügelchen, eine Zelle, eine Organelle, ein Protein oder Peptid, ein Teströhrchen, ein Plastikkügelchen, einen kolloidalen Goldpartikel, einen Farbpartikel, ein Magnetkügelchen, einen Quantum Dot, einen Messstab oder ein Sieb etc.) angeheftet an eine Bindungskomponente. Das Partikel umfasst oft ein aktiviertes Kügelchen. Das Partikel wird oft eingesetzt, wenn ein nicht-spezifisches Immunglobulin nicht eingesetzt wird.
Häufig umfasst der Nachweis des Analyten die Bestimmung der 7-84-Menge in der Probe. Gelegentlich umfasst der Nachweis des Analyten die Bestimmung der Menge eines anderen PTH-Fragments als 7-84 PTH in der Probe oder eines zusätzlichen Fragments. Darüber hinaus umfasst der selektive Nachweis der Kombination aus dem Analyten und der interferierenden Einheit in der Probe oft den Nachweis von Gesamt-PTH in der Probe. In dieser Ausführungsform wird der 7-84 PTH-Wert oft von dem Gesamt-PTH-Wert subtrahiert, wodurch der 1-84 PTH-Wert in der Probe erhalten wird. Häufig werden zwei Werte aus dem 7-84 PTH-Wert, dem Gesamt-PTH-Wert und/oder dem 1-84 PTH Wert ausgewählt und miteinander ins Verhältnis gesetzt. Ebenso häufig umfasst der Analyt Calcitonin und die interferierende Einheit umfasst Calcitonin oder Präprocalcitonin. Der Wert/die Werte oder Verhältnis(se) werden oft zur Diagnose, Überwachung oder als Leitfaden für die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung eingesetzt.
Häufig bindet die Indikator-Bindungskomponente an die interferierende Einheit und die isolierende Bindungskomponente wird aus der Reaktionskammer entfernt, nachdem die daran angeheftete Bindungskomponente an die interferierende Einheit bindet. Die Entfernung ist für die erfindungsgemäßen Verfahren jedoch nicht notwendig. Ebenfalls häufig umfasst das Verfahren weiterhin den Nachweis der Menge an interferierender Einheit nach Entfernung aus der Reaktionskammer und Nachweis der Analytenwerte in der Reaktionskammer nach Entfernung der interferierenden Einheit daraus. Der Analyt umfasst oft 7-84 PTH und/oder ein anderes PTH-Fragment und die interferierende Einheit umfasst 1-84 PTH. Häufig umfasst das Verfahren weiterhin die Berechnung eines Gesamt-PTH-Wertes aus den kombinierten 7-84 PTH- und 1-84 PTH-Werten.
In einer weiteren häufig eingesetzten Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, das umfasst: a) Einbringen einer Probe enthaltend oder vermeintlich enthaltend einen Analyten und eine interferierende Einheit in eine Reaktionskammer; b) Inkontaktbringen der Probe mit einer isolierenden Bindungskomponente, wobei die isolierende Bindungskomponente spezifisch an die interferierende Einheit, nicht aber an einen Analyten in der Probe bindet; c) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, die den Analyten und die interferierende Einheit in der Probe bindet; d) Inkontaktbringen der Probe mit einer Test-Festphasen-Bindungskomponente, die an den Analyten in der Probe bindet; und e) selektiver Nachweis der Bindung zwischen der Indikator- Bindungskomponente und: (i) dem Analyten; (ii) der interferierenden Einheit, und/oder (iii) der Kombination des Analyten und der interferierenden Einheit, wobei der Analyt ein Fragment, Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist, wobei Schritt (b) vor den Schritten (c) und/oder (d) durchgeführt wird und wobei die an den Analyten gebundene Test-Festphasen-Bindungskomponente und/oder die an die interferierende Einheit gebundene isolierende Bindungskomponente vor dem selektiven Nachweis (i) des Analyten oder (ii) der interferierenden Einheit gegebenenfalls aus der Reaktionskammer entfernt und in eine andere Kammer überführt werden.
Häufig wird die an den Analyten gebundene Test-Festphasen-Bindungskomponente vor dem selektiven Nachweis des Analyten oder der interferierenden Einheit aus der Reaktionskammer entfernt und in eine andere Kammer überführt wird und wobei die Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem Analyten und die Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und der interferierenden Einheit selektiv bestimmt werden, wobei eine derartige Bestimmung die Bestimmung der Mengen des Analyten und der Menge der interferierenden Einheit in der Probe umfasst.
Oft sind der Analyt und die interferierende Einheit nach dem selektiven Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und der Kombination des Analyten und der interferierenden Einheit in der Reaktionskammer präsent. Ebenfalls oft wird der Analyt nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der isolierenden Bindungskomponente aus der Reaktionskammer entfernt wird. Der Analyt wird häufig mit der Indikator-Bindungskomponente und/oder der Test-Festphasen-Bindungskomponente entweder (i) bei Kontakt mit der anderen Reaktionskammer oder (ii) nach Entfernung in eine andere Reaktionskammer in Kontakt gebracht. Die andere Kammer umfasst oft ein Gefäß wie ein Teströhrchen, worin keine nennenswerte Bindungsreaktion stattfindet.
Häufig umfasst der Nachweis des Analyten die Bestimmung der Menge an 7-84 PTH in der Probe und der Nachweis der interferierenden Einheit die Bestimmung der Menge an 1-84 PTH in der Probe. Oft wird die Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem Analyten in der anderen Kammer nachgewiesen. Häufig umfasst die interferierende Einheit einen anderen oder zweiten Analyten. Das Verfahren schließt ferner oft die Berechnung eines Gesamt-PTH-Wertes aus den kombinierten Werten von 7-84 PTH, 1-84 PTH und gegebenenfalls eines anderen PTH-Fragments wie 1-34 PTH ein. Auch wird eine Auswahl von zwei Werten aus der 7-84-Menge, der Gesamt-PTH-Menge und der 1-84 PTH-Menge im Verhältnis zueinander verglichen. Der Wert/die Werte und/oder das Verhältnis/die Verhältnisse werden oft zur Diagnose, Überwachung oder als Leitfaden für die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung eingesetzt. Dies Krankheiten schließen häufig adynamische Knochenerkrankung und einen hohen Knochenumsatz ein, der von normalem Knochenumsatz verschieden ist.
In einer manchmal eingesetzten Ausführungsform umfasst der Analyt 7-84 PTH und die interferierende Einheit 1-84 PTH, 1-34 PTH und/oder 1-37 PTH, wobei das Verfahren ferner die Bestimmung der Mengen an 1-84 PTH in der Probe durch einen direkten 1-84 PTH-Test umfasst, wie im Stand der Technik bekannt oder hier vorgestellt (siehe unten).
Häufig ist die isolierende Bindungskomponente derart an eine Wand der Reaktionskammer angeheftet ist, dass die Probe nach Einführen von zumindest einem Teil der Probe in die Reaktionskammer mit der isolierenden Bindungskomponente in Kontakt kommt.
Auch kommt häufig vor, dass die Indikator-Bindungskomponente weiterhin eine nachweisbare Markierung umfasst. Gelegentlich ist die Indikator-Bindungskomponente mit einer nachweisbaren Markierung markiert und die Indikator-Bindungskomponente umfasst eine erste markierte Indikator-Bindungskomponente, die spezifisch an den Analyten bindet, wie auch eine zweite (oder andere) markierte Indikator-Bindungskomponente, die spezifisch an die interferierende Einheit bindet, wobei der markierende Bestandteil der ersten markierten Indikator-Bindungskomponente bezogen auf den markierten Bestandteil der zweiten markierten Indikator-Bindungskomponente auf unterscheidbare Weise nachgewiesen werden kann. Häufig kann die erste markierte Indikator-Bindungskomponente bezüglich des Nachweises von dem Markierungsbestandteil der zweiten markierten Indikator-Bindungskomponente unterschieden werden und zwar dadurch, dass der Komplex aus markierter Indikator-Bindungskomponente/der interessierendem Analyt aus der ersten Reaktionskammer entfernt werden.
In einer häufig vorkommenden Ausführungsform ist die Krankheit oder Erkrankung Osteoporose, Nierensteinleiden oder renale Osteodystrophie. Gleichfalls häufig werden die hier vorgestellten Verfahren in der Prognose, Diagnose und/oder Behandlungsüberwachung von familärer Hypocalciurie, Hypercalcämie, multipler endokriner Adeomatose Typ I und II, Osteoporose, Paget's Knochenleiden, Hyperparathyreoidismus, Pseudohyperparathyreoidismus, Nierenversagen, renaler Osteopathie, adynamischer niedriger Knochenumsatznierenerkrankung, hoher Knochenumsatznierenerkrankung, Osteomalazie, Osteofibrose, Graves Leiden, beim Ausmaß chirurgischer Entfernung der Nebenschilddrüse, Übersuppression mit Vitamin D oder einem Vitamin D-Analog oder einem Calcimimetikum oder Calcium oder chronischer Urämie eingesetzt. Häufig ist der Hyperparathyreoidismus primärer Hyperparathyreoidismus, verursacht durch primäre Hyperplasie oder ein Adenom von einer oder mehreren Nebenschilddrüsen, oder er ist sekundärer Hyperparathyreoidismus, der durch Nierenversagen verursacht ist. Auch wird die Bindung zwischen Analyt und/oder interferierender Einheit und der Bindungskomponente häufig durch ein Testformat analysiert, ausgewählt aus beispielsweise einem Enzymgebundenen Immunadsorptionstest (ELISA), einem Immunblot, einer Immunpräzipitation, einem Radioimmuntest (RIA), einer Immunfärbung, einer Latexagglutination, einem indirekten Hämagglutinationstest (IHA), Komplementbindung, einem indirekten Fluoreszenztest (IFA), Nephelometrie, einem Fluß-zytometrischen Test, einem Chemilumineszenztest, einem lateralen Fluß-Immuntest, einem immunradiometrischen Test (IRMA), einem μ-Fang(„capture")-Test, linearer Membranflusschromatographie, einem Inhibitionstest, einem Energietransfertest, einem Aviditätstest, einem turbidimetrischen Immuntest und einem zeitlich aufgelösten Cryptat-Emissionstest (TRACE).
In einer weiteren häufig eingeschlossenen Ausführungsform umfasst der Bindungskomponenten-Bestandteil der blockierenden Bindungskomponente, der Indikator-Bindungskomponente und/oder der Test-Festphasen-Bindungskomponente jeweils einen Antikörper, ein Antikörperfragment, oder einen Bestandteil eines spezifischen Bindungspaares.
In einer noch anderen Ausführungsform wird eine Verbesserung in einem Immuntest der Art bereitgestellt, welcher zur Bestimmung der Gesamt-PTH-Menge in einem Subjekt verwendet wird, wobei die Verbesserung ein Mittel zur spezifischen und direkten Messung der 7-84 PTH-Werte in einer Probe umfasst. Wenn nötig, wird eine Verbesserung in einem Immuntest der Art bereitgestellt, welcher zur Bestimmung der Gesamt-PTH-Menge in einem Subjekt verwendet wird, wobei die Verbesserung ein Mittel zur spezifischen und direkten Messung der Menge eines PTH-Fragmentes zusätzlich zu der oder verschieden von der 7-84 PTH-Menge in einer Probe umfasst. Häufig besteht die Gesamt-PTH-Menge in dem Subjekt aus einer 1-84 PTH-Menge, einer 7-84 PTH-Menge und gegebenenfalls PTH-Fragmenten, die nicht das 7-84 PTH darstellen.
Häufig umfasst der Bindungskomponenten-Bestandteil der blockierenden Bindungskomponente, der Indikator- Bindungskomponente und der Festphasen-Bindungskomponente einen Antikörper, ein Antikörperfragment, einen Rezeptor oder einen Bestandteil eines spezifischen Bindungspaares.
In einer häufig eingesetzten Ausführungsform umfasst die interferierende Einheit vollständiges PTH und der Analyt ein PTH-Fragment; wobei die interferierende Einheit Procalcitonin und der Analyt ein Präproalcitonin umfasst; wobei die interferierende Einheit Procalcitonin und der Analyt Calcitonin umfasst; wobei die interferierende Einheit gastrisches inhibitorisches Peptid (GIP) und der Analyt Glucagon-ähnliches Peptid (GLP) umfasst; wobei die interferierende Einheit GIP-1 und der Analyt GLP-1 umfasst; wobei die interferierende Einheit GIP-2 und der Analyt GLP-2 umfasst; wobei die interferierende Einheit eine Isoform von Creatinkinase (CK), ausgewählt aus Muskel-(CK-MM)-, Hybrid (CK-MB)- und Hirn (CK-BB)-Isoformen und der Analyt eine von der interferierenden Einheit verschiedene CK-Isoform ist; oder wobei die interferierende Einheit Proinsulin und der Analyt Insulin umfasst; wobei die interferierende Einheit Osteocalcin und der Analyt ein Osteocalcinfragment umfasst; oder die interferierende Einheit adrenocorticotrophes Hormon (ACTH) und der Analyt ein ACTH-Fragment umfasst. In einer häufig gewählten Ausführungsform umfasst der Analyt 7-84 PTH und die interferierende Einheit umfasst 1-84 PTH.
In einer häufigen Ausführungsform befindet sich die Markierung auf der Indikator-Bindungskomponente, die ein Substrat, ein Chromogen, ein Katalysator, eine chemilumineszierende Verbindung, eine partikuläre Markierung, eine fluoreszierende Markierung, eine enzymatische Markierung, eine kolorimetrische Markierung, eine Farbmarkierung, eine radioaktive Markierung oder eine magnetische Markierung ist. Häufig ist die Indikator-Bindungskomponente jedoch nicht markiert. Sie kann jedoch markiert werden, wodurch der Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem Zielliganden oder einem anderen Bestandteil eines spezifischen Bindungspaares ermöglicht wird. Beispielsweise kann die Indikator-Bindungskomponente einen Maus-anti-Mensch-Antikörper umfassen, der vermittels der Einführung einer nicht-spezifischen Markierung umfassend ein Anti-Maus-Immunglobulin markiert werden kann. Weitere Zwei-Schritt-Markierungsverfahren kommen in Betracht und sind im Stand bekannt.
Häufig ist ferner, dass die Test-Festphase eine Microtiterplatte, ein Glas-Objektträger, eine Nitrozellulosemembran, eine Nitrozellulose-Membran, ein Latexkügelchen, eine Zelle, ein Teströhrchen, ein Plastikkügelchen, ein kolloidaler Goldpartikel, ein Farbpartikel, ein Magnetkügelchen oder ein Quantum Dot, innerhalb der vorstehend angegebenen Möglichkeiten ist.
In einer weiteren häufigen Ausführungsform stellt diese Offenbarung ein neues Verfahren zum spezifischen Nachweis von 1-84 PTH bereit. In dieser Ausführungsform wird häufig ein Verfahren zum Nachweis von vollständigem PTH in einer Probe in Gegenwart von PTH-Fragmenten bereitgestellt, umfassend: a) Inkontaktbringen einer Probe, die vollständiges PTH und/oder ein PTH-Fragment enthält oder vermeintlich enthält, mit einer blockierenden Bindungs-Komponente-Zusammensetzung enthaltend eine Bindungskomponente, die spezifisch an vollständiges PTH und (das) PTH-Fragment(e) in der Probe bindet, so dass ein einzigartiges Epitop, das auf dem vollständigen PTH, nicht aber auf dem PTH-Fragment vorhanden ist, von der Bindungskomponente in der blockierenden Bindungskomponente-Zusammensetzung nicht gebunden wird; b) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wobei die Bindung der Indikator-Bindungskomponente mit dem einzigartigen Epitop auf dem vollständigen PTH ermöglicht wird, das von der blockierenden Bindungskomponente-Zusammensetzung nicht gebunden wurde, wobei die Indikator-Bindungskomponente nicht an das/die PTH-Fragment(e) bindet; und c) Nachweis der Bindung zwischen dem vollständigen PTH und der Indikator- Bindungskomponente, wobei die Gegenwart und/oder Menge des vollständigen PTH in der Probe bestimmt wird, wobei Schritt (a) vor Schritt (b) durchgeführt wird. Häufig umfasst die blockierende Bindungskomponente-Zusammensetzung eine Reihe an monoklonalen Antikörpern oder einen polyklonalen Antikörper, wobei die monoklonalen oder polyklonalen Antikörper gegen den gesamten Bereich umfassend 9-34 PTH oder einen Teil davon gerichtet sind. Es kommt ebenfalls häufig vor, dass die Indikator-Bindungskomponente einen Antikörper umfasst, der gegen den gesamten Bereich umfassend 1-34 PTH oder einen Teil davon gerichtet ist. Eine oft eingeschlossene Ausführungsform betrifft auch Verfahren, weiterhin umfassend das Inkontaktbringen einer Test-Festphasen-Bindungskomponente mit der Probe, wobei die spezifische Bindung des vollständigen PTH und/oder des PTH-Fragmentes/der PTH-Fragmente vor dem Nachweis der Bindung zwischen dem gesamten und der Indikator-Bindungskomponente ermöglicht wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Zusammensetzung bereit gestellt, die für die Vorbehandlung einer Probe zur Bestimmung der Menge an 7-84 PTH in der Probe eingesetzt werden kann, unter Verwendung eines wie hier beschriebenen Gesamt-PTH-Tests enthaltend eine Bindungskomponente spezifisch für den gesamten Bereich des PTH-Moleküls umfassend 1-9 PTH oder 1-15 PTH oder einen Teil davon, wobei die Bindungskomponente an eine Festphase gebunden ist. In einer weiteren Ausführungsform wird eine andere Zusammensetzung bereitgestellt, die in der Vorbehandlung einer Probe zur Bestimmung der Menge an 1-84 PTH in der Probe eingesetzt werden kann, unter Verwendung eines Gesamt-PTH-Tests, wie hier vorgestellt, enthaltend eine Bindungskomponente spezifisch für den gesamten Bereich des PTH-Moleküls umfassend 15-34 PTH oder 7-34 PTH oder einen Teil davon, wobei die Bindungskomponente an eine Festphase gebunden ist. Die vorstehend genannte Zusammensetzung kann weiter Mittel zur Messung von Gesamt-PTH umfassen.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Nachweis von vollständigem PTH in einer Probe bereit gestellt, umfassend a) Inkontaktbringen einer flüssigen Probe, die vollständiges PTH und/oder PTH-Fragmente enthält oder vermeintlich enthält, mit einer Indikator-Bindungskomponente, wodurch man die spezifische Bindung der Indikator-Bindungskomponente an das vollständige PTH ermöglicht; b) Inkontaktbringen der Probe mit einer isolierenden Bindungskomponente, wodurch die spezifische Bindung der isolierenden Bindungskomponente an das vollständige PTH ermöglicht wird; c) Inkontaktbringen der Probe mit einer nicht-spezifischen Bindungskomponente, wobei die nicht-spezifische Bindungskomponente aus derselben Art stammt wie die isolierende Bindungskomponente; d) Inkontaktbringen der Probe mit einer Komplex-bildenden Bindungskomponente, wodurch die Bindung der Komplex-bildenden Bindungskomponente an die an vollständiges PTH gebundene, isolierende Bindungskomponente und die nicht-spezifische Bindungskomponente und damit eine Komplexbildung ermöglicht wird, wobei der Komplex in Lösung ausfällt; und e) Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem vollständigen PTH, wobei einer der Schritte (a), (b) oder (c), oder alle Schritte vor Schritt (d) durchgeführt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zum Nachweis von PTH und Fragmenten und/oder Analoga davon in einer Probe bereit gestellt, umfassend a) Inkontaktbrigen einer Probe, die vollständiges PTH und ein N-terminales PTH-Fragment oder ein Analogon enthält oder vermeintlich enthält, mit einer isolierenden Bindungskomponente, wodurch die spezifische Bindung der isolierenden Bindungskomponente an das vollständige PTH, nicht jedoch an das N-terminale PTH-Fragment oder Analogon ermöglicht wird; b) Inkontaktbringen der Probe mit einer Test-Festphasen-Bindungskomponente, wodurch die spezifische Bindung der Test-Festphasen-Bindungskomponente an das N-terminale PTH-Fragment oder Analogon, aber nicht an das vollständige PTH ermöglicht wird; c) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wodurch die Bindung der Indikator-Bindungskomponente an das vollständige PTH und das N-terminale PTH-Fragment oder Analogon ermöglicht wird; und d) Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem vollständigen PTH, dem N-terminalen PTH-Fragment oder Analogon und/oder der Kombination aus vollständigem PTH und dem N-terminalen PTH-Fragment oder Analogon, wobei Schritt (a) vor den Schritten (b) und/oder (c) durchgeführt wird.
In einer noch anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Nachweis eines nicht-typischen PTH (auch als nicht-typisches 1-84 PTH bezeichnet oder neue Form des PTH (nfPTH)) in einer Probe bereit gestellt, umfassend: a) Testen einer Probe unter Verwendung eines Tests auf die PTH Gesamtmenge, der den Nachweis von 1-84 PTH und 7-84 PTH, sofern in der Probe vorhanden, erlaubt, wodurch eine PTH Gesamtmenge in der Probe bestimmt wird; b) Testen der Probe unter Verwendung eines Tests auf vollständiges PTH, der spezifisch 1-84 PTH nachweist und auch ntPTH misst, sofern in der Probe vorhanden, wodurch eine kombinierte Menge an 1-84 PTH und ntPTH in der Probe bestimmt wird; c) Testen der Probe gemäß einem Verfahren der vorstehend zitierten Ausführungsformen zur Bestimmung einer 7-84 PTH-Menge in der Probe; und d) Subtraktion der Differenz zwischen der 7-84 PTH-Menge und der PTH-Gesamtmenge von der kombinierten Menge an 1-84 PTH und ntPTH, wodurch die ntPTH-Menge in der Probe bestimmt wird. Bei Verwendung einer geeigneten Auswahl an spezifischen Reagenzien können die Schritte a), b) und/oder c) mit den hier beschriebenen, zusammengestellten Verfahren durchgeführt werden. Somit umfasst diese Ausführungsform häufig eine Kombination von einer oder mehreren Ausführungsformen, die hier an anderer Stelle beschrieben sind.
Die 7-84 PTH-Mengen können mit jedem geeigneten Verfahren ermittelt werden. Beispielsweise kann die 7-84 PTH-Menge durch ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit ermittelt werden, umfassend a) Inkontaktbringen einer Probe, die einen Analyten und/oder eine interferierende Einheit enthält oder vermeintlich enthält, mit einer blockierenden Bindungskomponente, wodurch die spezifische Bindung der blockierenden Bindungskomponente an die interferierende Einheit, nicht jedoch an den Analyten ermöglicht wird, falls der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorkommt; b) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wodurch eine spezifische Bindung der Indikator-Bindungskomponente an den Analyten, aufgrund der Gegenwart der daran gebundenen Blockierungsbindungskomponente nicht jedoch an die interferierende Einheit ermöglicht wird; und c) Nachweis der Bindung des Analyten an die Indikator-Bindungskomponente, wodurch die Gegenwart und/oder die Menge des Analyten in der Probe nachgewiesen wird, wobei der Analyt ein Fragment, ein Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist und Schritt (a) vor oder gleichzeitig mit Schritt (b) durchgeführt wird.
In einem anderen Beispiel kann die Menge an 7-84 PTH durch ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit ermittelt werden, umfassend a) Inkontaktbringen einer Probe, die einen Analyten und/oder eine interferierende Einheit enthält oder vermeintlich enthält, mit einer isolierenden Bindungskomponente, wodurch die spezifische Bindung der isolierenden Bindungskomponente an die interferierende Einheit, nicht jedoch an den Analyten ermöglicht wird, falls der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorkommt, wobei die interferierende Einheit durch Bindung an die isolierende Bindungskomponente aus einer löslichen Phase in der Probe entfernt wird; b) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wodurch eine Bindung der Indikator-Bindungskomponente an den Analyten ermöglicht wird; und c) Nachweis der Bindung des Analyten an die Indikator- Bindungskomponente, wodurch die Gegenwart und/oder die Menge des Analyten in der Probe nachgewiesen wird, wobei der Analyt ein Fragment, ein Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist und Schritt (a) vor oder gleichzeitig mit Schritt (b) durchgeführt wird.
In einem noch anderen Beispiel kann die 7-84-Menge bestimmt werden durch ein Verfahren, das umfasst: a) Einbringen einer Probe enthaltend oder vermeintlich enthaltend einen Analyten und eine interferierende Einheit in eine Reaktionskammer; b) Inkontaktbringen der Probe mit einer isolierenden Bindungskomponente, wobei die isolierende Bindungskomponente spezifisch an die interferierende Einheit, nicht aber an einen Analyten in der Probe bindet; c) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, die den Analyten und die interferierende Einheit in der Probe bindet; d) Inkontaktbringen der Probe mit einer Test-Festphasen-Bindungskomponente, die an den Analyten in der Probe bindet; und e) selektiver Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und: (i) dem Analyten; (ii) der interferierenden Einheit, und/oder (iii) der Kombination des Analyten und der interferierenden Einheit, wobei der Analyt ein Fragment, Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist, wobei Schritt (b) vor den Schritten (c) und/oder (d) durchgeführt wird und wobei die an den Analyten gebundene Test-Festphasen-Bindungskomponente und/oder die an die interferierende Einheit gebundene isolierende Bindungskomponente vor dem selektiven Nachweis (i) des Analyten oder (ii) der interferierenden Einheit gegebenenfalls aus der Reaktionskammer entfernt und in eine andere Kammer überführt werden.
Oft wird eine Auswahl von zwei Werten aus der 7-84-Menge, der Gesamt-PTH-Menge, der 1-84 PTH-Menge und/oder der ntPTH-Menge im Verhältnis zueinander verglichen. Ferner wird häufig das Verhältnis zur Diagnose, Überwachung oder als Leitfaden für die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung, wie adynamische Knochenerkrankung, hohe Knochenumsatzerkrankung oder Osteoporose eingesetzt.
Häufig wird die gemessene Gesamt-PTH-Menge, 1-84 PTH-Menge, 7-84 PTH-Menge, 1-34 PTH-Menge, ntPTH-Menge, die Menge eines anderen PTH-Fragments oder ein daraus berechnetes Verhältnis in einen Algorithmus eingespeist, wodurch das Risiko ermittelt wird, dass ein Subjekt einer Nierenerkrankung oder -störung entwickeln wird. Der Algorithmus wird unter Verwendung von Patientendaten generiert und trägt verschiedenen Variablen Rechnung. Beispielsweise kann der Algorithmus die Bewertung an einem oder mehreren der folgenden Parameter einschließen: 7-84 PTH-Mengen, 1-84 PTH-Mengen, Gesamt-PTH-Mengen, 1-34 PTH-Mengen, ntPTH-Mengen, Mengen eines anderen PTH-Fragments oder Verhältnisse ausgewählter PTH-Bestandteile (z.B. Gesamt-PTH, 7-84 PTH, 1-84 PTH, 1-34 PTH, ntPTH oder eines anderen PTH-Fragments). Üblicherweise stellt die Verwendung eines Algorithmus eine beispielhafte Methode zur Korrelierung einer oder mehrerer Variablen mit dem Risiko dar, dass ein Subjekt eine hier in Betracht kommende Krankheit oder Erkrankung/Störung entwickeln wird oder bereits hat. Die Algorithmus-Methode ist für jeden der hier in Betracht kommenden Analyten nützlich (z.B. PTH, Calcitonin etc), um eine Krankheit oder Störung zu überwachen, zu diagnostizieren und/oder einen Leitfaden für die Behandlung davon bereit zu stellen.
Auch wird häufig ein Verfahren bereitgestellt zur Überwachung, Diagnose und/oder Bereitstellung eines Leitfadens zur Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung, umfassend die Bewertung der Menge eines spezifischen Analyten oder einer interferierenden Einheit in einer Probe, wobei das Subjekt ein Risiko für eine spezifische Krankheit oder Störung aufweist oder diese bereits hat, wenn der gemessene Analyten- oder interferierende Einheit-Wert einem spezifischen, oft vorhergesagten Wert entspricht (oder darüber oder darunter liegt). Oft ist der Analyt (und die Menge davon), die interferierende Einheit (und die Menge davon) und/oder die spezifische Krankheit oder Störung vorherbestimmt. Weiterhin und auf der Basis der gemessenen Werte des Analyten oder der interferierenden Einheit wird oft ermittelt, dass ein Verhältnis von einem oder mehreren Analyten und/oder interferierenden Einheiten für die Überwachung, Diagnose und/oder als Leitfaden für die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung verwendet werden sollte. In dieser Ausführungsform wird die Menge des Analyten und/oder interferierenden Einheit als „Gate" verwendet, das anzeigt, wenn die Verwendung einer auf einem Verhältnis basierenden Bewertung der Probe eignet oder medizinisch indiziert ist. Oft kann die Menge eines Analyten oder einer interferierenden Einheit sich bei einem bestimmten Wert bewegen (häufig ein hoher oder niedriger Wert), wodurch eine Indikation einer spezifischen Krankheit oder Erkrankung angezeigt wird, ohne dass auf eine Verhältnisbasierende Analyse zurückgegriffen werden muss.
In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit bereitgestellt, umfassend a) Inkontaktbringen einer Probe, die einen Analyten und/oder eine interferierende Einheit enthält oder vermeintlich enthält, mit einer blockierenden Bindungskomponente, wodurch die spezifische Bindung der blockierenden Bindungskomponente an die interferierende Einheit, nicht jedoch an den Analyten ermöglicht wird, falls der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorkommt; b) Inkontaktbringen der Probe mit einem Analyt-Analogon und einer Bindungskomponente, wodurch eine kompetitive Bindung des Analyten und des Analyt-Analogons an die Bindungskomponente ermöglicht wird, wobei entweder das Analyt-Analogon oder die Bindungskomponente eine nachweisbare Markierung umfasst, und die Bindungskomponente nicht spezifisch an die interferierende Einheit bindet, was auf die Gegenwart der daran gebundenen blockierenden Bindungskomponente zurückzuführen ist; und c) Nachweis der kompetitiven Bindung des Analyten und des Analyt-Analogons an die Bindungskomponente, wodurch die Gegenwart und/oder die Menge des Analyten in der Probe nachgewiesen wird, wobei der Analyt ein Fragment, ein Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist und Schritt (a) vor oder gleichzeitig mit Schritt (b) durchgeführt wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit bereit gestellt, umfassend a) Inkontaktbringen einer Probe, die einen Analyten und/oder eine interferierende Einheit enthält oder vermeintlich enthält, mit einer isolierenden Bindungskomponente, wodurch eine spezifische Bindung der isolierenden Bindungskomponente an die interferierende Einheit ermöglicht wird, nicht jedoch an den Analyten, sofern der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorkommt, wobei die interferierende Einheit durch Bindung an die isolierende Bindungskomponente aus der löslichen Phase in der Probe entfernt wird; b) Inkontaktbringen der Probe mit einem Analyt-Analogon und einer Bindungskomponente, wodurch eine kompetitive Bindung des Analyten und des Analyt-Analogons an die Bindungskomponente ermöglicht wird, wobei entweder das Analyt-Analogon oder die Bindungskomponente eine nachweisbare Markierung enthält; und c) Nachweis der kompetitiven Bindung des Analyten und des Analyt-Analogon an die Bindungskomponente, wodurch die Gegenwart und/oder die Menge des Analyten in der Probe ermittelt wird, wobei der Analyt ein Fragment, ein Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist und Schritt (a) vor oder gleichzeitig mit Schritt (b) durchgeführt wird.
In Bemühungen, nicht-(1-84)PTH zu reinigen und zu sequenzieren, sind modifizierte HPLC Acetonitril-Gradienten eingesetzt worden, um nicht-(1-84)PTH von hPTH 1-84 besser zu trennen. Dabei ist eine neue amino-terminale molekulare PTH-Form entdeckt worden, die sich von PTH(1-84) und nicht-(1-84)PTH unterscheidet. Diese wird nur durch einen Zyklaseaktivierungs(CA)-PTH-Test entdeckt, der spezifisch für die ersten vier Aminosäuren der PTH-Struktur ist (Gao P, et al., J bone Min Res 2001;16:605-614). Die bereitgestellte Information zeigt, dass diese neue Form von PTH (nfPTH) biologisch in gleicher Weise wirkt wie PTH(1-84) voller Länge, das eine intakte N-terminale Sequenz zur Bindung und Aktivierung des PTH1R aufweist, und eine intakte C-terminale Sequenz zur Bindung und Aktivierung des C-PTH-Rezeptors. Um nicht-(1-84)PTH von PTH(1-84) zu trennen, wurden neue HPLC-Gradienten entwickelt. Damit wurde beobachtet, dass der in früher verwendeten Gradienten mit hPTH(1-84) gleichzeitig eluierende Immunreaktivitäts-Peak nunmehr in 2 Einheiten weiter aufgetrennt werden kann, wo zur Messung ein Zyklase-aktivierender PTH-(CAP oder CA-PTH)-Test mit einer einzigartigen markierten Antikörperspezifität für die Aminosäuren am oder in der Nähe des N-Terminus der PTH-Struktur eingesetzt wird. Wie hier vorgestellt, wurde diese neue Auflösung mittels Analyse von Seren aus 6 normalen Individuen (NI), 5 Patienten mit primärem Hyperparathyreoidismus (PHP), und 8 Serumpools aus Patienten mit Nierenversagen (RF) mit erhöhten PTH-Konzentrationen untersucht. Ein Gesamt (T)-PTH-Test (der sowohl PTH als auch nicht-(1-84)PTH misst, mit Erkennung durch markierte Antikörper in dem (15-34)-Bereich, der CA-PTH-Test und ein Carboxy-terminaler (C)-PTH-Test (der sowohl PTH wie auch nicht-(1-84) PTH und C-terminale Fragmente von PTH misst), der spezifisch für den (65-84) Bereich ist, wurden eingesetzt, um Basis-PTH-Werte zu messen und Aliquots aus HPLC-Elutionen zu analysieren. Wie erwartet, waren die T-PTH-Ergebnisse höher als die CA-PTH-Ergebnisse in allen NI (3,13±0,37 gegenüber 2,29±0,33 pmol/L, p<0,01). Da CA-PTH ähnlich oder höher ist als CA-PTH in 3/5 Patienten mit PHP, war die Differenz zwischen den zwei Tests minimal (25,7±26 gegenüber 23,1±24,1 pmol/L, NS). Der Unterschied zwischen T-PTH und CA-PTH war ausgeprägter und in allen RF-Patienten vorhanden (47±35 gegenüber 33,3±26,1 pmol/L, p<0,01). Der CA-PTH-Test erkannte einen Immunreaktivitäts-Peak, der vor dem hPTH(1-84) lief, der unterschiedlich zu dem nicht-(1-84)-Peak war, der durch T-PTH-Test erkannt wurde. Dieser Peak stellte 8,13±2,45% (Bereich 4,7-12) der CA-PTH-Immunreaktivität in NI dar, 24,7±23,3% (Bereicht 9-63,3) in PHP-Patienten und 22,2±7,3% (Bereich 17,3 bis 35) in RF-Patienten dar. Dieser Peak war im T-PTH-Test nicht ersichtlich, jedoch im C-PTH-Test. Dies suggeriert die strukturelle Unversehrtheit der N-terminalen (z.B. PTH_1-4, PTH_1-6, PTH_1-9) und der PTH_65-84 Bereiche, jedoch mit einer Modifikation im Bereich, der die Aminosäurepositionen (15-34) umfasst, die für die Nichtreaktivität in dem T-PTH-Test verantwortlich sind. Eine post-translationale Modifikation innerhalb dieses Bereichs stimmt mit unseren Befunden überein. Obwohl wir nicht durch eine Theorie gebunden werden möchten, geht unsere gegenwärtiges Verständnis dahin, dass eine derartige Modifikation eine Phosphorylierung des Serinrests in Position 17 der PTH-Struktur umfasst. Weitere hier ins Auge gefasste Studien klären die Struktur dieses neuen amino-terminalen PTH-Moleküls und der zugehörigen biologischen Implikationen auf.
In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Identifizierung einer neuen molekularen PTH-Form (nfPTH) bereitgestellt, umfassend: (a) Erhalt einer biologischen Probe aus einem Subjekt, (b) Messung der PTH-Menge in der Probe mittels einem oder mehreren PTH-Immuntests, wobei jeder dieser einer oder mehreren PTH-Immuntests einen Antikörper einsetzt, der spezifisch an einen PTH-Peptidbereich bindet, umfassend einen N-terminalen Bereich, einen mittel-terminalen Bereich, einen C-terminalen Bereich oder eine Kombination davon, wobei jeder der einen oder mehreren PTH-Immuntests einen Antikörper verwendet, der spezifisch an einen PTH-Peptidbereich bindet, oder eine Kombination davon, der/die unterschiedlich sind von all denen, in dem einen oder den mehreren PTH-Immuntests eingesetzten; (c) Vergleich der durch den einen oder die mehreren PTH-Immuntests gemessenen PTH-Mengen; und (d) Identifizierung der Gegenwart eines nfPTH in der Probe, beruhend auf den PTH-Mengen, die in dem einen oder den mehreren PTH-Immuntests gemessen wurden. Häufig wird das durch die vorliegende Ausführungsform identifizierte nfPTH isoliert. Die Isolierung des nfPTH wird häufig mit Hochdurchsatzflüssigchromatographie (HPLC) erreicht, wie hier beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die ein nfPTH enthält. Häufig wird eine derartige Zusammensetzung durch die hier beschriebenen Verfahren identifiziert. In einer häufig verwendeten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Bestimmung und/oder Überwachung der biologischen Aktivität eines isolierten amino-terminalen PTH-Moleküls bereitgestellt, das durch die hier genannten Verfahren isoliert wurde, umfassend: Durchführung eines biologischen Tests zur Bestimmung der Wirkung des amino-terminalen PTH-Moleküls auf Osteoblasten-Osteoclasten- und/oder Chondrozyten-Aktivität. Vergleiche, zum Beispiel, Loveridge, N., et al., Endocrinology 128(4):1938-46 (1991). Gelegentlich wird eine derartige Bestimmung und/oder Überwachung durch Bewertung der PTH-Agonisten- oder PTH-Antagonisten-Aktivität des amino-terminalen PTH-Moleküls erreicht, wobei die Wirkung des amino-terminalen PTH-Moleküls auf die Aktivität alkalischer Phospatase und/oder Glukose-6-Phosphatdehydrogenase in Osteoclasten- und Osteoblastenzellen gemessen wird.
In einer anderen häufig eingesetzten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Messung der zirkulierenden Werte eines nfPTH bereitgestellt, das umfasst: (a) Isolierung eines nfPTH-Moleküls; (b) Erzeugung eines für das nfPTH-Molekül spezifischen Antikörpers; (b) Erhalt einer biologischen Probe aus einem Subjekt; (c) Kontakt der Probe mit dem Antikörper, sodass der Antikörper an das nfPTH-Molekül, sofern vorhanden, in der Probe bindet; und (d) Messung des an das nfPTH-Molekül gebundenen Antikörpers.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Identifizierung eines Zustands oder einer Krankheit in einer Probe bereitgestellt, umfassend (a) Erhalten einer biologischen Probe; (b) Messung von zwei oder mehr Werten von PTH-Bestandteilen ausgewählt aus Gesamt-PTH-Mengen, PTH-Fragment-Mengen, Mengen an vollständigem PTH oder einer Menge an nfPTH in der Probe; (c) Vergleich der gemessenen Mengen der zwei oder mehr Mengen an PTH-Komponenten, wodurch ein Zustand oder eine Krankheit in der Probe identifiziert wird. Häufig wird der Vergleich in der Form eines Verhältnisses oder Anteils sein. Gelegentlich wird der PTH-Bestandteil umfassend nfPTH gemessen und ein Zustand oder eine Krankheit wird auf der Basis davon identifiziert. In einer häufigen Ausführungsform gehört der Zustand oder die Krankheit zu einem mit dem Knochenumsatz verwandten Zustand oder einer derartigen Krankheit wie primärer Hyperparathyreoidismus, adynamische niedrige Knochenumsatzerkrankung, normaler Knochenumsatz, hoher Knochenumsatz, Osteoporose, Hypercalzaemie, Hypocalzaemie, Osteoperose, unter anderem. In einer gelegentlich angewendeten Ausführungsform sind solche Verfahren nützlich, um derartige Zustände oder Krankheiten zu überwachen oder als Leitfaden für die Behandlung davon zu dienen, wobei die Mengen des einen oder der mehreren PTH-Bestandteile eingesetzt werden, um die Therapie in einem von derartigen Zuständen oder Krankheiten betroffenen Subjekt zu bestimmen und/oder zu leiten.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Behandlung einer mit dem Knochenumsatz in Zusammenhang stehenden Störung bereitgestellt, umfassend die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein bedürftiges Subjekt, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein isoliertes nfPTH-Molekül zusammen mit einem physiologisch akzeptablen Exzipienten umfasst. Häufig ist die mit dem Knochenumsatz in Beziehung stehende Störung adynamische niedrige Knochenumsatzerkrankung oder Osteoporose; gelegentlich ist die mit dem Knochenumsatz in Beziehung stehende Krankheit jedoch Hyperparathyreoidismus oder renale Osteodystrophie.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1(A-D) stellt eine exemplarische Methode dar unter Verwendung der Spezifität durch Blockierung (SBB) Technologie.
2(A-D) stellt eine exemplarische Methode dar unter Verwendung selektiver Epitop-Expositions(SEE)-Technologie.
3(A-G) stellt eine andere exemplarische Methode dar unter Verwendung der SBB-Technologie zur Messung von 1-84 PTH.
4(A-F) stellt eine exemplarische Methode dar unter Verwendung Cyclase-aktivierender Parathormon-Präzipitationsentfernungs-(CAP-PR) Technologie.
5(A-D) stellt eine exemplarische Methode dar unter Verwendung von Analytentfernung durch Insolubilisierungs(ARI)technologie.
6(A-E) stellt eine exemplarische Methode dar unter Verwendung der Trio-Kit-Technologie.
7(A-H) stellt eine exemplarische Methode dar unter Verwendung der Fällungsreagenstechnologie zur Messung von 1-84 PTH.
8(A-E) stellt eine exemplarische Methode dar zum Nachweis großer N-terminaler PTH-Fragmente und Analoga wie 1-34 PTH (oder Teriparatid) und 1-84 PTH.
9(A-F) stellt eine exemplarische Methode dar unter Verwendung der PCT-PR Technologie unter Verwendung von präzipitierenden Antikörpern.
10(A) stellt ein HPLC-Profil dar, welches 7-84 PTH, 1-84 PTH und ntPTH Prozentwerte und Mengen in einem Organismus misst. 10(B-H) stellt eine exemplarische Methode dar zur Messung von 7-84 PTH, 1-84 PTH und ntPTH Mengen.
11 stellt Eigenschaften von PTH-Tests mit PTH Standards dar, welche in dieser Studie verwendet wurden, und ein HPLC Profil eines Patienten mit primärer Hyperparathyreoidie. Standards waren hPTH(1-84)
hPTH(7-84)❍, [tyr³⁴] hPTH(19-84)Δ, hPTH(39-84)
hPTH(39-68)☐, hPTH(53-84)
and hPTH(64-84)
Der CA-PTH-Test reagierte nur mit hPTH(1-84) und erkannte einen Immunreaktivitäts-Peak, welcher zusammen mit hPTH(1-84) in Position 45 co-eluierte und einen neuen Immunreaktivitäts-Peak in Position 42. Der T-PTH Test reagierte mit hPTH(1-84) und hPTH(7-84) auf ähnliche Weise und erkannte ebenfalls hPTH(1-84) in Position 45 und nicht-(1-84)PTH in den Positionen 36 bis 41. Der C-PTH Test reagierte hauptsächlich mit hPTH(39-84) und weniger mit hPTH(1-84) und hPTH(7-84). C-PTH erkannte HPLC-Peaks, welche bei zwei anderen Versuchen identifiziert wurden ebenso, wie verschiedene weniger hydrophobe Peaks (Positionen 15, 16, 19, 23, 30).
12 stellt HPLC-Profile von zirkulierendem PTH in verschiedenen Populationen dar, nachgewiesen durch die T-PTH und CA-PTH Tests. Der Acetonitril-Gradient 2 aus 3 wird verwendet. Individuelle Ergebnisse werden als helle Linie dargestellt, und Durchschnittsergebnisse einer Gruppe als dunklere, dickere Linien. Die Ergebnisse sind qualitativ ähnlich zu 1, aber quantitativ verschieden für jede Gruppe. Die planimetrische Bewertung dieser Peaks ist in Tabelle 2 zusammengefasst.
13 stellt den Einfluss von verschiedenen Acetonitril-Gradienten auf die Trennung von zirkulierenden molekularen PTH-Formen mit Hilfe von HPLC dar, unter Verwendung des Serums eines Patienten mit primärer Hyperparathyreoidie und drei verschiedene PTH-Tests. Der T-PTH Test wies hPTH(1-84) (Position 45) und nicht-(1-84)PTH (Positionen 36 bis 41) nach. Der CA-PTH Test wies ebenfalls hPTH(1-84) (Position 45) und einen Peak wandernd vor dem hPTH(1-84) (Positionen 42, 43) und verschieden von nicht-(1-84)PTH nach. Dieser Peak reagierte in dem C-PTH Test, während nicht-(1-84)PTH viel weniger reaktiv war.
14 stellt HPLC-Profile von oxidiertem hPTH(1-84) (links) und hPTH(7-84) (rechts) dar. Acetonitril-Gradient 2 (gezeigt in 3) wurde verwendet. Ergebnisse mit dem Ca-PTH (unterbrochene Linie) und T-PTH (durchgezogene Linie) Test. Die üblichen Positionen von hPTH(1-84) und hPTH(7-84) sind durch Pfeile dargestellt. Oxidiertes hPTH(1-84) wanderte in Position 38, wohingegen oxidiertes hPTH(7-84) in Position 36 wanderte. Oxidiertes hPTH(1-84) reagierte ebenso in den CA-PTH und T-PTH Tests, wohingegen oxidiertes hPTH(7-84) nur in dem T-PTH Test reagierte.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Im Sinne der Klarheit der Offenbarung, und nicht zum Zwecke der Beschränkung wird die Beschreibung der Erfindung in die folgenden Unterabschnitte gegliedert.
A. DEFINITIONEN
Soweit nicht anders definiert, haben alle Begriffe des Standes der Technik, Begrifflichkeiten und andere wissenschaftliche Begriffe oder Terminologien, welche hier verwendet werden die gleiche Bedeutung, wie sie normalerweise von einem für das erfindungsgemäße Fachgebiet relevanten Durchschnittsfachmann verstanden wird. In einigen Fällen werden Begriffe, welche allgemein verstanden werden hier definiert aufgrund Klarheit und/oder zu Referenzzwecken und die Einbringung solcher Definitionen sollte nicht notwendigerweise so verstanden werden, dass es eine essentielle Differenz zu dem gibt, was allgemein im Stand der Technik darunter verstanden wird. Viele der Techniken und Verfahren, welche hier beschrieben sind oder durch Bezugnahme hier inkorporiert werden, werden sehr gut vom Fachmann verstanden und allgemein unter Verwendung konventioneller Verfahren eingesetzt. Soweit geeignet werden Verfahren, welche kommerziell erhältliche Kits und Reagenzien verwenden, üblicherweise gemäß den vom Hersteller definierten Protokollen und/oder Parametern ausgeführt, es sei denn dies ist anders beschrieben. Alle Patente, Patentanmeldungen, publizierte Patentanmeldungen und andere Publikationen, welche hier auftauchen, sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit beinhaltet. Sollte eine Definition aus diesem Abschnitt in Widerspruch zu einer Definition in Patenten, Patentanmeldungen, publizierten Patentanmeldungen und anderen Publikationen stehen, die hier durch Bezugnahme inkorporiert sind, oder in irgendeiner anderen Weise damit nicht konsistent sein, so ist die Definition in diesem Abschnitt ausschlaggebend, und nicht die Definition, welche durch Bezugnahme inkorporiert ist.
Die Begriffe „ein/eine", wie hier verwendet, bedeuten „mindestens einer/eine" oder „eine(r) oder mehrere".
Der Ausdruck „Antigen", wie hier verwendet, bezieht sich auf jeden Stoff, welcher in der Lage ist, an einen Antikörper zu binden oder gegen welchen Antikörper hergestellt werden können.
Der Begriff „Antikörper", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Polypeptid, welches im Wesentlichen durch ein Immunglobulin-Gen, oder Immunglobulin-Gene kodiert wird oder Fragmente davon. Die bekannten Immunglobulin-Gene umfassen sowohl die Kappa, Lamda, Alpha, Gamma, Delta, Epsilon, und Mu konstanten Regionen als auch Myriaden von Immunglobulin-Genen variabler Regionen. Leichte Ketten werden entweder als Kappa oder Lamda klassifiziert. Schwere Ketten werden als Gamma, Mu, Alpha, Delta oder Epsilon klassifiziert, welche wiederum die Immunglobulinklassen IgG, IgM, IgA, IgD, und IgE kennzeichnen. Typischerweise ist ein Antikörper ein Immunoglobulin, welches einen Bereich auf einer Oberfläche oder in einer Vertiefung aufweist, welcher spezifisch an eine spezielle räumliche und polare Organisation eines anderen Moleküls bindet und daher als komplementär dazu definiert ist. Der Antikörper kann polyklonal oder monoklonal sein. Antikörper können ein komplettes Immunoglobulin oder Fragment davon beinhalten. Fragmente davon können Fab, Fv und F(ab')₂, Fab' und ähnliches beinhalten. Antikörper können auch chimäre Antikörper oder Fragmente davon beinhalten, welche mit Hilfe rekombinanter Methoden hergestellt werden.
Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Antikörper, welcher aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wurde. Das bedeutet, die Antikörper, die die Population umfassen, sind identisch mit der Ausnahme von möglichen natürlich auftretenden Mutationen, welche in geringerer Häufigkeit auftreten.
Der Ausdruck „Polypeptid", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Polymer von mindestens 4, 5, 6, 7, oder 8 Aminosäuren. In der ganzen Beschreibung werden die Standard drei-Buchstaben oder ein-Buchstaben Bezeichnungen für Aminosäuren verwendet. Im Stand der Technik wird dieser Begriff häufig in Austausch verwendet mit dem Begriff „Peptid" oder „Protein".
Der Ausdruck „gesamtes (vollständiges) Parathormon" oder „vollständiges PTH", wie hier verwendet, bezieht sich auf das komplette PTH-Molekül oder eine Variante, ein Fragment, Derivat oder Analogon davon. Häufig stimuliert dieses Molekül die Osteoclastenbildung, Osteoblastenbildung, Knochenresorption, Stimulierung der Adenylatcyclase und den Knochen Turnover, um Blut-Kalzium Konzentrationen zu erhöhen. 1-84 PTH ist ein Beispiel eines vollständigen PTH. Für diesbezügliche Zwecke wird der Name „Parathormon (PTH)" verwendet, auch wenn andere Namen auftauchen können. Andere Namen von PTH beinhalten, zum Beispiel, Parathormon und Parathyrin. Versuchswerte für ein vollständiges PTH können erhalten werden durch Messung einer Probe mit einer Vielzahl von Tests. Vollständiges PTH bezieht sich auf jegliche Varietät von Spezies-abhängigen Formen des Moleküls. Siehe, z. B., Caetano, A.R., et al., Equus Genome Res. 9(12): 1239-1249 (1999) (Pferd), U.S. Patentanmeldungsveröffentlichung US 2002/0110871 A1 (Ratte, Maus, Rind, Hund, Schwein), U.S. Patent Nrn. 6,689,566 and 6,743,590 (Mensch). Umfasst sein soll ferner vollständiges PTH mit konservativen Aminosäureaustauschen, welche die biologische Aktivität nicht-substantiell ändern. Geeignete konservative Aminosäure-Austausche sind dem Fachmann bekannt und können üblicherweise ohne Änderung der biologischen Aktivität des resultierenden Moleküls durchgeführt werden. Der Fachmann weiß, dass einzelne Aminosäureaustausche in nicht-essentiellen Regionen eines Polypeptids im Allgemeinen die biologische Aktivität nicht substantiell ändern (siehe, z. B., Watson et al, Molecular Biology of the Gene, 4. Auflage, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Seite 224).
Der Begriff „Parathormonagonist" oder „PTH Agonist", wie hier verwendet, bezieht sich auf das vollständige PTH-Molekül, oder eine Variante, ein Fragment, Derivat, oder Analogon davon. Häufig stimuliert dieses Molekül Osteoclastenbildung, Osteoblastenbildung, Knochenresorption, Stimulierung von Adenylatcyclase und Knochen-Turnover, um die Blut-Kalzium Konzentration zu erhöhen. Gesamtes PTH, z. B., 1-84 PTH ist ein Beispiel eines PTH-Agonisten, aber andere PTH-Agonisten werden auch in Erwägung gezogen. Ein PTH-Agonist bezieht sich des weiteren auf Peptide, die PTH-Agonisten Eigenschaften haben. Umfasst sein soll ferner gesamtes PTH mit konservativen Aminosäureaustauschen, welche die biologische Aktivität nicht-substantiell ändern. Geeignete konservative Aminosäure-Austausche sind dem Fachmann bekannt und können üblicherweise ohne Änderung der biologischen Aktivität des resultierenden Moleküls durchgeführt werden. Der Fachmann weiß, dass einzelne Aminosäureaustausche in nicht-essentiellen Regionen eines Polypeptids im Allgemeinen die biologische Aktivität nicht substantiell ändern (siehe, z. B., Watson et al, Molecular Biology of the Gene, 4. Auflage, 1987, The Benjamin/Cummings Pub.Co., Seite 224).
Der Begriff „Parathormon Antagonist" oder „PTH-Antagonist", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein PTH-Fragment oder Derivat, welches biologische Aktionen ausführt, die allen oder einem Teil der Effekte eines PTH-Agonisten entgegensteuern und/oder der seine eigene biologische Aktivität besitzt, unabhängig von einem PTH-Agonisten. 7-84 PTH ist ein Beispiel eines PTH-Antagonisten. Wie weiter unten beschrieben, werden eine Reihe von anderen Beispielen von PTH-Antagonisten bedacht. Dieser Ausdruck beinhaltet häufig ein PTH-Fragment oder Derivat, welches keine biologische PTH-Agonisten Aktivität aufweist. Geeignete konservative Aminosäure-Austausche sind dem Fachmann bekannt und können üblicherweise ohne Änderung der biologischen Aktivität des resultierenden Moleküls durchgeführt werden. Der Fachmann weiß, dass einzelne Aminosäureaustausche in nicht-essentiellen Regionen eines Polypeptids im Allgemeinen die biologische Aktivität nicht substantiell ändern (siehe, z. B., Watson et al, Molecular Biology of the Gene, 4. Auflage, 1987, The Benjamin/Cummings Pub.Co., Seite 224).
Konservative Aminosäureaustausche können häufig in einem Protein ohne Änderung sowohl der Konformation als auch der Funktion des Proteins hergestellt werden. Solche Änderungen umfassen das Ersetzen von Isoleucin (I), Valin (V), oder Leucin (L) durch irgendeine andere dieser hydrophoben Aminosäuren; Aspartat (D) durch Glutamat (E) und umgekehrt; Glutamin (Q) durch Asparagin (N) und umgekehrt; und Serin (S) durch Threonin (T) und umgekehrt. Andere Austausche können auch als konservative Austausche angesehen werden, abhängig von der Umgebung der besonderen Aminosäure und ihrer Rolle in der dreidimensionalen Struktur des Proteins. Zum Beispiel können Glycin (G) und Alanyn (A) häufig ausgetauscht werden, ebenso wie Alanin (A) und Valin (V). Methionin (M), welches relativ hydrophob ist, kann häufig durch Leucin und Isoleucin und manchmal durch Valin ausgetauscht werden. Lysin (K) und Argenin (R) können häufig ausgetauscht werden in Bereichen, in welchen die signifikante Eigenschaft des Aminosäurerestes seine Ladung ist und die unterschiedlichen pK-Werte dieser beiden Aminosäuren nicht bedeutsam sind. Andere Änderungen können in speziellen Umgebungen ebenfalls als „konservativ" erachtet werden, Siehe, z. B., BIOCHEMISTRY 13-15 (L. Stryer Hrsg., 2. Auflage 1981); Henikoff et al., PNAS (1992) 89:10915-10919; Lei et al., J. Biol. Chem. (1995) 270 (20):11882-6.
Der Ausdruck "Gesamt-PTH", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Kombination von vollständigem (gesamten) PTH und PTH-Fragmenten in einem Organismus. In einer anderen Ausführungsform bezieht sich der Ausdruck „Gesamt-PTH" auf eine Kombination von PTH-Agonist und PTH-Antagonist in einem Organismus. Häufig bezieht sich diese „Kombination" auf eine Messung von Mengen von jedem dieser Substituenten des Gesamt-PTHs in einem Organismus. Diese Messung umfasst häufig den Nachweis von 1-84 PTH und 7-84 PTH in einer Probe. Häufig umfasst diese Messung den Nachweis von 1-84 PTH, 7-84 PTH und einem anderen PTH-Fragment, wie 1-34 PTH oder 1-37 PTH in einer Probe. Manchmal schließt die Messung des Gesamt-PTH das Messen von ntPTH ein.
Der Ausdruck „Probe", wie hier verwendet, bezieht sich auf alles, was einen Analyten enthält, für welchen ein Analyten-Test gewünscht ist. Die Probe kann eine biologisch Probe sein, wie eine biologische Flüssigkeit oder biologisches Gewebe. Beispiele für biologische Flüssigkeiten umfassen Urin, Blut, Plasma, Serum Speichel, Samen, Stuhl, Sputum, cerebrale Spinalflüssigkeit, Tränen, Mucus, amniotische Flüssigkeit oder ähnliches. Biologische Gewebe umfassen ein Zellaggregat, gewöhnlich einer speziellen Art zusammen mit ihrer interzellulären Substanz, welche eine der strukturellen Materialien eines/r Menschen, Tiers, Pflanze, Bakteriums, Pilz oder viralen Struktur bilden, einschließlich Binde-, Epithel-, Muskel- und Nervengewebe. Beispiele von biologischen Geweben umfassen ebenfalls Organe, Tumoren, Lymphknoten, Arterien und (eine) einzelne Zelle(n).
Der Ausdruck „Organismus/Individuum/Subjekt", wie hier verwendet ist, nicht auf eine(n) spezifische(n) Art oder Probentyp eingegrenzt. Zum Beispiel kann der Ausdruck „Organismus/Individuum/Subjekt" sich beziehen auf einen Patienten, häufig einen menschlichen Patienten. Jedoch ist dieser Ausdruck nicht begrenzt auf Menschen und kann daher eine Reihe von Säugerspezies umfassen.
Der Ausdruck „bindet spezifisch", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Bindungsspezifität eines spezifischen Bindungspaars. Erkennung eines speziellen Ziels durch einen Antikörper in der Anwesenheit anderer möglichen Zielstrukturen ist eine Eigenschaft dieser Bindung. Der Ausdruck „Komponente/Bestandteil/Mitglied eines Bindungspaares" bezieht sich auf eine Komponente eines spezifischen Bindungspaars, d. h. zwei verschiedener Moleküle, wobei eines der Moleküle spezifisch an das zweite Molekül mit Hilfe chemischer oder physikalischer Eigenschaften bindet. Die zwei Moleküle sind der Gestalt in Beziehung, dass ihre Bindung zueinander so ist, dass sie ihren Bindungspartner von anderen Testkonstitutenten unterscheiden können, welche ähnliche Eigenschaften besitzen. Die Komponenten der Bindungskomponentenpaare werden als Ligand und Rezeptor (Anti- Ligand), Bestandteil eines spezifischen Bindungspaares (sbp) und sbp-Partner, und in ähnlicher Weise bezeichnet. Ein Molekül kann auch ein sbp-Partner sein, und zwar für eine Aggregation von Molekülen. Zum Beispiel ein Antikörper, welcher gegen einen Immunkomplex eines zweiten Antikörpers und sein korrespondierendes Antigen hergestellt wurde, kann als ein sbp-Bestandteil für den Immunkomplex angesehen werden.
Zusätzlich zu den Antigen- und Antikörper-Bindungskomponenten-Bestandteilen schließen andere Bindungs-Komponenten zum Beispiel ohne Eingrenzung Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lectine, komplementäre Nucleotidsequenzen, komplementäre Peptidsequenzen, Effektor- und Rezeptormoleküle, Enzym-Co-Faktoren und Enzyme, Enzyminhibitoren und Enzyme, eine Peptidsequenz und ein Antikörper spezifisch für die Sequenz oder das gesamte Protein, polymere Säuren und Basen, Farbstoffe und Proteinbinder, Peptide und spezifische Proteinbinder, z. B. Ribunuclease, S-Peptid und Ribunucleasse S-Protein, Metalle und ihre Chelatoren und ähnliches ein. Des weiteren können Bindungskomponenten Bestandteile enthalten, die Analoga der ursprünglich bindenden Komponenten sind, zum Beispiel ein Analytanalog oder einen Bindungskomponenten-Bestandteil, welche durch rekombinante Techniken oder molekulare Techniken hergestellt wurden.
Sollte die Bindungskomponente ein Immunoreaktant sein, kann sie, zum Beispiel, ein Antikörper, Antigen, Hapten oder ein Komplex davon sein. Sollte ein Antikörper verwendet werden, kann es sich um einen monoclonalen oder polyclonalen Antikörper, ein rekombinantes Protein oder einen rekombinanten Antikörper, einen chimäreren Antikörper, (eine) Mischung von Fragmenten davon, als auch eine Mischung von Antikörper und anderen bindenden Komponenten sein. Die Details der Herstellung solcher Antikörper und ihre Eignung zur Verwendung als spezifische bindende Komponenten sind dem Fachmann bekannt.
Der Begriff „Markierung", wie hier verwendet, bezieht sich auf jede Substanz, welche in der Lage ist, ein Signal zu produzieren, welches durch visuelle oder instrumentelle Mittel nachweisbar ist. Verschiedene Markierungen, welche geeignet sind, in der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden, schließen Markierungen ein, welche Signale entweder durch chemische oder physikalische Eigenschaften produzieren. Solche Markierungen können Enzyme und Substrate, Chromogene, Katalysatoren, fluoroszierende Substanzen, chemilumineszierende Substanzen und radioaktive Markierungen beinhalten. Andere Markierungen umfassen partikuläre, fluoreszierende, enzymatische, kolorimetrische, Farb-, radioaktive, magnetische oder andere Markierungen, welche in dem Stand der Technik bekannt sind. Andere sich eignende Markierungen enthalten partikuläre Markierungen, wie zum Beispiel colloidale metallische Partikel, wie zum Beispiel Gold, colloidale nicht-metallische Partikel wie Selen oder Tellur, Farb- oder gefärbte Partikel, wie zum Beispiel gefärbtes Plastik oder einen angefärbten Mikroorganismus, organische Polymerlatexpartikel und Liposomen, gefärbte Kügelchen, polymere Mikrokapseln, Säcke, Erythrocyten, Erythrocyten-„Ghosts" oder andere Vesikel enthaltend direkt sichtbare Substanzen und ähnliches. Typischerweise wird eine visuell detektierbare Markierung verwendet als die Markierungskomponente des Markierungsreagenz, wobei eine direkte visuelle oder instrumentale Ablesung des Vorhandenseins oder der Menge des Analyten in der Testprobe möglich ist, ohne die Notwendigkeit zusätzlicher signalproduzierender Komponenten an den Detektionsstellen.
Die Auswahl einer speziellen Markierung ist nicht kritisch für die vorliegende Erfindung, aber die Markierung wird in der Lage sein, ein nachweisbares Signal zu generieren entweder aus sich selbst heraus oder sie kann instrumentell nachgewiesen werden oder kann nachgewiesen werden im Zusammenhang mit einem oder mehreren zusätzlichen signalproduzierenden Komponenten, wie einem Enzym/Substrat signalproduzierenden System. Eine Reihe von verschiedenen Markierungsreagenzien kann durch Änderung entweder der Markierung oder der spezifischen Bindungskomponente des Markierungsreagenz hergestellt werden; ein Fachmann weiß, dass die Auswahl die Begutachtung des Analyten, welcher nachgewiesen werden muss, beinhaltet, als auch des entsprechenden Nachweisverfahrens.
Beispielhafte Markierungen beinhalten weiterhin Biotin (nachweisbar durch Bindung an markierten Avidin oder Streptavidin) und Enzyme, wie zum Beispiel Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase (nachweisbar durch Hinzufügung von Enzymsubstraten zur Herstellung eines gefärbten Reaktionsproduktes).
Nachweismethoden sind allgemein abhängig vom Typus der Markierung. Eine mit einem Radioisotop markierte Sonde oder Zielnukleinsäure kann durch Autoradiographie nachgewiesen werden. Alternativ kann die Sonde oder die Zielnukleinsäure, welche mit einer Fluoreszenzeinheit markiert ist, durch Fluorimetrie nachgewiesen werden, wie dem Fachmann bekannt ist. Eine Hapten- oder Ligand- (z. B. Biotin-) markierte Nukleinsäure kann nachgewiesen werden durch Hinzufügung eines Antikörpers oder eines Antikörperpigments zum Hapten oder eines Proteins, welches den markierten Liganden bindet (z. B. Avidin).
Der Ausdruck „nachweisbares Signal", wie hier verwendet, wird in seiner weitesten Bedeutung verwendet. Dieser Ausdruck bezieht sich auf ein Signal welches in den beschriebenen Verfahren, Zusammensetzungen und Kits produziert wird und nachweisbar ist durch Beobachtung unter Verwendung von Instrumenten oder anderswie. Das Signal muss kein visuelles Signal sein. Ohne Einschränkung hängt der Typus des hergestellten Signals davon ab, welches Markierungs-Reagenz verwendet wird.
Der Ausdruck „Partikel", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Festphase, der nicht-flüssige Phase, Einheit/Hälfte. Partikel der vorliegenden Offenbarung sind unterscheidbar von flüssigen Proben (z. B. unlöslich). Der Ausdruck bezieht sich häufig auf ein Gel, insbesondere ein Polymergel wie ein Agerosegel. Dieser Ausdruck bezieht sich auch auf ein Kügelchen; und alle Arten von Kügelchenmaterialien sind berücksichtigt. Manchmal bezieht sich der Ausdruck „Partikel" auf einen Teil einer Festphase wie zum Beispiel eine Gefäßwand. Im Allgemeinen ist ein Partikel der vorliegenden Erfindung in der Lage, mit den Bindungskomponenten und Markierungen verbunden zu werden, häufig unter Verwendung eines Linkers. Häufig umfasst die Bindung zwischen einer Bindungskomponente und einem Partikel eine kovalente Bindung, nonkovalente Bindungen sind aber auch möglich.
Der Ausdruck „vermeidet Bindung", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Spezifität einer bestimmten Bindungskomponente wie Antikörper oder Antikörperfragmente. Antikörper oder Antikörperfragmente welche die Bindung an eine spezielle Einheit vermeiden, enthalten im Allgemeinen eine Spezifität so, dass ein hoher Prozentsatz der speziellen Einheit durch solche Antikörper oder Antikörperfragmente nicht gebunden werden würde. Dieser Prozentsatz liegt im Allgemeinen innerhalb der akzeptablen Kreuzreaktivitäts-Prozentsatzes mit interferierenden Einheiten bei Versuchen, welche Antikörper verwenden, welche gegen ein bestimmtes, nachzuweisendes Ziel gerichtet sind. Häufig vermeiden es Antikörper oder Antikörperfragmente der vorliegenden Offenbarung, mehr als 90% einer interferierenden Einheit zu binden, obwohl höhere Prozentzahlen auch eindeutig in Betracht kommen und bevorzugt sind. Zum Beispiel vermeiden Antikörper oder Antikörperfragmente der vorliegenden Offenbarung, etwa 91 %, etwa 92%, etwa 93%, etwa 94%, etwa 95%, etwa 96%, etwa 97%, etwa 98%, und etwa 99% oder mehr einer interferierenden Einheit zu binden. Weniger häufig vermeiden Antikörper oder Antikörperfragmente der vorliegenden Offenbarung mehr als etwa 15% oder etwa 50% oder etwa 60%, oder etwa 70% oder etwa 75%, oder etwa 80% oder etwa 85% einer interferierenden Einheit zu binden. Diesbezüglich trifft die obige Beschreibung auf spezielle Bindungskomponenten zu, die spezifisch an interferierende Einheiten binden, eher als interessierende Analyten, auch wenn die Spezifität umgedreht ist.
Der Begriff „Krankheit oder Erkrankung/Störung", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen pathologischen Zustand in einem Organismus resultierend aus, zum Beispiel, einer Infektion oder einem genetischen Defekt und ist gekennzeichnet durch identifizierbare Symptome.
Der Ausdruck „hoher Knochen Turnover/Umsatz" wie hier verwendet, bezieht sich auf die Knochen Turnover-Rate, welche über der normalen Knochen-Turnover Rate in einem Organismus liegt und manifestiert ist als eines der Symptome in einem Organismus, welcher Hyperparathyreoidie aufweist. Ohne durch irgendeine Theorie gebunden zu sein hat ein Organismus, welcher an schwerer Hyperparathyreoidie erkrankt ist, eine höhere Turnover-Rate als der gleiche Organismus, welcher es mit einer milden Form der Hyperparathyreoidie zu tun hat. Jedoch haben beide eine hohe Knochen-Turnover-Rate verglichen mit einem normalen Organismus und einem Organismus, welche eine adynamische Knochenkrankheit aufweist.
Der Ausdruck „N-terminal", wie hier verwendet, bezieht sich auf den Aminoterminus eines Polypeptids, wie des PTH-Polypeptids, welcher eine freie Aminogruppe aufweist. Mit Bezug auf ein PTH-Fragment bezieht sich ein N-terminales PTH-Fragment auf einen nicht-vollständigen zusammenhängenden Teil eines PTHs, welches einen intakten N-Terminus besitzt. Ein „intakter N-Terminus", wie hier verwendet, bezieht sich auf PTH oder ein PTH-Fragment, welches eine intakte erste Position eines PTH_1-84 besitzt. Diese erste Position wird hier auch als „ursprünglicher N-Terminus" oder „ursprünglich N-terminal" bezeichnet.
Der Ausdruck „C-Terminal", wie hier verwendet, bezieht sich auf den Carboxyterminus eines Polypeptids wie ein PTH-Polypeptid, welches eine freie Carboxylgruppe hat. Bezüglich eines PTH-Fragments bezieht sich ein C-terminales PTH-Fragment auf einen nicht-vollständigen zusammenhängenden Teil eines PTH, welcher einen intakten C-Terminus hat. Ein „intakter C-Terminus", wie hier verwendet, bezieht sich auf PTH oder ein PTH-Fragment, welches eine intakte 84ste Position eines PTH_1-84 hat. Diese 84ste Position wird hier auch als „ursprünglicher C-Terminus" oder „ursprünglich C-terminal" bezeichnet.
Sollte, wie hier beschrieben, der Analyt PTH sein, dann umfasst der Analyt häufig 7-84 PTH, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Häufig umfasst der Analyt 1-84 PTH oder vollständiges PTH. Daher, wie hier verwendet, ist ein Analyt nicht automatisch der Analyt und der andere die interferierende Einheit, da die spezifische Methode vorschreibt, was was ist. Weiterhin, auch wenn ein Analyt ausgewiesen ist als eine interferierende Einheit und ein anderer Analyt (oder interessierender Analyt), kann der erstgenannte ebenfalls mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen werden. Die Unterscheidung von Analyt und interferierender Einheit wird zur vereinfachenden Darstellung gemacht und ist nicht limitierend.
Der Ausdruck „Säuger", wie hier verwendet, bezieht sich auf jegliche Säugerklasse von Spezies. Der Ausdruck „Säuger", wie hier verwendet, bezieht sich häufig auf Menschen, menschliche Organismen oder menschliche Patienten.
Der Ausdruck „funktionelles Derivat oder Fragment" eines PTH-Agonisten oder PTH-Antagonisten, bezieht sich, wie hier verwendet, auf ein Derivat oder Fragment von PTH, welches im wesentlichen seine Funktion als PTH-Agonist oder PTH-Antagonist beibehält.
Normalerweise behält ein Derivat oder Fragment mindestens 50% seiner PTH-Agonisten- oder PTH-Antagonisten-Aktivität bei. Vorzugsweise behält das Derivat oder Fragment mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% und 100% seiner PTH-Agonisten- oder PTH-Antagonisten-Aktivität bei. Es ist auch möglich, dass ein funktionelles Derivat oder Fragment eines PTH-Agonisten oder PTH-Antagonisten eine höhere PTH-Agonisten- oder PTH-Antagonisten-Aktivität aufweist, als ein parentales Molekül, von welchen das funktionelle Derivat oder Fragment abgeleitet ist.
B. BLOCKIERUNGSVERFAHREN
1. Spezifität durch Blockieren
In einer Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt zum direkten Nachweis oder Messen eines „Analyten" oder eines „interessierenden Analyten" (beide Ausdrücke können im Austausch verwendet werden) in Gegenwart einer interferierenden Einheit (z.B. eines zu messenden ungewünschten Analyten). Im Allgemeinen weisen die interferierende Einheit und der interessierende Analyt unterschiedliche Eigenschaften auf. Zum Beispiel kann der interessierende Analyt 7-84 PTH umfassen, und die interferierende Einheit kann 1-84 PTH umfassen. Manchmal kann der interessierende Analyt ein PTH-Fragment umfassen, das unterschiedlich ist zu oder zusätzlich zu 7-84 PTH (wie 1-34 PTH oder 1-37 PTH) und die interferierende Einheit umfasst 1-84 PTH und/oder ein PTH-Fragment. Hierbei handelt es sich um Polypeptide unterschiedlicher Länge, welche, abhängig von ihrer Homologie, häufig mit Agenzien kreuzreagieren oder in anderer Weise miteinander interagieren, welche das eine oder andere messen sollen. Häufig umfasst der Analyt ein Fragment, eine Isoform oder Analogon der interferierenden Einheit.
Die Bindungskomponenten-Blockierungsmethodologie, wie hier beschrieben, sorgt für das Messen eines spezifischen interessierenden Analyten in einer Probe und zwar auch in Gegenwart einer interferierenden Einheit. Des weiteren erlaubt dieses Verfahren die Messung eines interessierenden Analyten, welcher einen Teil eines gesamten Moleküls umfasst, welches die interferierende Einheit umfasst. Der interessierende Analyt kann zum Beispiel 7-84 PTH umfassen und die interferierende Einheit kann 1-84 PTH umfassen. 7-84 PTH umfasst im Allgemeinen ein großes Polypeptidfragment von 1-84 PTH.
In einer Ausführungsform wird eine Probe von einem Organismus erhalten, wobei die Probe vermeintlich einen interessierenden Analyten und eine interferierende Einheit enthält. Häufig muss ein solcher Verdacht, dass die Probe diese Konstituenten enthält, nicht vorhanden sein. Ein Vorhandensein kann jedoch einfach angenommen werden, da sie typische Konstituenten solcher Probentypen darstellen. Eine blockierende Bindungskomponenten-Zusammensetzung wird mit der Probe unter Bedingungen kontaktiert, welche Komponentenbindungen erlauben. Die Bindungskomponenten in der Blockierungsbindungskomponenten-Zusammensetzung, welche häufig einen Antikörper umfasst, binden dann an die interferierende Einheit. Die Bindungskomponente hat eine Spezifität dergestalt, dass sie im Allgemeinen nicht den interessierenden Analyten binden wird. Eine Indikator-Bindungskomponente wird dann mit der Probe kontaktiert, wobei die Indikator-Bindungskomponente einen interessierenden Analyten bindet, aber nicht eine interferierende Einheit bindet, welche durch die Bindungskomponente gebunden oder blockiert wurde. Sterische Behinderung oder allosterische Änderungen sind im Allgemeinen verantwortlich für das nicht Auftreten einer Bindung zwischen der interferierenden Einheit, welche gebunden ist durch die Blockierungsbindungskomponente und die Indikator-Bindungskomponente. Häufig ist die Indikator-Bindungskomponente markiert oder kann mit einem nachweisbaren Marker markiert werden. Die Probe wird dann gegebenenfalls kontaktiert mit einer Festphasenbindungskomponente, welche spezifisch an den interessierenden Analyten und/oder die interferierende Einheit bindet. Alternativ kann die Indikator-Komponente hinzugefügt werden, nachdem die Probe mit der Testfestphase kontaktiert wurde oder gleichzeitig damit. Die Testfestphasenbindungskomponente umfasst im Allgemeinen eine Bindungskomponente, welche an die Festphase geheftet ist. Danach wird der interessierende Analyt durch Nachweis der Bindung zwischen dem Analyten und der Indikator-Bindungskomponente nachgewiesen. Im Allgemeinen gilt: Sollte die Indikator-Bindungskomponente markiert sein, wird dieser Nachweis unternommen unter Verwendung von angemessenen Mitteln zum Nachweis des spezifischen Markierungstyps auf der Indikator-Bindungskomponente. Sollte die Indikator-Bindungskomponente nicht markiert sein, wird ein Markierungsmittel mit der Probe kontaktiert und eine Bindung mit der Indikator-Bindungskomponente ermöglicht. Das Nachweismittel kann ein Bestandteil eines spezifischen Bindungspaars sein, umfassend die Indikator-Bindungskomponente und das Nachweismittel. Die Indikator-Bindungskomponente kann auch ein spezifischer oder nicht-spezifischer Ligand des Markierungsmittels sein. Markierungsmittel, welche hier berücksichtigt sind, inkorporieren nachweisbare Markierungen gemäß der vorliegenden Beschreibung. Eine beispielhafte durch ein Blockierungsverfahrens erreichte Spezifität ist in 1 dargestellt. Der interessierende Analyt wird im Allgemeinen dergestalt nachgewiesen, dass das Vorhandensein, die Menge und/oder die Konzentration in der Probe (und dem Organismus) bestimmt wird.
In 1 ist ein beispielhaftes Verfahren dargestellt, wobei der erste Schritt darin besteht, einen blockierenden Antikörper zu einer Probe hinzuzufügen, welcher (1) an einen ersten großen Teil des 1-84 PTH bindet, ohne in der Lage zu sein, an 7-84 PTH zu binden (Kandidaten beinhalten 1-13 PTH, 1-14 PTH, 1-15 PTH usw.); und (2) eine sterische Behinderung dergestalt bereitstellt, dass Antikörper, welche an 7-84 PTH binden, nicht an 1-84 PTH binden werden. Des weiteren wird eine Festphase häufig mit der Probe kontaktiert, um einen Test zur Bestimmung der Konzentration des Analyten durchzuführen, wobei in dieser Ausführungsform nur 7-84 PTH (der Analyt) gemessen wird, weil der blockierende Antikörper den Nachweisantikörper hindert zu binden und das Testsandwich der Indikator-Bindungskomponente und Festphasen-Testbindungskomponente mit dem 1-84 PTH auszubilden.
Mehrere Bindungs-/Blockierungskomponenten werden häufig verwendet, wobei jede eine unterschiedlich Spezifität aufweist. Multiple Bindungskomponenten sind zum Beispiel nützlich, wenn mehrere interferierende Einheiten oder Epitope mit unterschiedlichen Eigenschaften in der Probe vorhanden sind. Mehrere Bindungskomponenten können auch verwendet werden, wenn es gewünscht ist, Bindungskomponenten zu verwenden, welche eine Spezifität für einen kleineren Teil der interferierenden Einheit haben. Zusammen werden sie verwendet zur Bindung eines vorbestimmten Teils der interferierenden Einheit oder definierter Epitope.
Eine blockierende Blockierungsbindungskomponente ist im Allgemeinen nützlich, um einen Teil der interferierenden Einheit zu blockieren, wodurch die Bindung dieses Teils durch eine weitere Testbindungskomponente verhindert oder inhibiert wird. Manchmal ist eine Blockierungsbindungskomponente nützlich, um eine andere Bindungskomponente von der Bindung der interferierenden Einheit durch allosterische Effekte abzuhalten resultierend aus der Bindung der Blockierungsbindungskomponente. Solche allosterischen Effekte können einen Konformationswechsel in der Struktur der interferierenden Einheit umfassen. Häufig jedoch inhibiert oder verhindert die Blockierungsbindungskomponente das Binden durch eine weitere Bindungskomponente aufgrund sterischer Behinderung.
In einer häufigen Ausführungsform umfasst die blockierende Bindungskomponente einen Antikörper. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die interferierende Einheit vollständiges Parathormon (PTH) oder ein Fragment hiervon und der blockierende Antikörper umfasst einen Antikörper mit einer Spezifität für 1-3 PTH, 1-4 PTH, 1-5 PTH, 1-6 PTH, 1-7 PTH, 1-8 PTH, 1-9 PTH, 1-10 PTH, 1-11 PTH, 1-12 PTH, 1-13 PTH, 1-14 PTH, 1-15 PTH, 1-16 PTH, 1-17 PTH, 1-18 PTH, 1-19 PTH, 1-20 PTH, 1-21 PTH, 1-22 PTH, 1-23 PTH, 1-24 PTH, 1-25 PTH, 1-26 PTH, 1-27 PTH, 1-28 PTH, 1-29 PTH, 1-30 PTH, 1-31 PTH, 1-32 PTH, 1-33 PTH, 1-34 PTH, 2-5 PTH, 2-6 PTH, 2-7 PTH, 2-8 PTH, 2-9 PTH, 2-10 PTH, 2-11 PTH, 2-12 PTH, 2-13 PTH, 2-14 PTH, 2-15 PTH, 2-16 PTH, 2-17 PTH, 2-18 PTH, 2-19 PTH, 2-20 PTH, 2-21 PTH, 2-22 PTH, 2-23 PTH, 2-24 PTH, 2-25 PTH, 2-26 PTH, 2-27 PTH, 2-28 PTH, 2-29 PTH, 2-30 PTH, 2-31 PTH, 2-32 PTH, 2-33 PTH, 2-34 PTH, 3-6 PTH, 3-7 PTH, 3-8 PTH, 3-9 PTH, 3-10 PTH, 3-11 PTH, 3-12 PTH, 3-13 PTH, 3-14 PTH, 3-15 PTH, 3-16 PTH, 3-17 PTH, 3-18 PTH, 3-19 PTH, 3-20 PTH, 3-21 PTH, 3-22 PTH, 3-23 PTH, 3-24 PTH, 3-25 PTH, 3-26 PTH, 3-27 PTH, 3-28 PTH, 3-29 PTH, 3-30 PTH, 3-31 PTH, 3-32 PTH, 3-33 PTH, 3-34 PTH, 4-8 PTH, 4-9 PTH, 4-10 PTH, 4-11, PTH, 4-12 PTH, 4-13 PTH, 4-14 PTH, 4-15 PTH, 4-16 PTH, 4-17 PTH, 4-18 PTH, 4-19 PTH, 4-20 PTH, 4-21 PTH, 4-22 PTH, 4-23 PTH, 4-24 PTH, 4-25 PTH, 4-26 PTH, 4-27 PTH, 4-28 PTH, 4-29 PTH, 4-30 PTH, 4-31 PTH, 4-32 PTH, 4-33 PTH, 4-34 PTH, 5-9 PTH, 5-10 PTH, 5-11, PTH, 5-12 PTH, 5-13 PTH, 5-14 PTH, 5-15 PTH, 5-16 PTH, 5-17 PTH, 5-18 PTH, 5-19 PTH, 5-20 PTH, 5-21 PTH, 5-22 PTH, 5-23 PTH, 5-24 PTH, 5-25 PTH, 5-26 PTH, 5-27 PTH, 5-28 PTH, 5-29 PTH, 5-30 PTH, 5-31 PTH, 5-32 PTH, 5-33 PTH, 5-34 PTH, 6-9 PTH, 6-10 PTH, 6-11, PTH, 6-12 PTH, 6-13 PTH, 6-14 PTH, 6-15 PTH, 6-16 PTH, 6-17 PTH, 6-18 PTH, 6-19 PTH, 6-20 PTH, 6-21 PTH, 6-22 PTH, 6-23 PTH, 6-24 PTH, 6-25 PTH, 6-26 PTH, 6-27 PTH, 6-28 PTH, 6-29 PTH, 6-30 PTH, 6-31 PTH, 6-32 PTH, 6-33 PTH, 6-34 PTH, etc., unter anderem, abhängig von der Natur des Analyten von Interesse und der interferierenden Einheit. Obwohl weiter oben eine Spezifität bis zu Position 34 beschrieben ist, wird der blockierende Antikörper gelegentlich eine Spezifität für Positionen jenseits von 34 auf dem PTH-Molekül haben. Weiterhin werden Kombinationen von blockierenden Antikörpern ins Auge gefasst, umfassend zwei oder mehr Antikörper mit variierender, aber komplementärer Spezifität für das PTH-Molekül, gemäß den vorliegenden Verfahren.
Es werden eine Vielzahl von Analyten oder interferierenden Einheiten ins Auge gefasst. Zum Beispiel umfasst die interferierende Einheit häufig ein vollständiges PTH und der Analyt umfasst ein PTH-Fragment; oder die interferierende Einheit umfasst Präprocalcitonin oder ein Fragment hiervon und der Analyt umfasst Procalcitonin; oder die interferierende Einheit umfasst Procalcitonin und der Analyt umfasst Calcitonin; oder die interferierende Einheit umfasst das gastrische inhibitorische Polypeptid (GIP) und der Analyt umfasst Glucagonähnliches Peptid (GLP); oder die interferierende Einheit umfasst GIP-1 und der Analyt umfasst GLP-1; oder die interferierende Einheit umfasst GIP-2 und der Analyt umfasst GLP-2; oder die interferierende Einheit wird ausgewählt aus einer Isoform von Kreatinkinase (CK) ausgewählt aus den Muskel-(CK-MM), Hybrid-(CK-MB) und Gehirn-Isoformen (CK-BB) und der Analyt wird ausgewählt aus einer CK-Isoform, die sich von der interferierenden Einheit unterscheidet; oder die interferierende Einheit umfasst Proinsulin und der Analyt umfasst Insulin, oder andersherum; wobei die interferierende Einheit Osteocalcin umfasst und der Analyt ein Osteocalcin-Fragment umfasst; und wobei die interferierende Einheit ein adrenocorticotropes Hormon (ACTH)-Fragmentumfasst und der Analyt ACTH umfasst.
Wie oben angedeutet umfasst die Indikator-Bindungskomponente oftmals eine Bindungskomponente und eine detektierbare Markierung. Wie hier dargelegt, werden eine Vielzahl von Markierungstypen ins Auge gefasst. In häufigen Ausführungsformen ist die Indikator-Bindungskomponente spezifisch für den Analyten von Interesse, so dass, nach Kontakt der Probe unter Bedingungen, die Bindung ermöglichen, die Indikator-Bindungskomponente spezifisch an den Analyten von Interesse bindet. Die Indikator-Bindungskomponente hat häufig eine Spezifität, die eine Bindung an die interferierende Einheit erlauben würde, wäre da nicht die „gebundene" Anwesenheit der blockierenden Bindungskomponente.
Gelegentlich umfassen die Bindungskomponente des Indikators und die Markierungskomponente des Indikators separate Zusammensetzungen, sodass nach Inkontaktbringen der Probe mit der Bindungskomponente des Indikators und Bindung dieser Komponente an den Analyten von Interesse die detektierbare Markierungskomponente mit der Probe in Kontakt gebracht wird, die dann an die Bindungskomponente des Indikators gebunden oder angelagert wird. Hierauf wird als ein Zweischritt-Markierungsprozess Bezug genommen. Die Markierung kann an die Bindungskomponente des Indikators durch eine Vielzahl von Mitteln binden, beispielsweise können sie entsprechende Mitglieder eines spezifischen Bindungspaars oder an diese angelagert sein.
Die Indikator-Bindungskomponente kann ein Partikel umfassen, das an eine Bindungskomponente gebunden ist. In einer solchen Ausführungsform ist das Partikel grundsätzlich detektierbar oder in der Lage, detektiert zu werden, wenn die markierte Indikator-Bindungskomponente an den Analyten von Interesse gebunden ist. In einer Ausführungsform ist das Partikel ein Kügelchen eines Typs, der in der Lage ist, durch Verwendung von Durchfluss-Cytometrie untersucht zu werden. In diesem Typ von Ausführungsform ist das Kügelchen oftmals ein fluoreszierendes Kügelchen oder ist es selbst mit einer Markierung versehen, die durch Durchfluss-Cytometrie nachweisbar ist.
In einer häufigen Ausführungsform umfasst die Indikator-Bindungskomponente einen markierten Antikörper. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Analyt von Interesse vollständiges Parathormon (1-84 PTH) oder ein Fragment hiervon und die Indikator-Bindungskomponente umfasst einen Antikörper mit einer Spezifität für 1-3 PTH, 1-4 PTH, 1-5 PTH, 1-6 PTH, 1-7 PTH, 1-8 PTH, 1-9 PTH, 1-10 PTH, 1-11 PTH, 1-12 PTH, 1-13 PTH, 1-14 PTH, 1-15 PTH, 1-16 PTH, 1-17 PTH, 1-18 PTH, 1-19 PTH, 1-20 PTH, 1-21 PTH, 1-22 PTH, 1-23 PTH, 1-24 PTH, 1-25 PTH, 1-26 PTH, 1-27 PTH, 1-28 PTH, 1-29 PTH, 1-30 PTH, 7-15 PTH, 7-16 PTH, 7-17 PTH, 7-17 PTH, 7-18 PTH, 7-19 PTH, 7-20 PTH, 7-21 PTH, 7-22 PTH, 7-23 PTH, 7-24 PTH, 7-25 PTH, 7-26 PTH, 7-27 PTH, 7-28 PTH, 7-29 PTH, 7-30 PTH, 7-31 PTH, 7-32 PTH, 7-33 PTH, 7-34 PTH, 8-15 PTH, 8-16 PTH, 8-17 PTH, 8-17 PTH, 8-18 PTH, 8-19 PTH, 8-20 PTH, 8-21 PTH, 8-22 PTH, 8-23 PTH, 8-24 PTH, 8-25 PTH, 8-26 PTH, 8-27 PTH, 8-28 PTH, 8-29 PTH, 8-30 PTH, 8-31 PTH, 8-32 PTH, 8-33 PTH, 8-34 PTH, 9-15 PTH, 9-16 PTH, 9-17 PTH, 9-17 PTH, 9-18 PTH, 9-19 PTH, 9-20 PTH, 9-21 PTH, 9-22 PTH, 9-23 PTH, 9-24 PTH, 9-25 PTH, 9-26 PTH, 9-27 PTH, 9-28 PTH, 9-29 PTH, 9-30 PTH, 9-31 PTH, 9-32 PTH, 9-33 PTH, 9-34 PTH, etc., unter anderem, abhängig von der Natur des Analyten von Interesse. In der beispielhaften Ausführungsform, worin die interferierende Einheit 1-84 PTH umfasst und der Analyt von Interesse 7-84 PTH umfasst, vermeidet die Indikator-Bindungskomponente oftmals die Bindung von PTH-Fragmenten, die kleiner als 7-84 PTH sind, oder wird dadurch geblockt.
Die Bindungskomponente der Testfestphasen umfasst eine Bindungskomponente, die an eine feste Phase angeheftet oder gebunden ist. Die Bindungskomponente der Testfestphasen umfasst häufig einen Antikörper, der an eine Festphase angeheftet ist. Die Testfestphase kann, unter anderen im Fachgebiet bekannten Festphasen, eine Kammerwand umfassen, die Wand einer Säule, die Wand eines Reaktionsgefäßes, eine Platte, eine Vertiefung, ein Partikel, ein Kügelchen, eine Zelle, eine Organelle, ein Protein oder Peptid, einen Messstab, ein Sieb („screen"). Die Bindungskomponente der Testfestphasen ist nützlich zum Binden und Einfangen des markierten Analyten von Interesse. Oftmals bindet die Bindungskomponente der Testfestphasen-Bindungskomponente spezifisch den Analyten von Interesse, vermeidet aber die Bindung an die interferierende Einheit, wobei dies nicht notwendig ist. Daher bindet die Bindungskomponente der Testfestphasen-Bindungskomponente oft spezifisch an den Analyten von Interesse und die interferierende Einheit. Weiterhin umfasst die Bindungskomponente der Testfestphasen-Bindungskomponente oft einen Antikörper, der spezifisch für PTH ist, häufig 39-84 PTH umfassend oder hierein fallend, einen Mitt-terminalen oder C-terminalen Abschnitt von PTH. In einer häufigen Ausführungsform, und zwar wenn multiple interferierende Einheiten in einer Probe anwesend sind, bindet die Bindungskomponente der Testfestphasen-Bindungskomponente spezifisch einen oder mehrere der interferierenden Einheiten, aber bindet nichts anderes. In einer häufigen Ausführungsform ist die Testfestphasen-Bindungskomponente nützlich, um markierte Analyten von Interesse aus der Probe zu isolieren.
In einer Ausführungsform enthält die interferierende Einheit ein Epitop, das als Ganzes oder in Teilen nicht im Analyten vorkommt aufgrund des Status des Analyten als ein Fragment der interferierenden Einheit, wobei die blockierende Bindungskomponente spezifisch für das Epitop ist. Häufig enthält die interferierende Einheit ein weiteres Epitop, das mit dem ersten Epitop überlappt, wobei dieses weitere Epitop auf dem Analyten anwesend ist und wobei die Indikator-Bindungskomponente spezifisch für dieses weitere Epitop ist. Beispielsweise kann das erste Epitop 7-15 PTH sein und das Epitop der interferierenden Einheit kann 1-9 PTH umfassen. Als weiteres Beispiel kann das erste Epitop ein Epitop innerhalb der Positionen 60-91 des Procalcitonin-Moleküls umfassen (umfassend drei oder mehr Aminosäure-Reste) und das Epitop der interferierenden Einheit kann ein Epitop innerhalb der Positionen 1-70 des Procalcitonin-Moleküls umfassen (z. B. 1-65, 10-64, 20-63, 30-62; unter anderen innerhalb der Grenzen, die den N-Terminus des Epitops auf der N-terminalen Seite von Position 60 des Procalcitonin-Moleküls haben). Andere überlappende Epitope können in demselben oder in anderen Analyten vorhanden sein, wie hier beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die interferierende ein vollständiges PTH und der Analyt umfasst ein PTH-Fragment, oder der Analyt von Interesse umfasst Calcitonin und der Analyt umfasst ein Präprocalcitonin-Fragment; oder die interferierende Einheit umfasst Procalcitonin und der Analyt umfasst Calcitonin. Oftmals umfasst der Nachweis des Analyten von Interesse die Mengenbestimmung des Analyten von Interesse in der Probe. Häufig umfasst der Analyt von Interesse 7-84 PTH und umfasst die interferierende Einheit 1-84 PTH. In einer häufig einbezogenen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin den Nachweis der Menge an Gesamt-PTH in der Probe, wobei die Menge an 7-84 PTH von der Gesamtmenge an PTH abgezogen wird, um die Menge an 1-84 PTH in der Probe zu bestimmen. In dieser Ausführungsform werden oftmals die Mengen einer Auswahl von zwei von 7-84 PTH, der Gesamtmenge an PTH und der Menge an 1-84 PTH in einem Verhältnis verglichen. Dieses Verhältnis wird häufig benutzt, um die Behandlung einer Krankheit oder Störung zu diagnostizieren, zu überwachen oder lenken. Die Gatter-, Schwellenwert- und/oder Algorithmus-Verfahren, die hier beschrieben werden, können zur Diagnose, Überwachung oder Lenkung der Behandlung von Krankheiten oder Störungen verwendet werden. Die Krankheit oder Störung wird häufig ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Osteoporose, Nierensteinerkrankung, familiäre Hypokalziurie, Hyperkalzämie, multiplen endokrinen Neoplasien Typen I und II, Osteoporose, Paget's Knochenleiden, Hyperparathyreoidismus, Pseudohypoparathyreoidismus, Nierenversagen, renaler Osteopathie, adynamischer niedriger Knochenumsatznierenerkarnkung, hoher Knochenumsatznierenerkrankung, Osteomalazie, Osteofibrose, Graves Leiden, dem Ausmaß der chirurgischen Entfernung der Nebenschilddrüse, Übersupression mit Vitamin D oder einem Vitamin D Analog oder einem Calcimimetikum oder Calcium oder chronischer Urämie.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Bindungskomponenten-Aspekt der blockierenden Bindungskomponente, der Indikator-Bindungskomponente und der Testfestphasen-Bindungskomponente einen Antikörper, ein Antikörper-Fragment, einen Rezeptor oder ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars. Wenn die Indikator-Bindungskomponente markiert ist, wird die Markierung häufig ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Enzym und einem Substrat, einem Chromogen, einem Katalysator, einem chemilumineszenten Stoff, einer partikulären Markierung, einer Fluoreszenz-Markierung, einer enzymatischen Markierung, einer kolorimetrischen Markierung, einer Farbstoffmarkierung, einer radioaktiven Markierung und einer magnetischen Markierung. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Testfestphasen-Bindungskomponente oftmals einen Antikörper, der eine Spezifität für die Region 39-84 PTH hat.
2. Selektive Epitopen-Exposition
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt zum direkten Nachweis eines Analyten von Interesse durch selektive Epitopen-Exposition in Gegenwart von interferierenden Einheiten, die gewöhnlich oder potenziell schädlich auf die Untersuchungsspezifität oder Genauigkeit wirken. Selektive Epitopen-Exposition wird durch die Verwendung einer Kombination von blockierenden Bindungskomponenten, die unterschiedliche Spezifitäten haben, erreicht. Diese blockierenden Bindungskomponenten binden den Analyten von Interesse und/oder die interferierende Einheit in einer Art und Weise, die ein spezifisches Epitop auf dem Analyten von Interesse exponiert, aber generell einen oder mehrere andere Epitope, die auf dem Analyten von Interesse und/oder auf der interferierenden Einheit vorhanden sind, blockiert. Das exponierte Epitop steht dann zur Bindung einer anderen, häufig markierten Untersuchungsbindungskomponente zur Verfügung.
In einer häufigen Ausführungsform ist die Probe von einem Individuum erhältlich, wobei die Probe einen Analyten und/oder eine interferierende Einheit enthalten kann oder nicht. Eine Zusammensetzung der blockierenden Bindungskomponente wird mit der Probe in Kontakt gebracht. Anschließend läßt man die blockierenden Bindungskomponenten in der blockierenden Zusammensetzung spezifisch den Analyten und/oder die interferierende Einheit binden.
Einer oder mehrere Abschnitte des Analyten verbleiben durch die blockierenden Bindungskomponenten ungebunden. Anschließend wird die Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente in Kontakt gebracht, die spezifisch das Epitop bindet, das durch die bindenden Komponenten aus der Zusammensetzung mit der blockierenden Bindungskomponente ungebunden geblieben ist. Die Indikator-Bindungskomponente bindet grundsätzlich nicht an die interferierende Einheit. In einer oftmals eingeschlossenen Ausführungsform wird die Probe dann mit einer Testfestphasen-Bindungskomponente in Kontakt gebracht, die spezifisch den Analyten bindet und optional die interferierende Einheit, wodurch die Begutachtung der Probe hinsichtlich der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem Analyten ermöglicht ist. Daher kann der durch die Indikator-Bindungskomponente gebundene Analyt durch eine von mehreren Verfahren nachgewiesen werden, die hier ins Auge gefasst werden und im Stand der Technik bekannt sind. Ein ausgewähltes selektives Epitopen-Expositionsverfahren ist in 2 abgebildet.
Die blockierende Bindungskomponente wird oft einen oder mehrere Epitope auf dem Analyten von Interesse binden, aber wird eine ungebundene Region, umfassen ein Epitop, das dafür ausersehen ist, durch die Testfestphasen-Bindungskomponente gebunden zu werden, lassen. Diese ungebundene Region wird häufig durch die Bindung der blockierenden Bindungskomponenten nicht behindert, sei es durch sterische Hinderung oder durch allosterische Änderungen. Gelegentlich könnte die ungebundene Region leicht geändert sein, aber immer noch für eine Bindung mit einer spezifischen Testbindungskomponente zur Verfügung stehen. Im Beispiel von PTH als Analyt von Interesse umfasst die ungebundene Region häufig eine Region auf der N-terminalen Seite des PTH-Moleküls. Generell verbleibt diese Region offen für eine Bindung mit einer Indikator-Bindungskomponente.
Die Zusammensetzung mit der blockierenden Bindungskomponente umfasst häufig multiple/mehrere blockierende Bindungskomponenten mit unterschiedlichen Spezifitäten. Auch umfasst die Zusammensetzung mit der blockierenden Bindungskomponente häufig eine einzelne blockierende Bindungskomponente. Bei gegebenem Anlass werden multiple blockierende Zusammensetzungen häufig verwendet, jede umfassend eine blockierende Bindungskomponente, die eine unterschiedliche oder dieselben Spezifitäten haben. In einer Ausführungsform, worin mehrere blockierende Bindungszusammensetzungen verwendet werden, können diese Zusammensetzungen häufig mit der Probe gleichzeitig oder aufeinanderfolgend in Kontakt gebracht werden. Bei Gelegenheit wird eine erste blockierende Bindungszusammensetzung mit der Probe in Kontakt gebracht und der/den blockierenden Bindungszusammensetzung(en) darin wird die Möglichkeit gegeben, den Analyten und/oder die interferierende Einheit in der Probe zu binden, und nach dieser Bindung wird eine andere blockierende Bindungszusammensetzung mit der Probe in Kontakt gebracht und man lässt die blockierenden Bindungszusammensetzungen(en) darin an den Analyten und/oder die interferierende Einheit in der Probe zu binden, usw.
In einer Ausführungsform umfasst die blockierende Bindungskomponente einen Anti-PTH-Antikörper, der für einen bestimmten Abschnitt oder ein Epitop entlang der Länge des PTH-Moleküls spezifisch ist. Beispielsweise kann eine blockierende Bindungskomponente einen Antikörper umfassen mit einer Spezifität für 1-3 PTH, 1-4 PTH, 1-5 PTH, 1-6 PTH, 1-7 PTH, 1-8 PTH, 1-9 PTH, 1-10 PTH, 1-11 PTH, 1-12 PTH, 1-13 PTH, 1-14 PTH, 1-15 PTH, 1-16 PTH, 1-17 PTH, 1-18 PTH, 1-19 PTH, 1-20 PTH, 1-21 PTH, 2-5 PTH, 2-6 PTH, 2-7 PTH, 2-8 PTH, 2-9 PTH, 2-10 PTH, 2-11 PTH, 2-12 PTH, 2-13 PTH, 2-14 PTH, 2-15 PTH, 2-16 PTH, 2-17 PTH, 2-18 PTH, 2-19 PTH, 2-20 PTH, 2-21 PTH, 3-6 PTH, 3-7 PTH, 3-8 PTH, 3-9 PTH, 3-10 PTH, 3-11 PTH, 3-12 PTH, 3-13 PTH, 3-14 PTH, 3-15 PTH, 3-16 PTH, 3-17 PTH, 3-18 PTH, 3-19 PTH, 3-20 PTH, 3-21 PTH, 4-8 PTH, 4-9 PTH, 4-10 PTH, 4-11, PTH, 4-12 PTH, 4-13 PTH, 4-14 PTH, 4-15 PTH, 4-16 PTH, 4-17 PTH, 4-18 PTH, 4-19 PTH, 4-20 PTH, 4-21 PTH, 5-9 PTH, 5-10 PTH, 5-11, PTH, 5-12 PTH, 5-13 PTH, 5-14 PTH, 5-15 PTH, 5-16 PTH, 5-17 PTH, 5-18 PTH, 5-19 PTH, 5-20 PTH, 5-21, 6-9 PTH, 6-10 PTH, 6-11, PTH, 6-12 PTH, 6-13 PTH, 6-14 PTH, 6-15 PTH, 6-16 PTH, 6-17 PTH, 6-18 PTH, 6-19 PTH, 6-20 PTH, 6-21 PTH, etc., unter anderen. Weiterhin kann eine andere blockierende Bindungskomponente verwendet werden, die unter anderem eine Spezifität für 25-34 PTH umfasst, sodass einer der obigen Abschnitte mit ungefähr zumindest vier Aminosäuren Länge ungebunden und relativ uninhibiert durch die blockierende Bindungskomponente bleibt. Häufig umfasst dieser Abschnitt eine Länge von etwa vier bis etwa zehn oder mehr Aminosäuren. Die blockierenden Bindungskomponenten werden ausgewählt, um an PTH zu binden, aber auch um einen ungebundenen Abschnitt auf dem PTH-Polypeptid zu erhalten, der durch eine separate Indikator-Bindungskomponente gebunden werden kann. Gegebenenfalls ist die blockierende Bindungskomponente gegen eine andere oder eine unterschiedliche interferierende Einheit gerichtet wie hier ins Auge gefasst, beispielsweise als Procalcitonin.
Die Indikator-Bindungskomponente hat häufig eine Spezifität, die die spezifische Bindung mit einem bestimmten, und häufig vorbestimmten Abschnitt eines Analyten von Interesse ermöglicht. Darüber hinaus bindet die Indikator-Bindungskomponente häufig spezifisch an das Epitop, das von dem Abschnitt umfasst wird, der durch die blockierende Bindungskomponente nicht gebunden wird. Diese Indikator-Bindungskomponente umfasst häufig einen Antikörper. Darüber hinaus, und zwar im Beispiel von PTH als Analyt von Interesse, hat die Indikator-Bindungskomponente häufig eine Spezifität für einen Abschnitt auf der N-terminalen Seite des PTH-Moleküls. Dieser Abschnitt umfasst häufig einen oder mehrere Epitope. Dieser Abschnitt auf der N-terminalen Seite des PTH-Moleküls ist nicht-restriktiv und bezeichnet häufig eine Region auf der N-terminalen Seite von Position 34 des PTH-Moleküls. Nichtsdestotrotz ist die Indikator-Bindungskomponente gegebenenfalls spezifisch für einen Abschnitt auf der C-terminalen Seite des PTH-Moleküls. Ähnlich wie die Indikator-Bindungskomponente, die an anderer Stelle hierin beschrieben wird, umfasst die Indikator-Bindungskomponente eine nachweisbare Markierung und eine Bindungskomponente. In einer gelegentlichen Ausführungsform kann die Spezifität der Indikator-Bindungskomponente und der Testfestphasen-Bindungskomponente umgedreht sein. Obwohl die Spezifität und Beschaffenheit der Bindungskomponente variieren kann, abhängig von dem bestimmten Untersuchungstyp, ist beabsichtigt, dass die nachweisbare Markierung generisch ist und auf jeden von einer Vielzahl von Untersuchungstypen zugeschnitten werden kann. Daher werden die hierin diskutierten und im Stand der Technik bekannten nachweisbaren Markierungen ins Auge gefasst.
Die Testfestphasen-Bindungskomponente ist ähnlich zu der an anderer Stelle hierin beschriebenen. Merkmale des Testfestphasen-Abschnitts dieser Komponente werden weiter hierin beschrieben. Im Allgemeinen wird die Spezifität des Bindungskomponenten-Bestandteils der Testfestphasen-Bindungskomponente in Abhängigkeit von dem gewünschten Analyten von Interesse variieren. Darüber hinaus kann diese Spezifität auch in Abhängigkeit von der Spezifität, die für die blockierenden Bindungskomponenten und/oder die Testsindikator-Bindungskomponenten gewählt wurde variieren. Häufig bindet die Testfestphasen-Bindungskomponente spezifisch an einen anderen Abschnitt als den durch die blockierende oder Indikator-Bindungskomponente gebundenen. In einer häufigen Ausführungsform wird eine andere Region des Analyten von Interesse durch die blockierende(n) Bindungskomponente(n) ungebunden verbleiben (zusätzlich zu dem oben beschriebenen Abschnitt, der durch eine Indikator-Bindungskomponente gebunden wird); die Testfestphasen-Bindungskomponente wird häufig diesen „anderen" Abschnitt spezifisch binden. Beispielsweise kann der Analyt von Interesse ein PTH-Molekül wie z. B. 7-84 PTH und der Bindungskomponenten-Bestandteil der Testfestphasen-Bindungskomponente ein Antikörper sein, der eine Spezifität für 39-84 PTH hat. Weiterhin umfasst der Bindungskomponenten-Bestandteil der Testfestphasen-Bindungskomponente häufig einen Antikörper, der spezifisch für PTH ist, häufig innerhalb oder umfassend 39-84 PTH, einem Mitt-terminalen oder C-terminalen Abschnitt von PTH. In einer gelegentlichen Ausführungsform sind die Spezifitäten der Testfestphasen-Bindungskomponente und der Indikator-Bindungskomponent umgedreht.
In einer weiteren Ausführungsform fasst die vorliegende Offenbarung jede von einer Vielzahl von Analyten als einen Analyten von Interesse ins Auge. Diese sind nicht beschränkt auf PTH und nicht auf bestimmte Fragmente hiervon. 7-84 PTH wird hierin häufig als ein exemplarischer Analyt von Interesse diskutiert, die vorliegende Offenbarung fasst jedoch ins Auge, dass der Analyt von Interesse ein anderes PTH-Fragment als 7-84 PTH, oder vollständiges PTH (zusätzlich zu einer Vielzahl anderer Analyten) sein kann. Darüber hinaus kann der Analyt Calcitonin umfassen und die interferierende Einheit kann Procalcitonin umfassen. In einem solchen Beispiel wird ein Epitop, das innerhalb der Positionen 60-91 des Procalcitoninmoleküls gelegen ist (umfassend 3 oder mehr Aminosäurereste) für die Bindung mit einer Test-Indikatorbindundskomponente offen bleiben. Die blockierenden Antikörper können gegen Abschnitte auf den N-terminalen und C-terminalen Seiten gerichtet sein, und mit dem Epitop leicht überlappen (dieses aber nicht umfassen), das von dieser Region 60-91 umfasst ist, in dem Maße, dass Calcitonin, wenn es nicht in Procalcitonin inkorporiert ist, durch die blockierenden Antikörper gebunden werden könnte.
Der Fachmann wird erkennen, dass, basierend auf der vorliegenden Offenbarung, die Ausführungsformen an die spezifischen Analyte von Interesse angepasst werden können.
In einer Ausführungsform ist der Analyt von Interesse 1-84 PTH und die interferierende Einheit umfasst ein großes PTH-Fragment wie beispielsweise 7-84 PTH (wie in 3 dargestellt). In dieser Ausführungsform erhält man eine Probe von einem Individuum. Eine Serie von blockierenden monoklonalen Antikörpern, ein polyklonaler Antikörper, eine Serie von affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpern oder ein affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper gegen 9-34 werden sodann mit der Probe unter Bedingungen die Antikörperbindung erlauben, in Kontakt gebracht. Daraufhin lässt man den blockierenden Antikörper an den Analyten und/oder die interferierende Einheit binden. Dies resultiert darin, dass einer oder mehrere Antikörper an 1-84 PTH und 7-84 PTH entlang aller Teile des PTH-Moleküls von Position 9 bis Position 34 binden. Die Probe wird sodann in Kontakt gebracht mit einem markierten Indikatorantikörper, der spezifisch für den N-Terminus des PTH-Moleküls ist, mit einer Spezifität wie beispielsweise 1-3 PTH, 1-4 PTH, 1-5 PTH, 1-6 PTH, 1-7 PTH, 1-8 PTH, 1-9 PTH, 1-10 PTH, 1-11 PTH, 1-12 PTH, 1-13 PTH, 1-14 PTH, 1-15 PTH, 1-16 PTH, 1-17 PTH, 1-18 PTH, 1-19 PTH, 1-20 PTH, 1-21 PTH, 1-22 PTH, 1-23 PTH, 1-24 PTH, 1-25 PTH, 1-26 PTH, 1-27 PTH, 1-28 PTH, 1-29 PTH, 1-30 PTH, 1-31 PTH, 1-32 PTH, 1-33 PTH oder 1-34 PTH, unter anderen. Im Allgemeinen kann der Indikatorantikörper 1-84 PTH selektiv und spezifisch binden. Der Indikatorantikörper bindet dann das 1-84 PTH Molekül an oder bei den exponierten Positionen 1-9. Bemerkenswerterweise wird dieser Indikatorantikörper an 7-84 PTH nicht binden, da alle Bindungsabschnitte oder Epitope, die durch den Indikatorantikörper gebunden werden könnten, durch den gebundenen blockierenden Antikörper besetzt sein würden. In dieser Ausführungsform wird der Test-Festphasen-Fänger-Antikörper dann häufig in Kontakt gebracht mit der Probe, die das markierte 1-84 PTH und 7-84 PTH bindet. Der Test-Festphasen-Fänger-Antikörper kann spezifisch für einen Abschnitt sein, der exponiert auf dem PTH-Molekül verbleibt, d.h. der nicht durch Indikator-oder blockierenden Antikörper gebunden ist. Beispielsweise kann der Test-Festphasen-Fänger-Antikörper spezifisch für einen Abschnitt innerhalb 39-84 PTH sein. Auch umfasst der Bindungskomponenten-Bestandteil der Test-Festphasenbindungsdkomponente einen Antikörper, der spezifisch für PTH ist, häufig innerhalb oder umfassend 39-84 PTH, einen mitt-terminalen oder C-terminalen Abschnitt von PTH. Anschließend wird gebundenes 1-84 PTH durch adäquate Mittel nachgewiesen, die zum Teil von dem Typ der verwendeten Markierung abhängen.
Ein beispielhaftes Verfahren, das die SBB-Technologie verwendet, ist in 3(A-H) dargestellt. In dieser Figur wird eine Probe, die 1-84 PTH und 7-84 PTH enthält, erhalten. Eine Serie von monoklonalen Antikörpern oder ein polyklonaler Antikörper, der gegen 9-34 PTH (dieser kann hergestellt werden durch Affinitätsaufreinigung von Ziege-anti-1-84 PTH oder Ziege-anti-1-34 PTH, der durch 9-34 PTH affinitätsgereinigt ist und negativ gegen 1-9 PTH absorbiert werden kann) gerichtet ist wird dann in die Probe (3C) eingebracht. Der Antikörper bindet alle Teile von 1-84 PTH von 9-34 PTH (wodurch eine Serie von blockierenden Flicken („patches") gebildet wird) und dieselben 9-34 PTH Flicken-Antikörper binden an 9-34 PTH auf dem 7-84 PTH-Molekül (3D). Zusätzlich wird ein markierter 1-34 PTH-Antikörper zur Probe hinzugegeben (3E). Der markierte Antikörper verbindet an den in 1-9 PTH exponierten Abschnitt des 1-84 PTH-Moleküls (der untere Markierungsantikörper soll den 1-34 PTH-Indikatorantikörper darstellen, der nicht an die 9-34 PTH-Flicken Teile des PTH-Moleküls binden wird und daher während des Waschschritts dieses Tests weggewaschen wird) (3F). Dann wird der Test-Festphasen-Fänger hinzugegeben, der das markierte 1-84 PTH-Molekül bindet, wobei der Sandwich aus Testfestphasenbindungskomponente-Analyt-Indikatorbindungskomponente gebildet wird, aus dem das Testsignal resultiert (3G). Der Fänger-Antikörper bindet auch den durch den Flicken blockierten 7-84 PTH, was dazu führt, dass kein Indikatorantikörper an das 7-84 PTH, das blockiert ist, gebunden wird, sodass kein Nachweis von 7-84 PTH möglich ist.
In dieser Ausführungsform werden Antikörper als die beispielhaften Bindungskomponenten verwendet, jedoch können alle hier ins Auge gefassten anderen Bindungskomponenten verwendet werden. Darüber hinaus wird PTH als eine exemplarische Ausführungsform verwendet, jedoch können andere Analyten von Interesse durch diese Verfahren getestet werden. Aspekte/Bestandteile der blockierenden Bindungskomponente, der Indikatorbindungskomponente und der Test-Festphasenbindungskomponente und Verfahren, die für diese Komponenten hierin an anderer Stelle beschrieben verwendet werden, sind in dem Maße in den vorliegenden Verfahren anwendbar, wie sie zur der allgemeinen hierin dargestellten Methodologie passen.
C. ISOLATIONSBINDUNG
1. Entfernung von Analyten durch Unlöslichmachung (ARI)
Bei der Ausarbeitung der vorliegenden Offenbarung wurde folgendes entdeckt: Wenn interferierende Einheiten durch spezifische Bindungskomponenten als Ziel erfasst und gebunden werden können, wobei diese an Analyten von Interesse nicht binden, dann können diese interferierenden Einheiten aus der Probe entfernt werden, wodurch eine Untersuchung der Probe ermöglicht ist, die eine Kreuzreaktivität sowohl des Analyten von Interesse als auch einer interferierenden Einheit mit gewisser Homologie zu dem Analyten von Interesse mit Testreagenzien vermeidet. Es wurde weiterhin entdeckt, dass die interferierende Einheit entfernt werden kann, wenn bewirkt wird, dass diese spezifisch an ein Partikel wie beispielsweise ein Kügelchen bindet und das Partikel aus Probe entfernt wird. In einer häufigen Ausführungsform ist das Partikel ein Agarose-Gel. Diese Ausführungsform verlangt die Verwendung von Bindungskomponentenreagenzien, die an solche Partikel (einschließlich Oberflächen) angeheftet sind, die die Bindung des Analyten von Interesse verhindern. Allgemein wurde gemäß der vorliegenden Offenbarung entdeckt, dass die Verwendung eines Partikels (Kügelchen) an das eine spezifische Bindungskomponente fixiert ist (z.B. kovalent gebunden oder verbunden durch eine nicht- kovalente Bindung), die Bindung von spezifischen unerwünschten Einheiten oder von Analyten in einer Probe erlaubt wie auch deren gemeinsame Entfernung aus der Lösung. In einer häufigen Ausführungsform kann diese Entfernung aus der Lösung im Wesentlichen die ausgewählte unerwünschte Einheit oder den unerwünschten Analyten aus dem Testansatz entfernen. Der verbleibende Analyt von Interesse in der Probe kann dann getestet werden, wobei eine Kreuzreaktivität und mögliche Testungenauigkeiten, die typischerweise durch die nunmehr entfernte Einheit oder den entfernten Analyten verursacht sind, vermieden werden. Obwohl nicht beabsichtigt ist, an eine Theorie gebunden zu sein, wird hier folgendes aufgeführt: Unlöslichmachung bezieht sich auf die Bindung eines Analyten oder einer Einheit an eine Festphase, und wenn ein Analyt/eine Einheit an eine Festphase gebunden hat, kann es nicht an eine andere Festphase der vorliegenden Verfahren gebunden sein. Ein exemplarisches Verfahren, das die Entfernung von Analyten durch die Insolubisierungtechnologie verwendet, ist in 5 dargestellt.
In einer Ausführungsform wird eine Probe von einem Individuum erhalten, wobei die Probe einen Analyten von Interesse und/oder eine interferierende Einheit enthalten kann oder nicht. Die Probe wird sodann mit einer isolierenden Bindungskomponente in Kontakt gebracht, um die spezifische Bindung der isolierenden Bindungskomponente an die interferierende Einheit, aber nicht an den Analyten zu ermöglichen, falls der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorhanden ist, wobei die interferierende Einheit durch Bindung mit der isolierenden Bindungskomponente aus einer in der Probe vorhandenen löslichen Phase entfernt wird. Die isolierende Bindungskomponente kann dann spezifisch an die interferierende Einheit binden. Obwohl nicht an eine bestimmte Theorie gebunden, wird folgendes vermerkt: diese Bindung verursacht die Entfernung der interferierenden Einheit aus einer löslichen Phase in der Probe (oder macht die interferierende Einheit unlöslich), da die isolierende Bindungskomponente selber in der Probe unlöslich ist oder wird. Diese Unlöslichkeit ist relativ in Bezug auf den bestimmten Test, und es wird ins Auge gefasst, dass exemplarische isolierende Bindungskomponenten verwendet werden können, die auf kurze Sicht unlöslich sind, aber in Lösung übergehen können. Eine derartige Solubilisierung wird im Allgemeinen nach Vollendung eines Tests vonstatten gehen. Unter bestimmten Umständen werden die Probe und die isolierende Bindungskomponente durch Entfernung der isolierenden Bindungskomponente aus der Probe getrennt oder durch Entfernung der Probe von der isolierenden Bindungskomponente. Häufig verbleibt jedoch die isolierende Bindungskomponente in der Probe, bis zu einem anschließenden Waschschritt, vor dem Nachweisschritt. In einer Ausführungsform werden eine oder mehrere multiple interferierende Einheiten und eine oder mehrere isolierende Bindungskomponenten ins Auge gefasst.
Die Probe wird dann mit einer Indikator-Bindungskomponente in Kontakt gebracht, sodass die Indikator-Bindungskomponente den Analyten bindet. Diese Bindung umfasst oftmals, aber nicht immer, eine spezifische Bindung. Vor, gleichzeitig damit, oder nach Bindung der Indikator-Bindungskomponente wird die Probe mit einer Test-Festphasenbindungskomponente, die den Analyten spezifisch bindet, in Kontakt gebracht. Die interferierende Einheit, die an den isolierende Bindungskomponente gebunden ist, bindet im Allgemeinen nicht an die Test-Festphasenbindungskomponente. Die interferierende Einheit, die an die isolierende Bindungskomponente gebunden ist, wird im Waschschritt vom Analyten von Interesse, der durch die Indikator-Bindungskomponente gebunden ist, abgetrennt.
Der durch die Indikator-Bindungskomponente gebundene Analyt von Interesse wird dann durch ein Verfahren nachgewiesen, das hier in Betracht kommt, jedoch auch im Stand der Technik bekannt ist. Falls die Indikator-Bindungskomponente markiert ist, wird der zum Nachweis des interessierenden Analyten eingesetzte Test oft auf die Art der eingesetzten nachweisbaren Markierung ausgerichtet. Häufig wird ein Zweischritt-Markierungsverfahren durchgeführt. Die zum Nachweis der markierten Indikator-Bindungskomponente, die an den Analyten von Interesse und/oder die interferierende Einheit gebunden ist, umfassen häufig einen Test, welcher ein Format aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend zum Beispiel aus einem Enzym-gebundenen Immunabsorbtionstest (ELISA), Immunblot, Immunfällung, Radioimmuntest (RIA), Immunfärbung, Latexagglutination, indirektem Hämagglutinationstest (IHA), Komplementfixierung, indirektem Immunfluoreszenztest (IFA), Nephelometrie, Durchflusszytometrietest, Chemilumineszenz-Test, Lateralflussimmuntest, Immunradiometrietest (IRMA), μ-Einfang-Test, Linearfluss-Membran-Chromatographie, Inhibitionstest, Energietransfertest, Aviditätstest, turbidimetrischem Immuntest und zeitaufgelöstem amplifiziertem Cryptat-Emissionstest (TRACE).
Der Analyt wird im Allgemeinen so nachgewiesen, dass die Anwesenheit, die Menge und/oder Konzentration in der Probe (und dem Individuum) bestimmt wird. Manchmal bindet die Indikator-Bindungskomponente an die interferierende Einheit, sie wird jedoch vor der Messung oder dem Nachweis weggewaschen.
Die isolierende Bindungskomponente umfasst häufig ein Kügelchen oder eine andere Festphase. Agarose-Kügelchen (häufig von einer Größe zwischen etwa vier bis etwa 100 Micron) werden häufig verwendet, insbesondere Kügelchen des Typs, die Bromcyan-aktiviert sind und eine kovalente Bindung der Bindungskomponente daran erlauben. Dennoch ist jede der verschiedenen hierin diskutierten Festphasen ins Auge gefasst. Die isolierende Bindungskomponente kann häufig von der Probe abgetrennt werden nachdem die darauf befindliche Bindungskomponente die interferierende Einheit bindet, auch wenn die isolierende Bindungskomponente während des Tests nicht tatsächlich von der Probe getrennt wird. Falls Trennung gewünscht ist, kann dies in Form einer einfachen Entfernung aus der Probe erfolgen. Zusätzlich kann die Probe von der isolierenden Bindungskomponente entfernt werden. Häufig ist die isolierende Bindungskomponente von dem Typ, der sich nach Zentrifugation am Boden des Teströhrchens absetzen wird, was ein Absaugen der Probe/des Überstands aus dem Reaktionesgefäß zum weiteren Testen erlaubt. Häufig ist die isolierende Bindungskomponente von einem Typ, der aus der Lösung durch die Anwendung eines elektrischen oder magnetischen Feldes entfernt werden kann. Gelegentlich ist die isolierende Bindungskomponente von einer Größe, die in einem Sieb oder Netz oder Filter aufgefangen werden kann, wenn die Probe durch eine solche Einheit geleitet wird, wodurch die um die interferierende Einheit dezimierte Probe hindurch geführt wird. In einer weiteren gelegentlichen Ausführungsform wird ein „Star"-Röhrchen („star tube") verwendet (verfügbar von Nalge Nunc Int'I, Rochester, NY), wobei die Testfestphasen-Bindungskomponente zwischen zwei Lamellen in dem Reaktionsgefäß positioniert wird, so angeordnet über dem Boden des Reaktionsgefäßes, dass sich ein Präzipitat unterhalb der Lamelle und der darauf angeordneten Testfestphase, z.B. einem Kügelchen absetzen könnte, ohne dass es mit der pelletierten isolierenden Bindungskomponente, die an den Analyten gebunden ist, zu einer Kontamination kommt.
Sobald die interferierende Einheit an die isolierende Bindungskomponente gebunden wird, wird die interferierende Einheit im wesentlichen aus der Lösung entfernt und diese Entfernung aus der Lösung könnte als eine Unlöslichmachung des ungewünschten Analyten angesehen werden. Diese interferierende Einheit steht dem Test dann nicht länger zur Verfügung, da sie kein Teil der Lösung ist, die den Analyten von Interesse enthält. Wenn die interferierende Einheit an die isolierende Bindungskomponente gebunden ist, kann sie häufig die Testfestphase nicht binden, jedoch könnte der Indikator gelegentlich daran binden. Aber da der Sandwich nicht durch Bindung an die Test-Bindungskomponente vervollständigt ist, wird kein Nachweis erfolgen.
Der Test-Bindungskomponenten-Bestandteil der isolierenden Bindungskomponente ist häufig dergestalt für die interferierende Einheit spezifisch, dass er in der Lage ist, die interferierende Einheit spezifisch zu binden. In einer häufigen Ausführungsform werden mehrere isolierende Bindungskomponenten verwendet, wobei jede eine Bindungskomponente enthält, die eine Spezifität für eine andere interferierende Einheit oder einen anderen Abschnitt auf derselben interferierenden Einheit hat. Der Bindungskomponenten-Bestandteil der isolierenden Bindungskomponente ist durch jedes von einer Vielzahl von bekannten oder im Stand der Technik verfügbaren Mitteln verbunden. Im allgemeinen ist die Bindungskomponente durch Mittel verbunden, die die Bindungsfähigkeit der Bindungskomponente an ihren Ziel-Liganden nicht nachteilig oder entscheidend ändern. Beispielsweise kann die Bindungskomponente an ein Partikel adsorbiert sein. Andere Mittel, um die Bindungskomponente zu befestigen, umfassen oder involvieren Carbodiimid, Bromcyan, passive Adsorption, Verwendung eines zweiten Antikörpers, Biotin- und Avidin-beschichtete Festphase, unter anderen im Stand der Technik bekannten.
Festphasentechnologie ist nützlich, um interferierende Einheiten aus der Probe zu entfernen. Die Spezifität des Bindungskomponenten-Bestandteils der isolierenden Bindungskomponente hängt direkt von dem jeweiligen Analyten von Interesse und den möglicherweise interferierenden Einheiten in der Probe ab. Im allgemeinen wird die isolierende Bindungskomponente verwendet, um eine interferierende Einheit aus der Probe zu entfernen. Die isolierende Bindungskomponente wird häufig verwendet, um die interferierende Einheit zu binden und zu halten, sodass der Analyt von Interesse die Testfestphase binden kann und in eine(n) getrennte(n) Kammer/Behälter zur weiteren Analyse transferiert werden kann. In der Zwischenzeit wird die erste Reaktionskammer/das erste Gefäß häufig bewertet hinsichtlich der Anwesenheit und/oder der Menge an interferierender Einheit. Obwohl als „interferierende" Einheit bezeichnet, umfasst diese Einheit häufig einen weiteren Analyten von Interesse.
In einem Beispiel umfasst die isolierende Bindungskomponente einen Antikörper, der eine Spezifität hat für 1-3 PTH, 1-4 PTH, 1-5 PTH, 1-6 PTH, 1-7 PTH, 1-8 PTH, 1-9 PTH, 1-10 PTH, 1-11 PTH, 1-12 PTH, 1-13 PTH, 1-14 PTH, 1-15 PTH, 1-16 PTH, 1-17 PTH, 1-18 PTH, 1-19 PTH, 1-20 PTH, 1-21 PTH, 1-22 PTH, 1-23 PTH, 1-24 PTH, 1-25 PTH, 1-26 PTH, 1-27 PTH, 1-28 PTH, 1-29 PTH, 1-30 PTH, 1-31 PTH, 1-32 PTH, 1-33 PTH, 1-34 PTH, 2-5 PTH, 2-6 PTH, 2-7 PTH, 2-8 PTH, 2-9 PTH, 2-10 PTH, 2-11 PTH, 2-12 PTH, 2-13 PTH, 2-14 PTH, 2-15 PTH, 2-16 PTH, 2-17 PTH, 2-18 PTH, 2-19 PTH, 2-20 PTH, 2-21 PTH, 2-22 PTH, 2-23 PTH, 2-24 PTH, 2-25 PTH, 2-26 PTH, 2-27 PTH, 2-28 PTH, 2-29 PTH, 2-30 PTH, 2-31 PTH, 2-32 PTH, 2-33 PTH, 2-34 PTH, 3-6 PTH, 3-7 PTH, 3-8 PTH, 3-9 PTH, 3-10 PTH, 3-11 PTH, 3-12 PTH, 3-13 PTH, 3-14 PTH, 3-15 PTH, 3-16 PTH, 3-17 PTH, 3-18 PTH, 3-19 PTH, 3-20 PTH, 3-21 PTH, 3-22 PTH, 3-23 PTH, 3-24 PTH, 3-25 PTH, 3-26 PTH, 3-27 PTH, 3-28 PTH, 3-29 PTH, 3-30 PTH, 3-31 PTH, 3-32 PTH, 3-33 PTH, 3-34 PTH, 4-8 PTH, 4-9 PTH, 4-10 PTH, 4-11, PTH, 4-12 PTH, 4-13 PTH, 4-14 PTH, 4-15 PTH, 4-16 PTH, 4-17 PTH, 4-18 PTH, 4-19 PTH, 4-20 PTH, 4-21 PTH, 4-22 PTH, 4-23 PTH, 4-24 PTH, 4-25 PTH, 4-26 PTH, 4-27 PTH, 4-28 PTH, 4-29 PTH, 4-30 PTH, 4-31 PTH, 4-32 PTH, 4-33 PTH, 4-34 PTH, 5-9 PTH, 5-10 PTH, 5-11, PTH, 5-12 PTH, 5-13 PTH, 5-14 PTH, 5-15 PTH, 5-16 PTH, 5-17 PTH, 5-18 PTH, 5-19 PTH, 5-20 PTH, 5-21 PTH, 5-22 PTH, 5-23 PTH, 5-24 PTH, 5-25 PTH, 5-26 PTH, 5-27 PTH, 5-28 PTH, 5-29 PTH, 5-30 PTH, 5-31 PTH, 5-32 PTH, 5-33 PTH, 5-34 PTH, 6-9 PTH, 6-10 PTH, 6-11, PTH, 6-12 PTH, 6-13 PTH, 6-14 PTH, 6-15 PTH, 6-16 PTH, 6-17 PTH, 6-18 PTH, 6-19 PTH, 6-20 PTH, 6-21 PTH, 6-22 PTH, 6-23 PTH, 6-24 PTH, 6-25 PTH, 6-26 PTH, 6-27 PTH, 6-28 PTH, 6-29 PTH, 6-30 PTH, 6-31 PTH, 6-32 PTH, 6-33 PTH, 6-34 PTH, etc., unter anderen. Obwohl weiter oben eine Spezifität von bis zu Position 34 beschrieben wird, wird die isolierende Bindungskomponente gelegentlich eine Spezifität für Positionen jenseits von 34 auf dem PTH-Molekül haben. Zusätzlich werden Kombinationen von isolierenden Bindungskomponenten ins Auge gefasst, umfassen zwei oder mehr Bindungskomponenten, die variierende, aber komplementäre Spezifitäten für das PTH-Molekül im Einklang mit den vorliegenden Verfahren haben.
In einem häufigen Beispiel umfasst die isolierende Bindungskomponente ein Kügelchen mit einem angelagerten Antikörper, der spezifisch für 1-9 PTH ist. Wie weiter in den Beispielen beschrieben ist, kann dieses Kügelchen mit einer Probe in Kontakt gebracht werden und bindet dann eine interferierende Einheit umfassend 1-84 PTH. Das 1-84 PTH wird dann aus der Lösung entfernt. Die verbleibende Lösung wird dann durch einen traditionellen oder bekannten Gesamt-PTH-Test getestet, um die Menge an 7-84 PTH zu bestimmen. Das 7-84 PTH, das in der verbleibenden Lösung enthalten ist, wird häufig in ein anderes Reaktionsgefäß transferiert, um analysiert zu werden. Das aus der Lösung entfernte 1-84 PTH kann ebenfalls getestet werden. Zusammen ergeben die Testwerte von 7-84 PTH und 1-84 PTH, wahlweise zusammen mit anderen PTH-Fragmenten häufig eine Gesamt-PTH-Menge.
Weniger häufig wird von dem Individuum eine Parallelprobe erhalten, die zurückbehalten und nicht mit dem Kügelchen in Kontakt gebracht wird. Diese Probe kann durch Verwendung eines traditionellen oder bekannten Gesamt-PTH-Tests analysiert werden, um die Menge an Gesamt-PTH zu bestimmen. Diese Gesamt-PTH-Menge wird anschließend von der 7-84 PTH-Menge (und/oder der Menge eines anderen PTH-Fragments, falls bestimmt) subtrahiert, um die Menge an 1-84 PTH in dem Individuum zu bestimmen.
Die Indikator-Bindungskomponente kann eine Spezifität für einen Analyten von Interesse haben, die ähnlich zu der oben in der Ausführungsform „Spezifität durch Blockierung" beschrieben ist; jedoch kann sie eine breitere Spezifität haben, da die interferierende Einheit gelegentlich vor Einführung der Indikator-Bindungskomponente aus der Probe entfernt werden wird. In einer häufigen Ausführungsform kann jede Bindungskomponente, die selektiv den Analyten von Interesse binden kann und die nachweisbar markiert werden kann, geeignet sein. In Abhängigkeit von der gewünschten Ausführungsform kann jede Bindungskomponente, die den Analyten von Interesse und/oder die interferierende Einheit binden kann und die nachweisbar markiert werden kann, geeignet sein.
In einer gelegentlichen Ausführungsform bindet der Bindungskomponenten-Bestandteil der markierten Indikator-Bindungskomponente die interferierende Einheit, die an die isolierende Bindungskomponente gebunden ist und/oder den Analyt, der an die Festphase gebunden ist. Spezifisch Bindungspaarmitglieder, die hier diskutiert werden und im Stand der Technik bekannt sind, können in einer solchen Ausführungsform nützlich sein, um eine derartige Bindung zu bewerkstelligen.
In einer häufig verwendeten Ausführungsform ist der Analyt von Interesse zusammen mit anderen Einheiten in der Probe vorhanden, und zwar nach Entfernung von Ziel-erfassten interferierenden Einheiten aus der Lösungsphase. In dieser Ausführungsform können diese „anderen" Einheiten zur Markierung mit einer Indikator-Bindungskomponente als Ziel erfasst sein, gelegentlich gemeinsam mit dem Analyten von Interesse. In einem Beispiel ist der Analyt von Interesse 7-84 PTH und die anderen Einheiten sind andere PTH-Fragmente als 7-84 PTH. Darüber hinaus hat die Indikator-Bindungskomponente im Beispiel von PTH als dem Analyten von Interesse häufig eine Spezifität für einen Abschnitt auf der N-terminalen Seite des PTH-Moleküls (z. B. des 7-84 PTH-Moleküls). Häufig umfasst dieser Abschnitt ein oder mehrere Epitope. Dieser Abschnitt auf der N-terminalen Seite des PTH-Moleküls ist nicht-restriktiv und bezieht sich im allgemeinen auf einen Abschnitt auf der N-terminalen Seite jenseits von Position 34 des PTH-Moleküls. Nichtsdestotrotz ist die Indikator-Bindungskomponente gelegentlich spezifisch für einen Abschnitt im Mitt-Terminus oder auf der C-terminalen Seite des PTH-Moleküls. In beiden Fällen wird häufig ein Zweischrittprozess verwendet, um Kreuzreaktivität mit zirkulierenden C-terminalen PTH-Fragmenten, die unterschiedlich von 7-84 PTH sind, zu vermeiden.
Die Testfestphasen-Bindungskomponente kann ähnlich beschaffen sein wie an anderer Stelle hierin beschrieben. Merkmale des Testfestphasenabschnitts dieser Komponente werden hierin weiter beschrieben. Im allgemeinen wird die Spezifität des Bindungskomponenten-Bestandteils der Testfestphasen-Bindungskomponente in Abhängigkeit von dem gewünschten Analyten von Interesse dergestalt variieren, dass er so strukturiert ist, den Analyten von Interesse zu binden. Häufig ist die Testfestphasen-Bindungskomponente spezifisch für den Analyten von Interesse. Gegebenenfalls könnte die Testfestphasen-Bindungskomponente die interferierende Einheit binden, tut dies aber nicht, da sie aufgrund der Bindung an die isolierenden Bindungskomponente für eine Bindung nicht mehr zur Verfügung steht. Darüber hinaus kann diese Spezifität auch in Abhängigkeit von der für die isolierende Bindungskomponente gewählten Spezifität variieren. Häufig bindet die Testfestphasen-Bindungskomponente spezifisch an einen anderen Abschnitt als den, der durch die isolierende Bindungskomponente und/oder die markierte Indikator-Bindungskomponente gebunden ist. Beispielsweise kann der Analyt von Interesse ein PTH-Molekül sein wie 7-84 PTH und der Bindungskomponenten-Bestandteil der Testfestphasen-Bindungskomponente kann ein Antikörper mit einer Spezifität für 39-84 PTH sein. Häufig umfasst der Bindungskomponenten-Bestandteil der Testfestphasen-Bindungskomponente einen Antikörper, der spezifisch für PTH ist, häufig innerhalb oder umfassend 39-84 PTH, einen Mitt-terminalen oder C-terminalen Abschnitt von PTH. In einer gelegentlichen Ausführungsform sind die Spezifitäten der Testfestphasen-Bindungskomponente und der markierten Indikator-Bindungskomponente umgedreht. Häufig umfasst der Analyt einen anderen Analyten als PTH, wie beispielsweise Calcitonin. Die vorliegenden Verfahren können zur Bewertung der Anwesenheit und/oder Menge von Calcitonin in einem Individuum in Gegenwart von Procalcitonin oder Präprocalcitonin angepasst werden.
In einer Ausführungsform umfasst die isolierende Bindungskomponente einen Partikel, der mit einer Bindungskomponente verbunden ist. Der Partikel umfasst häufig eine Mikrotiterplatte, eine Glasscheibe, eine Nitrocellulosemembran, Cellulose oder ein Cellulosederivat, ein Latexkügelchen, eine Zelle, eine Organelle, ein Protein oder Peptid, ein Teströhrchen, ein Plastikkügelchen, ein colloidales Goldpartikel, ein gefärbtes Partikel, ein Magnetkügelchen, einen Quantumdot, einen Messstab oder ein Sieb. Das Kügelchen besteht auch häufig aus Cellulose oder einem Cellulosederivat, einem Polymer, Latex, Glas oder Metall. In einer häufigen Ausführungsform ist das Kügelchen Bromcyan-aktiviert.
In einer anderen Ausführungsform werden die Verfahrensschritte in einer Reaktionskammer durchgeführt. Häufig bindet die Indikator-Bindungskomponente an die interferierende Einheit und den Analyten, und das Verfahren umfasst weiter den Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und der interferierenden Einheit. Auch häufig umfasst die Detektion der Bindung zwischen dem Analyten und der Indikator-Bindungskomponente und der Nachweis der Bindung zwischen der interferierenden Einheit und der Indikator-Bindungskomponente das Bestimmen der Menge des Analyten und der interferierenden Einheit in der Probe. Oftmals wird der an die Indikator-Bindungskomponente gebundene Analyt vor der Bestimmung der Menge des Analyten und der interferierenden Einheit in der Probe von der Reaktionskammer in eine zweite Kammer überführt. Hiermit verwandt ist eine weitere Ausführungsform, worin die Indikator-Bindungskomponente die interferierende Einheit bindet und die isolierende Bindungskomponente aus der Reaktionskammer entfernt wird, nachdem die Bindungskomponente, die daran gebunden ist, die interferierende Einheit bindet. Diese Ausführungsform umfasst öfter weiterhin den Nachweis der Menge an interferierender Einheit nach Entfernung aus der Reaktionskammer und den Nachweis der Menge an Analyten in der Reaktionskammer nach Entfernung der interferierenden Einheit daraus. Oftmals umfasst der Analyt von Interesse 7-84 oder (ein) andere(s) PTH-Fragment(e) und die interferierende Einheit umfasst 1-84 PTH und das Verfahren umfasst wahlweise weiterhin die Errechnung einer Gesamt-PTH-Menge aus den kombinierten Mengen von 7-84 PTH und 1-84 PTH.
Auch wird häufig eine Auswahl von zwei Mengen, und zwar von der 7-84 PTH-Menge, der Gesamt PTH-Menge und/oder der 1-84 PTH-Menge in einem Verhältnis verglichen. Zusätzlich zu den Mengen der PTH-Fragmente in der Probe kann dieses Verhältnis zur Diagnose, Überwachung oder Lenkung der Behandlung einer Krankheit oder Störung wie beispielsweise renale Knochenerkrankung von adynamischer Knochenkrankheit oder hoher Knochenumsatzkrankheit verwendet werden. Das Gatter, der Grenzwert und/oder die Algorithmusverfahren, die hierin beschrieben werden, können für die Diagnose, Überwachung oder Lenkung der Behandlung einer Krankheit oder Störung verwendet werden.
In einer weiteren häufigen Ausführungsform umfasst der Bindungskomponenten-Bestandteil der isolierenden Bindungskomponente, der Indikator-Bindungskomponente, und/oder der Test-Festphasenbindungskomponente einen Antikörper, ein Antikörperfragment, einen Rezeptor, oder ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars. Häufig kann jede dieser Bindungskomponenten einen anderen Typ von Bindungskomponente umfassen. In einer Ausführungsform kann der Bindungskomponenten-Bestandteil der isolierenden Bindungskomponente beispielsweise ein Antikörper sein, die Indikator-Bindungskomponente kann ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars umfassen, und die Test-Festphasenbindungskomponente könnte einen Rezeptor umfassen. In einer häufigen Ausführungsform, und zwar wenn jede der Bindungskomponenten einen Antikörper umfasst, ist jeder Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper. Häufig umfassen der Bindungskomponenten-Bestandteil der isolierenden Bindungskomponente, der markierten Indikator-Bindungskomponente und der Test-Festphasenbindungskomponente einen anti-PTH-Antikörper.
Wie angedeutet, wird die isolierende Bindungskomponente gegebenenfalls aus der Probe entfernt, nachdem die daran gebundene Bindungskomponente die interferierende Einheit gebunden hat. Dieses Entfernen kann vor, gleichzeitig mit oder nach in Kontakt bringen der Probe mit der Test-Festphase und/oder dem markierten Indikator erfolgen. Häufig bindet die Indikator-Bindungskomponente die interferierende Einheit, und die isolierende Bindungskomponente wird aus der Reaktionskammer entfernt, nachdem die Bindungskomponente, die daran gebunden ist, die interferierende Einheit gebunden hat. Auch wird die Menge an interferierender Einheit häufig nach Entfernung aus der Reaktionskammer und dem Nachweis der Menge an Analyten von Interesse in der Reaktionskammer nach Entfernung der interferierenden Einheit nachgewiesen.
2. Fällungsreagenztechnologie
a. Zyklase-aktivierendes Parathyroidhormon-Entfernung durch Fällung CAP-PR
In einer weiteren Ausführungsform werden Verfahren zur Verbesserung der Messung von 7-84 PTH, 1-84 PTH und/oder anderen PTH-Fragmenten durch bekannte Tests zur Verfügung gestellt. In dieser Ausführungsform werden isolierende Bindungskomponenten, die die interferierende Einheit binden, zur Verfügung gestellt. In dieser Ausführungsform werden Fällungsreagenzien zur Verfügung gestellt, die in der Lage sind, indirekt an eine oder mehrere bestimmte PTH-Komponenten zu binden, was zu deren Fällung führen kann. Die Fällung kann aus der Probe selbst erfolgen oder aus einer Reaktionslösung, wobei die Reaktionslösung eine Probe nach einem oder mehreren Verfahrensschritten umfasst. In einer häufigen Ausführungsform, ähnlich der oben beschriebenen Insolubilisierungverfahren, wird ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit zur Verfügung gestellt, umfassend: a) in Kontakt bringen einer Probe, die einen Analyten und/oder eine interferierende Einheit enthält oder vermeintlich enthält mit einer isolierenden Bindungskomponente, wobei man die isolierende Bindungskomponente an die interferierende Einheit, nicht jedoch an den Analyten binden lässt, falls der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorhanden ist/sind, wobei die interferierende Einheit durch Bindung an die isolierende Bindungskomponente aus der löslichen Phase der Probe entfernt wird; b) in Kontakt bringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wobei man die Indikator-Bindungskomponente an den Analyten binden lässt; und d) Nachweis der Bindung zwischen dem Analyten und der Indikator-Bindungskomponente, um die Gegenwart und/Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen, wobei der Analyt ein Fragment, eine Isoform oder ein Analogon der interferierenden Einheit ist und Schritt a) vor Schritt b) durchgeführt wird. In einer häufigen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin das Inkontaktbringen der Probe mit einer Testfestphasen-Komponente, wobei man die spezifische Bindung der Test-Bindungskomponente an den Analyten, nicht aber an die interferierende Einheit zulässt.
Häufig wird die interferierende Einheit durch die Bildung eines Komplexes der interferierenden Einheit aus der Lösung entfernt, wobei der Komplex durch Kontaktieren der Probe mit einer Komplex-bildenden Bindungskomponente, welche in der Lage ist, an die isolierende Bindungskomponente zu binden, gebildet wird. Auch umfasst das Verfahren häufig das Inkontaktbringen der Probe mit einer unspezifischen Immunglobulin-Zusammensetzung, die von derselben Spezies abgeleitet ist wie die isolierende Bindungskomponente, wobei die Komplex-bildende Bindungskomponente weiterhin in der Lage ist, die unspezifische Immunglobulin-Zusammensetzung zu binden und dadurch den Komplex der interferierenden Einheit zu bilden, der aus der Lösung durch Prezipitation ausfällt. Häufig kommt auch folgendes vor: Die isolierende Bindungskomponente umfasst eine von der Maus abgeleitete monoclonale Antikörperzusammensetzung, die nichtspezifische Immunglobulin-Zusammensetzung umfasst Maus-Immunglobulin, und die zweite Immunglobulin-Zusammensetzung umfasst Ziege-anti-Maus-Immunglobulin. Gegebenenfalls ist das nichtspezifische Immunglobulin nicht von derselben Spezies abgeleitet wie die isolierende Bindungskomponente und die Komplex-bildende Bindungskomponente umfasst wahlweise eine Zusammensetzung, wobei zumindest eine Bindungskomponente der Zusammensetzung ebenfalls in der Lage ist, bevorzugt das nicht-spezifische Immunglobulin zu binden.
In einer exemplarischen Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt zur direkten Messung von 7-84 PTH (und/oder einem anderen PTH-Fragment) in Gegenwart von 1-84 PTH, 7-84 PTH und/oder einem anderen PTH-Fragment. In dieser exemplarischen Ausführungsform werden Reagenzien, umfassend anti-1-9 PTH-Antikörper (z. B. Maus-anti-1-9 PTH monoclonale Antikörper) und Maus-Immunglobulin einer Probe hinzugegeben. Der anti-1-9 PTH-Antikörper bindet darauf 1-84 PTH, aber nicht 7-84 PTH, das während der Inkubation der Probe anwesend ist. Das Maus-Immunglobulin bindet keinen der Analyten. Nachdem der Maus-anti-1-9 PTH-Antikörper genügend Zeit hatte, um das 1-84 PTH zu binden, wird das Ziege-anti-Maus-Immunglobulin zu der Probe hinzugegeben und wirkt als ein Fällungsantikörper. Dieser Antikörper ist nicht Spezies-begrenzt, sondern wird oftmals dergestalt sein, dass er das Maus-Immunglobulin-Reagenz und/oder den in der Probe vorhandenen Antikörper binden wird. Das Maus-Immunglobulin und das anti-1-9 PTH-Antikörper-Reagenz können auf ähnliche Weise durch nicht-Maus-Versionen ersetzt werden, mit dem einhergehenden Wechsel der Spezifität des Fällungsantikörpers. Zum Beispiel könnte Meerschweinchen-anti-1-9 PTH oder Kaninchen-anti-1-9 PTH verwendet werden mit der entsprechenden Verwendung von Meerschweinchen-Immunglobulin oder Kaninchen-Immunglobulin als Träger, sodass Ziege-anti-Meerschweinchen-Immunglobulin oder Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin ins Auge gefasst werden. Das Ziege-anti-Maus-Immunglobulin bindet an den Maus-1-9 PTH-Antikörper (der an 1-84 PTH gebunden ist) und an das Maus-Immunglobulin, wodurch ein Immunkomplex gebildet wird, der aus der Lösung ausfallen kann. Diese Fällung führt dazu, dass 1-84 PTH unlöslich wird und nicht in der Lage ist, wirksam an die Testfestphasen-Bindungskomponente zu binden, was für einen Nachweis in einem Gesamt-PTH-Test notwendig ist. Währenddessen wird 7-84 PTH nicht an den Fällungsantikörper gebunden und verbleibt in Lösung und damit in einem löslichen Zustand, sodass es durch den PTH-Test gemessen werden kann. Das 1-84 PTH, das durch den 1-9 PTH-Antikörper gebunden und als ein gefällter Immunkomplex unlöslich gemacht wurde, wird von der Test-Festphasenbindungskomponente während der Waschphase vor dem Nachweis der Markierung auf der Test-Festphasenbindungskomponente entfernt.
Anschließend wird die Probe auf 7-84 PTH und/oder ein anderes PTH-Fragment getestet. In einer häufigen Ausführungsform wird dann ein Gesamt-PTH-Test für die Probe verwendet (oder Reagenzien die hierfür nützlich sind). Dieser Test kann durchgeführt werden (oder auch nicht) ohne die gefällte (unlösliche) 1-84 PTH Masse zu entfernen. Jedoch wird die gefällte (unlösliche) 1-84 PTH Masse von der Test-Festphasenbindungskomponente durch den Waschschritt vor dem Nachweis der Markierung entfernt. 7-84 PTH wird daraufhin durch den Gesamt-PTH-Test nachgewiesen. Dieser Schritt kann durch eine Vielzahl von Gesamt-PTH-Tests, die Reagenzien verwenden, die die Fähigkeit haben, lösliches 7-84 PTH und/oder 1-84 PTH zu binden, durchgeführt werden. Die vorliegende Ausführungsform erlaubt die direkte Messung von 7-84 PTH und/oder anderen PTH-Fragmenten, ohne die oben erwähnte Subtraktionsmethode zu verwenden. In einer weniger eingesetzten Ausführungsform können zwei parallele Proben gleichzeitig oder aufeinanderfolgend getestet werden, wobei eine die hier weiter oben beschriebenen Reagenzien und Methoden verwendet, und die andere auf diese Reagenzien verzichtet, wobei jedoch gemäß der Gesamt-PTH-Testinstruktionen gearbeitet wird. Die erste hiervon wird eine Bestimmung der 7-84 PTH-Menge ergeben und die zweite wird eine Bestimmung der Gesamt-PTH-Menge ergeben. Man könnte die 1-84 PTH-Menge durch Subtrahieren der 7-84 PTH Menge, und/oder der Menge anderer PTH-Fragmente, aus der Gesamt-PTH-Menge bestimmen.
4 liefert eine Darstellung eines beispielhaften Verfahrens, das die CAP-PR-Technologie verwendet, wobei Fällungsantikörper verwendet werden. In diesem Beispiel werden ein 1-9 PTH monoklonaler Maus-Antikörper zusammen mit Maus-Immunglobulin zu der Probe von einem Individuum hinzugegeben, wobei beide nicht an eine Festphase gebunden sind. Die Probe wird anschließend für mehrere Stunden bei Raumtemperatur unter Drehung inkubiert (z.B. etwa 5-10 Stunden). Der 1-9 Maus-Antikörper bindet dann 1-84 PTH, das in der Probe vorhanden ist (4C). Nach der Inkubation wird Ziege-anti-Maus-Immunglobulin (Fällungsantikörper) zu der Probe hinzugegeben, was zu einer Fällung des monoklonalen Antikörpers führt, der an das 1-84 PTH gebunden ist sowie zu einer Fällung des Maus-Immunglobulin, nicht aber zur Bindung oder Fällung von 7-84 PTH und/oder einem anderen PTH-Fragment (4D-4E) führt. Das Ziege-anti-Maus-Immunglobulin bindet an den 1-9 PTH monoklonalen Maus-Antikörper (der an das 1-84 PTH gebunden ist) und an das Träger-Maus-Immunglobulin, wodurch ein massiver Immunkomplex gebildet wird, der aus der Lösung ausfällt, wodurch das 1-84 PTH unlöslich wird und im nachfolgenden Gesamt-PTH-Test nicht gemessen werden kann. 1-84 PTH wurde unlöslich gemacht durch die Fällung mit dem 1-9 PTH-Antikörper, der in einem massiven, unlöslichen Immunkomplex mit Ziege-anti-Maus-Immunglobulin und Maus-Immunglobulin gebunden ist. 7-84 PTH, das nicht durch 1-9 PTH-Antikörper gebunden wurde und nicht durch Ziege-anti-Maus-Antikörper gefällt wurde, wird gemessen. Die Einfangkügelchen und Indikatoren des Gesamt-PTH-Tests werden dann hinzugegeben, ohne Abtrennung des Präzipitats, und das Nachweisverfahren wird als ein normaler Gesamt-PTH-Test weitergeführt (4F). Das gefällte (unlösliche 1-84 PTH) wird in dem Gesamt-PTH-Test nicht gemessen und muss nicht vor dem Test entfernt werden. Der Gesamt-PTH-Test wird ausschließlich das 7-84 PTH messen und nicht das unlösliche 1-84 PTH, das ebenfalls in dem Nachweisreaktionsgemisch vorhanden ist. Oftmals wird das Präzipitat während des Waschschritts von der Anwesenheit der Einfangkügelchen des Gesamt-PTH-Tests entfernt. Das Ergebnis ist direkt eine Messung von 7-84 PTH (und/oder einem anderen PTH-Fragment), ohne dass 1-84 PTH gemessen wird.
b. Messung von vollständigem PTH
In einer anderen Ausführungsform, die die Fällungsreagenzientechnologie verwendet, wird ein Verfahren zur Messung von vollständigem PTH oder 1-84 PTH zur Verfügung gestellt. In seiner Summe stellt diese Ausführungsform die Fällung und Messung von vollständigem PTH zur Verfügung. Durch das Praktizieren der vorliegenden Verfahren ergibt sich ein Vorteil, da keine Festphasenreagenzien zur Durchführung des Tests notwendig sind. Dies bietet einen Vorteil in Form einer Verringerung jedweder sterischer Hinderung der Bindung des Analyten durch die Test-Bindungskomponente, welche (die sterische Hinderung) in Testbindungskomponenten, die an Festphasen gebunden sind, vorhanden sein kann. Darüberhinaus sind Festphasenreagenzien oftmals teuer und zeitintensiv in der Herstellung. Zusätzlich sind Festphasenreagenzien häufig instabil und/oder sperrig und verlangen im Allgemeinen höhere Konzentrationen an Bindungskomponenten pro Test, um effektive Testbedingungen sicherzustellen. Somit wird die Verwendung von flüssigen Reagenzien die Gesamtkosten der Testherstellung und Durchführung reduzieren.
Demnach wird in einer Ausführungsform ein Verfahren zum Nachweis von vollständigem PTH in einer Probe bereitgestellt, umfassend: a) in Kontakt bringen einer flüssigen Probe, die vollständigem PTH und/oder ein PTH-Fragment enthält oder vermeintlich enthält mit einer Indikator-Bindungskomponente, wodurch die spezifische Bindung der Indikator-Bindungskomponente an das vollständigem PTH ermöglicht wird; b) in Kontakt bringen der Probe mit einer isolierenden Bindungskomponente, wodurch die spezifische Bindung der isolierenden Bindungskomponente an das vollständigem PTH ermöglicht wird; c) wahlweise in Kontakt bringen der Probe mit einer nicht-spezifischen Bindungskomponente, wobei die nicht-spezifische Bindungskomponente aus derselben Art stammt wie die isolierende Bindungskomponente; d) in Kontakt bringen der Probe mit einer Komplex-bildenden Bindungskomponente, wodurch die Bindung der Komplex-bildenden Bildungskomponente an die vollständigem PTH-gebundene isolierende Bindungskomponente und die nicht-spezifische Bindungskomponente und damit eine Komplexbildung ermöglicht wird, wobei der Komplex aus der Lösung ausfällt; und e) Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem vollständigen PTH, wobei einer von den Schritten a), b) oder alle Schritte vor Schritt d) durchgeführt werden. Häufig umfasst die Probe zusätzlich zu PTH-Fragmenten vollständiges PTH und das Verfahren erlaubt einen selektiven Nachweis von vollständigem PTH.
Häufig umfasst das Verfahren weiterhin das Entfernen von ungebundener Indikatorbindungskomponente, ungefällter isolierender Bindungskomponente, ungefällter nicht-spezifischer Bindungskomponente und/oder ungefällter Komplex-bildender Bindungskomponente, wenn überhaupt, vor dem Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem vollständigen PTH. Oft wird dieses Entfernen durch einen oder mehrere Waschschritte bewerkstelligt, wobei die Probe, die die Testreagenzien enthält, gewaschen wird, indem ein Waschreagenz hinzugefügt und zentrifugiert wird (oder auf andere Weise getrennt wird), um den Komplex, der das vollständige PTH enthält, zu sedimentieren. Die Komplex-bildende Bindungskomponente wird oft mit einer Probe in einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die als Waschreagenz fungiert. Dadurch sind die ungebundene Indikatorbindungskomponente, ungefällte isolierende Bindungskomponente, ungefällt, nicht-spezifische Bindungskomponente, ungefällte Komplex-bildende Bindungskomponente und/oder andere Probenkomponenten, wie PTH-Fragmente häufig in einem Überstand umfasst, wobei der Überstand von dem sedimentierten Komplex verworfen wird.
In einer häufigen Ausführungsform umfasst die Indikator-Bindungskomponente und die isolierende Bindungskomponente Antikörper und Fragmente davon. Oftmals umfassen einer oder beide dieser Antikörper monoklonale Antikörper. In einer weiteren häufigen Ausführungsform umfasst die nicht-spezifische Bindungskomponente ein nicht-spezifisches Immunglobulin, und die Komplex-bildende Bindungskomponente umfasst ein weiteres Immunglobulinmolekül, das in der Lage ist, das nicht-spezifische Immunglobulin zu binden. In einer Ausführungsform umfasst die Indikator-Bindungskomponente einen anti-1-9 PTH-Antikörper. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die isolierende Bindungskomponente einen anti-39-84 PTH-Antikörper. Die Indikator-Bindungskomponente umfasst häufig einen Antikörper, der von einer anderen Spezies abgeleitet ist als der isolierende Antikörper. In einer häufigen Ausführungsform umfasst die Indikator-Bindungskomponente einen Ziege anti-1-9 PTH-Antikörper, die isolierende Bindungskomponente umfasst einen Maus anti-39-84 PTH-Antikörper, die nicht-spezifische Bindungskomponente umfasst ein Maus-Immunglobulin, und die Komplex-bildende Bindungskomponente umfasst ein Ziege anti-Maus-Immunglobulin. Die nicht-spezifische Bindungskomponente umfasst häufig auch Kaninchen-Immunglobulin, die isolierende Bindungskomponente umfasst Kaninchen anti-39-84 PTH-Antikörper und die Komplex-bildende Bindungskomponente umfasst Ziege anti-Kaninchen-Immunglobulin. Somit können die Reagenzien von jeder von einer Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Spezies abgeleitet werden, unter der Voraussetzung, dass die allgemeinen Bindungsspezifitäten des vorliegenden Verfahrens beibehalten werden. Gegebenenfalls wird das nicht-spezifische Immunglobulin nicht von derselben Spezies abgeleitet, wie die isolierende Bindungskomponente, und die Komplex-bildende Bindungskomponente umfasst wahlweise eine Zusammensetzung, worin zumindest eine Bindungskomponente der Zusammensetzung ebenfalls in der Lage ist, bevorzugt, das nicht-spezifische Immunglobulin zu binden.
Gemäß weiterer Ausführungsformen, wie hierin beschrieben, umfasst die Indikatorbindungskomponente häufig weiterhin einen Marken ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Enzym und einem Substrat, einem Chromogen, einem Katalyten, einer Chemiluminescenz Komponente, einen partikulären Marker, einem fluoreszenten Marker, einem enzymatischen Marker, einem colorimetrischen Marker, einem Farbmarker, einem radioaktiven Marker, und einem magnetischen Marker. Häufig umfasst der Marker 125-Iod.
Auch wenn das vollständige PTH in dem vorliegenden Verfahren spezifisch dargestellt wird, können andere Analyten, die hier beschrieben sind, gemäß dem vorliegenden Verfahren auch verwendet werden.
7 ist eine exemplarische Darstellung der vorliegenden Ausführungsform.
c. Calcitonin-Messung
Calcintonin ist ein Protein, dass eine wichtige Rolle spielt im Calciummetabollismus, in Menschen, Fischen und Nagern spielt. Daher gibt es eine signifikate klinische Notwendigkeit, die Präsenz und Konzentration dieses Proteins in Organismen zu messen und nachzuweisen. Calcitonin umfasst ein 32 Aminosäure-Protein, welches durch die Herstellung und das Prozessieren von den Vorläuferproteinen Preprocalcitonin und Procalcitonin gebildet wird. Procalcitonin ist ein Protein mit einer Länge von 116 Aminosäuren. Dieses Protein wird in zwei größere Polypeptide degradiert, welche vor der Produktion des Calcitonins den Aminosäuren 1-57 (N-Procalcitonon-(1-57)-Peptid) und 60-116 (C-Procalcitonin-(60-116)-Peptid) entsprechen. Das letztere dieser beiden Polypeptide wird in die Polypeptide Calcitonin und Cacatcalcin aufgeteilt. Calcitonin stellt daher ein Degradationsprodukt des Procalcitonins dar, welches den Aminosäuren 60-91 des Procalcitonins entspricht.
Procalcitonin (menschlich) umfasst ein Peptid mit den folgenden Sequenzen:
Ala-Pro-Phe-Arg-Ser-Ala-Leu-Glu-Ser-Ser-Pro-Ala-Asp-Pro-Ala-Thr-Leu-Ser-Glu-Asp-Glu-Ala-Arg-Leu-Leu-Leu-Ala-Ala-Leu-Val-Gln-Asp-Tyr-Val-Gln-Met-Lys-Ala-Ser-Glu-Leu-Glu-Gln-Glu-Gln-Glu-Arg-Glu-Gly-Ser-Ser-Leu-Asp-Ser-Pro-Arg-Ser-Lys-Arg-Cys-GIy-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Asp-Met-Ser-Ser-Asp-Leu-Glu-Arg-Asp-His-Arg-Pro-His-Val-Ser-Met-Pro-Gln-Asn-Ala-Asn.
Calcitonin (menschlich) umfasst ein Peptid mit der folgenden Sequenz: Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro.
Das C-terminal flankierende Peptid (menschlich) von Calcitonin umfasst:
Asp-Met-Ser-Ser-Asp-Leu-Glu-Arg-Asp-His-Arg-Pro-His-Val-Ser-Met-Pro-Gln-Asn-Ala-Asn (C-Procalcitonin (menschlich); Catacalcin; PDN-21)
Das N-terminal flankierende Peptid (menschlich) von Calcitonin umfasst:
Ala-Pro-Phe-Arg-Ser-Ala-Leu-Glu-Ser-Ser-Pro-Ala-Asp-Pro-Ala-Thr-Leu-Ser-Glu-Asp-Glu-Ala-Arg-Leu-Leu-Leu-Ala-Ala-Leu-Val-Gln-Asp-Tyr-Val-Gln-Met-Lys-Ala-Ser-Glu-Leu-Glu-Gln-Glu-Gln-Glu-Arg-Glu-Gly-Ser-Ser-Leu-Asp-Ser-Pro-Arg-Ser
Daher ist das Calcitoninprotein 32 Aminosäuren lang. Siehe, z. B., H.D. Niall, et al., Biochemistry (1969) 64:771-8 (beschreibt verschiedene Speziesformen des Calcitonins). Versuche, welche verwendet werden, um Calcitonin zu messen zeigen häufig Kreuzreaktionen mit Procalcitonin oder Präprocalcitonin, da sie überlappende homologe Sequenzen enthalten.
Folglich wird ein Verfahren zum Nachweis von Calcitonin bei Vorhandensein einer interferierenden Einheit, die einen Calcitoninvorläufer in einer Probe umfasst, bereitgestellt, umfassend: a) Kontaktieren einer Probe enthaltend oder möglicherweise enthaltend Calcitonin und/oder einen Calcitoninvorläufer mit einer isolierenden Bindungskomponente, wobei man die isolierende Bindungskomponente an die interferierende Einheit, nicht jedoch an Calcitonin, spezifisch binden lässt, wenn der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorhanden ist, wobei die interferierende Einheit von einer Lösungsphase in der Probe durch Bindung mit der isolierenden Bindungskomponente entfernt wird; b) inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wobei man die Bindung der Indikator-Bindungskomponente an den Analyten erlaubt; und c) Nachweis der Bindung zwischen dem Analyten und der Indikator-Bindungskomponente, um die Gegenwart und/oder die Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen, wobei der Analyt ein Fragment oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist und Schritt a) vor Schritt b) ausgeführt wird. Im Allgemeinen bindet die isolierende Bindungskomponente an ein Epitop auf der interferierenden Einheit, welches im Ganzen oder als Teil kein Epitop von Calcitonin ist. Häufig wird die Indikator-Bindungskomponente von der Lösung mittels der Bildung eines Komplexes der interferierenden Einheit entfernt, welcher nach Kontaktieren der Probe mit einer Komplex-bildenden Bindungskomponente gebildet wird, welche in der Lage ist, die isolierende Bindungskomponente zu binden.
In einer häufig einbezogenen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin das Kontaktieren der Probe mit einer nicht-spezifischen Immunglobulinzusammensetzung, welche von der gleichen Spezies wie die isolierende Bindungskomponente abgeleitet ist, wobei die Komplexbildende Bindungskomponente weiterhin in der Lage ist, nicht-spezifische Immunglobulinzusammensetzungen zu binden, um weiterhin den Komplex der interferierenden Einheit zu bilden. Ebenfalls häufig umfasst die isolierende Bindungskomponente eine Mausabgeleitete Monoclonale Antikörperzusammensetzung, die nicht-spezifische Immunoglobulinzusammensetzung umfasst Maus-Immunoglobulin, und die zweite Immunoglobulinzusammensetzung umfasst Ziegen-anti-Maus-Immunoglobulin. Gemäß den vorliegenden Verfahren umfasst die interferierende Einheit häufig Procalcitonin oder Präprocalcitonin. Manchmal wird das nicht-spezifische Immunoglobulin nicht von der gleichen Art abgeleitet, wie die isolierende Bindungskomponente und die Komplex-bildende Bindungskomponete umfasst wahlweise eine Zusammensetzung, wobei mindestens eine Bindungskomponente der Zusammensetzung auch in der Lage ist, vorzugsweise das nicht-spezifische Immunglobulin zu binden.
9 stellt ein exemplarisches Verfahren dar, das die HCT-PR Technologie verwendet, die fällende Antikörper nutzt. In diesem Beispiel werden ein Procalcitonin monoclonaler Maus-Antikörper zusammen mit Maus-Immunglobulin (wobei beide nicht an die Festphase geheftet sind) zu einer Probe eines Organismus hinzugefügt, dann für mehrere Stunden (z. B. 5 bis 10 Stunden) bei Raumtemperatur unter Rotation inkubiert. Der Procalcitonin Maus-Antikörper bindet daraufhin das Procalcitonin, das in der Probe vorhanden ist (9C). Nach Inkubation wird ein Ziegen anti-Maus-Immunoglobulin (fällender Antikörper) zu der Probe hinzugefügt, wodurch eine Fällung des monoclonalen Antikörpers verursacht wird, an das Procalcitonin gebunden ist, und eine Fällung des Maus-Immunoglobulins, nicht jedoch eine Bindung oder Fällung von Calcitonin (9E). Das Ziegen anti-Maus-Immunoglobulin bindet an den Procalcitonin monoclonalen Maus-Antikörper (welcher an das Procalcitonin gebunden ist) und and das Maus Träger-Immunoglobulin, wobei ein massiver Immunkomplex gebildet wird, welcher aus der Lösung ausfällt, wodurch das Procalcitonin unlöslich gemacht und häufig unmessbar gemacht wird. Procalcitonin, das durch die Fällung durch den Procalcitonin-Antikörper der in einem unlöslichen Immunkomplex mit Ziege anti-Maus-Immunglobulin und Maus-Immunglobulin gebunden ist, fällt aus der Lösung aus. Calcitonin, das durch Procalcitonin-Antikörper gebunden wurde und nicht durch Ziegen-Anti-Maus Immunoglobulin gefällt wurde, verbleibt in der Lösung.
Dann werden die Einfang-Kügelchen des Calcitonin-Tests und die Indikatoren hinzugefügt, ohne das Präzipitat (9F) zu trennen. Das gefällte (unlösliche) Procalcitonin wird nicht in dem Calcitonin-Test gemessen und muss nicht vor Ausführung des Tests entfernt werden. Der Calcitonin-Test wird nur das Calciton messen, nicht aber das unlösliche Procalcitonin, das auch im Reaktionsgemisch des Tests vorhanden ist. Während des Waschvorgangs wird das Präzipitat von dem Einfang-Kügelchen des Calcitonin-Tests entfernt. Die Einfang-Kügelchen des Tests mit Calcitonin und markiertem Antikörper können nun so interpretiert werden, als dass sie Calcitonin messen. Das Ergebnis ist eine direkte Messung des Calcitonins ohne Messung von Procalcitonin. Auch wenn im dargestellten Beispiel das gefällte Procalcitonin entfernt wird, ist das Entfernen kein wesentliches Element der vorliegenden Verfahren.
Gelegentlich wird ein Verfahren zur Messung von Procalcitonin gemäß anderen Verfahren wie hier beschrieben bereitgestellt. Wie anderswo beschrieben, umfasst Procalcitonin einen Analyten von Interesse, welcher in der vorliegenden Offenbarung dargestellt ist.
d. Trio-Kit Technik
In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Bewertung von multiplen Analyten und/oder interferierenden Einheiten in einer einzigen Probe bereitgestellt. Dieses Verfahren ist nützlich, um das Vorhandensein und/oder die Konzentration von zwei oder drei oder mehreren Analyten von Interesse zu bestimmen. In einer beispielhaften Ausführungsform wird das Verfahren zur Bestimmung von PTH-Konzentrationen in einer Probe angewendet. Häufig wird dieses Verfahren verwendet, um die Gesamt-PTH-Konzentration zu bestimmen, die 1-84 Konzentration, die 7-84 PTH-Konzentration und/oder eine andere PTH-Fragmenten-Konzentration in einer einzigen Probe. Häufig ist lediglich eine einzige Probe von ungefähr 200 Mikrolitern notwendig, auch wenn alle Probenvolumina in Betracht gezogen werden. Wie anderswo hier beschrieben, ist eine Probe häufig eine Blut- oder Serumprobe.
In einer häufigen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit bereitgestellt, umfassend: a) Plazieren einer Probe, enthaltend oder möglicherweise enthaltend einen Analyten und eine interferierende Einheit in einer Reaktionskammer; b) inkontaktbringen der Probe mit einer isolierenden Bindungskomponente, wobei die isolierende Bindungskomponente die interferierende Einheit spezifisch bindet, nicht aber den Analyten in der Probe; c) inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, die den Analyten und die interferierende Einheit in der Probe bindet; d) inkontaktbringen der Probe mit einer Test-Festphasen-Bindungskomponente, welche den Analyten in der Probe bindet; und e) selektives Nachweisen der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und: (i) dem Analyten, (ii) der interferierenden Einheit, und/oder (iii) der Kombination des Analyten und der interferierenden Einheit, wobei der Analyt ein Fragment, Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist, wobei Schritt b) vor den Schritten c) und/oder d) ausgeführt wird und wobei die an den Analyten und/oder die isolierende Bindungskomponente gebundene Test-Festphasen-Bindungskomponente, die an die interferierende Einheit gebunden ist, wahlweise vor dem selektiven Nachweis (i) des Analyten oder (ii) der interferierenden Einheit aus der Reaktionskammer entfernt und in eine andere Kammer überführt werden.
In einem Beispiel kann die isolierende Bindungskomponente einen Antikörper umfassen, der eine Spezifität aufweist für 1-3 PTH, 1-4 PTH, 1-5 PTH, 1-6 PTH, 1-7 PTH, 1-8 PTH, 1-9 PTH, 1-10 PTH, 1-11 PTH, 1-12 PTH, 1-13 PTH, 1-14 PTH, 1-15 PTH, 1-16 PTH, 1-17 PTH, 1-18 PTH, 1-19 PTH, 1-20 PTH, 1-21 PTH, 1-22 PTH, 1-23 PTH, 1-24 PTH, 1-25 PTH, 1-26 PTH, 1-27 PTH, 1-28 PTH, 1-29 PTH, 1-30 PTH, 1-31 PTH, 1-32 PTH, 1-33 PTH, 1-34 PTH, 2-5 PTH, 2-6 PTH, 2-7 PTH, 2-8 PTH, 2-9 PTH, 2-10 PTH, 2-11 PTH, 2-12 PTH, 2-13 PTH, 2-14 PTH, 2-15 PTH, 2-16 PTH, 2-17 PTH, 2-18 PTH, 2-19 PTH, 2-20 PTH, 2-21 PTH, 2-22 PTH, 2-23 PTH, 2-24 PTH, 2-25 PTH, 2-26 PTH, 2-27 PTH, 2-28 PTH, 2-29 PTH, 2-30 PTH, 2-31 PTH, 2-32 PTH, 2-33 PTH, 2-34 PTH, 3-6 PTH, 3-7 PTH, 3-8 PTH, 3-9 PTH, 3-10 PTH, 3-11 PTH, 3-12 PTH, 3-13 PTH, 3-14 PTH, 3-15 PTH, 3-16 PTH, 3-17 PTH, 3-18 PTH, 3-19 PTH, 3-20 PTH, 3-21 PTH, 3-22 PTH, 3-23 PTH, 3-24 PTH, 3-25 PTH, 3-26 PTH, 3-27 PTH, 3-28 PTH, 3-29 PTH, 3-30 PTH, 3-31 PTH, 3-32 PTH, 3-33 PTH, 3-34 PTH, 4-8 PTH, 4-9 PTH, 4-10 PTH, 4-11, PTH, 4-12 PTH, 4-13 PTH, 4-14 PTH, 4-15 PTH, 4-16 PTH, 4-17 PTH, 4-18 PTH, 4-19 PTH, 4-20 PTH, 4-21 PTH, 4-22 PTH, 4-23 PTH, 4-24 PTH, 4-25 PTH, 4-26 PTH, 4-27 PTH, 4-28 PTH, 4-29 PTH, 4-30 PTH, 4-31 PTH, 4-32 PTH, 4-33 PTH, 4-34 PTH, 5-9 PTH, 5-10 PTH, 5-11, PTH, 5-12 PTH, 5-13 PTH, 5-14 PTH, 5-15 PTH, 5-16 PTH, 5-17 PTH, 5-18 PTH, 5-19 PTH, 5-20 PTH, 5-21 PTH, 5-22 PTH, 5-23 PTH, 5-24 PTH, 5-25 PTH, 5-26 PTH, 5-27 PTH, 5-28 PTH, 5-29 PTH, 5-30 PTH, 5-31 PTH, 5-32 PTH, 5-33 PTH, 5-34 PTH, 6-9 PTH, 6-10 PTH, 6-11, PTH, 6-12 PTH, 6-13 PTH, 6-14 PTH, 6-15 PTH, 6-16 PTH, 6-17 PTH, 6-18 PTH, 6-19 PTH, 6-20 PTH, 6-21 PTH, 6-22 PTH, 6-23 PTH, 6-24 PTH, 6-25 PTH, 6-26 PTH, 6-27 PTH, 6-28 PTH, 6-29 PTH, 6-30 PTH, 6-31 PTH, 6-32 PTH, 6-33 PTH, 6-34 PTH, usw, unter anderem. Auch wenn eine Spezifität bis zur Position 34 oben beschrieben ist, wird die isolierende Bindungskomponente gelegentlich eine Spezifität für Positionen jenseits 34 auf dem PTH-Molekül aufweisen. Zusätzlich werden Kombinationen von isolierenden Bindungskomponenten berücksichtigt, welche zwei oder mehrere Bindungskomponenten umfassen, die variierende, aber komplementäre Spezifitäten für das PTH-Molekül gemäß dem vorliegenden Verfahren haben.
Die Indikator-Bindungskomponente kann jegliche Varietät von Spezifitäten für ein PTH-Molekül umfassen. Im Allgemeinen jedoch ist die Indikator-Bindungskomponente in der Lage, 1-84 und/oder 7-84 PTH zu binden. Häufig ist die Indikator-Bindungskomponente in der Lage ein oder mehrere PTH-Fragmente zusätzlich zu oder andere als 7-84 PTH zu binden. Daher kann die Indikator-Bindungskomponente eine Spezifität aufweisen, die diese PTH-Moleküle spezifisch oder andersartig binden kann. Häufig weist die Indikator-Bindungskomponente eine Spezifität auf, welche 1-84 PTH und/oder 7-84 PTH binden kann, wenn eines oder beide dieser Moleküle durch andere Bindungskomponenten wie hier beschrieben gebunden ist/sind. Die Indikator-Bindungskomponente umfasst häufig desweiteren einen nachweisbaren Marker, was ebenfalls hierin berücksichtigt ist.
Die Indikator-Bindungskomponente kann mehr als eine unterschiedliche Indikator-Bindungskomponente umfassen. Die Indikator-Bindungskomponenten können in einem Schritt hinzugefügt werden oder sie können in unterschiedlichen Schritten hinzugefügt werden. Daher sind die Bindungskomponentenaspekte der Reagenzien eines bestimmten Nachweisverfahrens der vorliegenden Beschreibung häufig kompatibel in Abhängigkeit von der Struktur und/oder Sequenz des interessierenden Analyten und der interferierenden Einheit. In einer gelegentlichen Ausführungsform bindet der Bindungskomponentenaspekt der markierten Indikator-Bindungskomponente die isolierende Bindungskomponente und/oder die Test-Festphase, die jeweils an die interferierende Einheit und den interessierenden Analyten gebunden ist. Spezifische Bindungspaare wie hier diskutiert und dem Fachmann bekannt, können in solch einer Ausführungsform nützlich sein, um eine derartige Bindung bereitzustellen.
In einer häufig mit einbezogenen Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren das Einführen einer Probe in ein Röhrchen (Reaktionskammer) umfassen, enthaltend oder möglicherweise enthaltend sowohl 1-84 PTH, 7-84 PTH (und/oder ein anderes PTH-Fragment). Das Reagenzglas umfasst Wände die mit einer spezifischen isolierenden Bindungskomponente beschichtet sind, gelegentlich als Einfang-Antikörper. In einer häufigen Ausführungsform umfasst der Einfang-Antikörper, mit dem das Röhrchen beschichtet ist, anti-1-9 PTH-Antikörper (z. B. Ziege-anti 1-9 PTH) oder einen anderen Antikörper, der selektiv oder spezifisch 1-84 PTH binden kann ohne 7-84 PTH zu binden. 1-84 PTH, das in der Probe vorhanden ist, bindet dann die beschichtete Röhrchenwand, aber 7-84 PTH wird nicht durch den 1-84 PTH Einfang-Antikörper auf den Wänden des Röhrchens gebunden. In der Praxis kann das Röhrchen mit der Probe während einer gewissen Zeit, z. B. 1-12 Stunden, ungefähr 18 bis 24 Stunden oder ungefähr 6 Stunden bei einer spezifischen Temperatur, z. B. Raumtemperatur inkubiert werden. Häufig wird das Röhrchen auf einem Orbitalmixer während der Inkubation, z. B. bei ungefähr 170 Rotation pro Minute rotiert. Nach Inkubation wird ein Kügelchen, das mit einem anderen PTH-Antikörper beschichtet ist, zu dem Röhrchen hinzugegeben. Häufig kann der Antikörper, der an das Kügelchen geheftet ist, selektiv oder spezifisch 7-84 PTH binden. In einem Beispiel kann der Antikörper auf dem Kügelchen eine Spezifität für einen Bereich umfassend 39 bis 84 des PTH-Moleküls umfassen (siehe, z. B., US-Patent Nr. 6,689,566) auch wenn andere Spezifitäten mit berücksichtigt sind. Das „Kügelchen" kann eine Sammlung von Kügelchen umfassen und der „Antikörper" kann eine Sammlung von Antikörpern umfassen. In einer häufigen Ausführungsform umfasst dieser an das Kügelchen gebundene Antikörper eine Test-Festphase. Ohne an eine spezifische Theorie gebunden zu sein: 1-84 PTH, das an die Röhrchenwand oder Kammer gebunden ist, verhindert das Binden des Antikörpers, der an das Kügelchen geheftet ist. Überdies kann die Kügelchen-Test-Bindungskomponente möglicherweise nicht das 1-84 PTH, welches an die Wand des Röhrchens oder der Kammer gebunden ist, binden. Eine Indikator-Bindungskomponente kann zu der Probe hinzugefügt werden, welche in der Lage ist, sowohl 1-84 PTH als auch 7-84 PTH zu binden. Häufig umfasst der Bindungskomponentenaspekt der Indikator-Bindungskomponente einen Antikörper oder ein Antikörperfragment. Gelegentlich kann der Indikator zwei oder mehrere Antikörper umfassen, so dass sowohl das 1-84 PTH als auch das 7-84 PTH an die Indikator-Bindungskomponente gebunden werden. Diese zwei oder mehrere Antikörper können zusammen oder getrennt hinzugefügt werden. Ein Inkubationsschritt der die Bindung der Indikator-Bindungskomponente(n) an 1-84 und 7-84 PTH ermöglicht, wird bereitgestellt. Die Indikator-Bindungskomponente wird häufig für einen solchen Abschnitt oder ein solches Epitop auf dem PTH spezifisch sein, das nicht schon durch die isolierende Bindungsopmponente (d.h. Einfang-Antikörper auf der Röhrchenwand) gebunden ist und auch nicht schon durch die Kügelchentestphasenbindungskomponente (d.h. der Einfang-Antikörper auf der Oberfläche des Kügelchens). Basierend auf dem oben genannten Beispiel wäre ein anti-7-34 PTH Indikator-Antikörper geeignet.
Nach Bindung von Röhrchen- und Kügelchen-Antikörper und Bindung von Indikator-Bindungskomponente, können das Röhrchen und das Kügelchen zusammen gewaschen werden, wie bei normalen Versuchsbedingungen für Waschprozesse und, sollte die Indikator-Bindungskomponente markiert sein, hinsichtlich dem Marker, der den Gesamt-PTH Mengen entspricht und 1-84 PTH und 7-84 PTH Mengen umfasst, analysiert werden. Die Kügelchen und Röhrchen müssen nicht zusammen gewaschen werden. Da beide Komponenten (interessierender Analyt und interferierende Einheit) markiert sind und sich das Kügelchen innerhalb des Röhrchens befindet, wird die Analyse sowohl des markierten Röhrchens, wie auch des markierten Kügelchens, das Zählen der Gesamtkonzentration von markiertem Analyt oder interferierender Einheit im Röhrchen umfassen.
Zusätzlich wird die Test-Festphase zur separaten Analyse häufig in ein anderes Röhrchen oder Mittel überführt. In dem obigen Beispiel kann diese separate Analyse nützlich sein, um die 7-84 PTH-Menge (und/oder ein anderes PTH-Fragment) in der Probe zu bestimmen, da die Test-Festphase an 7-84 PTH gebunden ist. Sobald die Test-Festphase von dem ersten Röhrchen entfernt ist (durch Überführen des Kügelchens in ein anders Röhrchen, das nicht in dem Versuch verwendet wurde), kann dieses Röhrchen (Teströhrchen oder Reaktionskammer) in Bezug auf 1-84 PTH-Mengen analysiert werden. Die 7-84 PTH-Konzentration (die nach Abtrennung von dem Antikörperbeschichteten Röhrchen aus dem Nachweismarker auf der Test-Festphase bestimmt wurde) und die 1-84 PTH-Konzentration (die aus dem Nachweismarker auf dem Röhrchen nach Abtrennung von den Kügelchen bestimmt wird) können zusammenaddiert werden, um die Gesamt-PTH-Konzentration in der Probe zu berechnen. Zusammen messen die drei Versuche direkt Gesamt-PTH, 1-84 PTH, 74-84 PTH-Konzentration (und/oder ein anderes PTH-Fragment) in der Probe. In einer weniger häufigen Ausführungsform, abhängig von der Spezifität der Reagenzien und dem Vorhandensein von PTH-Fragmenten die sich von 7-84 PTH unterscheiden, kann eine Berechnungsmethode verwendet werden, um die PTH-Mengen zu bestimmen, so dass wenn das Ergebnis von zwei der Analyten umfassend Gesamt-PTH, 1-84 PTH und 7-84 PTH bekannt sind, sie berechnet werden können, um zusammen mit anderen Komponenten die Menge des dritten Analyten oder die Menge des dritten Analyten (z. B. 1-34 PTH) zu bestimmen. Wie zusammen mit den anderen hier beschriebenen Ausführungsformen dargestellt, hängt das verwendete Verfahren zur Bestimmung der Menge an Analyten von Interesse in der Probe, zum Großen Teil von der Art des verwendeten Markers ab. Im Beispiel der Verwendung von radioaktivem Marken (z. B. 125-Iod) wird die Radioaktivität (CPM) der Röhrchen unter Verwendung von Gamma-Zählern und bekannten Mitteln gezählt.
Ein beispielhaftes Verfahren unter Verwendung der Trio-Kit Technologie wird in 6(A-E) dargestellt. In dieser Ausführungsform wird die Probe zur Bindung von 1-84 PTH enthaltend 1-84 PTH und 7-84 PTH in ein solches Röhrchen gegeben, dessen Wände mit Ziege-anti 1-9 PTH beschichtet sind und wird dann für Stunden (z. B. 18 bis 24 Stunden) (6A-6B) inkubiert. 1-84 PTH wird an den Röhrchenwänden die mit dem 1-9 PTH Antikörper beschichtet sind, eingefangen, 7-84 PTH wird jedoch nicht von den Röhrchenwänden, die mit dem 1-84 PTH Antikörper beschichtet sind, gefangen. Ein Kügelchen, das mit 39-84 PTH-Antikörper beschichtet ist wird hinzugefügt, wobei dieses an 7-84 PTH bindet, aber nicht von dem Röhrchen, das mit 1-9 PTH-Antikörper (6C) beschichtet ist, gebunden wird. Eine Inkubation in diesem Schritt ist nicht notwendig. Dann wird 7-34 PTH-Indikator (125-I) Antikörper hinzugefügt, welcher sowohl das Röhrchen mit gebundenem 1-84 PTH als auch das Kügelchen mit gebundenem 1-84 PTH markiert (6D). Häufig werden das Kügelchen und der Indikator und das Röhrchen über Nacht mit der Probe im Röhrchen rotierend bei Raumtemperatur inkubiert. Dann werden das Kügelchen und das beschichtete Röhrchen zusammen gewaschen und voneinander getrennt. Das Kügelchen und das beschichtete Röhrchen werden gemeinsam bezüglich der Markierung (CPM) und pgm/mL (6E) bewertet. Der beschichtete Röhrchenmarker entspricht der 1-84 PTH-Konzentration und der beschichtete Kügelchenmarker entspricht der 7-84 PTH-Konzentration. Die beiden Konzentrationen werden zusammenaddiert, und ergeben eine Gesamt-PTH („intaktes" PTH) Menge.
In einer alternativen Ausführungsform kann eine Testprobe, z. B. 300 Mikroliter Plasmaprobe, während einer gewissen Zeit, z. B. 5 Stunden bei einer geeigneten Temperatur, z. B. Raumtemperatur mit einem Röhrchen und einem Kügelchen inkubiert werden, wobei beide mit einem N-Terminus PTH-Antikörper z. B. 1-9 PTH-Antikörper beschichtet sind. Nach Inkubation kann ein Teil der Flüssigkeit, z. B. 200 Mikroliter, in ein neues Gefäß transferiert werden, z. B. in ein Teströhrchen, um 7-84 PTH zu messen. Das 7-84 PTH, welches nun im Wesentlichen frei von 1-84 PTH und anderen PTH-Fragmenten mit einem intakten N-Terminus ist, kann durch jegliche geeignete Verfahren gemessen werden, z. B. unter Verwendung eines mit einem 39-48 PTH-Antikörper beschichtetem Kügelchens und 7-34 PTH-Indikator-Antikörpers. Das 1-84 PTH und andere PTH-Fragmente mit einem intakten N-Terminus, welche nun sowohl an das Röhrchen wie auch an ein Kügelchen geheftet sind, welches mit 1-9 PTH-Antikörper beschichtet ist, können durch jegliches geeignete Verfahren gemessen werden, z. B. unter Verwendung eines 39-84 PTH -Indikator-Antikörpers für 1-84 PTH und andere geeignete Indikator-Antikörper für PTH-Fragmente mit einem intakten N-Terminus. Das 1-84 PTH und andere PTH-Fragmente mit einem intakten N-Terminus können, während sie an das ursprüngliche Röhrchen und Kügelchen gebunden sind oder können vor der Messung aus dem Röhrchen oder dem Kügelchen entlassen werden. Desgleichen können das 1-84 PTH, und andere PTH-Fragmente mit einem intakten N-Terminus, in dem ursprünglichen Röhrchen gemessen werden oder vor der Messung in ein neues Behältnis transferiert werden. Wenn das 1-84 PTH und andere PTH-Fragmente mit einem intakten N-Terminus in dem ursprünglichen Röhrchen gemessen werden, kann die Restflüssigkeit in dem ursprünglichen Röhrchen behalten werden oder kann vor der Messung aus dem Röhrchen entfernt werden. Das 1-84 PTH, andere PTH-Fragmente mit einem intakten N-Terminus und das 7-84 PTH können zusammen hinzugefügt werden, um eine Gesamt-PTH („intaktes" PTH) Menge zu errechnen.
In einer anderen Ausführungsform kann ein zusätzliches Festphasenpartikel mit einer daran gebundenen Bindungskomponente in die Probe eingeführt werden. Dieses zusätzliche Partikel ist mit einem Marker markiert, der von dem Marker auf der Indikator-Bindungskomponente unterscheidbar ist, wenn diese markiert ist. Im Allgemeinen kann dieses zusätzliche Festphasenpartikel für einen anderen Abschnitt auf der interferierenden Einheit und/oder dem Analyten spezifisch sein und wird Fragmente binden, die anders sind, als der Analyt von Interesse. Zum Beispiel, sollte die interferierende Einheit 1-84 PTH umfassen und der Analyt 7-84 PTH umfassen, dann kann das zusätzliche Festphasenpartikel für ein Epitop oder einen Abschnitt, umfassend 39-65 PTH spezifisch sein. Dieser Abschnitt kann selbstverständlich variieren, abhängig von der gewünschten Spezifität. Verfahren, welche hier beschrieben sind ermöglichen die Produktion von Bindungskomponenten mit der gewünschten Spezifität. Das zusätzliche Festphasenpartikel wird in die Probe eingeführt, nachdem die Probe mit den isolierenden und Test-Festphasen und/oder Indikator Bindungskomponenten inkubiert hat.
In einer alternativen Ausführungsform kann das beschichtete Röhrchen durch die Verwendung eines anderen Substrates, dass das gleiche daran gebundene Reagenz besitzet, ersetzt werden. Dieses Substrat ist vorzugsweise selektiv unterscheidbar von dem oben beschriebenen Kügelchen. In einem beispielhaften Verfahren kann beispielsweise eine Probe erhalten werden und in ein Röhrchen oder eine Reaktionssäule-/Kammer platziert werden, wie z.B. eine von Pierce Biotechnology (Rockford, IL) erhältliche. In einer häufigen Ausführungsform kann ein Gel mit daran gebundenem anti-1-9 PTH in die Säule und die Probe eingeführt werden, wobei man das 1-84 PTH, das in der Probe vorhanden ist, an den Gel-gebundenen Antikörper binden lässt. Ein Kügelchen mit einem Einfang-Antikörper wie dem anti-39-84 PTH wird dann in die Reaktionssäule eingeführt. Zusätzlich wird ein Indikator-Antikörper gemäß der obigen Beschreibung in die Probe eingeführt. Der Indikator-Antikörper und das Kügelchen mit dem gebundenem Einfang-Antikörper können dann verfügbare Analyten binden. Nach einer ersten Inkubation der Probe und des an den 1-9 PTH Antikörper befestigten Gels, bindet das 1-84 PTH an das Gel. Anschließend werden die mit dem 39-84 PTH Antikörper beschichteten Kügelchen (z. B. Testfestphase) hinzugefügt, und die zweite Inkubation wird gestartet, während welcher das 7-84 PTH an das Kügelchen gebunden wird. Dann wird der 7-34 PTH Indikator hinzugefügt, welcher beides, das 1-84 PTH, welches an das Gel gebunden ist, und das 7-84 PTH, welches an das Kügelchen gebunden ist, erkennt und eine Inkubation fortgesetzt. Nach dieser Inkubation kann eine Endwaschlösung auf die Säule gegeben werden, die Säule wird zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Der Waschschritt kann wiederholt werden für ein oder mehrere Male. Anschließend wird die Säule, enthaltend das Gel und das Kügelchen (und den gebundenen, markierten Analyt von Interesse und eine interferierende Einheit) gezählt und das Kügelchen in ein anderes Reaktionsgefäß überführt und die Säule, enthaltend das Gel und das Kügelchen, werden bewertet/gezählt. Die Bewertung zeigt die Anwesenheit, die Menge und/oder die Konzentration des Analyten von Interesse, der interferierenden Einheit und/oder einer Kombination dieser beiden.
Gemäß eines anderen Beispieles kann das Substrat magnetische Partikel umfassen oder andere Substrate, die unterschieden oder entfernt werden können von der Probe oder der Reaktionslösung, enthaltend das Kügelchen, verbunden mit dem Anti-39-84 PTH Antikörper, welcher an 7-84 PTH gebunden ist. Diese Ausführung ist ähnlich zu dem oben beschriebenen Verfahren, mit der Ausnahme, dass anstelle der Zentrifugation das Reaktionsgefäß auf einem Magneten platziert wird, zum Pelletieren durch die magnetisierten 1-9 PTH Antikörper beschichteten magnetischen Partikel, verbunden mit 1-84 PTH. Der Überstand wird anschließend abgesaugt und verworfen. Dieser Schritt kann ein- bis mehrfach wiederholt werden.
In einer Ausführungsform sind der Analyt und die interferierende Einheit anwesend in der Reaktionskammer bei selektivem Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und der Kombination aus dem Analyt und der interferierenden Einheit. Oft wird allerdings der Analyt entfernt aus der Reaktionskammer, nachdem die Probe in Kontakt gebracht wird mit der isolierten Bindungskomponente. Häufig wird der Analyt in Kontakt gebracht mit der Indikator-Bindungskomponente und/oder der Testfestphasen-Bindungskomponente, entweder (i) nach Kontakt mit der anderen Reaktionskammer oder (ii) im Anschluss an das Überführen in eine andere Reaktionskammer.
In einer anderen Ausführungsform ist die isolierte Bindungskomponente befestigt an der Wand der Reaktionskammer, so dass bei Hinzugabe mindestens einem Teiles der Probe in die Reaktionskammer die Probe in Kontakt tritt mit der isolierten Bindungskomponente.
In einer häufigen Ausführungsform ist die Indikator-Bindungskomponente markiert mit einem nachweisbaren Marker und die Indikator-Bindungskomponente umfasst eine erste markierte Indikator-Bindungskomponente, die spezifisch den Analyten bindet, und eine zweite markierte Indikator-Bindungskomponente, die spezifisch die interferierende Einheit bindet, wobei die Markierung der ersten Indikator-Bindungskomponente nachweislich unterscheidbar ist von der Markierung der zweiten markierten Indikator-Bindungskomponente.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die markierte Indikator-Bindungskomponente eine erste markierte Indikator-Bindungskomponente, die spezifisch den Analyten von Interesse bindet, und eine zweite markierte Bindungskomponente, die spezifisch die interferierende Einheit bindet, wobei die Markierung der ersten markierten Indikator-Bindungskomponente nachweislich unterscheidbar ist von der Markierung der zweiten markierten Indikator-Bindungskomponente.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren den Nachweis des Analyten, umfassend die Bestimmung der Menge von 7-84 PTH in der Probe, und den Nachweis der interferierenden Einheit, umfassend die Bestimmung der Menge von 1-84 PTH in der Probe. Häufig umfasst das Verfahren darüber hinaus das Berechnen der Menge des Gesamt-PTH aus der Kombination der Menge von 7-84 PTH und 1-84 PTH.
In einer anderen Ausführungsform umfasst der Nachweis der Kombination des markierten Analyten und der interferierenden Einheit in der Probe den Nachweis der Menge des Gesamt-PTH in einer Probe, wobei die 7-84 PTH Menge abgezogen wird von der Menge des Gesamt-PTH, zur Bestimmung der Menge von 1-84 PTH in der Probe.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Nachweis des Analyten die Bestimmung der Menge von 7-84 PTH in der Probe und der Nachweis der interferierenden Einheit umfasst die Bestimmung der Menge von 1-84 PTH in der Probe, wobei der Analyt nachgewiesen wird in einer anderen Reaktionskammer, und die interferierende Einheit nachgewiesen wird in der Reaktionskammer.
Oft wird eine Auswahl von zwei aus der 7-84 PTH Menge, der Menge des Gesamt-PTH und der Menge des 1-84 PTH in einem Verhältnis zueinander verglichen. Die Menge und/oder das Verhältnis kann verwendet werden zur Diagnose, zur Beobachtung oder als Leitfaden für eine Behandlung einer Erkrankung oder eines Leidens. Schranken, Grenzwert und/oder algorithmische Verfahren sind hierin beschrieben und können verwendet werden zur Diagnose, zur Beobachtung oder als Leitfaden für eine Behandlung einer Erkrankung oder eines Leidens.
Oft werden die Erkrankung und Leiden ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Ostheoporose, Nierensteinleiden, familäre Hypocalciurie, Hypercalciämie, multiple endokrine Adeomatose Typ I und II, Osteoporose, Paget's Knochenleiden, Hyperparathyreoidismus, Pseudohyperparathyreoidismus, Nierenversagen, renale Osteopathie, adynamische niedrige Knochenumsatznierenerkrankung, hohe Knochenumsatznierenerkrankung, Osteomalazie, Osteofibrose, Graves Leiden, das Ausmaß chirurgischer Entfernung der Nebenschilddrüse, Übersuppression mit Vitamin D oder einem Vitamin D-Analog oder einem Calcimimetikum oder Calcium und chronische Urämie.
In einer häufigen Ausführungsform umfasst die Bindungskomponente in jeder, der isolierten Bindungskomponente, der Indikator-Bindungskomponente und der Test-Festphasen-Bindungskomponente, einen Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares. Ebenso häufig umfasst die Bindungskomponente in jeder Ausführungsform, der isolierten Bindungskomponente, der Indikator-Bindungskomponente und der Test-Festphasen-Bindungskomponente, einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper.
In einer oft einbezogenen Ausführungsform wird die Test-Festphasen-Bindungskomponente, gebunden an den Analyten, entfernt aus der Reaktionskammer und überführt in eine andere Reaktionskammer, vor dem selektiven Nachweis des Analyten oder der interferierenden Einheit, und die Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem Analyten und die Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und der interferierenden Einheit werden selektiv bestimmt, wobei diese Bestimmung die Bestimmung der Menge des Analyten und der Menge der interferierenden Einheit in der Probe umfasst. Oft umfasst der Analyt 7-84 PTH und die interferierende Einheit umfasst 1-84 PTH und 1-34 PTH, wobei das Verfahren darüber hinaus die Bestimmung der Menge von 1-84 PTH in der Probe durch einen direkten 1-84 PTH Test umfasst. In dieser Ausführungsform wird der Test oft durchgeführt mit einem hierin beschriebenen Verfahren, aber mit einem zusätzlichen Test der Probe unter Verwendung eines Tests, der geeignet ist zum spezifischen Nachweis von 1-84 PTH, wie ein CAP-PTH Test (erhältlich von Scantibodies Laboratories Inc., Santee, Kalifornien). Die 1-84 PTH Menge, bestimmt durch Verwendung der Trio-Kit-Technologie, die hierin diskutiert wurde, wird dann subtrahiert von der 1-84 PTH Menge, bestimmt durch die Anwendung eines spezifischen 1-84 PTH Tests zur Bestimmung der Anwesenheit, Konzentration oder Menge von 1-34 PTH in der Probe. Diese Ausführungsform ist oft nützlich für einen Probanden, wenn dieser eine Verabreichung eines PTH Therapeutikums, wie Teraparatid (Forteo^® (erhältlich von Eli Lilly, Indianapolis, IN)), erhält.
Oft umfasst der Analyt einen Analyten, der sich von PTH unterscheidet, wie Calcitonin. Das vorliegende Verfahren kann angepasst werden zur Verwendung der Bestimmung der Anwesenheit und/oder der Menge von Calcitonin in einem Probanden in Anwesenheit von Procalcitonin und Präprocalcitonin.
e. PTH Medikations-Überwachungskit
1-34 PTH ist ein Medikament, das bekannt ist als Teriparatid oder FORTEO^® und oft verabreicht wird zur Behandlung von Osteoporose. Teriparatid ist eine syntetische Form von PTH (oder ein PTH-Analog) das dazu dient, die biologischen Effekt von PTH in vielfacher Weise nachzuahmen, insbesondere auf die Rate des Knochenumsatzes. Entsprechend ist es erstrebenswert die Menge von beidem, 1-34 PTH (oder Teriparatid) und 1-84 PTH, in Probanden zu überwachen. Die vorliegenden Ausführungformen können dieses Ziel für eine einzelne Patientengruppe erfüllen. Die vorliegenden Ausführungsformen sind ferner geeignet zum Nachweis von mittleren und großen N-terminalen PTH Fragmenten, wenn vorhanden.
In einer häufigen Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt zum Nachweis von PTH und Fragmenten und Analoga davon in einer Probe, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe enthaltend oder in Verdacht stehend zu enthalten vollständiges PTH und ein N-terminales PTH-Fragment oder Analog mit einer isolierten Bindungskomponente, welche die spezifische Bindung der isolierten Bindungskomponente an das vollständige PTH, aber nicht an das N-terminale PTH-Fragment oder Analog erlaubt; (b) Inkontaktbringen der Probe mit einer Test-Festphasen-Bindungskomponente, die eine spezifische Bindung der Test-Festphasen-Bindungskomponente an ein N-terminalen PTH-Fragment oder Analog, aber nicht an das vollständige PTH erlaubt; (c) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, die eine Bindung der Indikator-Bindungskomponente an das vollständige PTH und das N-terminale PTH-Fragment oder Analog erlaubt; und (d) Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem vollständigen PTH, dem N-terminalen PTH Fragment oder dem Analog und/oder die Kombination des vollständigen PTH und des N-terminalen PTH Fragments oder Analoga, wobei Schritt (a) ausgeführt wird vor Schritt (b) und/oder (c). Wie dargestellt, umfasst das N-terminalen PTH-Fragment oder Analog häufig 1-34 PTH oder Teraparatid.
In einer oft hinzugefügten Ausführungsform wird die Probe in einem Reaktionsgefäß in Kontakt gebracht mit der isolierten Bindungskomponente, wobei die isolierte Bindungskomponente immobilisiert ist auf der Oberfläche des Reaktionsgefäßes. Wenn notwendig, wird die isolierte Bindungskomponente dennoch immobilisiert auf einer festen Phase, die sich von der Oberfläche des Reaktionsgefäßes unterscheidet. Ferner, wie hierin beschrieben, schließt die „Oberfläche" im vorgesehenen breitesten Verständnis die äußerste Fläche einer festen Phase ein, wie auch den Bereich unterhalb der äußersten Fläche der festen Phase (z. B. innerhalb der Festphasen-Matrix) und einen Bereich oberhalb der äußersten Fläche der festen Phase (z.B. wenn ein Reagenz wie ein Linker oder eine Beschichtung verwendet wird).
Häufig umfasst die isolierte Bindungskomponente einen Anti-39-34 PTH Antikörper, wobei die isolierte Bindungskomponente ein C-terminales PTH-Fragment bindet, wenn vorhanden, zusätzlich zur Bindung des vollständigen PTHs. Häufig bindet die Indikator-Bindungskomponente das C-terminale Fragment nicht.
In einer Ausführungsform umfasst die isolierte Bindungskomponente einen Anti-39-84 PTH-Antikörper, die Test-Festphasen-Bindungskomponente einen Anti-15-34 PTH-Antikörper und der Testindikator einen Anti-1-9 PTH-Antikörper.
Häufig wird die Test-Festphase, gebunden an das 1-34 PTH oder Teriparatid, entfernt aus dem Reaktionsgefäß und zum Nachweis in ein anderes Reaktionsgefäß überführt. Oft wird die Bindung zwischen dem vollständigen PTH und der Indikator-Bindungskomponente nachgewiesen in einem Reaktionsgefäß, nachdem die Test-Festphase, gebunden an das 1-34 PTH oder Teriparatid, entfernt wurde.
In einer anderen häufigen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiter das Inkontaktbringen einer zweiten (oder anderen) Indikatorbindungskomponente mit der Probe nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der Test-Festphasen-Bindungskomponente, um eine Bindung der zweiten Indikator-Bindungskomponente an ein PTH-Fragment, umfassend 7-84 PTH, zu ermöglichen, soweit dieses in der Probe enthalten ist, und das Nachweisen der Bindung zwischen der zweiten Indikator-Bindungskomponente und dem 7-84 PTH. Häufig umfasst die zweite Indikator-Bindungskomponente einen Anti-15-34 PTH-Antikörper.
Ebenso häufig umfasst der Nachweis der Bindung zwischen dem vollständigen PTH und der Indikator-Bindungskomponente die Bestimmung der Menge des vollständigen PTHs in der Probe, wobei der Nachweis der Bindung zwischen dem 1-34 PTH oder Teriparatid und der Indikator-Bindungskomponente die Bestimmung der Menge von 1-34 PTH oder Teriparatid in der Probe umfasst, und wobei die gesamte Menge von vollständigem PTH und 1-34 PTH oder Teriparatid berechnet wird aus der Menge des vollständigen PTHs und der Menge des 1-34 oder Teriparatid.
In einer weiteren verwandten Ausführungsform umfasst das Verfahren darüber hinaus die Messung oder Berchnung der Menge eines PTH-Fragments, umfassend 7-84 PTH, in der Probe. Häufig wird die 7-84 PTH Menge gemessen unter Verwendung eines hierin beschriebenen Verfahrens. Oft wird dennoch die 7-84 PTH Menge gemessen und berechnet unter Verwendung des hierin beschriebenen Subtraktionsverfahrens, welches dem Fachmann bekannt ist. Wenn gemessen, wird häufig die Menge von 1-34 PTH oder Teriparatid, vollständigem PTH, 7-84 PTH und/oder Kombinationen oder davon bestimmten Verhältnissen verwendet in der Diagnose, Überwachung oder als Leitfaden für eine Behandlung einer Erkrankung oder eines Leidens. Schranke, Schwellenwert und/oder algorythmische Verfahren, die hierin beschrieben sind, können verwendet werden in der Diagnose, der Überwachung oder als Leitfaden für eine Behandlung einer Erkrankung oder eines Leidens. Die Erkrankung oder das Leiden sind üblicherweise derart, wie an anderer Stelle hierin beschrieben. Häufig umfassen die Erkrankung oder das Leiden Osteoporose.
8 zeigt eine beispielhafte Beschreibung der vorliegenden Ausführungsformen. Wie darin dargestellt, wird eine Probe, enthaltend oder in Verdacht zu enthalten 1-84 PTH und/oder 1-34 PTH, von einer Testperson genommen. Die Probe wird hinzugefügt in ein Röhrchen, dessen Wände mit einem Ziege-Anti-39-84 PTH-Antikörper beschichtet sind (8A). Ist 1-84 PTH in der Probe enthalten, dann verbindet sich dieses mit dem Ziege-Anti-39-84 PTH-Antikörper und dadurch an die Röhrchenwand (8B). In der Probe enthaltenes 1-34 PTH verbindet sich nicht mit dem Ziege-Anti-39-84 PTH-Antikörper, da das Zielepitop nicht vorhanden ist (8B). Die Probe wird nun inkubiert in dem Röhrchen, unter Rotation, für etwa 18-24 Stunden. Anschließend wird ein Kügelchen, beschichtet mit Anti-15-34 PTH Antikörper, zu der Probe in das Röhrchen hinzugefügt (8C). Dieses Antikörper-beschichtete Kügelchen bindet mit dem in der Probe enthaltenen 1-34 PTH. Obwohl nicht vorgesehen ist durch eine Theorie gebunden zu sein, bindet der Anti-15-34 PTH Antikörper kein 1-84 PTH, wenn dies in der Probe vorhanden ist, da das 1-84 PTH bereits gebunden wurde durch den Ziege-Anti-39-84 PTH Antikörper. Ein Anti-1-9 PTH Indikator-Antikörper wird ferner hinzugefügt zu der Probe (8D). Dieser Indikator-Antikörper ist markiert mit einer 125-Jodmarkierung und bindet beides, das in der Probe enthaltene 1-84 PTH und 1-34 PTH. Diese Kombination wird nun inkubiert, unter Rotation, für mehrere Stunden. Das Kügelchen und das beschichtete Röhrchen werden dann zusammen gewaschen und anschließend getrennt (8E). Einmal getrennt, werden das Kügelchen und das Röhrchen getrennt betrachtet für die Markierung (CPM) und pgm/mL. Die Markierung des beschichteten Röhrchens entspricht der 1-84 PTH Konzentration und die Markierung des beschichteten Kügelchen entspricht der 1-34 PTH Konzentration. Die beiden Konzentrationen können zusammenaddiert werden, um die Menge des gesamten 1-84 PTH und 1-34 PTH zu erhalten. Wenn notwendig, werden Kügelchen und Röhrchen vor der Trennung betrachtet.
f. Antikörperherstellung
Proteine und Peptide geeignet zur Antikörpererzeugung können hergestellt werden durch eine Vielzahl von dem Fachmann bekannter Methoden. Zum Beispiel können solche Proteine und Peptide hergestellt werden durch konventionelle Verfahren einschließlich Festphasen-Peptidsynthese, siehe z.B. R.B. Merrifield, et al., Bichemistry 21:5020 (1982), Flüssigphasen-Peptidsynthese oder rekombinante Techniken. Für verwandte Verfahren siehe US Patentanmeldung Nr. 10/799,476, eingereicht am 11. März 2004. Damit können solche Peptide und Proteine isoliert oder synthetisch/rekombinant hergestellt werden durch dem Fachmann bekannte Verfahren.
Polyklonale Antikörper können in vivo hergestellt werden durch Antwort auf ein immunisierendes Antigen (z.B. Protein, Peptid, Hapten, chemische Substanzen, etc.). Antiserum kann erhalten werden in einer Vielzahl von Tieren und beobachtet durch einen ELISA Test (oder andere bekannte Tests). Oft wird ein Antigen, umfassend ein kleines Molekül oder ein Hapten, gekoppelt an einen Träger zur Induktion einer immunologischen Reaktion. Monoklonale Antikörper bieten eine einzige Epitopspezifität und ein großes Volumen von identischen Antikörpern. Im Gegensatz dazu bieten polyklonale Antikörper oft eine Vielzahl von Spezifitäten und sind gelegentlich limitiert im Volumen, in Teilen, durch die Menge von Serum die erhalten werden kann durch die Immunisation eines Tieres. Dennoch kann die Spezifität von polyklonalen Antikörpern durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von gereinigtem oder syntetischem Antigen verbessert werden (das Volumen kann größer sein, wenn ein Tier wie eine Ziege verwendet wird, was den Vorteil hat, das ein größeres Serumvolumen bereitgestellt wird als bei kleineren Tieren, wie dem Guinea-Schwein oder Kaninchen).
Synthetische kleine Peptide werden häufig verwendet zur Erzeugung von Antikörpern. Dieser Ansatz umfasst das Synthetisieren kleiner Peptidsequenzen, oft das anschließende Ankoppeln dieser an größere Trägermoleküle, und das Immunisieren des Tieres der Wal mit dem Peptid-Trägermolekül.
Eine beispielhafte Ausführungsform eines Verfahrens zur Herstellung einer spezifischen Bindungskomponente/Antikörper sieht folgendermaßen aus: menschliches 1-84 PTH wird erhalten oder synthetisiert umfassend eine Aminosäuresequenz:
SVSEIQLMHN LGKHLNSMER VEWLRKKLQD VHNFVALGAP LAPRDAGSQR PRKKEDNVLV ESHEKSLGEA NKADVNVLTK AKSQ
Menschliches 1-9 PTH wird erhalten/synthetisiert umfassend die Aminosäuresequenz:
SVSEIQLMH
Menschliches 39-84 PTH wird erhalten oder synthetisiert umfassend die Aminosäuresequenz:
P LAPRDAGSQR PRKKEDNVLV ESHEKSLGEA NKADVNVLTK AKSQ
Menschliches 1-34 PTH wird erhalten oder synthetisiert umfassend die Aminosäuresequenz:
SVSEIQLMHN LGKHLNSMER VEWLRKKLQD VHNF
Ein 7-34 PTH Protein-Fragment wird isoliert oder synthetisiert umfassend:
LMHN LGKHLNSMER VEWLRKKLQD VHNF
In einer Ausführungsform wird das 1-9 PTH Fragment angeheftet an eine Affinitätsausreinigungssäule. Die Anheftung kann erreicht werden durch bekannte Hilfsmittel, wie durch die Verwendung eines Linkers am Carboxyl-terminalen Ende des PTH-Fragments.
In einer Ausführungsform umfasst die Bindungskomponente einen Antikörper, spezifisch für den Bereich 1-9 PTH, und wird hergestellt wie folgt. Eine oder mehrere Ziegen werden immunisiert mit 1-84 PTH. Anschließend wird Serum der/den immunisierten Ziege(n) vereinigt und Affinitäts-aufgereinigt gegen 1-9 PTH. Nach Affinitätsaufreinigung gegen 1-9 PTH wird das Reaktionsprodukt der Affinitätsausreinigung gegebenenfalls als negativ absorbiert mit 7-84 PTH. Häufig umfasst diese Bindungskomponente Bindungskomponenteneigenschaften der Blockierungs-, Isolations- und/oder Indikator-Bindungskomponente. Es gibt andere Verfahren zur Herstellung und Aufreinigung von Antikörpern und diese sind allgemein bekannt, siehe z.B. US Patent Nr. 6,689,566.
In einer Ausführungsform umfasst eine Bindungskomponente einen Antikörper spezifisch für den Bereich 1-34 PTH und wird hergestellt wie folgt. Das 1-34 PTH Fragment wird angeheftet an eine Affinitätsaufreinigungssäule. Die Anheftung kann erreicht werden durch allgemein bekannte Hilfsmittel, wie durch die Verwendung eines Linkers am Carboxyl-terminalen Ende des PTH-Fragmentes. Eine oder mehrere Ziegen werden immunisiert mit 1-84 PTH. Anschließend wir Serum der/die immunisierte Ziege(n) vereinigt und Affinitätsaufgereinigt gegen 1-34 PTH. Nach Affinitätsaufreinigung gegen 1-34 PTH wird das Reaktionsprodukt dieser Affinitätsaufreinigung gegebenenfalls negativ absorbiert mit 1-9 PTH. Häufig umfasst diese Bindungskomponente die Bindungskomponenteneigenschaften der Indikator-Bindungskomponente.
In einer Ausführungsform umfasst eine Bindungskomponente einen Antikörper, spezifisch für den Bereich 7-34 PTH, und wird hergestellt wie folgt. Das 7-34 PTH-(7-34) Fragment wird angeheftet an eine Affinitätsaufreinigungssäule. Die Anheftung kann erreicht werden durch allgemein bekannte Hilfsmittel, wie durch Verwendung eines Linkers am Carboxy-terminalen Ende des PTH-Fragments. Eine oder mehrere Ziegen werden immunisiert mit 1-84 PTH. Anschließend wird Serum von der/den immunisierten Ziege(n) vereinigt und aufgereinigt gegen 7-34 PTH. Nach Affinitätsaufreinigung gegen 7-34 PTH wird das Reaktionsprodukt dieser Affinitätsaufreinigung gegebenenfalls negativ absorbiert mit 1-9 PTH. Häufig umfasst die Bindungskomponente die Bindungskomponenteneigenschaften der Indikator-Bindungskomponente.
Obwohl nicht vorgesehen ist, durch eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, hängt die Fähigkeit von Antipeptid-Antikörpern zur Erkennung von natürlichen Proteinen, wenn diese in der Immupräzipitation oder Immunohistochemiefärbung eingesetzt werden, von der präsentierten Peptidsequenz auf der Oberfläche des natürlichen Proteins in einer Konfirmation ähnlich der im Peptid-Trägerprotein-Konjugat enthaltenen ab. Deshalb wird die erfolgreiche Herstellung von Antipeptid-Antikörper oft bestimmt durch die Vorhersage der Lokalisation von bestimmten Peptidsequenzen in der dreidimensionalen Struktur des Proteins. Proteinvorhersageprogramme sind erhältlich für solche Analysen. Wichtige Faktoren, die berücksichtigt werden sollen, umfassen z.B. Proteinhydrophilität, -hydrophobität, den Anteil zugänglicher Reste, Beta-Faltung und Flexibilität. Siehe Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132; Hopp T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828; Janin J., 1979 Nature 277:491-492; Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1:289-294; und Bhaskaran R., und Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32 :242-255. Siehe ebenso die ProtScale Website im World Wide Web unter (.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) über den ExPasy molecular biology server.
Einmal hergestellt oder erhalten sind solche Antigene geeignet zur Erzeugung von dagegen gerichteter Antikörper unter Verwendung allgemein bekannter Verfahren. Häufig umfasst dieser Prozess die Verabreichung von Ziel-Proteinen oder Peptiden an ein Wirtstier. Geeignete Tiere schließen Kaninchen, Mäuse, Schafe, Hühner, Ziegen, Kühe, Schweine, Ratten, etc. ein. Eine Anzahl von verschiedenen Tieren kann ebenso geeignet sein zur Erzeugung solcher Antikörper, diese sind allgemein bekannt und dem Fachmann zugänglich.
In einer Ausführungsform ist das negative Durchmusterungsprotein oder Peptid angeheftet an eine feste Phase. Häufig ist die feste Phase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Agarosekügelchen, einem Zellulosepartikel, einer Glasfaser, einem überprüften Porenglaskügelchen und einem Polystyrolplastikkügelchen. In einer anderen häufigen Ausführungsform wird die feste Phase getrennt von der Antikörpermixtur zur Entfernung ungewünschter Antikörper, welche das negative Durchmusterungsprotein oder Peptid binden.
In einer anderen Ausführungsform wird die Antikörpermischung durch eine Säule geschickt, umfassend das negative Durchmusterungsprotein oder Peptid, angeheftet an eine feste Phase, zum Zurückhalten eines unerwünschten Antikörpers, der an das negative Durchmusterungsprotein oder Peptid auf der Säule bindet, während zugelassen wird, dass ein gewünschter Antikörper nicht an das negative Durchmusterungsprotein oder Peptid bindet und hindurchläuft.
In einer gelegentlichen Ausführungsform umfasst das vorliegende Verfahren eine positive Durchmusterung zur Sammlung der gewünschten Antikörper. Ein solcher positiver Durchmusterungsschritt kann vorgenommen werden vor, wird jedoch häufig vorgenommen nach der Abschätzung der Bindung.
In einer häufigen Ausführungsform wird die Bindung zwischen dem Zielprotein oder Peptid mit einem spezifischen Antikörper abgeschätzt durch ein Sandwich oder ein Kompetitionstest-Format. Häufig wird die Bindung zwischen dem Zielprotein oder Peptid mit einem spezifischen Antikörper abgeschätzt, durch Verwendung eines Formats ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus enzym-verbundenen Immunosorbens-Test (ELISA), Immunblotten, Immunpräzipitation, Radioimmunoassay (RIA), Immunanfärbung, Latexagglutination, indirekter Hämagglutinintest (IHA), Komplementfixierung, indirekter Immunofluoreszenzassay (IFA), Nephilometrie, Durchflußzytrometrietest, Chemilumineszenztest, Lateralflussimmunotest, u-capture Test, Inhibitionstest und Aviditätstest.
Zur Schaffung eines Affinitäts-aufgereinigten anti-1-9 PTH Antikörpers verwendet man als erstes ein ausgewähltes initiales PTH Sequenzpeptid (z.B. 1-3 PTH, 1-4 PTH, 1-5 PTH, 1-6 PTH, 1-7 PTH, 1- 8 PTH, 1-9 PTH, 1-10 PTH, ...1-34 PTH, etc.) wie oben beschrieben als Teil eines Immunogens zur Injektion in eine Ziege. Das Peptid kann verwendet werden entweder alleine als injizierbares Immunogen, eingefügt in ein nicht-PTH Peptid, welches üblicherweise ein Molekulargewicht besitzt zwischen etwa 5000 und 10.000.000, oder als Teil einer vollständigen 1-84 PTH Sequenz. Das Immunogen wird gemischt mit einem gleichen Volumen von kompletten Freundschem Adjuvans, welches ein Gemisch ist aus leichtem Mineralöl und inaktiviertem Mykobakterium tuberculosis bacilli. Das erhaltene Gemisch wird homogenisiert zur Herstellung einer wässrigen/öligen Emulsion, die injiziert wird in das Tier (üblicherweise eine Ziege) für eine erste Immunisation. Die immunogene Dosis liegt ungefähr bei 50-400 Mikrogramm. Ziegen werden monatlich mit der gleichen Dosis des immunogenen Komplexes injiziert, abgesehen davon dass kein Mykobakterium tuberulosis bacilli bei den folgenden Injektionen verwendet wird (unvollständiges Freundsches Adjuvans). Die Ziegen werden monatlich geblutet, etwa drei Monate nach der ersten Immunisation. Das Serum (oder Antiserum) wird bei jeder Blutung gewonnen durch Separation der roten Blutzellen vom Blut durch Zentrifugation und Entfernen des Antiserums, welches angereichert ist mit 1-9 PTH Antikörpern.
Zur Reinigung des Antiserums für einen exemplarischen (1-9) PTH-Antikörper packt man eine Auftrennungssäule mit den initialen PTH Sequenzpeptid, gebunden an Kügelchen wie oben beschrieben, wäscht die Säule und equilibriert diese mit 0,01 M Phospat-gepufferter Saline (PBS). Das Antiserum wird auf die Säule geladen und gewaschen mit 0,01 M PBS um die Antikörper ohne Spezifität für (1-9) PTH zu entfernen. Der gebundene spezifische Ziege-Anti-(1-9) PTH poloklonale Antikörper wird eluiert von der 1-9 PTH Festphase in der Säule durch Durchführung einer Elutionslösung von 0,1 M Glycinhydrochloridpuffer, pH 2,5, durch die Säule. Der eluierte polyklonale Antikörper wird neutralisiert nach dem Verlassen der Säule, entweder durch Zugabe von 1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, oder durch einen Pufferaustausch mit 0,01 M PBS, wie dies dem Fachmann bekannt ist. Der polyklonale Antikörper kann gelagert werden bei 2-8 °C. Dieses Verfahren kann verwendet werden zur Schaffung einer Vielzahl von PTH Antikörpern, die geeignet sind als Bindungskomponenten zur Bindung ungewünschter interferierender Einheiten (wie 1-84 PTH bei einem direkten 7-84 PTH Test), Einfangantikörper, Blockierungsantikörper und andere hierin genannte, abhängig vom PTH Fragment, welches am Gel der Säule befestigt ist. Die spezifische Peptidsequenz, welche als Immunogen und auf der Auftrennungssäule benutzt wird, wird variieren, abhängig von der gewünschten Spezifität. Der Anti-1-9 PTH Antikörper, hergestellt durch dieses Verfahren vermeidet Kreuzreaktivität mit PTH-Fragmenten, welchen der ersten Aminosäurerest von PTH fehlt, welche das Analyt von Interesse enthalten kann, wenn das 1-84 PTH die interferierende Einheit umfassen kann. Weitere Antikörper mit anderen Spezifitäten werden klar erwogen.
Beispielhafte Einfangantikörper können erzeugt werden durch die Befestigung von Antikörpern (z.B. Affinitäts-aufgereinigte Ziege-Anti-39-84 PTH Antikörper (Scantibodies Laboratory, Inc., Santee, Kalifornien)) an eine 12 × 75 mm Polysterolröhrchen (Nunc, Dänemark) unter Zuhilfenahme von passiven Absorbtionstechniken, oder an Partikel, Kügelchen oder Agarosegel (und anderen Substrate) durch Verfahren über kovalente oder nicht-kovalente Bindung, die Chemie dieser ist dem Fachmann bekannt.
Man kann einen markierten Antikörper schaffen durch Jodierung von 50 Mikrogramm eines Antikörpers durch Oxidation mit Chloramin-T, Inkubation für 25 Sekunden bei Raumtemperatur mit einem Millicurie von 125-I Radioisotops und Reduzieren mit Natriummetabisulfat. Nicht eingebaute 125-I Radioisotope können abgetrennt werden vom Antikörper durch Durchführung des Jodierungsgemisches über eine PD-10 Entsalzungssäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) entsprechend der Herstellerinstruktionen. Die von der Entsalzungssäule gesammelten Fraktionen werden gemessen in einem Gammazähler und die Fraktionen, die den 125-I markierten Antikörper enthalten, werden zusammengeführt und verdünnt auf etwa 300.000 DPM (Zerfalle pro Minute) pro 100 Mikroliter. Alternativ kann man markierte und unmarkierte Antikörper erhalten, wie Affinitäts-aufgereinigte Ziege Anti-1-34 PTH Antikörper oder Affinitäts-aufgereinigte Ziege-Anti-7-34 PTH Antikörper und andere aus kommerziell zugänglichen Quellen wie Scantibody Laboratory, Inc., Santee, Kalifornien.
g. Kits
In einer häufigen Ausführungsform wird ein Kit gemäß den hierin beschriebenen Verfahren und Materialien bereitgestellt, inklusive Spezifität durch Blocken, selektive Epitopexposition, Kügelchen, CAP-PR, PTH-Medikamentbeobachtung, Calcitoninmessung, Messung von vollständigem PTH und Triokittechnologien. Diese Verfahren und Materialien sind hierin an anderer Stelle beschrieben.
Die vorliegende Beschreibung stellt Kits bereit zur Ausführung der Verfahren der Erfindung. Diese Kits umfassen in einer oder mehreren Behältern eine blockierende Bindungskomponente, eine markierte Indikator-Markierungskomponente, eine Test-Festphasen-Bindungskomponente (wie eine Agarose oder Kügelchen, oder eine feste Oberfläche wie die feste Oberfläche einer Röhrchenwand) und gegebenenfalls eine isolierende Bindungskomponente. Die Reagenzien werden sich unterscheiden, abhängig von dem auszuführenden Test und können darüber hinaus Waschreagenzien, Verdünnungsmittel oder andere Reagenzien und Behälter enthalten, die notwendig sind zur Ausführung eines Tests gemäß den vorliegenden Verfahren. Oft stellt der Kit ein oder mehrere Reaktionskammern/Gefäße und Reagentien zur Verwendung darin bereit.
In einer häufigen Ausführungsform wird ein Reagenz bereitgestellt, das geeignet ist zur Vorbehandlung einer Probe zur Bestimmung der Menge von 7-84 PTH unter Verwendung eines Gesamt-PTH Tests umfassend eine Bindungskomponente, die spezifisch ist für alle oder Teile eines Bereichs auf dem PTH-Molekül umfassend 1-9 PTH oder 1-15 PTH, wobei die Bindungskomponente an eine feste Phase angeheftet ist. In einer anderen häufigen Ausführungsform wird ein Reagenz, geeignet zur Vorbehandlung der Probe, bereitgestellt, zur Bestimmung der Menge von 1-84 PTH unter Verwendung eines Gesamt-PTH-Tests umfassend eine Bindungskomponente, die spezifisch ist für alle oder Teile eines Bereichs des PTH-Moleküls umfassend 15-34 PTH oder 7-34 PTH. Im Allgemeinen sind die Reagenzien geeignet zur Umwandlung eines gesamten oder „intakten" PTH-Tests zu einem Test, der geeignet ist zur direkten spezifischen Messung von 7-84 PTH bzw. 1-84 PTH. Bei Gelegenheit werden diese Reagenzien zusammen benutzt zur spezifischen Analyse der Anwesenheit und/oder Menge von 1-84 PTH und der Anwesenheit und/oder Menge von 7-84 PTH in einer Probe, von der die Gesamt-PTH-Menge bestimmt wird. Die Reagenzien werden genutzt gemäß dem hierin bereitgestellten Verfahren, wobei die Probe vorbehandelt wird vor dem Inkontaktbringen der Probe mit den Reagenzien, die verwendet werden für den gesamten oder „intakten" PTH Test, der, abgesehen von den Proben-Vorbehandlungsverfahren, geeignet ist zur Messung von beidem, 1-84 PTH und 7-84 PTH.
Instruktionen werden häufig den erwogenen Kits und Reagentien beigefügt.
h. PTH-Tests
Tests, die geeignet sind zur Messung von vollständigem PTH, umfassen Scantibodies CAP PTH assays (erhältlich von Scantibodies Laboratories, Inc., Santee, Kalifornien), Scantibodies Whole PTH assay (erhältlich von Scantibody Laboratories, Inc.), Advantage Bio-Intact PTH assay (erhältlich von Nichols Institute Diagnostics, San Clemente, Kalifornien) oder Human Bioactive Intact PTH assay (erhältlich von Immutopics, Inc., San Clemente, Kalifornien).
Tests, die geeignet sind zur Bestimmung von Gesamt-PTH, umfassen Scantibodies total intact PTH assay oder intact PTH assay (erhältlich von Scantibodies Laboratories, Inc.), Allegro Intact PTH assay (erhältlich von Nichols Institute Diagnostics), Advantage Intact PTH assay (erhältlich von Nichols Institute Diagnostics) oder Human Intact PTH assay (erhältlich von Immunotopics). Siehe z.B. Slatopolsky E, et al., Kidney Intl. 2000; 58:753-761 (zeigen, dass der Nichols-Allegro intact PTH IRMA assay beides misst, 1-84 PTH und 7-84 PTH); siehe auch Lepage, R., et al., Clin. Chem. (1998) 44(4):805-9. Andere Gesamt-PTH-Tests sind erhältlich oder dem Fachmann bekannt und werden hierhin erwogen, wie solche, die erhältlich sind von Diagnostics Products Corp. (Los Angeles, CA) (z.B. der Immulite Intact PTH assay oder der Immulite Turbo Intact PTH assay), wie auch andere.
In einer Ausführungsform wird ein Kit erwogen, der geeignet ist zusammen mit bekannten PTH-Tests. Zum Beispiel durch Zugabe einer 1-9 PTH Blockierungs-Bindungskomponente in der Form eines Partikels oder einer blockierenden Antikörper-Vorbehandlung zu der Probe, kann jeder der Gesamt-PTH-Tests, auf die oben verwiesen wurde, umgewandelt werden in einen spezifischen und direkten 7-84 PTH-Test. Andere hierin erwogene Testreagenzien können in gleicher Art verwendet werden, in Übereinstimmung mit ihrem Zweck im Gesamttest.
In einer Ausführungsform wird weiter davon ausgegangen dass, wenn ein Gesamt-PTH-Test 7-84 PTH zusammen mit anderen PTH-Fragmenten misst, und wenn dieser Gesamt-PTH-Test entsprechend der oben beschriebenen Verfahren nicht gemacht wurde zur Messung von 1-84 PTH (z.B. durch Verwendung einer 1-9 PTH-Blockierungs-Bindungskomponente), der resultierende „direkte und spezifische 7-84 PTH-Test" häufig 7-84 PHT zusammen mit den anderen PTH-Fragmenten messen wird, die der gesamte PTH-Test gemessen hat bevor dieser einer der anderen vorliegenden Methoden zugeführt wurde.
Häufig wird die Bindung zwischen dem Analyt und/oder der interferierenden Einheit und der Bindungskomponente in einer Ausführung betrachtet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus z.B. einem enzym-verbundenen Immunosorbens-Test (ELISA) Immunblotten, Immunpräzipitation, Radioimmunoassay (RIA), Immunfärbung, Latexagglutination, indirekter Hämagglutinationstest (IHA), Komplementfixierung, indirekter Immunfloureszenzassay (ISA), Nephelometrie, Durchfluß-zytrometrischer Test, Chemilumineszenztest, Lateralflussimmunotest, Immunoradiometrischer Test (RMA), μ-capture-Test, lineare Flussmembranchromatographie, Inhibitionstest, Energietransfertest, Aviditätstest, turbidometrischer Immuntest und „time resolved amplified cryptate emission (TRACE)"-Test.
i. Beispielhafte Analyte
In einer Ausführungsform ist der Analyt von Interesse ein Marker eines biologischen Stoffwechselwegs, eine Gruppe von zellulären Strukturen mit identischen oder ähnlichen biologischen Funktionen, ein Stadium des Zellzyklus, ein Zelltyp, ein Gewebetyp, ein Organtyp, ein Entwicklungsstadium, eine Erkrankungs- oder Störungsart oder – Stadium, oder ein Arzneistoff oder eine andere Behandlung. Häufig ist der Analyt von Interesse ein klinischer Marker. Oft ist der Analyt von Interesse ein Marker für das Nebenschilddrüsenerkrankungsstadium, renale Osteopathie, Osteoporose, Knochenumsatzstadien, Graves' Leiden, das Ausmaß der teilweisen oder vollständigen Nebenschilddrüsen-Entfernung. Bei Gelegenheit ist der Analyt von Interesse ein Hormon oder eine nicht-proteinartige oder Nicht-Peptidyleinheit, wie ein Oligonucleotid, eine Nukleinsäure, ein Vitamin, ein Oligosaccharid, ein Kohlenhydrat, ein Lipid, ein kleines Molekül und ein Komplex oder eine Kombination daraus. Ähnlich kann die interferierende Einheit jede dieser Arten von Einheiten sein.
Die in der vorliegenden Offenbarung erwogenen Analyte enthalten generell eine gewisse Homologie zu der interferierenden Einheit. Oft ist diese Homologie signifikant. Deshalb umfasst der Analyt oft ein Fragment, Isoform, Analog, Variante oder homologe Mutante der interferierenden Einheit. Ein Analyt, umfassend eine Isoform oder ein Analog, bezieht sich auf eine Einheit, die verwandt ist mit und/oder abgeleitet von der interferierenden Einheit.
Oft ist der Analyt mehr als 90% homolog oder identisch mit der interferierenden Einheit, obwohl höhere Anteil klar erwogen und bevorzugt sind. Zum Beispiel können Analyte der vorliegenden Offenbarung etwa 91 %, etwa 92%, etwa 93%, etwa 94%, etwa 95%, etwa 96%, etwa 97%, etwa 98%, etwa 99% und etwa 99% oder mehr homolog oder identisch zu der entsprechenden interferierenden Einheit sein. Weniger gelegentlich ist der Analyt gemäß der vorliegenden Offenbarung mehr als etwa 15%, oder etwa 50%, oder etwa 60%, oder etwa 70%, oder mehr als etwa 75%, oder mehr als etwa 80%, oder mehr als etwa 85% homolog oder identisch mit der entsprechenden interferierenden Einheit.
In einer häufigen Ausführungsform werden die vorliegenden Verfahren verwendet zur Prognose, Diagnose und/oder Beobachtung der Behandlung von familiärer Hypocalciurie, Hypercalcämie, multipler endokriner Adeomatose Typ I und II, Osteoporose, Paget's Knochenleiden, Hyperparathyreoidismus, Pseudohyperparathyreoidismus, Nierenversagen, renaler Osteopathie, adynamischer niedriger Knochenumsatznierenerkrankung, hohe Knochenumsatznierenerkrankung, Osteomalazie, Osteofibrose, Graves Leiden, das Ausmaß chirurgischer Entfernung der Nebenschilddrüse, Übersuppression mit Vitamin D oder einem Vitamin D-Analog oder einem Calcimimetikum oder Calcium oder chronische Urämie. Oft ist der Hyperparathyroidismus ein primärer Hyperparathyroidismus, ausgelöst durch primäre Hyperplasie oder ein Adenom der Nebenschilddrüsen oder sekundärer Hyperparathyroidismus ausgelöst durch Nierenversagen.
In einer gelegentlichen Ausführungsform werden die Verfahren verwendet zur Unterscheidung zwischen gastritisch-inhibitorischem Polypeptid (GIP) und/oder Glucagon-ähnlichem Peptid (GLP), GIP-1 und/oder GLP-1, und GIP-2 und/oder GLP-2. Ebenso wird das Verfahren gelegentlich verwendet zur Unterscheidung zwischen Creatinkinase (CK)-Isoformen (CK-MM(Muskel) und CK-BB(Gehirn) und CK-MB(Hybrid)), zum Beispiel verwendet zur Unterscheidung von CK-MM von CK-BB. Ebenso gelegentlich wird das Verfahren verwendet zur Unterscheidung von Schilddrüsen-stimulierendem Hormon (TSH) und/oder Follikel-stimulierendem Hormon (FSH). Zusätzlich wird das Verfahren verwendet zur Unterscheidung von Insulin von Proinsulin oder zur Messung der einzelnen Analyte. Ferner ist das vorliegende Verfahren geeignet zur Unterscheidung von Osteocalcin oder adenocorticotrophem Hormon (ACTH) von deren Fragmenten. Häufig werden die vorliegenden Verfahren genutzt zur Unterscheidung zwischen Insulin und Proinsulin. Ebenso häufig werden vorliegende Kits und Verfahren verwendet zur Unterscheidung zwischen Calcitonin und Procalcitonin.
Die vorliegenden Verfahren sind ebenso geeignet zur Bestimmung und/oder Vergleich der Anwesenheit und/oder Menge von nicht-typischen PTH (ntPTH) (auf das hierin auch verwiesen wird als nicht-typisches 1-84 PTH oder eine neue Form von PTH (nfPTH)). Siehe die US-Anmeldung mit der Seriennummer 60,508,547 eingereicht am 3. Oktober 2003. Wie gekennzeichnet in den HPLC-Profilen in 10A sind drei Peaks vorhanden. Diese Peaks repräsentieren einen Anteil von Gesamt-PTH in einer Probe. Die Probe wurde erhalten von einer Testperson, die unter Nebenschilddrüsenkrebs litt. Peak 1 entspricht einem nicht-vollständigem PTH-Fragment, umfassend 7-84 PTH, Peak 2 entspricht dem ntPTH. Peak 3 entspricht dem vollständigen PTH. Wie das Profil zeigt, ist ntPTH chromatographisch unterschiedlich von 1-84 PTH und wird gemessen in einem spezifischen 1-84 PTH-Test (zum Beispiel der CAP oder Whole-PTH-assay der Peaks 2 und 3 misst), dies wird aber nicht in einem signifikanten Ausmaß durch einen Gesamt-PTH-Test gemessen (zum Beispiel der total-intact-PTH oder intact-PTH-assay, der die Peaks 1 bis 3 misst). Diese beiden Tests, zusammen mit einer gegebenenfalls direkten Messung von 7-84 PTH, ermöglichen die Messung von ntPTH durch Subtraktion der 7-84 Menge von der gemessenen Gesamt-PTH-Testmenge, die dann subtrahiert wird von der gemessenen 1-84 PTH-Testmenge. Die 7-84 PTH-Menge in diesem Vergleich kann bestimmt werden unter Verwendung einer der hierin genannten Verfahren.
Wie weiter dargestellt in 10B-H, ist ein beispielhaftes Verfahren zur Bestimmung von ntPTH wie folgt: Als erstes wird eine Probe enthaltend oder vermutlich enthaltend sowohl 1-84 PTH als auch 7-84 PTH und ntPTH erhalten (10B). Die Probe wird dann in ein Röhrchen gegeben, dessen Wände beschichtet sind mit Ziegen-Anti 1-9 PTH. 1-84 PTH und nicht-typisches 1-84 PTH, wenn vorhanden, werden durch den 1-9 PTH-Antikörper an der Röhrchenwand gefangen/gebunden. 7-84 PTH, wenn vorhanden, wird nicht gefangen durch das Röhrchen, das beschichtet ist mit dem Anti-1-9-PTH-Antikörper (10C). Dieses Röhrchen mit der Probe wird bei Raumtemperatur unter Rotation für 18 bis 24 Stunden inkubiert. Ein Kügelchen beschichtet mit Anti-39-84 PTH-Antikörper, wird in das Röhrchen gegeben, wobei der Antikörper das in der Probe enthaltende 7-84 PTH bindet (10D). Es ist keine Inkubation nötig, bevor der nächste Schritt gemacht wird. Anti-7-34 PTH-Indikator (125-I)-Antikörper wird hinzugegeben, der beides bindet und markiert, das 1-84 PTH und nicht-typisches 1-84 PTH gebunden an die Röhrchenwand und das 7-84 PTH gebunden an das Kügelchen (10E). Das Kügelchen und der Indikator und das Röhrchen werden über Nacht mit der Probe in dem Röhrchen bei Raumtemperatur unter Rotation inkubiert. Das Kügelchen und das beschichtete Röhrchen werden zusammen gewaschen und dann getrennt. Das Kügelchen und das beschichtete Röhrchen werden einzeln beurteilt für die Markierung (CPM) und pgm/mL (10F). Die auf dem beschichteten Röhrchen nachgewiesene Markierung entspricht der Gesamt 1-84 PTH (umfassend 1-84 PTH und nicht-typisches 1-84 PTH)-Konzentration, und die nachgewiesene Markierung auf dem beschichteten Kügelchen entspricht der 7-84 PTH-Konzentration. Eine andere verwandte und/oder parallele Probe enthaltend beides, 1-84 PTH und 7-84 PTH, wird unter Verwendung eines Gesamt-PTH-Kits zur Messung von 1-84 PTH und 7-84 PTH (aber nicht von nicht-typischem 1-84 PTH) gemessen. Dieses Gesamt-PTH umfasst die Summe von 1-84 PTH plus 7-84 PTH (10G). Das nicht-typische 1-84 PTH wird dann berechnet durch Bestimmung des 1-84 PTH-Mengenwerts und Subtraktion des Wertes aus der Kombination des nicht-typischen PTH und 1-84 PTH-Mengenwertes (10H). Beispielhafte alternative Gleichungen (basierend auf den vorliegenden Verfahren) zur Berechnung von nicht-typischen PTH-Werten in einer Probe sind wie folgt:

a) nicht-typisches PTH = (nicht-typisches PTH + 1-84 PTH) – (1-84 PTH + 7-84 PTH) – 7-84 PTH
b) nicht-typisches PTH = (Gesamt 1-84 PTH-Wert gemäß Trio-Kit) – (Gesamt-PTH-Wert) – 7-84 PTH-Wert gemäß Trio-Kit

Die Menge von ntPTH kann genutzt werden zur Diagnose, Beobachtung und/oder Führung einer Behandlung einer Erkrankung oder eines Leidens. Häufig umfasst die Erkrankung oder das Leiden renale Knochenerkrankungen, einschließlich adynamischer Knochenerkrankungen, hoher Knochenumsatzerkrankungen und Osteoporose. Ebenso häufig wird die ntPTH-Menge verglichen mit der Menge der 1-84 PTH, 7-84 PTH und/oder Gesamt-PTH-Menge in einem Verhältnis zur Diagnose, Beobachtung und/oder Führung einer Behandlung einer Erkrankung oder eines Leidens. Die Schranke, Schwellenwert und/oder algorithmische Verfahren, die hierin beschrieben sind, können benutzt werden zur Diagnose, Beobachtung und/oder Führung einer Behandlung einer Erkrankung oder eines Leidens.
Ebenso häufig wird ein Verfahren bereit gestellt zur Beobachtung, Diagnose und/oder Führung einer Behandlung einer Erkrankung oder eines Leidens, umfassend die Beurteilung einer Menge eines spezifischen Analyten oder einer interferierenden Einheit in einer Probe, wobei, wenn die gemessene Menge des Analyten oder der interferierenden Einheit bei einer spezifischen, oft vorher bestimmten, Menge liegt, die Testperson gefährdet ist für eine spezifische Erkrankung oder ein spezifisches Leiden oder diese/dieses hat. Oft ist/sind der Analyt (und die Menge davon), die interferierende Einheit (und die Menge davon), und/oder die spezifische Erkrankung oder das Leiden vorbestimmt. Ferner, basierend auf der gemessenen Menge des Analyten oder der interferierenden Einheit, wird oft bestimmt, dass ein Verhältnis von einem oder mehreren Analyten und/oder interferierenden Einheiten benutzt werden soll zur Beobachtung, Diagnose und/oder Führung einer Behandlung einer Erkrankung oder eines Leidens. In dieser Ausführungsform wird die Menge des Analyten und/oder der interferierenden Einheit benutzt als Basis, die anzeigt, wenn die Verwendung einer Verhältnis-basierenden Beurteilung einer Probe geeignet wäre oder medizinisch indiziert. Zum Beispiel kann oft die Menge eines Analyten oder der interferierenden Einheit in einer spezifischen Menge (oft eine höhere oder niedrigere Menge) vorhanden sein, so dass diese eine spezifische Erkrankung oder Leiden anzeigt, ohne dass eine Verhältnisanalyse verwendet wird.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen hervor aus der folgenden Beschreibung.
Die vorliegende Erfindung wird weiter beschrieben durch die folgenden Beispiele. Die Beispiele sind lediglich bereitgestellt zur Illustration der Erfindung durch Verweis auf die spezifischen Ausführungsformen. Diese Beispiele, die einige spezifische Aspekte der Erfindung illustrieren, stellen keine Limitierung oder Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung dar.
Beispiele
Beispiel 1
Kontrollpräparationen werden wie folgt hergestellt:

1. 1000 gefrorene Kontrollröhrchen mit 500 pgm/ml von 1-84 PTH
2. 1000 gefrorene Kontrollröhrchen mit 500 pgm/ml mit 7-84 PTH
3. 1000 gefrorene Kontrollröhrchen mit 500 pgm/ml von 1-84 PTH und 500 pgm/ml von 7-84 PTH.

Affinitätsaufgereinigter Antikörperpräparationen werden wie folgt hergestellt:
Präparation von 2 mg der folgenden affinitätsaufgereinigten Ziege-Anti-PTH-Antikörper mit den folgenden Spezifitäten:

1. 1-9 PTH-Antikörper
2. 1-13 PTH-Antikörper
3. 1-15 PTH-Antikörper
4. 1-18 PTH-Antikörper
5. 1-20 PTH-Antikörper
6. 1-22 PTH-Antikörper
7. 1-25 PTH-Antikörper
8. 1-27 PTH-Antikörper
9. 1-30 PTH-Antikörper
10. 25-34 PTH-Antikörper

Indikator- und Einfang-Bindungskomponenten werden hergestellt wie folgt:
Herstellen von 10 Indikator- und Einfang-Antikörpern, jeder umfassend eine rohe Präparation, die einen Signalunterschied zeigt zwischen 100, 500, 1000 und 2000 pgm/ml, unter Verwendung einer bestehenden Standardkurve:

1. 1-9 Indikator-PTH-Antikörper mit 39-84 PTH-Einfang-Antikörper (erhalten von Scantibodies, Inc., Santee, CA)
2. 1-13 Indikator PTH-Antikörper mit 39-84 PTH-Fänger
3. 1-15 Indikator PTH-Antikörper mit 39-84 PTH-Fänger
4. 1-18 Indikator-PTH-Antikörper mit 39-84 PTH-Fänger
5. 1-20 Indikator PTH-Antikörper mit 39-84 PTH-Fänger
6. 1-22 Indikator PTH-Antikörper mit 39-84 PTH-Fänger
7. 1-25 Indikator PTH-Antikörper mit 39-84 PTH-Fänger
8. 1-27 Indikator PTH-Antikörper mit 39-84 PTH-Fänger
9. 1-30 Indikator PTH-Antikörper mit 39-84 PTH-Fänger
10. 1-34 Indikator PTH-Antikörper mit 39-84 PTH-Fänger (erhalten von Scantibodies, Inc., Santee, CA).

Kügelchen werden hergestellt wie folgt:
Herstellung von 200 Kügelchen mit den folgenden Antikörpern (die Kügelchen sind Avidin-beschichtet und haben daran angeheftet die folgenden biotinylierten Antikörper):

1. 1-9 PTH-Antikörper
2. 1-13 PTH-Antikörper
3. 1-15 PTH-Antikörper
4. 1-18 PTH-Antikörper
5. 1-20 PTH-Antikörper

Kontrollexemplare werden für den Test hergestellt:
Die Kontrollproben, mit der Ausnahme von Kügelchen-behandelten Kontrollproben, werden inkubiert bei Raumtemperatur für 18 bis 24 Stunden unter Rotation bei 10 Upm in der folgenden Weise (alle Hinzufügungen von Antikörpern verdünnen die Kontrollen nicht mehr als 10%):
Kontrolle
3 Kontrollen
Spezifisches Blocken

1. 3 Kontrollen plus 2 μgms von 1-9 PTH-Antikörper
2. 3 Kontrollen plus 2 μgms von 1-13 PTH-Antikörper
3. 3 Kontrollen plus 2 μgms von 1-15 PTH-Antikörper
4. 3 Kontrollen plus 2 μgms von 1-18 PTH-Antikörper
5. 3 Kontrollen plus 2 μgms von 1-20 PTH-Antikörper

Ausgewählte Epitop-Exposition

1. 3 Kontrollen plus 2 μgms von 1-9 PTH Antikörper & 2 μgms von 25-34 PTH Antikörper
2. 3 Kontrollen plus 2 μgms von 1-13 PTH Antikörper & 2 μgms von 25-34 PTH Antikörper
3. 3 Kontrollen plus 2 μgms von 1-15 PTH Antikörper & 2 μgms von 25-34 PTH Antikörper
4. 3 Kontrollen plus 2 μgms von 1-18 PTH Antikörper & 2 μgms von 25-34 PTH Antikörper
5. 3 Kontrollen plus 2 μgms von 1-20 PTH Antikörper & 2 μgms von 25-34 PTH Antikörper.

Kügelchentechnologie

1. 400 Mikroliter jeder der drei Kontrollen plus 1-9 PTH-Antikörper-Kügelchen, die entfernt werden nach 18 bis 24 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur mit 170 Upm-Rotation – Entfernung von 200 Mikrolitern der vorbehandelten Kontrolle und Testen im Gesamt-PTH-Test (erhalten von Scantibodies Laboratories, Inc.).
2. 400 Mikroliter von jeder der drei Kontrollen plus 1-13 PTH-Antikörper-Kügelchen, das entfernt wird nach 18 bis 24 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur mit 170 Upm-Rotation – Entfernung von 200 Mikrolitern der vorbehandelten Kontrolle und Testen in einem Gesamt-PTH-Test.
3. 400 Mikroliter von jeder der drei Kontrollen plus 1-15 PTH-Antikörper-Kügelchen, das entfernt wird nach 18 bis 24 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur mit 170 Upm-Rotation – Entfernung von 200 Mikrolitern der vorbehandelten Kontrolle und Testen in einem Gesamt-PTH-Test.
4. 400 Mikroliter von jeder der drei Kontrollen plus 1-18 PTH-Antikörper-Kügelchen, das entfernt wird nach 18 bis 24 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur mit 170 Upm-Rotation – Entfernung von 200 Mikrolitern der vorbehandelten Kontrolle und Testen in einem Gesamt-PTH-Test.
5. 400 Mikroliter von jeder der drei Kontrollen plus 1-20 PTH-Antikörper-Kügelchen, das entfernt wird 18 bis 24 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur mit 170 Upm-Rotation – Entfernung von 200 Mikrolitern der vorbehandelten Kontrolle und Testen in einem Gesamt-PTH-Test.

Testdaten werden ausgewertet wie folgt:
Die Testwerte für das Kontrollröhrchen mit dem 1-84 PTH plus dem 7-84 PTH werden verwendet zum Vergleich mit dem Testwert von den drei Kontrollröhrchen für einen bestimmten Test (alternativ kann man CPM verwenden):

1. (7-84 PTH-Kontrolltestwert ohne Vorbehandlung) – (1-84 PTH-Kontrolltestwert mit Vorbehandlung) × 100%/(7-84 PTH-Kontrolltestwert ohne Vorbehandlung).
2. (7-84 PTH-Kontrolltestwert ohne Vorbehandlung) – (7-84 PTH-Kontrolltestwert mit Vorbehandlung) × 100%/(7-84 PTH-Kontrolltestwert ohne Vorbehandlung).
3. (7-84 PTH-Kontrolltestwert ohne Vorbehandlung) – (1-84 PTH- und 7-84 PTH-Kontrolltestwert mit Vorbehandlung) × 100%/(7-84 PTH-Kontrolltestwert ohne Vorbehandlung).

Testpersonen werden beurteilt gemäß dem vorliegenden Verfahren, zum Beispiel wird jedes der oben beschriebenen Vorbehandlungsverfahren benutzt zur Behandlung der Proben, die gemessen werden unter Benutzung eines oder mehrerer PTH-Tests.
In einem weiteren Beispiel werden neue Tests für die spezifische Messung von 7-84 PTH (und/oder anderer PTH-Fragmente), gegebenenfalls zur Verwendung zusammen in einem 1-84 PTH/7-84 PTH-Verhältnis durch Knochenbiopsie-Studien validiert.
Beispiel 2
5 mg affinitätsaufgereinigten Ziege-anti-1-9 PTH wird gekoppelt an Kügelchen, erhalten von Pierce Biotechnology (Rockford, IL), Aminolink^® Kit. Die Kügelchen werden bereitgestellt in einem 4%-igem vernetzten Agarose-Kügelchen-Träger, der aktiviert wird zur Bildung funktionaler Aldehyd-Gruppen, die stabile Bindungen entwickeln. Die Kügelchen schwanken in ihrer Größe von 4-100 Mikrometern. Die gekoppelten Kügelchen werden verdünnt, so dass 2 Mikrogramm in 10 Mikrolitern enthalten sind und diese 10 Mikroliter werden hinzugefügt zu 200 Mikrolitern eines Patientenplasmas. Die Kügelchen und Patientenproben werden unter Rotation für 5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Als Ergebnis der Inkubation bindet 1-84 PTH, enthalten in der Probe, an das Ziegen-Anti-1-9 PTH gekoppelt an die Kügelchen. Agarosekügelchen wie SEPHAROSE^® 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, NJ)-Kügelchen, die mit Bromcyan aktiviert werden, können auch verwendet werden. Bromcyan-Aktivierung ist geeignet zum Koppeln, über kovalente Bindungen, von Proteinen, wie spezieller Bindungskomponenten an die Kügelchen.
Wenn die Kügelchen vor dem Test von der Probe entfernt werden, werden die 200 Mikroliter Patientenplasma und die 10 Mikroliter gekoppelter Kügelchen in eine Zentrifugensäule gegeben (erhalten von Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) und das Gemisch wird für 18 bis 24 Stunden bei 170 Upm bei Raumtemperatur in der Säule rotiert. Im Anschluss an die Inkubation wird der Boden der Säule aufgebrochen und sie wird in ein Mikrozentrifugen-Röhrchen platziert und zentrifugiert zur Entfernung des Patientenplasmas ohne 1-84 PTH. Die Patientenprobe wird abgesaugt/entfernt aus dem Mikrozentrifugen-Röhrchen, und wird dann auf die 7-84 PTH-Menge getestet.
In einer anderen Ausführungsform, wenn die Kügelchen in der Probe bleiben sollen, werden die 200 Mikroliter Patientenplasmas und die 10 Mikroliter gekoppelte Kügelchen in ein Teströhrchen gegeben und das Gemisch bei 170 Upm rotiert und für 18 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation werden ein markierter Indikator-Antikörper, der spezifisch das 7-84 PTH binden wird, und ein Testkügelchen, umfassend einen affinitätsaufgereinigten Antikörper gegen 39-84 PTH, hinzugefügt und der Gesamt-PTH-Test fortgesetzt ohne das Entfernen der gekoppelten Kügelchen. 1-84 PTH, gekoppelt an die 1-9 PTH-Antikörperkügelchen, wird nicht beteiligt an der Testreaktion (da es nicht in Lösung ist) und wird deshalb nicht nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wird 7-84 PTH, gebunden durch den nachweisbaren Indikator-Antikörper, in dem Test nachgewiesen.
Beispiel 3
Eine zu der in Beispiel 2 erhaltenen parallele Patientenprobe wird erhalten und getestet durch einen traditionellen Test, der die Menge des Gesamt-PTH misst. Die Gesamt-PTH-Testergebnisse für die Probe werden dann subtrahiert von den Ergebnissen der direkten 7-84 PTH-Testergebnisse aus Beispiel 2 zur Bestimmung der 1-84 PTH-Menge in der Probe.
Beispiel 4
1000 Polystyrol-12 × 75 mm-Röhrchen (Nunc, Dänemark) werden beschichtet durch ein konventionelles Röhrchenbeschichtungsverfahren, das dem Fachmann bekannt ist, so dass 2 Mikrogramm des affinitätsaufgereinigten Ziegen-anti 1-9 PTH-Antikörpers zur Beschichtung jedes Röhrchens verwendet werden.
200 Mikroliter einer Probe werden hinzugegeben zu einem 1-9 PTH-Antikörper beschichteten Röhrchen für jede Probe. Ein einzelnes Röhrchen wird für jede der folgenden 200 Mikrolite-Proben verwendet:

1. Die Kontrollen aufgelistet in Beispiel 1, oben;
2. Eine Reihe von Standardkalibrierungen enthaltend von 5 bis 2000 pgm/ml von 1-84 PTH;
3. Eine Reihe von Standardkalibrierungen enthaltend von 5 bis 2000 pgm/ml von 7-84 PTH;
4. eine Reihe von Standardkalibrierungen enthaltend von 2,5 bis 1000 pgm/ml von 1-84 PTH in Kombination mit 2,5 bis 1000 pgm/ml von 7-84 PTH (kombinierte 1-84 PTH plus 7-84 PTH-Kalibrierung);
5. 25 EDTA Plasmaproben von normalen Testpersonen; und
6. 25 EDTA Plasmaproben von ESRD-Patienten.

Die Röhrchen werden rotierend für 18 bis 24 Stunden bei Raumtemparatur mit 170 rpm Rotation inkubiert. Nach dieser Inkubation wird ein 3/16 Inch Polysterenkügelchen, welches vorher mit affinitätsaufgereinigten Ziegen-Anti 39-84 PTH-Antiköprern beschichtet wurde, in jedes Röhrchen gegeben. 100 Mikroliter von etwa 300000 cpm des 125-I markierten affinitätsaufgereinigten Ziege-Anti 1-34 PTH-Antikörpers wird ebenso in jedes Röhrchen gegeben. Die 39-84 PTH-Antikörper beschichteten Kügelchen werden weiter für 18 bis 24 Stunden bei Raumtemparatur mit 170 Upm Rotation inkubiert. Nach der Inkubation werden die 39-84 PTH-Antikörper beschichteten Kügelchen in den 1-9 PTH-Antikörper beschichteten Röhrchen gewaschen, so dass beide, die 39-84 PTH-Antikörper beschichteten Kügelchen und die 1-9 PTH-Antikörper beschichteten Röhrchen, gewaschen werden. Die Kombination von 1-9 PTH-Antikörper beschichteten Röhrchen und die 39-84 PTH-Antikörper beschichteten Kügelchen werden quantitativ, in Bezug auf 125-I, in einem Gammazähler bewertet. Durch die Verwendung des kombinierten Ansatzes von Kalibratoren/Standard, zusammengesetzt aus 1-84 PTH und 7-84 PTH, wird eine Standardkurve gebildet. Die Einzelproben von normalen Testpersonen und ESRD Einzelproben werden im Gammazähler gezählt und, basierend auf der Kombination der 1-84 PTH und 7-84 PTH-Standards, die Menge des Gesamt-PTH berechnet.
Die 39-84 PTH-Antikörper beschichteten Kügelchen werden anschließend zu Testzwecken von jedem der 1-9 PTH-Antikörper beschichteten Röhrchen zu einem 12 × 75 mm Polysterolröhrchen überführt, welches unbeschichtet und unbenutzt ist. Durch Verwendung von 7-84 PTH-Standard/Kalibrator wird eine Standardkurve gebildet. Die Einzelproben von normalen Testpersonen und ESRD-Einzelproben werden in einem Gammazähler gezählt und, basierend auf den 7-84 PTH-Standards, die Menge/Konzentration von 7-84 PTH in den Patientenproben und Normalproben berechnet.
Die 1-9 PTH-Antikörper beschichteten Röhrchen, die von den Kügelchen getrennt wurden, werden dann selbst ohne die Kügelchen gezählt. Die getrennten 1-9 PTH-Antikörper beschichteten Röhrchen von den 1-84 PTH-Standards/Kalibratoren werden zur Berechnung der 1-84 PTH-Konzentration verwendet. Zur Bestimmung der Genauigkeit der Gesamt-PTH-Konzentration werden die individuell bewerteten 1-84 PTH und 7-84-Konzentrationen der aufgetrennten 1-9 PTH-Antikörper beschichteten Röhrchen und der 39-84 PTH-Antikörper beschichteten Kügelchen mit den kombinierten 1-9 PTH-Antikörper beschichteten Röhrchen und den 39-84 PTH-Antikörper beschichteten Kügelchen verglichen. In diesem Schritt wird die Gesamtheit, die sich aus der Gamma-gezählten Kombination von 1-9 PTH-Antikörper beschichteten Röhrchen und 39-84 PTH-Antikörper beschichteten Kügelchen ergibt, mit der Gesamtsumme der 1-84 PTH-Konzentration verglichen, die aus der Bewertung der getrennten 1-9 PTH-Antikörper beschichteten Röhrchen plus der bewerteten getrennten 39-84 PTH-Antikörper beschichteten Kügelchen erhalten wurde.
Die Standards/Kalibratoren sind ferner hilfreich zur Identifikation von Überkreuznachweisen von Analyten in Röhrchen, so dass, zum Beispiel, 1-84 PTH irrtümlich nachgewiesen wird in Röhrchen, enthaltend die Kügelchen und/oder 7-84 PTH, irrtümlich nachgewiesen in Röhrchen mit den beschichteten Wänden nach Trennung von diesen Analyten. Überkreuz-Analytennachweis kann sich ergeben, wenn, zum Beispiel, 1-84 PTH irrtümlich an die 39-84 PTH beschichteten Kügelchen bindet und dann in die unbeschichteten Röhrchen zum Nachweis überführt wird. Überkreuz-Analytennachweis kann sich auch ergeben, wenn, zum Beispiel, 7-84 PTH irrrtümlich an die beschichteten Röhrchen bindet und nach dem Überführen der beschichteten Kügelchen gezählt wird.
In einer häufigen Ausführungsform werden die Mengen von 1-84 PTH und 7-84 PTH in den Proben direkt in getrennten Röhrchen bestimmt und das Gesamt-PTH wird durch Addieren der Werte/Mengen für 1-84 PTH und 7-84 PTH berechnet, gemäß der oben beschriebenen Methode.
Beispiel 5
Diese Studie wurde ebenso in D'Amour et al., Clin. Chem., 49(12): 2037-2044 (2003) beschrieben, dessen Inhalt in seiner Gesamtheit durch den Literaturverweis eingeschlossen wird.
1. MATERIALE UND METHODEN
A. Testpersonen
Sieben normale und fünf Patienten mit primärer Hyperparathyreoidismus (PHP) nahmen an dieser Studie teil.
B. Verfahren
Blut wurde von jedem der fünf Patienten mit primärem Hyperparathyreoidismus (PHP) erhalten. Für RF wurden acht Pools mit verschiedenen PTH-Konzentrationen (5,8 bis 86,8 pmol/L) gebildet, diese Pools wurden aus Serum gebildet, das bei Routine Nierenversagen Patienten-PTH-Bestimmungen übrig geblieben war. Obwohl es möglich ist, dass das Vereinigen von Proben zur Bildung von PTH-Formen führte, die nicht charakteristisch für Einzelproben der individuellen Testpersonen sind, haben wir heraus gefunden, dass dieser Ansatz zu ähnlichen Ergebnissen führte, wie jene, die in der Vergangenheit von einzelnen Personen erhalten wurden. Siehe Brossard JH, et al., J Clin Endocrinol Metab 1996; 81:3923-3929. Parameter des Phosphocalcin-Stoffwechsels und basaler PTH-Mengen werden bestimmt im Serum oder in Pools von Serum, entweder frisch oder gelagert bei –90°C. Dieselben Sera werden auch zur HPLC-Analyse verwendet.
Synthetische PTH-Peptide, hPTH(1-84), hPTH(7-84), hPTH(39-84), hPTH(53-84), hPTH(39-68) und hPTH(64-84) wurden von BACHEM (Torrance, CA, USA) erworben. Mutiertes [Tyr³⁴]hPTH(19-84) wurde freundlicherweise bereitgestellt von H. Juppner vom Massachusetts General Hospital in Boston, USA. Gesamt-Calcium, Phosphat, alkalisches Phosphat und Kreatinin wurden gemessen durch automatisierte, kolorimetrische Methoden.
Gesamt(T)-PTH und CA-PTH wurden mit kommerziellen Kits quantifiziert, die von Scantibodies Laboratories, Inc. (Santee, CA, USA) bereitgestellt wurden. C-PTH wurde in einem Radio-Immuno-Test bestimmt, vorwiegend mit C-PTH-Fragmenten (Siehe D'Amour P, et al., Am. J. Physiol. 1986;251 (Endo Metab):E680-E687; D'Amour P, et al., J Clin Endocrinol Metab 1992;75:525-532; Brossard JH, et al., J Clin Endocrinol Metab 1996;81:3923-3929). Die Testspezifität wurde durch Verwendung verschiedener PTH-Standads und auch durch die Bestimmung durch die Testeigenschaft zum Nachweis zirkulierender PTH-Molekülformen nach der Elution von HPLC-Profilen studiert. PTH-Formen aller Sera wurden auf Sep-Pak plus C-18-Patronen (Waters Chromatography Division, Milford, MA) (Bennett HP, et al., J Biol Chem 1984;259:2949-2955) extrahiert. Die PTH-Molekülformen wurden weiter auf C18μBondapak analytischen Säulen, 3,9 × 300 mm (Waters) aufgetrennt, unter Verwendung verschiedener Acetonitrilgradienten (15-50%) in 0,1 % Trifluoressigsäure, zugeführt bei 1,5 ml/min über verschiedene Zeiträume mit einem Model 2700 Solvent Delivery System (Bio-Rad, Mississauga, Ontario, Canada) (Brossard JH, et al., J Clin Endocrinol Metab 1996;81:3923-3929; Brossard JH, et al., J Clin Endocrinol Metab 1993;77:413-419; Lepage R, et al., Clin Chem 1998;44:805-809; Brossard JH, et al., Clin Chem 2000;46:697-703). Die 1,5-ml Fraktionen wurden verdampft, gefriertrocknet, mit 0,7% BSA in Wasser zu 1 ml rekonstruiert und ausreichende Volumina wurden in verschiedenen PTH-Tests gemessen. Kontrollexperimente wurden mit zusätzlichem hPTH(1-84) Standard zu Hyperparathyreoidismus-Serum ausgeführt, um sicherzustellen, dass PTH-Degradation nicht während der verschiedenen Behandlungen stattgefunden hat. Eine einzige Spitze von Immunreaktivität, korreliert mit hPTH(1-84), wurde in T-PTH und CA-PTH und C-PTH-Tests immer identifiziert. Das Wiederfinden von immunreaktivem PTH, im Anschluss an die verschiedenen Behandlungen, war besser als 75%.
C. Datenanalyse
Die Ergebnisse der folgenden Tabellen sind als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch Anova bestimmt, gefolgt durch den Studenten-Newman-Keuls Mehrfach-Vergleichstest. HPLC-Profile wurden planimetrisch mit Origin 4.1 Software (Microcal Software, Northbramton, MA, USA) ausgewertet.
2 stellt die Immunreaktivität der drei PTH-Tests unter Verwendung von PTH-Standards oder zirkulierenden PTH-Molekülformen dar, aufgetrennt durch HPLC in einem PHP Patienten. Der CA-PTH-Test reagiert mit dem hPTH(1-84) Standard und nicht mit dem synthetischen PTH-Fragment, einschließlich hPTH(7-84). Mit einem wirksameren Acetonitrilgradienten identifizierte dieser Test zwei HPLC-Spitzen. Die Erste, in der Position 42 bis 43, wanderte vor der hPTH(1-84) Spitze in Position 45. Der T-PTH-Test verhielt sich wie der vorher beschriebene typische I-PTH-Test (siehe Lepage R, et al., Clin. Chem. 44(4):805-9 (1998)) und es wurde gezeigt, dass dieser mit equimolarem hPTH(1-84) und hPTH(7-84) reagiert und nicht mit einem der kleineren C-PTH-Fragmente. Dieser Test identifizierte hPTH(1-84) in Position 45 wie auch in einem breiteren Bereich in den Positionen 36 bis 41, entsprechend dem nicht-(1-84)PTH. Der C-PTH-Test reagierte nur mit PTH-Fragmenten, die eine unversehrte (65-84)-Struktur besitzen. Er reagierte nicht mit einem mittleren Carboxy-Terminalen hPTH(39-68)-Fragment. Seine Affinität für verschiedene PTH-Moleküle variierte, sie war am höchsten für hPTH(39-84), intermediär für hPTH(1-84) und am geringsten für hPTH(7-84). Er reagierte mit Molekülformen, die durch die CA-PTH und T-PTH-Tests nachgewiesen wurden und auch mit verschiedenen weniger hydrophoben C-PTH-Fragmentspitzen, die an den Positionen 15, 16, 19, 23 und 29 wanderten.
Tabelle 1 (unten) fasst die biochemischen Eigenschaften der drei untersuchten Gruppen zusammen. Patienten mit PHP wurden hypercalcemisch mit erhöhten Normalwerten für Alkalynephosphatase, CA-PTH, T-PTH und C-PTH als NI. Pools von Seren von PHP-Patienten hatten ebenfalls erhöhte Normalwerte für Creatinin, Phosphat, Alkalynephosphatase, CA-PTH, T-PTH und C-PTH als NI. Die Ergebnisse sind in Form von Mittelwerten ± SD dargestellt. Statistische Analysen durch ANOVA und den Stundent-Newman-Keuls-Test folgten. NI gegen PHP oder RF: a, p<0,001; b, p<0,01; c, p<0,05. PHP gegen RF: d, p<0,001; e, p<01; f, p<0,05.
Tabelle 1: Biochemisch Eigenschaften der verschiedenen Gruppen
3 stellt die Serum-HPLC-Profile wie durch CA-PTH und T-PTH-Tests analysiert dar. Einzelne HPLC-Profile sind durch helle Linien dargestellt, während die durchschnittlichen HPLC-Profile als dunklere, kräftigere Linien gezeigt sind. Die Ergebnisse sind qualitativ in allen Gruppen ähnlich. Dennoch unterscheiden sich die Ergebnisse quantitativ von einer Gruppe zur nächsten. Die quantitative planimetrische Auswertung der HPLC-Profile ist in Tabelle 2 (unten) gezeigt. Der T-PTH-Test wies eine Spitze von Immunreaktivität nach, die mit dem hPTH-Standard in Position 45 koeluiert und mindestens zwei Spitzen von nicht-(1-84)PTH in den Positionen 36 bis 41. Nicht-(1-84)PTH stellte 17,3 ± 6,6% der Immunreaktivität in NI dar, 23,8±14,4% in PHP und 39,4±7,0% in RF. Der Anteil von nicht-(1-84)PTH war 2,3-mal höher in RF-Patienten als in NI. Der CA-PTH-Test zeigte eine Spitze von Immunreaktivität, die mit hPTH(1-84) koeluiert und vor hPTH(1-84) an den Positionen 42 und 43 wanderte, etwas hydrophober als nicht-(1-84)PTH in den Positionen 36 bis 41. Durch die Bindungsspezifität des CA-PTH-Tests, der zur Messung die Anwesenheit der ersten Aminosäure (Ser) von PTH erfordert, ist diese neue PTH-Form N-Terminal intakt. Die „neue" PTH-Spitze entspricht der 8,1±2,4% der CA-PTH-Immunreaktivität in NI, 24,7±23,3% in PHP und 22,2±7,3% in RF. Wiederum zeigten die Serumpools von RF-Patienten 2,7-mal mehr dieser neuen PTH molekularen Form als NI.
4 zeigt eine genaue immunologische Auflösungsanalyse, die mit dieser neuen molekularen Form von PTH mit den drei PTH-Tests unter Verwendung verschiedener Acetonitril HPLC-Gradienten in den PHP-Patienten mit den höchsten PTH-Konzentrationen durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in absoluten Werten dargestellt, um einen direkten Vergleich zwischen den Tests zu erlauben. Die neue PTH-Molekülform konnte nicht von hPTH(1-84) unter Verwendung des ursprünglichen HPLC-Gradienten getrennt werden, konnte aber in zwei neue Gradienten aufgelöst werden. Diese neue Form von PTH wanderte anders als nicht-(1-84)PTH in den Gradienten 2 und 3 und zeigte Reaktivität in den CA-PTH- und C-PTH-Tests, aber nur schwach, wenn überhaupt, in dem T-PTH-Test (Gradient 3).
Tabelle 2 (unten) fasst ferner die Anwendung der HPLC planimetrischen Ergebnisse auf die ursprünglichen C-PTH und CA-PTH-Werte zusammen, wobei diese in ihre Bestandteile zerlegt wurden. hPTH(1-84)-Wert des T-PTH- und CA-PTH-Tests waren ähnlich außer in NI, wobei der durchschnittliche CA-PTH hPTH(1-84) etwas niedriger lag. Wenn nicht-(1-84)PTH zusammen mit der neuen Aminoterminalen PTH-Molekularform eingeschlossen wurde, zeigten die kombinieten Werte 25% des gemessenen PTHs durch die zwei Tests in NI und 50% in PHP- oder RF-Patienten. In der letzten Gruppe verhielt sich die neue Molekularform von PTH in ihrer Wanderung ähnlich zu dem nicht-(1-84)PTH und zeigte Anzeichen von Anreicherung bei Nierenversagen. NI = normale Testperson, PHP = primärer Hyperparathyreoidismus, RF = Nierenversagen. Ergebnisse sind in Form von Mittelwerten ± SD dargestellt. Es folgte eine statistische Analyse sowohl durch ANOVA wie auch dem anschließenden Studenten-Newman-Keuls-Test. NI gegen PHP oder RF: a, p<0,001; b, p<0,01; c, p<0,05. Statistische Analyse durch den paarweisen Student's „t"-Test. T-PTH gegen CA-PTH: d, p<01.
II. DISKUSSION
Die vorliegende Studie wurde initiiert, um mehr Information über eine neue molekulare Form von zirkulierendem PTH (nfPTH) zu erhalten, das ausschließlich durch den CA-PTH-Test (wie oben beschrieben) nachgewiesen wurde, wenn wirksamere HPLC-Gradienten zur Auftrennung des vorher beschriebenen Nicht-(1-84)PTH vom PTH(1-84) verwendet wurden.
Die einzigartigen Spezifitäten der drei PTH-Tests und speziell des CA-PTH-Tests sind wichtig, da diese die Ableitung der Struktur für nfPTH ermöglichen. Der CA-PTH-Test verwendet einen Festphasen(39-84)Antikörper zum Einfangen von PTH und einen spezifischen [1-4]-gerichteten Antikörper zum Aufdecken von hPTH(1-84) mit einer Bindung abhängig von der Anwesenheit der ersten Aminosäure, John M.R., et al., Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism (1999) 84(11):4287-4290. Der CA-PTH-Test erkennt nur hPTH(1-84) und einen einzelnen Peak von Immunreaktivität, der koeluiert mit hPTH(1-84), wenn zirkulierendes PTH aufgetrennt wird unter Verwendung unseres alten HPLC-Gradienten. Siehe Gao P., et al., J Bone Min Res 2001; 16:605-614. Mit wirksameren Gradienten kann der einzige hPTH(1-84)-Peak aufgetrennt werden in zwei unterschiedliche Entitäten, die beide eine intakte aminoterminale Struktur besitzen, welche die erste Aminosäure umfasst. Der T-PTH-Test verwendet den gleichen Einfang-Antikörper und einen Nachweis-Antikörper gerichtet gegen den 15-34-Bereich der PTH-Struktur. Dieser Test erkennt hPTH(1-84) und hPTH(7-84) gleichermaßen und wird das hPTH(1-84) und das Nicht-(1-84)PTH erkennen, eluiert von HPLC-Profilen von Serum, gewonnen aus Patienten mit verschiedenen klinischen Zuständen. Siehe id. Dieser T-PTH-Test erkennt nicht (oder erkennt schwach) die neue molekulare Form von PTH, die erkannt wird durch den CA-PTH-Test, was eine Veränderung in dem (15-34)-Bereich vermuten lässt, die mit dem Nachweis dieser über den C-PTH-Test interferiert. Schließlich reagiert der C-PTH-Test, der seine Spezifität in dem (65-84)-Bereich besitzt und einen intakten (65-84 PTH)-Bereich für den Nachweis erfordert (Brossard JH, et al., J Clin Endocrinol Metab 1996;81:3923-3929; Brossard JH, et al., J Clin Endocrinol Metab 1993;77:413-419; Lepage R, et al., Clin Chem 1998;44:805-809; Brossard JH, et al., Clin Chem 2000;46:697-703), nicht mit den mittleren Carboxy-terminalen Fragmenten. Der C-PTH erkennt auch nfPTH, nachgewiesen durch den CA-PTH-Test, was nahe legt, dass nfPTH ein intaktes C-Terminales Ende besitzt. Diese Ergebnisse deuten die Entdeckung einer neuen Form von hPTH(1-84) an, die nicht verkürzt ist. Die Analysen zeigen, dass nfPTH eine Modifikation in dem (15-34 PTH)-Bereich enthält, verglichen mit dem normalen menschlichen vollständigen PTH. Eine post-translationale Modifikation des PTH-Moleküls wurde 1984 von Rabbani et al. beschrieben. Siehe Nguyen-Yamamoto L, et al., Eur J Endocrinol 2002;147:123-131. Wie von Nguyen-Yamamoto beschrieben, wurde eine Phosphorylierung im aminoterminalen Bereich durch die Verwendung boviner und menschlicher Nebennierendrüsen gezeigt. Siehe id. Eine Phosphorylierung von Serin-Resten in den Positionen 1 und 3 würde eine Immunreaktivität mit dem CA-PTH-Test unwahrscheinlich machen. Obwohl nicht beabsichtigt ist, durch eine Theorie gebunden zu sein, liefert die Phosphorylierung des Serin-Restes in Position 17 eine Erklärung für das Unvermögen von nfPTH, eine Immunreaktivität in dem T-PTH-Test zu zeigen. Die Analysen zeigen, dass die Struktur des nfPTH sich von der des vollständigen PTHs im mittleren terminalen Bereich unterscheidet, wobei dieser Bereich die Aminosäure-Positionen 15 bis 34 der hPTH-Sequenz umfassen kann.
Das Verhalten dieser neuen molekularen Form von hPTH in den drei untersuchten Gruppen ist ebenso von Interesse. Die Patienten mit Nierenversagen scheinen eine höhere relative Menge dieser neuen molekularen Form von PTH zu haben verglichen mit den Beobachtungen in NI und in Patienten mit PHP. Zwei PHP-Patienten hatten einen Anteil dieser neuen molekularen Form von PTH ähnlich des in NI, und drei andere hatten eine deutlich größere Menge (17,8 bis 63,3%). In RF-Patienten war diese neue molekulare PTH-Form erhöht im gleichen Anteil wie vorher für Nicht-(1-84)PTH beschrieben (siehe Gao P, et al., J Bone Mine Res 2001; 16:605-614), was eine erhöhte Produktion und Sekretion durch die hyperfunktionalen Nebenschilddrüsen mit anschließender Anreicherung in RF-Patienten nahelegt. Siehe Monier-Fougère MC, et al., Kindney Int 2001; 60:1460-1468.
Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass das Verhältnis von (1-84)/Nicht-(1-84)-PTH ein sehr hilfreicher Index ist zur Unterscheidung von RF-Patienten mit adynamischen Knochenumsatz von RF-Patienten mit hohen/normalen Knochenumsatzbedingungen. Eine solche Unterscheidung ist sehr wichtig in der Behandlung von sekundärem Hyperparathyreoidismus von RF mit Vitamin D-Analoga oder mit Nebenschilddrüsenektomie. Dennoch sollte die Aufdeckung dieses neuen hPTH(1-84) mit intakter sekundärem Aminosäurezusammensetzung in Testpersonen, die nfPTH besitzen berücksichtigt werden, wenn die Menge von Nicht-(1-84)PTH durch die Subtraktion des CA-PTH-Werts vom T-PTH-Wert bestimmt wird. Eine direkte Bestimmung von Nicht-(1-84)PTH durch Subtraktion des CA-PTH-Wertes von dem T-PTH-Wert könnte für einige Patienten zu einer Unterschätzung der Gesamtmenge von Nicht-(1-84)PTH führen, da die CA-PTH-Werte die neue PTH molekulare Form einschließen, welche durch den T-PTH-Test nicht erkannt wird. Ferner stellt der gleichbleibende Anteil der neuen molekularen Form von PTH in RF-Patienten eine Erklärung dar, warum Faugere et al. (siehe oben) in der Lage waren, mit dem Subtraktionsverfahren zu zeigen, dass das Verhältnis von (1-84)/Nicht-(1-84)PTH Nierenpatienten mit Nierenversagen mit adynamisch niedrigem Knochenumsatz von Patienten mit Nierenversagen mit normalen/hohen Knochenumsatzerkrankungen zu unterscheiden vermag.
Wie hierin beschrieben, wurde eine neue Art von PTH-Molekül mit einer erhaltenen intakten Aminosäuresequenz an beiden, dem N-Terminus und dem C-Terminus, identifiziert. Diese neue Form von PTH ist immunreaktiv und mit dem CA-PTH-Test nachweisbar, aber nicht mit dem T-PTH-Test.
Der Fachmann würde verstehen, dass, obwohl spezifische eigene PTH-Teste hierin benutzt wurden, der Schlüsselfaktor der vorliegenden Analyse auf die einzelnen Spezifitäten für jeden Test innerhalb des PTH-Moleküls abzielt. Entsprechend der hierin gegebenen Lehre können Tests benutzt werden, die sich von den hierin bereitgestellten und verwendeten unterscheiden, jedoch ähnliche oder identische molekulare PTH-Spezifitäten besitzen.
Ein beispielhafter PTH-Test für eine Aminoterminale Form von PTH
Die vorliegenden Verfahren stellen einen neuen 1-84 PTH (CAP)-Test bereit, mit der spezifischen Eigenschaft, dass dieser lediglich PTH messen wird, wenn die erste Aminosäure vorhanden ist (einschließlich zum Beispiel Serin in hPTH). Zusätzlich wird ein weiterer Gesamt-PTH (tTH)-Test hierin bereitgestellt, der nicht von der Anwesenheit von Serin abhängt. Für normale Testpersonen und für Patienten mit beidem, primärem und sekundärem Hyperparathyreoidismus, wurde gezeigt, dass die Menge von T-PTH höher ist als die von CAP. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass primäre Hyperparathyreoidismus-Patienten tPTH-Mengen besitzen, die 1,3mal höher sind als CAP-Mengen (132 14 pg/ml gegen 96 10 pg/ml). Deshalb liegt ein beträchtlicher Anteil an zirkulierendem PTH in der Form der großen N-verkürzten Fragmente (wie 7-84 PTH) vor. Da Nebenschilddrüsenkrebs die schwerwiegenste Form von primärem Hyperparatheoridismus ist, wurde die Beziehung zwischen tPTH und CAP untersucht.
Testpersonen mit metastatischem Nebenschilddrüsenkrebs wurden ausgewählt, zum Beispiel ein Mann von 60 Jahren mit einer Diagnose von PT-Krebs für 26 Jahre (CA 13,4 mg/dl), und eine Frau von 42 Jahren mit einer Diagnose von PT-Krebs für 9 Jahre (CA 19,6 mg/dl, nl: 8,4-10,3). CAP- und tPTH-Mengen von 964 pgm/ml bzw. 797 pgm/ml wurden in der männlichen Testperson gemessen. CAP und tPTH-Mengen wurden in der weiblichen Testperson als 1619 pgm/ml bzw. 1020 pgm/ml bestimmt. Die Tatsache, dass beide Patienten eine erhöhte Menge von CAP gegenüber tPTH hatten zeigt, dass diese Patienten die gerade beschriebene neue Form von PTH (nfPTH) besitzen, die die erste Aminosäure Serin besitzt. Da beide Tests den gleichen Einfang-Antikörper benutzen, ist das nfPTH kein aminoterminales Fragment von PTH mit einer Länge von mindestens weniger als 1 bis 44 PTH. Wie vorstehend dargestellt, ist nfPTH ein Gesamtlängen-PTH oder ein großes N-terminales PTH-Fragment. In beiden Fällen könnte eine post-trasnlationale Phosphorylierung/Glycosylierung oder Verkürzung zu einer einzigartigen dreidimensionalen Faltung führen, so dass das Markierungsantikörperepitop für den hierin beschriebenen tPTH-Test verborgen ist. Weitere Entwicklungen von zusätzlichen PTH-Tests führten zur Identifikation von nfPTH und werden weitere Informationen über nfPTH bringen. Die Aufklärung von nfPTH ist erstrebenswert, da dies zu einem weiteren Verstehen von beidem, Nebenschilddrüsenkrebs und der Gesamtbiologie der Nebenschilddrüse, führt.
Rolle der neuen molekularen Form von PTH
Weitere Charakterisierung und Analyse von nfPTH wird dessen Rolle in der PTH-übertragenen biologischen Aktivität aufdecken. Zum Beispiel werden weitere Untersuchungen eine PTH-Antagonisten- oder Agonisten-bezogene Aktivität von nfPTH zeigen. Ferner kann eine weitere Charakterisierung und Analyse von nfPTH eine neue Aktivität von nfPTH sowohl als PTH-Agonist als auch als PTH-Antagonist aufzeigen, oder dessen Rolle in einem anderen unabhängigen biologischen Signalweg. Basierend auf diesen Untersuchungen werden Therapeutika, Diagnostika, therapeutische Verfahren, diagnostische Verfahren und Kits entwickelt werden zur Benutzung von nfPTH- basierenden Zusammensetzungen und Antikörpern dagegen. Ferner wird eine weitere Charakterisierung und Analyse Informationen liefern, ob nfPTH eine aktive Rolle in der PTH-vermittelten biologischen Aktivität spielt. Das Design von PTH-Tests, entweder zur Vermeidung oder zur Sicherstellung des Nachweises von nfPTH werden erwogen. PTH-Komponentenverhältnisse werden entwickelt werden, basierend auf weiteren Studien mit diagnostischem und therapeutischem Zweck.
Ein beispielhafter PTH-Test, der eine Interferenz von Aminobereichen von PTH-Fragmenten vermeidet
Die vorliegende Beschreibung betrachtet zusätzlich einen neuen Parathyroidhormon-Test, der eine Interferenz von Aminobereichen von PTH-Fragmenten vermeidet. Für lange Zeit waren Schwierigkeiten mit Tests von intakten Gesamt-PTHs verbunden, wobei die Kreuzreaktivität von zirkulierenden PTH-Fragmenten unterschiedlich war. Diese Beobachtung wird dargestellt in Tabelle 3.
Tabelle 3: Nichols Intact (IRMA) (NID) gegen Scantibodies (SLI) Total Intact PTH IRMA (SLI) in Kontrollproben
In Patientenproben ist allerdings der NID-Wert der gleiche wie der SLI-Wert, was daraus folgt, dass der SLI-Test zu geringe Mengen 1-84 PTH und zu große Mengen 7-84 PTH misst, und, generell, Patientenproben eine Mischung aus 1-84 PTH und 7-84 PTH besitzen.
Es erscheint, dass es einige Proben gibt, umfassend etwa 2% der Patientenpopulation, in denen das intakte Gesamt-PTH (SLI) niedrigere Mengen zeigt als der CAP-Test (das heißt der „Teil" ergibt höhere Messwerte als die „Gesamtheit"). Beispielhafte PTH-Werte von einer Vielzahl dieser Typen von Patienten sind in Tabelle 4 dargestellt. In Tabelle 4 verweist „CAP" auf Zyklase-aktivierende PTH-Werte und „CIP" verweist auf Zyklase-inaktive PTH-Werte (zum Beispiel für den Zweck dieses Beispiels berechnet durch Subtraktion des Zyklase-aktivierenden PTH-Werts vom Gesamt-PTH-Wert).
Es wurde vorher festgestellt, dass PTH-Fragmente 2-34, 3-34, 4-34 und 5-34, jeweils interferieren und zu einer geringen Messung im SLI-Wert des intakten Gesamt-PTH-Test führen (ähnlich dem NID Intakten PTH-Test). Diese Beobachtungen zeigen somit, dass ein Aminobereichsfragment (ARF) in Proben vorhanden ist, der einen niedrigeren Gesamt-PTH-Wert zeigt als die CAP-Werte. Ein Aminobereichsfragment, wie hierin verwendet, schließt nicht aminoterminale(s) Fragment(e) ein (welches die erste Aminosäure enthält). Einem Aminobereichsfragment fehlt die erste Aminosäure, und es interferiert mit den Gesamt-PTH-Tests, die gereinigt werden mit 1-34 PTH-Antikörper, der nicht von der Anwesenheit der ersten Aminosäure abhängt. Die ARF hat mindestens zwei Verwendungen – Erstens, für einen Gesamt-PTH-Test ist es wichtig, ein PTH_2-34 bis zu PTH_28-34 zu verwenden (oder eine beliebige Anzahl dieser, zum Beispiel PTH_12-34 und PTH_13-34) um zu zeigen, dass es keine Kreuzreaktivität gibt, dass jedoch eine Kreuzreaktivität mit 7-84 PTH notwendig ist. Zum Beispiel wurde ein Antikörper gegen PTH_20-32 gemacht, der als Markierungsantikörper in einem Sandwich-Test dient. Ein solcher Antikörper bindet vorzugsweise PTH(7-84), so dass in der Abwesenheit der Aminosäure in Position 7 von PTH(7-84) der Antikörper nicht bindet. Obwohl nicht beabsichtigt ist, durch eine Theorie gebunden zu sein, kann ein solcher Antikörper oft eine Bindungsspezifität besitzen, die zumindest zum Teil abhängig ist von der dreidimensionalen Form der PTH(7-84), wobei in Abwesenheit oder bei einer Änderung der Aminosäure in der siebten Position der Antikörper nicht spezifisch an das PTH-Molekül binden wird. Unter solchen Bedingungen wird der Antikörper oft das PTH, dem die siebte Aminosäure fehlt, oder das Veränderungen an der siebten Aminosäure besitzt, nicht erkennen.
Die andere Verwendung dieses ARF ist, dass dieses ein nützliches Fragment zur Messung ist, wie alle anderen PTH-Fragmente, um die antagonistische biologische Aktivität von 7-84 PTH zu vergrößern. Mit anderen Worten, wenn 7-84 PTH gebildet wird – werden andere PTH-Fragmente gebildet, die eine wirksame antagonistische biologische Aktivität haben können oder nicht, aber als Verstärker dienen können, um ein Verhältnis deutlicher zu machen.
Der Fachmann kann einschätzen, dass die vorliegende Erfindung jede beliebige Anzahl von oben beschriebenen bevorzugten Merkmalen umfassen kann.
Tabelle 4
Beispiel 6 Entfernung von PTH-Fragmenten aus ESRD-Patientenproben
1-84 PTH von verschiedenen ESRD-Patientenproben wurde gemessen. 1-84 PTH wurde dann entfernt durch Inkubation der Proben für fünf Stunden bei Raumtemperatur unter Rotation mit einem Kügelchen, das beschichtet war mit 1-9 PTH-Antikörpern (1 Kügelchen mit 0,55 μg Ak beschichtet zur Behandlung von 280 μl Plasma). Das 1-84 PTH, das in der Probe zurück blieb, wurde wieder gemessen. Wie in der folgenden Tabelle 5 gezeigt, wurden etwa 94% des 1-84 PTH durch diese Behandlung entfernt.
Tabelle 5: Entfernung von 1-84 PTH durch Antikörper-Absorption
Die oben gezeigten Beispiele wurden lediglich zu einem erläuternden Zweck eingefügt und sollen nicht den Umfang der Erfindung einschränken. Viele Veränderungen zu den oben beschriebenen sind möglich. Da Modifikationen und Variationen zu den oben beschriebenen Beispielen für den Fachmann ersichtlich sind, ist beabsichtigt, dass die Erfindung lediglich begrenzt wird durch den Umfang der angehängten Ansprüche.
Das Zitieren der obigen Publikationen und Dokumente wird nicht angesehen als Eingeständnis, dass irgendetwas des Vorangehenden relevanter Stand der Technik ist, noch ergibt sich daraus irgendein Zugeständnis für den Inhalt oder den Daten dieser Publikationen oder Dokumente.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis eines Analyten von Interesse in Gegenwart von anderen Analyten, die von Interesse sein können oder von Einheiten, die mit üblichen Testprotokollen interferieren.

Claims

Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit, umfassend (a) Inkontaktbringen einer Probe, die einen Analyten und/oder eine interferierende Einheit enthält oder vermeintlich enthält, mit einer blockierenden Bindungskomponente, wobei man die blockierende Bindungskomponente an die interferierende Einheit, nicht jedoch an den Analyten binden lässt, falls der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorhanden ist/sind; (b) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wobei man die Indikator-Bindungskomponente an den Analyten, nicht aber an die interferierende Einheit spezifisch binden lässt, was darauf zurückzuführen ist, dass die blockierende Bindungskomponente bereits daran gebunden ist; und (c) Nachweis der Bindung zwischen dem Analyten und der Indikator-Bindungskomponente, um die Gegenwart und/oder Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen, wobei der Analyt ein Fragment, ein Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist und Schritt (a) vor oder gleichzeitig mit Schritt (b) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die interferierende Einheit ein Epitop aufweist, das weder als Teil noch im Ganzen auf dem Analyten vorkommt auf der Basis des Status des Analyten als ein Fragment der interferierenden Einheit und wobei die blockierende Bindungskomponente spezifisch für dieses Epitop ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die interferierende Einheit ein anderes Epitop aufweist, das mit dem ersten Epitop überlappt, wobei dieses andere Epitop auf dem Analyten vorkommt und wobei die Indikator-Bindungskomponente spezifisch für dieses andere Epitop ist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend eine Test-Festphasen-Bindungskomponente, wobei man die Test-Festphasen-Bindungskomponente mit der Probe in Kontakt bringt und spezifisch an den Analyten binden lässt, bevor die Bindung zwischen dem Analyten und der Indikator-Bindungskomponente nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Bindungskomponenten-Bestandteil der blockierenden Bindungskomponente und/oder der Indikator-Bindungskomponente einen Antikörper, ein Antikörperfragment, einen Rezeptor oder einen Bestandteil eines spezifischen Bindungspaares umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die interferierende Einheit vollständiges PTH und der Analyt ein PTH-Fragment umfasst; wobei die interferierende Einheit Procalcitonin und der Analyt Calcitonin umfasst; wobei die interferierende Einheit gastrisches inhibitorisches Peptid (GIP) und der Analyt Glucagon-ähnliches Peptid (GLP) umfasst; wobei die interferierende Einheit GIP-1 und der Analyt GLP-1 umfasst; wobei die interferierende Einheit GIP-2 und der Analyt GLP-2 umfasst; wobei die interferierende Einheit eine Isoform von Creatinkinase (CK), ausgewählt aus Muskel-(CK-MM)-, Hybrid (CK-MB)- und Hirn (CK-BB)-Isoformen und der Analyt eine von der interferierenden Einheit verschiedene CK-Isoform ist; wobei die interferierende Einheit Proinsulin und der Analyt Insulin umfasst; wobei die interferierende Einheit Osteocalcin und der Analyt ein Osteocalcinfragment umfasst; oder die interferierende Einheit adrenocorticotropes Hormon (ACTH) und der Analyt ein ACTH-Fragment umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Indikator-Bindungskomponente eine nachweisbare Markierung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die nachweisbare Markierung ein Substrat, ein Chromogen, ein Katalysator, eine chemilumineszierende Verbindung, eine partikuläre Markierung, eine fluoreszierende Markierung, eine enzymatische Markierung, eine kolorimetrische Markierung, eine Farbmarkierung, eine radioaktive Markierung oder eine magnetische Markierung ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Analyt 7-84 PTH und die interferierende Einheit 1-84 PTH umfasst und wobei die blockierende Bindungskomponente einen Antikörper umfasst, der eine Spezifität für 1-8 PTH, 1-9 PTH, 1-10 PTH, 1-11 PTH, 1-12 PTH, 1-13 PTH, 1-14 PTH, 1-15 PTH, 1-16 PTH, 1-17 PTH, 1-18 PTH, 1-19 PTH, 1-20 PTH, 1-21 PTH, 1-22 PTH, 1-23 PTH, 1-24 PTH, 1-25 PTH, 1-26 PTH, 1-27 PTH, 1-28 PTH, 1-29 PTH, 1-30 PTH 1-31 PTH, 1-32 PTH, 1-33 PTH, 1-34 PTH, 2-8 PTH, 2-9 PTH, 2-10 PTH, 2-11 PTH, 2-12 PTH, 2-13 PTH, 2-14 PTH, 2-15 PTH, 2-16 PTH, 2-17 PTH, 2-18 PTH, 2-19 PTH, 2-20 PTH, 2-21 PTH, 2-22 PTH, 2-23 PTH, 2-24 PTH, 2-25 PTH, 2-26 PTH, 2-27 PTH, 2-28 PTH, 2-29 PTH, 2-30 PTH, 2-31 PTH, 2-32 PTH, 2-33 PTH, 2-34 PTH, 3-8 PTH, 3-9 PTH, 3-10 PTH, 3-11 PTH, 3-12 PTH, 3-13 PTH, 3-14 PTH, 3-15 PTH, 3-16 PTH, 3-17 PTH, 3-18 PTH, 3-19 PTH, 3-20 PTH, 3-21 PTH, 3-22 PTH, 3-23 PTH, 3-24 PTH, 3-25 PTH, 3-26 PTH, 3-27 PTH, 3-28 PTH, 3-29 PTH, 3-30 PTH, 3-31 PTH, 3-32 PTH, 3-33 PTH, 3-34 PTH, 4-8 PTH, 4-9 PTH, 4-10 PTH, 4-11 PTH, 4-12 PTH, 4-13 PTH, 4-14 PTH, 4-15 PTH, 4-16 PTH, 4-17 PTH, 4-18 PTH, 4-19 PTH, 4-20 PTH, 4-21 PTH, 4-22 PTH, 4-23 PTH, 4-24 PTH, 4-25 PTH, 4-26 PTH, 4-27 PTH, 4-28 PTH, 4-29 PTH, 4-30 PTH, 4-31 PTH, 4-32 PTH, 4-33 PTH, 4-34 PTH, 5-9 PTH, 5-10 PTH, 5-11 PTH, 5-12 PTH, 5-13 PTH, 5-14 PTH, 5-15 PTH, 5-16 PTH, 5-17 PTH, 5-18 PTH, 5-19 PTH, 5-20 PTH, 5-21 PTH, 5-22 PTH, 5-23 PTH, 5-24 PTH, 5-25 PTH, 5-26 PTH, 5-27 PTH, 5-28 PTH, 5-29 PTH, 5-30 PTH, 5-31 PTH, 5-32 PTH, 5-33 PTH, 5-34 PTH, 6-9 PTH, 6-10 PTH, 6-11 PTH, 6-12 PTH, 6-13 PTH, 6-14 PTH, 6-15 PTH, 6-16 PTH, 6-17 PTH, 6-18 PTH, 6-19 PTH, 6-20 PTH, 6-21 PTH, 6-22 PTH, 6-23 PTH, 6-24 PTH, 6-25 PTH, 6-26 PTH, 6-27 PTH, 6-28 PTH, 6-29 PTH, 6-30 PTH, 6-31 PTH, 6-32 PTH, 6-33 PTH, oder 6-34 PTH aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Test-Festphasen-Bindungskomponente einen Antikörper mit einer Spezifität für den Bereich 39-84 PTH umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Test-Festphase eine Microtiterplatte, einen Glas-Objektträger, eine Nitrozellulosemembran, Zellulose oder ein Zellulosederivat, ein Latexkügelchen, eine Zelle, eine Organelle, ein Protein oder Peptid, ein Teströhrchen, ein Plastikkügelchen, einen kolloidalen Goldpartikel, einen Farbpartikel, ein Magnetkügelchen, einen Quantum Dot, einen Messstab oder ein Sieb umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweis des interessierenden Analyten die Bestimmung der Menge des Analyten in der Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Analyt 7-84 PTH und die interferierende Einheit 1-84 PTH umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, weiterhin umfassend die Bestimmung der Gesamt-PTH-Menge in der Probe, wobei die 7-84 PTH-Menge von der Gesamt-PTH-Menge substrahiert wird, wodurch die Menge an 1-84 PTH in der Probe erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei eine Auswahl von zwei Werten aus, und zwar der 7-84-Menge, der Gesamt-PTH-Menge und der 1-84 PTH-Menge im Verhältnis zueinander verglichen wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Verhältnis zur Diagnose, Überwachung oder als Leitfaden für die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Krankheit oder Erkrankung Osteoporose, Nierensteinleiden, familäre Hypocalciurie, Hypercalcämie, multiple endokrine Adeomatose Typ I und II, Osteoporose, Paget's Knochenleiden, Hyperparathyreoidismus, Pseudohyperparathyreoidismus, Nierenversagen, renale Osteopathie, adynamische niedrige Knochenumsatznierenerkrankung, hohe Knochenumsatznierenerkrankung, Osteomalazie, Osteofibrose, Graves Leiden, das Ausmaß chirurgischer Entfernung der Nebenschilddrüse, Übersuppression mit Vitamin D oder einem Vitamin D-Analog oder einem Calcimimetikum oder Calcium oder chronische Urämie ist.
Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit, umfassend Inkontaktbringen einer Probe, die einen Analyten und/oder eine interferierende Einheit enthält oder vermeintlich enthält, mit einer isolierenden Bindungskomponente, wobei man die isolierende Bindungskomponente an die interferierende Einheit, nicht jedoch an den Analyten binden lässt, falls der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorhanden ist/sind, wobei die interferierende Einheit durch Bindung an die isolierende Bindungskomponente aus der löslichen Phase der Probe entfernt wird; Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wobei man die Indikator-Bindungskomponente an den Analyten, nicht aber an die interferierende Einheit binden lässt, und Nachweis der Bindung zwischen dem Analyten und der Indikator-Bindungskomponente, um die Gegenwart und/oder Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen, wobei der Analyt ein Fragment, ein Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist und Schritt (a) vor oder gleichzeitig mit Schritt (b) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die interferierende Einheit aus der Lösung durch Bildung eines interferierende Einheit-Komplexes entfernt wird, welcher nach Kontakt der Probe mit einer Komplex-bildenden Bindungskomponente, die an die isolierende Bindungskomponente binden kann, geformt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, weiter umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einer nicht-spezifischen Immunglobulin-Zusammensetzung, die aus der selben Art wie die isolierende Bindungskomponente stammt, wobei die Komplex-bildende Bindungskomponente ferner an die nicht-spezifische Immunglobulin-Zusammensetzung binden kann, wodurch weiterhin der interferierende Einheit-Komplex gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die isolierende Bindungskomponente eine aus der Maus stammende Zusammensetzung monoklonaler Antikörper umfasst, wobei die nicht-spezifische Immunglobulin-Zusammensetzung Maus-Immunglobulin umfasst und wobei die zweite Immunglobulin-Zusammensetzung Ziege-anti-Maus-Immunglobulin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Nachweis der Bindung zwischen dem Analyten und dem Indikator-Bindungskomponente den Nachweis der Menge des Analyten in der Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Analyt 7-84 PTH umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die isolierende Bindungskomponente einen an eine Bindungskomponente angehefteten Partikel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Partikel eine Microtiterplatte, einen Glas-Objektträger, eine Nitrozellulosemembran, Zellulose oder ein Zellulosederivat, ein Latexkügelchen, eine Zelle, eine Organelle, ein Protein oder Peptid, ein Teströhrchen, ein Plastikkügelchen, einen kolloidalen Goldpartikel, einen Farbpartikel, ein Magnetkügelchen, einen Quantum Dot, einen Messstab oder ein Sieb umfasst.
Verfahren nach Anspruch 25 wobei das Kügelchen aus Zellulose oder einem Zellulosederivat, einem Polymer, Latex, Glas oder Metall besteht.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Kügelchen durch Bromcyan aktiviert ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Bindungskomponenten-Bestandteil der isolierende Bindungskomponente, der Indikator-Bindungskomponente und der Test-Festphasen-Bindungskomponente jeweils einen Antikörper, ein Antikörperfragment, einen Rezeptor oder einen Bestandteil eines spezifischen Bindungspaares umfasst.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei der Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Bindungskomponenten-Bestandteil der isolierenden Bindungskomponente, der Indikator-Bindungskomponente und der Test-Festphasen-Bindungskomponente jeweils einen Anti-PTH-Antikörperumfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Schritte (a) bis (d) in einer Reaktionskammer stattfinden.
Verfahren nach Anspruch 18, ferner umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einer Test-Festphasen-Bindungskomponente, wodurch eine spezifische Bindung der Test-Bindungskomponente an den Analyten, nicht aber an die interferierende Einheit ermöglicht wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Indikator-Bindungskomponente weiterhin eine nachweisbare Markierung aufweist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Analyt Calcitonin und die interferierende Einheit einen Calcitonin-Vorläufer umfasst.
Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit, umfassend: Einbringen einer Probe enthaltend oder vermeintlich enthaltend einen Analyten und eine interferierende Einheit in eine Reaktionskammer; Inkontaktbringen der Probe mit einer isolierenden Bindungskomponente, wobei die isolierende Bindungskomponente spezifisch an die interferierende Einheit, nicht aber an den Analyten in der Probe bindet; Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, die den Analyten und die interferierende Einheit in der Probe bindet; Inkontaktbringen der Probe mit einer Test-Festphasen-Bindungskomponente, die an den Analyten in der Probe bindet; und selektiver Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und: (i) dem Analyten; (ii) der interferierenden Einheit, und/oder (iii) der Kombination des Analyten und der interferierenden Einheit, wobei der Analyt ein Fragment, Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist, wobei Schritt (b) vor den Schritten (c) und/oder (d) durchgeführt wird und wobei die an den Analyten gebundene Test-Festphasen-Bindungskomponente und/oder die an die interferierende Einheit gebundene isolierende Bindungskomponente vor dem selektiven Nachweis (i) des Analyten oder (ii) der interferierenden Einheit gegebenenfalls aus der Reaktionskammer entfernt und in eine andere Kammer überführt werden.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der Analyt und die interferierende Einheit nach dem selektiven Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und der Kombination des Analyten und der interferierenden Einheit in der Reaktionskammer vorkommen.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei der Analyt nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der isolierenden Bindungskomponente aus der Reaktionskammer entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei der Analyt mit der Indikator-Bindungskomponente und/oder der Test-Festphasen-Bindungskomponente entweder (i) bei Kontakt mit der anderen Reaktionskammer oder (ii) nach Entfernung in eine andere Reaktionskammer in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die isolierende Bindungskomponente derart an eine Wand der Reaktionskammer angeheftet ist, dass die Probe nach Einführen von zumindest einem Teil der Probe in die Reaktionskammer mit der isolierenden Bindungskomponente in Kontakt kommt.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die Indikator-Bindungskomponente mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Indikator-Bindungskomponente eine erste markierte Indikator-Bindungskomponente umfasst, die spezifisch an den Analyten bindet, wie auch eine zweite markierte Indikator-Bindungskomponente, die spezifisch an die interferierende Einheit bindet, wobei der markierende Bestandteil der ersten markierten Indikator-Bindungskomponente bezogen auf den markierten Bestandteil der zweiten markierten Indikator-Bindungskomponente auf unterscheidbare Weise nachgewiesen werden kann.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der Nachweis des Analyten die Bestimmung der Menge an 7-84 PTH in der Probe und der Nachweis der interferierenden Einheit die Bestimmung der Menge an 1-84 PTH in der Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 42, weiterhin umfassend die Berechnung der Gesamt-PTH-Menge aus den kombinierten 7-84 PTH- und 1-84 PTH-Mengen.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die an den Analyten gebundene Test-Festphasen-Bindungskomponente vor dem selektiven Nachweis des Analyten oder der interferierenden Einheit aus der Reaktionskammer entfernt und in eine andere Kammer überführt wird und wobei die Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem Analyten und die Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und der interferierenden Einheit selektiv bestimmt werden, wobei eine derartige Bestimmung die Bestimmung der Mengen des Analyten und der Menge der interferierenden Einheit in der Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei der Analyt 7-84 PTH und die interferierende Einheit 1-84 PTH und 1-34 PTH umfasst und wobei das Verfahren ferner die Bestimmung der Mengen an 1-84 PTH in der Probe durch einen direkten 1-84 PTH-Test umfasst.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Menge an 1-34 PTH in der Probe durch Subtraktion der Menge an 1-84 PTH von der Menge an interferierender Einheit in der Probe bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei der Nachweis der Kombination von Analyt und interferierender Einheit in der Probe den Nachweis der Gesamt-PTH-Menge in der Probe umfasst und wobei die 7-84 PTH-Menge von der Gesamt-PTH-Menge subtrahiert wird, wodurch die Menge an 1-84 PTH in der Probe bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 47, wobei eine Auswahl von zwei Werten aus der 7-84-Menge, der Gesamt-PTH-Menge und der 1-84 PTH-Menge im Verhältnis zueinander verglichen wird.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Verhältnis zur Diagnose, Überwachung oder als Leitfaden für die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 49, wobei die Krankheit oder Erkrankung Osteoporose, Nierensteinleiden, familäre Hypocalciurie, Hypercalcämie, multiple endokrine Adeomatose Typ I und II, Osteoporose, Paget's Knochenleiden, Hyperparathyreoidismus, Pseudohyperparathyreoidismus, Nierenversagen, renale Osteopathie, adynamische niedrige Knochenumsatznierenerkrankung, hohe Knochenumsatznierenerkrankung, Osteomalazie, Osteofibrose, Graves Leiden, das Ausmaß chirurgischer Entfernung der Nebenschilddrüse, Übersuppression mit Vitamin D oder einem Vitamin D-Analog oder einem Calcimimetikum oder Calcium oder chronische Urämie ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der Bindungskomponenten-Bestandteil der isolierende Bindungskomponente, der Indikator-Bindungskomponente und der Test-Festphasen-Bindungskomponente jeweils einen Antikörper, ein Antikörperfragment, oder einen Bestandteil eines spezifischen Bindungspaares umfasst.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der Bindungskomponenten-Bestandteil der isolierenden Bindungskomponente, der Indikator-Bindungskomponente und der Test-Festphasen-Bindungskomponente jeweils einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper umfasst.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der Nachweis des Analyten die Bestimmungen der Menge an 7-84 PTH in der Probe und der Nachweis der interferierenden Einheit die Bestimmung der Menge an 1-84 PTH in der Probe umfasst, wobei der Analyt in der anderen Reaktionskammer nachgewiesen wird, und wobei die interferierende Einheit in der Reaktionskammer nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 53, weiterhin umfassend die Berechnung der Gesamt-PTH-Menge aus den kombinierten 7-84 PTH- und 1-84 PTH-Mengen.
Verfahren nach Anspruch 54, wobei eine Auswahl von zwei Werten aus der 7-84-Menge, der Gesamt-PTH-Menge und der 1-84 PTH-Menge im Verhältnis zueinander verglichen wird.
Verfahren nach Anspruch 55, wobei das Verhältnis zur Diagnose, Überwachung oder als Leitfaden für die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung, wie renale Osteopathie oder adynamische Knochenerkrankung oder hohe Knochenumsatzerkrankung, eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei die 7-84 PTH-Menge in einer Probe direkt bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 57, wobei die Gesamt-PTH-Menge in dem Subjekt weiter bestimmt wird und die Gesamt-PTH-Menge sich zusammensetzt aus einer 1-84 PTH Menge, einer 7-84-Menge und gegebenenfalls PTH-Fragmenten außer dem 7-84 PTH.
Verfahren zum Nachweis von vollständigem PTH in einer Probe in Gegenwart von PTH-Fragmenten, umfassend (a) Inkontaktbringen einer Probe, die vollständiges PTH und/oder ein PTH-Fragment enthält oder vermeintlich enthält, mit einer blockierenden Bindungs-Komponente-Zusammensetzung enthaltend eine Bindungskomponente, die spezifisch an vollständiges PTH und das PTH-Fragment in der Probe bindet, so dass ein einzigartiges Epitop, das auf dem vollständigen PTH, nicht aber auf dem PTH-Fragment vorhanden ist, von der Bindungskomponente in der blockierenden Bindungskomponente-Zusammensetzung nicht gebunden wird; (b) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wobei die Bindung der Indikator-Bindungskomponente mit dem einzigartigen Epitop auf dem vollständigen PTH ermöglicht wird, das von der blockierenden Bindungskomponente-Zusammensetzung nicht gebunden wurde, wobei die Indikator-Bindungskomponente nicht an das PTH-Fragment bindet; und (c) Nachweis der Bindung zwischen dem vollständigen PTH und der Indikator-Bindungskomponente, wobei die Gegenwart und/oder Menge des vollständigen PTH in der Probe bestimmt wird, wobei Schritt (a) vor Schritt (b) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 59, wobei die blockierende Bindungskomponenten-Zusammensetzung eine Reihe an monoklonalen Antikörpern oder einen polyklonalen Antikörper enthält und wobei die monoklonalen oder polyklonalen Antikörper gegen den gesamten Bereich umfassend 9-34 PTH oder einen Teil davon gerichtet sind.
Verfahren nach Anspruch 60, wobei die Indikator-Bindungskomponente einen Antikörper umfasst, der gegen den gesamten Bereich umfassend 1-34 PTH oder einen Teil davon gerichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 59, weiterhin umfassend das Inkontaktbringen einer Test-Festphasen-Bindungskomponente mit der Probe, wobei die spezifische Bindung des vollständigen PTH und/oder des PTH-Fragmentes vor dem Nachweis der Bindung zwischen dem gesamten und der Indikator-Bindungskomponente ermöglicht wird.
Verfahren nach Anspruch 59, wobei die Indikator-Bindungskomponente weiterhin eine nachweisbare Markierung umfasst.
Zusammensetzung, die für die Vorbehandlung einer Probe zur Bestimmung der Menge an 7-84 PTH eingesetzt werden kann, unter Verwendung eines Gesamt-PTH-Tests enthaltend eine Bindungskomponente spezifisch für den gesamten Bereich des PTH-Moleküls umfassend 1-9 PTH oder 1-15 PTH oder einen Teil davon, wobei die Bindungskomponente an eine Festphase gebunden ist.
Zusammensetzung, die in der Vorbehandlung einer Probe zur Bestimmung der Menge an 1-84 PTH eingesetzt werden kann, unter Verwendung eines Gesamt-PTH-Tests enthaltend eine Bindungskomponente spezifisch für den gesamten Bereich des PTH-Moleküls umfassend 15-34 PTH oder 7-34 PTH oder einen Teil davon, wobei die Bindungskomponente an eine Festphase gebunden ist.
Verfahren zum Nachweis von vollständigem PTH in einer Probe, umfassend (a) Inkontaktbringen einer flüssigen Probe, die vollständiges PTH und/oder ein PTH-Fragment enthält oder vermeintlich enthält, mit einer Indikator-Bindungskomponente, wodurch man die spezifische Bindung der Indikator-Bindungskomponente an das vollständige PTH ermöglicht; (b) Inkontaktbringen der Probe mit einer isolierenden Bindungskomponente, wodurch die spezifische Bindung der isolierenden Bindungskomponente an das vollständige PTH ermöglicht wird; (c) Inkontaktbringen der Probe mit einer nicht-spezifischen Bindungskomponente, wobei die nicht-spezifische Bindungskomponente aus derselben Art stammt wie die isolierende Bindungskomponente; (d) Inkontaktbringen der Probe mit einer Komplex-bildenden Bindungskomponente, wodurch die Bindung der Komplex-bildenden Bindungskomponente an die an vollständiges PTH gebundene, isolierende Bindungskomponente und die nicht-spezifische Bindungskomponente und damit eine Komplexbildung ermöglicht wird, wobei der Komplex in Lösung ausfällt; und (e) Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem vollständigen PTH, wobei einer der Schritte (a), (b) oder (c), oder alle Schritte vor Schritt (d) durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 66, weiterhin umfassend das Entfernen von nicht gebundener Indikator-Bindungskomponente, isolierender Bindungskomponente, nicht spezifischer Bindungskomponente und/oder Komplex-bildender Bindungskomponente, falls vorhanden, vor dem Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem vollständigen PTH.
Verfahren nach Anspruch 66, wobei die Indikator-Bindungskomponente einen Anti-1-9 PTH-Antikörper enthält.
Verfahren nach Anspruch 68, wobei die isolierende Bindungskomponente einen Anti-39-84 PTH-Antikörper enthält.
Verfahren nach Anspruch 66, wobei die Indikator-Bindungskomponente einen Antikörper enthält, der aus einer unterschiedlichen Art als der isolierende Antikörper stammt.
Verfahren nach Anspruch 66, wobei die Indikator-Bindungskomponente weiterhin eine nachweisbare Markierung umfasst.
Verfahren zum Nachweis von PTH und eines Fragmentes und/oder Analogons davon in einer Probe, umfassend (a) Inkontaktbrigen einer Probe, die vollständiges PTH und ein N-terminales PTH-Fragment oder ein Analogon enthält oder vermeintlich enthält, mit einer isolierenden Bindungskomponente, wodurch die spezifische Bindung der isolierenden Bindungskomponente an das vollständige PTH, nicht jedoch an das N-terminale PTH-Fragment oder Analogon ermöglicht wird; (b) Inkontaktbringen der Probe mit einer Test-Festphasen-Bindungskomponente, wodurch die spezifische Bindung der Test-Festphasen-Bindungskomponente an das N-terminale PTH-Fragment oder Analogon ermöglicht wird; (c) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wodurch die Bindung der Indikator-Bindungskomponente an das vollständige PTH und das N-terminale PTH-Fragment oder Analogon ermöglicht wird; und (d) Nachweis der Bindung zwischen der Indikator-Bindungskomponente und dem vollständigen PTH, dem N-terminalen PTH-Fragment oder Analogon und/oder der Kombination aus dem vollständigen PTH und dem N-terminalen PTH-Fragment oder Analogon, wobei Schritt (a) vor den Schritten (b) und/oder (c) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 72, wobei das N-terminale PTH-Fragment oder Analogon 1-34 PTH oder Teraparatid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 73, wobei die Probe in einem Reaktionsgefäß mit der isolierenden Bindungskomponente in Kontakt gebracht wird und wobei die isolierende Bindungskomponente an einer Oberfläche des Reaktionsgefäßes immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 72, wobei die isolierende Bindungskomponente einen Anti-39-84 PTH-Antikörper umfasst, und wobei die isolierende Bindungskomponente zusätzlich zur Bindung an vollständiges PTH an ein C-terminales PTH-Fragment, sofern vorhanden, bindet.
Verfahren nach Anspruch 74, wobei die isolierende Bindungskomponente einen Anti-39-84 PTH-Antikörper umfasst, wobei die Test-Festphasen-Bindungskomponente einen Anti-15-34 PTH-Antikörper umfasst und der Test- Indikator einen Anti-1-9 PTH-Antikörper umfasst.
Verfahren nach Anspruch 74, wobei die an das 1-34 PTH oder Teriparatid gebundene Test-Festphase aus dem Reaktionsgefäß entfernt wird und für den Nachweis in ein anders Reaktionsgefäß überführt wird.
Verfahren nach Anspruch 77, wobei die Bindung zwischen dem vollständigen PTH und der Indikator-Bindungskomponente in dem Reaktionsgefäß nach der Entfernung der an das 1-34 PTH oder Teriparatid gebundenen Test-Festphase nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 78, weiterhin umfassend das Inkontaktbringen einer weiteren Indikator-Bindungskomponente mit der Probe nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der Test-Festphasen-Bindungskomponente, wodurch die Bindung der anderen Indikator-Bindungskomponente an ein PTH-Fragment umfassend 7-84 PTH, sofern in der Probe vorhanden, ermöglicht wird, und den Nachweis der Bindung zwischen der anderen Indikator-Bindungskomponente und dem 7-84 PTH.
Verfahren nach Anspruch 79, wobei die andere Indikator-Bindungskomponente zur selben Zeit wie die primäre Indikator-Bindungskomponente mit der Probe in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 78, wobei der Nachweis der Bindung zwischen dem vollständigen PTH und der Indikator-Bindungskomponente die Bestimmung der Menge an vollständigem PTH in der Probe umfasst, wobei der Nachweis der Bindung zwischen dem 1-34 PTH oder Teriparatid und der Indikator-Bindungskomponente die Bestimmung der Menge an 1-34 PTH oder Teriparatid in der Probe umfasst und wobei die vollständige Menge an vollständigem PTH und 1-34 PTH oder Teriparatid aus der Menge an vollständigem PTH und der Menge an 1-34 oder Teriparatid berechnet wird.
Verfahren nach Anspruch 81, weiterhin umfassend die Messung oder Berechnung der Menge an einem PTH-Fragment umfassend 7-84 PTH in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 82, wobei die Menge an 1-34 PTH oder Teriparatid, vollständigem PTH, 7-84 PTH und/oder daraus gewonnenen Kombinationen oder Verhältnissen zur Diagnose, Überwachung oder als Leitfaden für die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 83, wobei die Krankheit oder Erkrankung Osteoporose umfasst.
Verfahren zum Nachweis von Calcitonin in Gegenwart einer interferierenden Einheit enthaltend einen Calcitonin-Vorläufer in einer Probe, umfassend (a) Inkontaktbringen einer Probe, die Calcitonin und/oder eine interferierende Einheit enthaltend einen Calcitonin-Vorläufer enthält, oder vermeintlich enthält, mit einer isolierenden Bindungskomponente, wodurch die spezifische Bindung der isolierenden Bindungskomponente an die interferierende Einheit, nicht jedoch an Calcitonin ermöglicht wird, sofern das Calcitonin und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorkommen, wobei die interferierende Einheit aus einer löslichen Phase in der Probe durch Bindung an die isolierende Bindungskomponente entfernt wird; (b) Inkontaktbringen der Probe mit einer Indikator-Bindungskomponente, wodurch die Bindung der Indikator-Bindungskomponente an das Calcitonin ermöglicht wird; und (c) Nachweis der Bindung zwischen dem Calcitonin und der Indikator-Bindungskomponente, wodurch das Vorkommen und/oder die Menge des Calcitonins in der Probe ermittelt wird, wobei Schritt (a) vor oder gleichzeitig mit Schritt (b) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 85, wobei die interferierende Einheit durch Bildung eines interferierende Einheit-Komplexes aus der Lösung entfernt wird, der nach Kontakt der Probe mit einer Komplex-bildenden Bindungskomponente, die die isolierende Bindungskomponente binden kann, gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 85, weiterhin umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einer nicht-spezifischen Immunglobulin-Zusammensetzung die aus der selben Art stammt wie die isolierende Bindungskomponente, wobei die Komplex-bildende Bindungskomponente ferner die nicht-spezifische Immunglobulin-Zusammensetzung binden kann, wodurch eine Präzipitatmasse gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 87, wobei die isolierende Bindungskomponente eine von der Maus abgeleitete monoklonale Antikörper-Zusammensetzung umfasst, die nicht-spezifische Immunglobulin-Zusammensetzung Maus-Immunglobulin umfasst und die zweite Immunglobulin-Zusammensetzung Ziege-anti-Maus-Immunglobulin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 85, wobei die interferierende Einheit Procalcitonin oder Präprocalcitonin umfasst.
Verfahren zum Nachweis eines nicht-typischen PTH (ntPTH) in einer Probe, umfassend: (a) Testen einer Probe unter Verwendung eines Tests auf die PTH-Gesamtmenge, der den Nachweis von 1-84 PTH und 7-84 PTH, sofern in der Probe vorhanden, erlaubt, wodurch eine PTH-Gesamtmenge in der Probe bestimmt wird; (b) Testen der Probe unter Verwendung eines Tests auf vollständiges PTH, der spezifisch 1-84 PTH nachweist und auch ntPTH misst, sofern in der Probe vorhanden, wodurch eine kombinierte Menge an 1-84 PTH und ntPTH in der Probe bestimmt wird; (c) Testen der Probe zur Bestimmung einer 7-84 PTH-Menge in der Probe; und (d) Subtraktion der Differenz zwischen der 7-84 PTH-Menge und der PTH-Gesamtmenge von der kombinierten Menge an 1-84 PTH und ntPTH, wodurch die ntPTH-Menge in der Probe bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 90, wobei eine Auswahl von zwei Werten aus der 7-84 PTH-Menge, der 1-84 PTH-Menge, der PTH-Gesamtmenge und/oder der ntPTH Menge im Verhältnis zueinander verglichen wird.
Verfahren nach Anspruch 91, wobei das Verhältnis zur Diagnose, Überwachung oder als Leitfaden für die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung wie adynamische Knochenerkrankung, hohe Knochenumsatzerkrankung oder Osteoporose eingesetzt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 64, weiterhin umfassend ein Mittel zum Testen des gesamten PTH.
Zusammensetzung nach Anspruch 65, weiterhin umfassend ein Mittel zum Testen des gesamten PTH.
Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit, umfassend (a) Inkontaktbringen einer Probe, die einen Analyten und/oder eine interferierende Einheit enthält oder vermeintlich enthält, mit einer blockierenden Bindungskomponente, wodurch die spezifische Bindung der blockierenden Bindungskomponente an die interferierende Einheit, nicht jedoch an den Analyten ermöglicht wird, falls der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorkommt; (b) Inkontaktbringen der Probe mit einem Analyten, Analogon und einer Bindungskomponente, wodurch eine kompetitive Bindung des Analyten und des Analyt-Analogons an die Bindungskomponente ermöglicht wird, wobei entweder das Analyt-Analogon oder die Bindungskomponente eine nachweisbare Markierung umfasst, und die Bindungskomponente nicht spezifisch an die interferierende Einheit bindet, was auf die Gegenwart der daran gebundenen blockierenden Bindungskomponente zurückzuführen ist; und (c) Nachweis der kompetitiven Bindung des Analyten und des Analyt-Analogons an die Bindungskomponente, wodurch die Gegenwart und/oder die Menge des Analyten in der Probe nachgewiesen wird, wobei der Analyt ein Fragment, ein Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist und Schritt (a) vor oder gleichzeitig mit Schritt (b) durchgeführt wird.
Verfahren zum Nachweis eines Analyten in Gegenwart einer interferierenden Einheit, umfassend (a) Inkontaktbringen einer Probe, die einen Analyten und/oder eine interferierende Einheit enthält oder vermeintlich enthält, mit einer isolierenden Bindungskomponente, wodurch eine spezifische Bindung der isolierenden Bindungskomponente an die interferierende Einheit ermöglicht wird, nicht jedoch an den Analyten, sofern der Analyt und/oder die interferierende Einheit in der Probe vorkommt, wobei die interferierende Einheit durch Bindung an die isolierende Bindungskomponente aus der löslichen Phase in der Probe entfernt wird; (b) Inkontaktbringen der Probe mit einem Analyt-Analogon und einer Bindungskomponente, wodurch eine kompetitive Bindung des Analyten und des Analyt-Analogons die Bindungskomponente ermöglicht wird, wobei entweder das Analyt-Analogon oder die Bindungskomponente eine nachweisbare Markierung enthält; und (c) Nachweis der kompetitiven Bindung des Analyten und des Analyt-Analogons an die Bindungskomponente, wodurch die Gegenwart und/oder die Menge des Analyten in der Probe ermittelt wird, wobei der Analyt ein Fragment, ein Analogon oder eine Isoform der interferierenden Einheit ist und Schritt (a) vor oder gleichzeitig mit Schritt (b) durchgeführt wird.