DE4328070C1 - Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einem Volumen einer flüssigen Probe sowie seine Anwendung zur Bestimmung von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern in einem Patientenserum - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einem Volumen einer flüssigen Probe sowie seine Anwendung zur Bestimmung von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikör­ pern in einem Patientenserum.

Ein "Analyt" im Sinne der Ausführungen zu der vorliegenden Erfindung ist in erster Linie eine biologisch aktive Sub­ stanz, deren Anwesenheit und/oder Menge in einer von Natur aus flüssigen oder in einer durch eine entsprechende Vor­ behandlung in flüssige Form überführten biologischen Probe bestimmt werden soll. Analyten im Sinne der vorliegenden Erfindung sind daher in erster Linie Substanzen mit Hapten- oder Antigeneigenschaften, wie Hormone, Peptidhormone, phy­ siologisch aktive Peptide und Proteine, wobei letztere auch Proteine mit Immunglobulin-Charakter, also Antikörper oder Autoantikörper, umfassen. Die biologischen Proben sind in erster Linie Blutproben oder andere flüssige Blutfraktionen, wie insbesondere Serumproben oder Plasmaproben, es kann sich bei der Probe grundsätzlich jedoch auch um eine andere biolo­ gische Flüssigkeit, wie Speichel oder Urin, oder um solubili­ sierte Gewebsextrakte handeln. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Bestimmung biologisch aktiver Substanzen natürlicher Herkunft beschränkt, sondern umfaßt auch die Bestimmung von Arzneimitteln und ihren Metaboliten in biologischen Flüssig­ keiten und kann auch zur Bestimmung beliebiger anderer Sub­ stanzen in beliebigen Flüssigkeiten angewandt werden, wenn zur Bestimmung derartiger Analyten der Einsatz des relativ aufwendigen Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung sinnvoll ist und die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem solchen Falle erforderlichen Bindungs- und Umsetzungspartner gefunden werden können. Die vorliegende Erfindung hat jedoch besondere Bedeutung für die Bestimmung von biologisch aktiven Substanzen, insbesondere von Substan­ zen proteinischer Natur, in biologischen Flüssigkeiten, und dabei wiederum für die Bestimmung solcher Analyten, deren Bestimmung auf andere, an sich bekannte Weise problematisch ist. Wenn in der Folge das erfindungsgemäße Bestimmungsver­ fahren vorrangig anhand bestimmter Typen von Analyten oder sogar anhand bestimmter Analyten erläutert wird, ist das nicht im Sinne einer Einschränkung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf derartige Analyten zu interpretieren.

Während für einfache chemische Substanzen anorganischer oder organischer Natur eine große Vielfalt von chemischen und/oder physikalischen Bestimmungsverfahren zur Verfügung steht, müssen biologisch aktive Analyten, insbesondere natürlich vorkommende Biomoleküle mit bestimmten physiologischen Auf­ gaben in der Regel nach sogenannten immundiagnostischen Verfahren bestimmt werden, da aufgrund ihrer Natur und/oder der Menge ihres Auftretens andere Bestimmungsverfahren nicht anwendbar oder z. B. für eine klinische Praxis zu aufwendig sind.

Die grundsätzliche Bekanntheit derartiger immunologischer Bestimmungsverfahren kann vorausgesetzt werden. Die bekannten Verfahren lassen sich je nach Reaktionstyp, zu bestimmender Substanz oder anzuwendendem Nachweisverfahren verschiedenen Typen zuordnen. So kann man einen Teil der Verfahren soge­ nannten kompetitiven Bestimmungen zuordnen, zu denen der klassische Radioimmunoassay (RIA) gehört, und die je nach Markierung, Art des zu bestimmenden Moleküls und der Bestim­ mung in homogener oder heterogen er Phase noch einmal ver­ schiedenen Untertypen zugeordnet werden können. Bezüglich der Grundverfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern nach kompetitiven Verfahren kann z. B. auf die US-B1-3654090, Spalte 3, oben verwiesen werden. Bei diesen Verfahren setzt man der zu untersuchenden Probe eine bekannte Menge eines Kompetitors sowie einen Unterschusses eines spezifischen Binders zu, wobei i.d.R. eine der Komponenten Kompetitor oder Binder markiert und die andere immobilisiert vorliegen, und man ermittelt die gesuchte Menge des Analyten aus der Menge der an die feste Phase gebundenen Markierung. Es ist bei diesem Verfahren somit erforderlich, daß wenigstens einer von Binder und Kompetitor immobilisierbar ist und der andere markierbar, wobei anstelle einer direkten Markierung auch eine nachträglich indirekte Markierbarkeit ausreicht.

Ein anderes Prinzip, das als sog. Zweiseiten- oder Sandwich- Bestimmungsverfahren bekannt ist, ist für Analyten geeignet, die zwei unterschiedliche Bindungsstellen für Binder, wie z. B. verschiedene Antikörper aufweisen. Dabei wird mittels eines Überschusses eines ersten immobilisierten Antikörpers zuerst die gesamte in der Probe vorhandene Menge des Analyten gebunden, und diese wird anschließend oder gleichzeitig mit einem zweiten markierten Antikörper markiert. In indirekten Varianten dieses Prinzips, wie sie z. B. in der EP-Al-0105714 oder der EP-Al-147848 verwirklicht werden, wird entweder zur Immobilisierung oder zur Markierung des den gesuchten Analy­ ten enthaltenden Sandwiches ein weiterer immobilisierter oder markierter Antikörper verwendet. Bei allen diesen Verfahren findet sich zum Schluß der zu bestimmende Analyt selbst im immobilisierten und markierten Immunkomplex, der als Ergebnis des Bestimmungstests erhalten und vermessen wird.

In ihren verschiedenen Ausführungsformen sind die obigen Grundverfahren für die Bestimmung der meisten biologisch aktiven Analyten in biologischen Flüssigkeiten einsetzbar.

Es gibt jedoch eine Reihe von Fällen, in denen aus verschie­ denen Gründen, zu denen Verfügbarkeit, erreichbare Reinheit, Stabilität, Immobilisierbarkeit und Bindungseigenschaften der in dem Bestimmungsverfahren miteinander umgesetzten Reaktan­ ten gehören, die bekannten Prinzipien nicht ohne weiteres anwendbar oder bei ihrer Anwendung mit einer Reihe schwerwie­ gender Nachteile verbunden sind, die auf den ersten Blick aufwendigere Abwandlungen der klassischen Bestimmungsver­ fahren gegenüber den einfachen Grundverfahren vorteilhafter machen. Ein Beispiel für ein derartiges komplexeres Bestim­ mungsverfahren findet sich im deutschen Patent DE 41 20 412 der Anmelderin, bei dem aus den im genannten Patent näher erläuterten Gründen die Bestimmung von Autoantikörpern gegen humane Schilddrüsenperoxidase (hTPO) so erfolgt, daß die Störung des Aufbaus eines Sandwich aus zum Reagenziensatz des Bestimmungsverfahrens gehörenden Bestandteilen durch den in der Probe vorhandenen Analyten, d. h. durch Autoantikörper gegen hTPO, gemessen wird. Bei diesem Verfahren äußert sich die Anwesenheit des zu bestimmenden Analyten als Verminderung der Bindung einer Markierung an eine feste Phase. Ein wesent­ licher Vorteil des genannten Verfahrens besteht darin, daß auf die vorher als erforderlich angesehene Hochreinigung des Antigens hTPO, das als Kompetitor zu den anti-hTPO-Antikör­ pern dient, verzichtet werden kann.

Aus der WO 85/00226 ist ein komplexeres Verfahren zur Bestim­ mung der Menge eines freien Liganden bekannt, d. h. der nicht an endogene Bindeproteine gebundenen Menge eines Liganden wie z. B. eines der Schilddrüsenhormone T₃ oder T₄, bei dem man die den gesuchten freien Liganden enthaltende Probe mit einem Ligandenanalogen, einem spezifischen Binder für sowohl den Liganden als auch das Ligandenanaloge sowie einem exogenen Binder, der z. B. ein Antikörper sein kann und der nur das Ligandenanaloge, jedoch nicht den Liganden bindet, umsetzt. Der exogene Binder dient als Puffer, der gewährleistet, daß die Konzentration des Ligandenanalogen in der Reaktionsmi­ schung nicht unkontrollierten Fluktuationen unterworfen ist, so daß insbesondere Effekte einer Bindung des Ligandenanalogen an die endogenen Bindeproteine ausgeglichen werden können. Die Anwesenheit des exogenen Binders ist nur durch seine Funktion, die Gleichgewichte (endogene Bindeproteine)/Ligandenanalo­ ges/(spezifischer Binder)/(exogener Binder) ausgleichend zu beeinflussen, gerechtfertigt. Die Verwendung eines zusätzli­ chen exogenen Binders für andere Meßverfahren wird weder gelehrt, noch erscheint sie vor dem Hintergrund der theoreti­ schen Begründung für die Anwesenheit des exogenen Binders bei anderen Meßverfahren sinnvoll.

Etwas anders gelagerte Probleme können insbesondere in sol­ chen Fällen auftreten, bei denen einer der Reaktionspartner des Bestimmungsverfahrens ein Rezeptor ist. Die Bindung von Biomolekülen von Peptid- oder Proteinnatur an Rezeptoren ist in der Regel sehr komplexer Natur, und die Ausbildung einer Bindung zwischen Rezeptor und Biomolekül ist sehr viel emp­ findlicher gegenüber strukturellen Veränderungen des Biomole­ küls bzw. des Rezeptors, z. B. durch Markierung oder Immobili­ sierung, als das bei einem üblichen Bindungspaar Antigen/- Antikörper der Fall ist. Für die Durchführbarkeit der bekann­ ten immunologischen Bestimmungsverfahren nach einem der oben geschilderten Grundprinzipien führt das dazu, daß nur eine geringe Freiheit im Hinblick auf die Ausgestaltung eines derartigen Verfahrens besteht. So konnte im Falle der Bestim­ mung von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern bisher nicht mit immobilisierten Rezeptoren (und markiertem bTSH) oder immobi­ liserten Kompetitoren (und markiertem Rezeptor) gearbeitet werden.

Die so eben gemachten Ausführungen sollen am Fall der Bestim­ mung von Autoantikörpern gegen den TSH-Rezeptor noch näher erläutert werden, der gleichzeitig einen bevorzugten Fall für die Durchführung eines typischen Bestimmungsverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt.

TSH ist ein Hypophysenhormon, das bei der Regulierung der Funktion der Schilddrüse eine zentrale Aufgabe erfüllt. Seine Freisetzung wird durch das im Hypothalamus gebildete Hormon TRH angeregt und steuert die Bildung und Ausschüttung des wichtigsten Schilddrüsenhormons Thyroxin (T4). Im Sinne einer Rückkopplung steuert der Gehalt des Serums an Thyroxin die TSH-Freisetzung. Die Bildung von Thyroxin durch die Schilddrüsenzellen wird von TSH dadurch stimuliert, daß das von der Hypophyse ausgeschüttete TSH an den TSH-Rezeptor der Schilddrüsenzellmembran bindet.

Gegen diesen TSH-Rezeptor können bei bestimmten Krankheits­ zuständen jedoch auch verschiedene Arten von Autoantikörpern gebildet werden. Je nach Art dieser Autoantikörper kann es entweder durch Abschirmung der TSH-Moleküle an den TSH-Rezep­ toren zu einer Inhibierung der Bildung und Ausschüttung von Thyroxin kommen, oder im Gegenteil auch dazu, daß dieses Schilddrüsenhormon unkontrolliert ausgeschüttet wird, weil die anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörper im Sinne der Wirkung des TSH die Synthese und Ausschüttung von Schilddrüsenhormonen stimulieren. Der im letzteren Falle resultierende Schild­ drüsenhormonüberschuß äußert sich u. a. als eine Hyperthyreose vom Typ Morbus Basedow.

Der Nachweis von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern hat somit für die klinische Praxis eine hohe Bedeutung, und es sind bereits eine Reihe von Radiorezeptor-Assays bekannt, die die Bestimmung von derartigen Autoantikörpern in biologischen Flüssigkeiten ermöglichen.

Derartige TSH-Rezeptor-Assays funktionieren ähnlich wie kompetitive Radioimmunoassays, wobei jedoch als spezifisches Bindungsreagenz für die zu bestimmenden Autoantikörper und die als Kompetitor in radioaktiv markierter Form eingesetzte TSH-Präparation nicht anti-Analyt-Antikörper verwendet wer­ den, sondern Präparationen von TSH-Rezeptoren. Wegen der nachfolgend noch weiter erläuterten Besonderheiten der Wech­ selwirkung Rezeptor/TSH muß der Test so durchgeführt werden, daß man die Umsetzung der TSH-Rezeptor-Präparation mit der radioaktiv markierten TSH-Präparation und der Probe in flüs­ siger Phase durchführt und daß man die gebildeten Reaktions­ produkte aus Rezeptor und Bindungspartnern ausfällt, z. B. durch Zugabe von Polyethylenglykol, und nach Abtrennung des Überstands die Radioaktivität in dem pelletierten Nieder­ schlag mißt.

Die Grundprinzipien und Einzelheiten der bekannten Bestimmung von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern in Humanserum werden in einer Vielzahl von Literaturstellen beschrieben, von denen neben den Produktinformationen der verschiedenen Test-Her­ steller insbesondere zu nennen sind der Artikel von L.C. Harrison und P.J. Leedman in Clin.Biochem. Vol. 23, Seiten 43 bis 48, 1990; Bernard Rees Smith et al. in Endocrine Reviews, Band 9, Nr. 1, Seiten 106 bis 121, 1989; sowie Bernard Rees Smith und Reginald Hall, Methods in Enzymology, Band 74, Seite 405 bis 420, 1981. Alle beschriebenen Rezeptorassays zur Bestimmung von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern ver­ wirklichen das oben beschriebene Grundverfahren. Bezüglich weiterer Einzelheiten wird noch verwiesen auf den Inhalt des nicht vorveröffentlichten deutschen Patents DE 42 37 430. C1 der Anmelderin. Nach einem anderen Grundprinzip als dem oben geschilderten arbeitende Rezeptorassays zur Bestimmung von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern sind bisher nicht bekannt geworden.

Der Grund dafür liegt in der Natur der Wechselwirkung Rezep­ tor/Autoantikörper bzw. Rezeptor/markierte TSH-Präparation. Diese machte es z. B. bislang unmöglich, den TSH-Rezeptor in immobilisierter Form einzusetzen und die zu messende Radio­ aktivität an der Festphase nach einer üblichen Flüssig/Fest­ trennung zu messen, und auch eine Markierung-der Rezeptor­ präparation und deren Umsetzung mit einer immobilisierten TSH-Präparation als Kompetitor zu dem Analyten erwies sich bisher als nicht machbar. Auch eine Markierung der TSH-Präpa­ ration mit anderen als radioaktiven Labels war bisher in der Praxis nicht möglich. So ist beispielsweise das radioaktive Label nicht durch ein Enzym- oder Fluoreszenzlabel ersetzbar, da diese bei der erforderlichen Ausfällung der Komplexe Rezeptor/Bindungspartner entweder mitgefällt oder desakti­ viert würden. Außerdem wird durch den Versuch einer Anfügung voluminöser organischer Reste als Label die Rezeptorbindefä­ higkeit bekannter TSH-Präparationen zu stark und unkontrol­ liert beeinträchtig.

Bisherige Rezeptorassays zur Bestimmung von anti-TSH-Rezep­ tor-Autoantikörpern waren daher zwangsläufig Radiorezeptoras­ says vom Präzipitationstyp, obwohl derartige Assays für den Anwender wie auch für den Produzenten mit einer Reihe von Nachteilen belastet sind, nämlich:

• 1. Ausschließlich radioaktive Verfahren bringen die bekannten sicherheitstechnischen Belastungen für Produzenten, Anwender und Umwelt mit sich.
• 2. Die zur Gebunden/Frei-Trennung erforderliche Zentrifuga­ tion zur Pelletierung des Niederschlags ist wesentlich zeit­ aufwendiger und unbequemer zu handhaben als andere, heute in der Immundiagnostik sehr verbreitete Methoden, wie z. B. die "Coated Tube"- und Mikrotiterplatten-Technologie.
• 3. Die Produktion des radioaktiv markierten TSH als Tracer ist kostenaufwendig und technisch schwierig. Zunächst muß das aus natürlichen Quellen gewonnene, in der Regel bovine TSH mehrstufig aufwendig gereinigt werden, was zu Lasten der spezifischen Rezeptor-Bindungsaktivität geht. Die erforderli­ che anschließende oxidative Radioiodierung reduziert die Bindungsaktivität weiter.
• 4. Die Wirksamkeit der Fällung sowie die unspezifische Pelle­ tierung des Tracer sind u. a. auch abhängig von der Zusammen­ setzung der Probe. Letztere variiert jedoch bei unterschied­ lichen Patientenseren, so daß bei diesem Test-Design die eigentlichen Meßwerte verfälscht werden können.

Zu den Vorteilen des bekannten Verfahrens gehört, daß in der Serumprobe vorhandenes endogenes humanes TSH nicht mit der Bindung des bovinen TSH an den in der Regel verwendeten porcinen TSH-Rezeptor interferiert. Die Affinität von bovinem TSH an porcinen TSH-Rezeptor ist die größte aller untersuch­ ten Kombinationen TSH/TSH-Rezeptor verschiedenen biologischen Ursprungs, so daß erwünscht ist, daß diese Vorteile auch bei neu zu schaffenden Tests genutzt werden können.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Ver­ fahren zur Bestimmung eines Analyten in einem Volumen einer flüssigen Probe zu schaffen, insbesondere ein Verfahren, das zum Typ der Rezeptorassays gehört, bei dem im Hinblick auf die Natur des Kompetitors für einen zu bestimmenden Analyten und die Methode zu seiner Markierung eine höhere Unabhängig­ keit des Tests von der Natur des Analyten und des zugehörigen Binders besteht und das es insbesondere ermöglicht, Rezeptor­ assays zu schaffen, die ohne einen Fällungsschritt auskommen und mit nahezu beliebiger Markierung arbeiten können.

Eine besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein nach einem solchen neuartigen Prinzip arbeitendes Verfahren zur Bestimmung von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern zu schaffen, das von den oben genannten Nachteilen des bekannten Verfahrens frei ist, gleichzeitig jedoch dessen Vorteile beibehält.

Diese Aufgaben werden durch Bestimmungsverfahren gemäß Pa­ tentanspruch 1 sowie die Ausgestaltung dieses Verfahrens gemäß Patentanspruch 15 gelöst.

Vorteilhafte Ausführungsformen dieser Verfahren sind in den nachgeordneten Unteransprüchen beschrieben.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen und Merkmale des Grund­ verfahrens und seiner speziellen Ausgestaltung zur Bestimmung von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.

Dabei wird zur Erläuterung und Veranschaulichung des Grund­ prinzips des Verfahrens auf Fig. 1 verwiesen.

Das erfindungsgemäße Verfahren löst die Grundaufgabe dadurch, daß man die Anwesenheit und Menge des zu bestimmenden Analy­ ten (A) indirekt mißt, indem man die eigentliche Konzentra­ tionsmessung als Messung der Konzentration des nicht an den Binder (B) gebundenen immobilisierten Kompetitors (K) durch­ führt, der direkt markiert ist oder insbesondere unter Aus­ bildung eines immobilisierten Sandwich mit einem zusätzlichen Antikörper (Mark) markierbar ist und dessen Menge mit der Menge des Analyten (A) in der zu untersuchenden Probe so korreliert ist, daß ein erhöhter Gehalt an Analyt (A) zu einer erhöhten Menge an gebundenem Kompetitor (K) bzw. gebun­ dener Markierung (Mark) führt.

Da es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht erforderlich ist, daß man die Markierung in dem Komplex aus Binder, z. B. Rezeptor, und Kompetitor findet, sondern die Markierung unabhängig von einem Komplex Binder/Analyt bzw. Kompetitor erfolgen kann, kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren jede Einschränkung im Hinblick auf die Verwendbarkeit bestimmter Label vermieden werden.

Aufgrund der indirekten Bestimmung des Analyten über eine Bestimmung eines nicht an den Binder gebundenen Kompetitors können die Anforderungen an die Reinheit und sonstigen Bin­ dungseigenschaften der Testreagenzien Binder und Kompetitor abgesenkt werden. Es ist für ein Funktionieren des Tests in erster Linie nur erforderlich, daß

• - das Ausmaß der Bindung der Kompetitors an den Binder, z. B. den Rezeptor, von der Anwesenheit des zu bestimmenden Analy­ ten hinreichend eindeutig beeinflußt wird - dieses Erforder­ nis ist in der Regel nur erfüllt, wenn der Binder ein spezi­ fischer Binder, z. B. auch ein Rezeptor, ist; und daß
• - die nicht gebundenen Anteile des Kompetitors so immobili­ siert werden können, daß es zu keiner gleichzeitigen Immobi­ lisierung und/oder Markierung der an den Binder gebundenen Anteile des Kompetitors kommen kann und die Bindung des Kompetitors an den Binder durch die Immobilisierung der ungebundenen Mengen des Kompetitors nicht nennenswert beein­ trächtigt wird.

Mit anderen Worten muß die Bindung des Kompetitors (z. B. des bovinem TSH bei der Bestimmung von anti-TSH-Rezeptor-Auto­ antikörpern) an den Binder (TSH-Rezeptor) im Vergleich zu der Bindung des Kompetitors an die feste Phase hinreichend begün­ stigt sein, d. h. der durch Wechselwirkung zwischen Binder und Kompetitor gebildete Komplex muß thermodynamisch und/oder kinetisch stabil genug sein, so daß es in Gegenwart der für die selektive Immobiliserung des Kompetitors verwendeten Substanz innerhalb der zur Anwendung kommenden gemeinsamen Inkubationszeiten nicht zu einer nennenswerten Freisetzung des bereits gebundenen Kompetitors aus dem genannten Komplex kommt. Zu erreichen ist das über eine richtige Auswahl der Konzentrationen der Testkomponenten und/oder die zeitliche Staffelung und Dauer der Inkubationen für die verschiedenen Reaktionen und/oder die Auswahl von solchen Antikörpern zur Immobilisierung und Markierung des nicht an den Binder gebun­ denen Kompetitors, die hinreichend niedrige Assoziations­ kinetiken aufweisen oder daß man unter Bedingungen arbeitet, die zu solchen Assoziationskinetiken führen.

Ferner muß sichergestellt werden, daß die an die feste Phase gebundene Markierung tatsächlich nur eine Markierung des nicht an den Binder gebundenen Kompetitors ist. Es muß mit anderen Worten gewährleistet werden, daß a) zu einer nachträgli­ chen Markierung des Kompetitors verwendete Antikörper oder Antikörperfragmente direkt an die auf der festen Phase immo­ bilisierten Antikörper zur Immobilisierung des Kompetitors binden und daß b) außerdem die Komplexe aus Binder und Kom­ petitor nicht an die feste Phase gebunden werden können oder, wenn sie gebunden werden sollten, nicht markiert werden. Die letztgenannte Anforderung ist dann erfüllt, wenn wenigstens einer der zur Immobilisierung und Markierung des Kompetitors verwendeten beiden Antikörper an ein solches Epitop des Kompetitors (bTSH) bindet, das durch die bevorzugte Bindung des Kompetitors an den Binder (des bTSH an den porcinen TSH-Rezeptor) blockiert ist.

Selbstverständlich müssen der Kompetitor und der Binder als Testkomponenten in solchen Mengen eingesetzt werden, daß eine effektive Konkurrenz des Kompetitors mit dem Analyten um die Bindungsstellen des Binders erfolgt. Es ist dabei aber nicht nötig, daß Kompetitor und Analyt um die gleiche Bindungs­ stelle direkt konkurrieren, es ist vielmehr ausreichend, daß die Bindung des Kompetitors durch eine Bindung des Analyten an den Binder in eindeutiger Weise vermindert wird. Dann wird ein erhöhter Anteil an ungebundenem Kompetitor in der flüssi­ gen Phase erhalten, der die Konzentration des Analyten in der flüssigen Reaktionsmischung widerspiegelt und daher an­ schließend durch Bindung an eine feste Phase und Markierung bestimmt werden kann.

Aufgrund der Proportionalität zwischen Antikörperkonzentra­ tion und nicht an den Binder gebundenen und dafür an der Festphase immobilisierten und markierten Kompetitor ermög­ licht das erfindungsgemäße Verfahren eine quantitative Mes­ sung der Konzentration des Analyten in der flüssigen Probe, wobei selbstverständlich wie bei derartigen Tests üblich ein gemessener Wert mit einer unter Verwendung von Eichsubstanzen erstellten Eichkurve verglichen wird.

Das Verfahren kann jedoch auch als einfacher qualitativer Ja/Nein-Test durchgeführt werden, indem relativ kleine Mengen an Binder und Kompetitor eingesetzt werden, so daß bei den in einer Probe zu erwartenden Analytkonzentrationen stets mit einer vollständigen Verdrängung des Kompetitors vom Binder zu rechnen ist und das dann erhältliche, mehr oder weniger konstante Signal des immobilisierten Kompetitors ein Signal für "Anwesenheit des Analyten" darstellt.

Daß die verschiedenen obigen Anforderungen an die Komponenten des Bestimmungsverfahrens in der Praxis verwirklichbar sind, zeigt das folgende konkrete Ausführungsbeispiel für die Durchführung dieses Verfahrens als Verfahren zur Bestimmung von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern.

Im Zusammenhang mit der Beschreibung des genannten konkreten Verfahrens wird Bezug genommen auf Figuren, die zeigen:

Fig. 1 ein schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Grundverfahrens mit seinen erforderlichen Testkomponenten am Beispiel der Bestimmung von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikör­ pern;

Fig. 2 die von der Konzentration eines zugesetzten bTSH ab­ hängige Bindung eines markierten TSH-Antikörpers an eine mit einem anderen TSH-Antikörper beschichtete Festphase in Form einer Wand eines Teströhrchens;

Fig. 3 die Verminderung des Meßsignals im System gemäß Fig. 2 bei Vorinkubation mit einem porcinen TSH-Rezeptor;

Fig. 4 die Aufhebung der rezeptorbedingten Verminderung des Meßsignals gemäß Fig. 3 durch Zusatz von Patientenserum mit anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern, wobei ansteigenden Mengen an Autoantikörpern ansteigende Mengen an immobilisiertem und markiertem bTSH entsprechen;

Fig. 5 die Ergebnisse einer Messung von Serumkollektiven von Morbus Basedow-Patienten und Gesunden nach dem erfindungs­ gemäßen Verfahren, und

Fig. 6 eine Korrelation der nach dem erfindungsgemäßen Ver­ fahren erhaltenen Meßwerte mit den Meßwerten eines in der Praxis erprobten traditionellen Tests zur Bestimmung von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern.

Zur Prüfung der Frage, ob anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörper in der Praxis nach einem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren bestimmt werden können, wurden unter Verwendung der folgenden Materialien und Methoden verschiedene Versuche durchgeführt.

Material und Methoden

1. Teströhrchen
Zur Herstellung einer Festphase zur Immobilisierung des als Kompetitor verwendeten bTSH wurden Polystyrol-Stern-Röhrchen (NUNC) mit 1,0 µg monoklonalem, im Handel erhältlichem anti- TSH-Antikörper (Antikörper Nr. 5405 der Fa. MEDIX, Finnland) pro 300 µl 0,1 M NaHCO₃, pH 8,0 beschichtet (15 Stunden, Zimmertemperatur), und anschließend wurde wie an sich bekannt mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA)/3% Karion/0,005% NaN₃ abgesättigt und lyophilisiert.

Der spezielle anti-TSH-Antikörper ist lt. Hersteller spezi­ fisch für hTSH bzw. die beta-Subunit von hTSH und hat eine Affinitätskonstante von 5 × 10⁹ l/mol hTSH. Er ist in vitro hergestellt und ist im Handel als affinitätsgereinigte Ig- Fraktion in 0,15 mol/l NaCl mit einem Gehalt von 0,1% NaN₃ (Proteinkonzentration 0,02 mg/ml) erhältlich.

2. Als Kompetitor verwendetes bovines TSH-Präparat
Es wurde ein handelsübliches TSH-Präparat mit der Bezeichnung "Thytropar" der Fa. Rorer Pharmaceuticals in einer Menge von 100 µU pro Bestimmung verwendet.

3. Als Binder verwendeter porciner TSH-Rezeptor
Es wurde ein porciner TSH-Rezeptor verwendet, der einen cruden Detergenz-Extrakt aus Schweineschilddrüsenmembranen darstellt, dessen Präparation in der Literatur beschreiben ist (vgl. z. B. Bernard Rees Smith und Hall in Meth. Enzym. 74, Seiten 405 bis 420, 1981 oder Patentschrift DE 42 37 430 C1 der Anmelderin). Der porcine TSH-Rezeptor wurde in einer gegenüber üblichen bekannten Bestimmungsverfahren vierfach erhöhten Konzentration eingesetzt.

4. Markierter Antikörper zur Markierung eines immobilisierten bTSH-Kompetitors.
Ein im Handel erhältlicher monoklonaler anti-bTSH-Antikörper aus der Maus, von dem bekannt ist, daß er bTSH in einem anderem Epitop bindet als der zur Beschichtung der Teströhr­ chen verwendete Antikörper (monoklonaler anti-bTSH-Antikörper 920831-52 der Fa. CLB, Amsterdam, Niederlande), wurde nach bekannten Methoden mit Acridiniumester in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 markiert. Nicht an den Antikörper gebun­ denes Acridiniumesterlabel wurde durch Gelfiltration abge­ trennt. Für die Durchführung des Tests wurde der erhaltene Tracer auf eine Konzentration von 200.000 RLU (Relative Light Units) pro 200 µl 10 mM Tris/HCl pH 7,5/0,1% BSA/0,4 mg/ml Maus IgG/0,4 mg/ml bovines IgG eingestellt.

Es ist davon auszugehen, daß die Verwendung dieses genannten Antikörpers genauso wenig kritisch ist wie die des zuerst genannten. Die Eignung möglicher anderer, auf an sich be­ kannte Weise durch Immunisierung (z. B. mit bTSH) von Testtie­ ren und anschließende übliche Selektion erhältlicher monoklo­ naler Antikörperpaare läßt sich auf die in den nachfolgenden Versuchen 1 und 2 beschriebene Weise einfach testen.

Unter Verwendung der obigen Materialien wurden die folgenden Versuche durchgeführt:

Versuch 1

Als Vorversuch wurde festgestellt, ob unter Verwendung der für die Beschichtung der Teströhrchen und zur Herstellung des Tracers verwendeten monoklonalen Antikörper ein an eine Festphase gebundener bTSH-Sandwich herstellbar ist. Zu diesem Zweck wurden in die wie oben beschrieben hergestellten Test­ röhrchen unterschiedliche Mengen an bovinem TSH zusammen mit 200.000 RLU des wie oben hergestellten Tracers in einem Volumen von 300 µl in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) unter Schütteln bei 300 Umdrehungen/min inkubiert. An­ schließend erfolgte die Gebunden/Frei-Trennung auf an sich bekannte Weise und die Messung der Festphasenlumineszenz. Die an die Teströhrchen gebundene Lumineszenz wurde mit einem LP 952 T-Luminometer der Fa. Bertold gemessen.

Fig. 2 zeigt, daß mit steigenden Mengen an bTSH steigende Mengen an Tracer immobilisiert werden, d. h. daß unter Ver­ wendung der beiden ausgewählten Antikörper ein Sandwich herstellbar ist.

Versuch 2

Prüfung des Einflusses der Anwesenheit einer TSH-Rezeptor- Präparation auf die in der "Sandwich"-Reaktion gemäß Versuch 1 meßbare Menge an bovinem TSH.

Es wurde wie folgt vorgegangen:

• 1. Es wurden variable Mengen an crudem porcinem TSH-Rezeptor (50 µl, aus TSH-Rezeptor-Reagenz TRAK-Assay Henning Berlin) in die mit monoklonalem anti-TSH-Antikörper beschichteten Teströhrchen pipettiert.
• 2. Anschließend wurden 25 µl an bovinem TSH (Thytropar, Fa. Rorer, 100 µU in PBS) pipettiert.
• 3. Anschließend wurden 200 µl markierter monoklonaler anti- TSH-Antikörper (Lumineszenz-markiert; 200.000 RLU in PBS) zupipettiert.

Anschließend wurde unter Schütteln bei 300 U/min und Raumtem­ peratur zwei Stunden inkubiert, wonach die Gebunden/Frei- Trennung, ein Waschen der Festphase und die Messung der festphasengebundenen Lumineszenz wie in Fig. 1 erfolgte.

Wie Fig. 3 zeigt, führt die Anwesenheit der porcinen TSH- Rezeptor-Präparation zu einer Verminderung der an der Fest­ phase immobilisierbaren und markierbaren bTSH-Menge, was beweist, daß die Menge an bTSH in der Lösung durch Bindung an den zugesetzten Rezeptor vermindert wurde.

Versuch 3

Dem Testsystem gemäß Versuch 2 wurden definierte Mengen an anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern zugesetzt. Eine Autoanti­ körper-Konzentrationseinheit entspricht einem Serum mit einem Antikörpertiter von 350 U/l. Ein derartiges Serum wurde mit einem antikörperfreien Serum verdünnt und dem Reagenziensy­ stem gemäß Versuch 2 zugesetzt.

Im einzelnen wurde der nunmehr vollständige Test, der in dieser Form sowohl zur Eichung mit bekannten Proben als zur Vermessung unbekannter Proben durchgeführt werden kann, wie folgt durchgeführt:

In unbeschichtete Teströhrchen wurden zuerst pipettiert: 50 µl des porcinem TSH-Rezeptors sowie 50 µl der antikör­ perhaltigen Serumprobe.

Es folgte eine fünfzehnminütige Inkubation bei Zimmertempera­ tur. Dann wurden hinzupipettiert 25 µl bTSH (100 µU).

Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden 100 µl der flüssigen Reaktionsmischung in die beschichteten Teströhrchen überführt, die mit dem monoklonalen anti-TSH- Antikörper 5405 beschichtet waren, und es wurden 200 µl des mit dem Acridiniumester markierten zweiten anti-bTSH-Antikör­ pers zum Aufbau des Sandwich zugesetzt.

Es wurde drei Stunden bei Zimmertemperatur unter Schütteln bei 300 U/min inkubiert und unter Verwendung einer handels­ üblichen Lumitest-Waschlösung der Fa. Henning Berlin gewa­ schen. Anschließend wurde die an die Teströhrchen gebundene Lumineszenz wie in Versuch 1 mit dem LB 952 T-Luminometer der Fa. Bertold gemessen.

Fig. 4 zeigt die Erhöhung der Konzentration des an die Wand des Teströhrchens gebundenen Lumineszenzmarkers in Abhängig­ keit von den Mengen an zugesetztem anti-TSH-Rezeptor-Auto­ antikörper.

Versuch 4

Zur Bestimmung der klinischen Wertigkeit wurden Seren, deren Spender als "Morbus Basedow-krank" klassifiziert sind, nach dem unter Versuch 3 beschriebenen Inkubationsprotokoll nach dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren gemessen. Außerdem wurden Seren von Schilddrüsengesunden, die frei von anti- TSH-Rezeptor-Autoantikörpern waren, vermessen.

Fig. 5 zeigt klar, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine klare Unterscheidung zwischen gesunden und Morbus Base­ dow-Patienten möglich ist.

Die bei der Messung der antikörperhaltigen Seren nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Werte wurden ferner mit Meßergebnissen eines anerkannten, in der Praxis einge­ führten Vergleichsverfahrens (TRAK-Assay der Fa. Henning Berlin) verglichen.

Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt. Es ist zu erkennen, daß die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den nach dem bekannten Bestimmungsverfahren erhaltenen Ergebnis­ sen korrelierbar sind. Autoantikörperfreie, negative Seren (< 15 U/l) werden im erfindungsgemäßen Test wie im bekannten Test niedrig gemessen, autoantikörperhaltige, positive Seren werden auch im erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren in der Regel mit größeren Werten gemessen. Die in Fig. 6 gezeigten Ergebnisse dokumentieren die klinische Wertigkeit des neuen Bestimmungsverfahrens in der beschriebenen praktischen Aus­ führungsform.

Bei dem oben beschriebenen Bestimmungsverfahren erfolgt eine Vorinkubation von Binder (cruder porciner TSH-Rezeptor aus Schweineschilddrüsen) mit der Probe (Patientenserum) sowie dem Kompetitor (crudem bovinem TSH) in einem Teströhrchen.

Die flüssige Reaktionsmischung wird dann in ein Teströhrchen überführt, das eine Beschichtung zur selektiven Bindung derjenigen Anteile des Kompetitors aufweist, die nicht an den Binder gebunden sind (Beschichtung mit einem monoklonalen anti-bTSH-Antikörper), und gleichzeitig wird dem Röhrchen der zweite, markierte Antikörper (Lumineszenzmarkierter monoklo­ naler anti-bTSH-Antikörper) zugesetzt. Dieser ist so ausge­ wählt, daß er nicht an den vom Binder gebundenen Kompetitor (an den Rezeptor gebundenes bTSH) oder den zweiten, an der Teströhrchenwand immobilisierten anti-bTSH-Antikörper bindet.

Nach der Inkubation wird gewaschen und die Lumineszenz an der Röhrchenwand gemessen. Die Menge des so nachgewiesenen bTSH ist proportional zur Menge des Analyten in der Patienten­ probe.

Der geschilderte Reaktionsablauf ist im einzelnen bezüglich Konzentration der Komponenten, Pipettierreihenfolge usw. jedoch variierbar.

Gegenüber dem eingangs geschilderten Bestimmungsverfahren für anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörper weist das erfindungsgemäße Verfahren folgende Vorteile auf:

• 1. Zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Test muß das als Kompetitor verwendete bovine TSH weder gereinigt noch mar­ kiert werden, sondern es kann das in einem Schritt aus Rin­ derhypophysen als crudes Homogenat extrahierte bovine TSH eingesetzt werden. Damit vermindert sich die Gefahr eines Aktivitätsverlusts durch spezielle Reinigungs- und Markie­ rungsschritte, und es ist ein Maximum an spezifischer Rezep­ tor-Bindungsaktivität gewährleistet.
• 2. Anders als bei den bekannten Verfahren erfolgt die Gebun­ den/Frei-Trennung nicht durch Zentrifugation, sondern durch einfaches, an sich bekanntes Waschen der Teströhrchen. Das ist schneller, preiswerter und bequemer und stellt damit einen erheblichen Handling-Vorteil für den Anwender dar.

Die bei dem bekannten Test existierende Beschränkung auf die Verwendung von radioaktiven Labels besteht bei dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren nicht. Da der Kompetitor nicht direkt markiert werden muß, muß keine Rücksicht auf die Beeinträch­ tigung der Rezeptor-Bindungsaktivität des Kompetitors genom­ men werden. Die Markierung eines Antikörpers als Tracer ist sehr viel unproblematischer als die von bTSH als Kompetitor. Die Wechselwirkung eines Antikörpers mit einem Antigen er­ folgt unter Beteiligung nur eines kleinen Teils des Antikör­ pers, wodurch ein grober Teil des Antikörpers chemisch ver­ ändert werden kann, ohne daß dies dessen Immunreaktivität beeinflußt. Die Rezeptorbindung ist demgegenüber sehr viel komplexer und sehr viel empfindlicher gegenüber äußeren Einwirkungen, wie sie durch das Einbringen eines Labels bewirkt werden können.

• 4. Da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht zentrifugiert wird, treten keine dadurch bedingten Meßfehler auf, die beispielsweise auf unterschiedliche Proteinkonzentrationen in den zu vermessenden Proben und eine davon abhängige unspezi­ fische Pelletierung des Tracers zurückzuführen sind und bei dem bekannten Verfahren vorkommen können.

Claims (17)

1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einem Volumen einer flüssigen Probe, bei dem man die Probe unter Bildung einer flüssigen Reaktionsmischung versetzt mit einem oder mehreren Bestimmungsreagenz(ien), das enthält bzw. die ent­ halten

• a) eine vorgegebene Menge eines Binders (B) für den Analyten
• b) eine vorgegebene Menge eines Kompetitors (K), der eben­ falls von dem Binder (B) gebunden wird, und zwar so, daß das Ausmaß seiner Bindung an den Binder (B) mit der gleichzei­ tigen Anwesenheit des Analyten (A) und/oder dessen Menge in der Probe korreliert ist, wobei der Kompetitor (K) mit einem Label markiert ist oder markierbar ist, das seine qualitative und/oder quantitative Bestimmung ermöglicht, dadurch gekennzeichnet, daß man
• c) die flüssige Reaktionsmischung gleichzeitig oder zeitlich nachgeordnet mit einer Festphase umsetzt, an die eine Sub­ stanz (Imm) für die selektive Immobilisierung der nicht an den Binder (B) gebundenen Menge des Kompetitors (K) gebunden ist, sowie gegebenenfalls einem markierten Umsetzungspartner (Mark) für den immobilisierten Kompetitor (K), und daß man nach einer quantitativen Trennung der Festphase von der flüssigen Reaktionsmischung auf an sich bekannte Weise die Menge des an die Festphase gebundenen Kompetitors (K) anhand eines physikalischen und/oder chemischen Nachwei­ ses des an diesen gebundenen Labels bestimmt und die ermit­ telte Menge des Kompetitors (K) mit der Anwesenheit und/oder Menge des Analyten (A) in der ursprünglichen Probe korre­ liert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Zugabe der Festphase die flüssige Reaktionsmi­ schung aus Probenflüssigkeit und den Bestimmungsreagenzien gemäß a) und b) so lange gemeinsam inkubiert, daß die Konzen­ trationen des Analyten (A) und des Kompetitors (K), die nicht an den Binder (B) gebunden sind, im wesentlichen konstante Werte erreicht haben.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß der Kompetitor (K) während seiner Bindung an die Festphase oder im Anschluß daran mit einem markierten Umset­ zungspartner (Mark), der an den immobilisierten Kompetitor (K) bindet, jedoch nicht an die Festphase, markiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den markierten Umsetzungspartner (Mark) in Form eines weiteren flüssigen Reagenz einsetzt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Kompetitor (K) oder der markierte Umsetzungspartner (Mark) mit einem radioaktiven Isotop, einem Enzym, einem Substrat einer Enzymreaktion, einem Fluoreszenz­ label oder einem Chemilumineszenzlabel direkt markiert sind.

6. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß der Analyt (A) eine biologisch aktive Substanz mit Antigen- oder Haptencharakter ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt (A) ein Antikörper oder Autoantikörper ist.

8. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß der Kompetitor (K) eine biologisch aktive Substanz mit Antigen- oder Haptencharakter ist.

9. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß der Binder (B) ein aus biologischem Material gewonnener oder gentechnologisch hergestellter biologischer Rezeptor für den Kompetitor (K) oder den Analy­ ten (A) ist.

10. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß man es als Verfahren zur Bestimmung der Gesamtmenge des in der Probe vorhandenen Analyten (A) durchführt.

11. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß die Substanz (Imm) für die selekti­ ve Immobilisierung des nicht an den Binder (B) gebundenen Kompetitors (K) ein monoklonaler Antikörper gegen den Kom­ petitor (K) ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Umsetzungspartner (Mark) zur Markierung des immobilisierten Kompetitors (K) ein mono­ klonaler Antikörper gegen den Kompetitor (K) oder ein Anti­ körperfragment ist, dessen Bindung an den Kompetitor (K) durch die Immobilisierung des Kompetitors (K) an der Fest­ phase nicht beeinträchtigt wird bzw. diese Immobilisierung nicht stört.

13. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß die Substanz (Imm) zur Immobilisie­ rung des Kompetitors (K) und der markierte Umsetzungspartner (Mark) so ausgewählt sind, daß a) eine Immobilisierung und/- oder Markierung derjenigen Anteile des Kompetitors (K), die an den Binder gebunden sind, verhindert wird, und/oder daß sie b) nicht zu einer Freisetzung der gebundenen Anteile des Kompetitors (K) aus seiner Bindung an den Binder (B) führen.

14. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß man als Festphase die Wand eines beschichteten Teströhrchens verwendet.

15. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß man es als Verfahren zur Bestimmung von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern (A) in einem Patienten­ serum durchführt, indem man

• - als Binder (B) eine standardisierte oder im Zusammenhang mit der Durchführung des Bestimmungsverfahrens eichbare TSH- Rezeptor-Präparation,
• - als Kompetitor (K) eine standardisierte oder im Zusammen­ hang mit der Durchführung des Bestimmungsverfahrens eichbare TSH-Präparation,
• - als Substanz (Imm.) für die selektive Immobilisierung an die Festphase einen ersten monoklonalen anti-TSH-Antikörper und
• - als markierten Umsetzungspartner (Mark) einen weiteren monoklonalen anti-TSH-Antikörper oder ein markiertes Fragment eines solchen Antikörpers verwendet, der unter Aufbau eines TSH-Sandwich an einen anderen Bereich des immobilisierten Kompetitors (K) TSH bindet als der zur Immobilisierung ver­ wendete erste Antikörper und eine Markierung in Form eines nicht-radioaktiven Labels aufweist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der TSH-Rezeptor als Binder (B) in Form einer porcinen TSHr- Präparation eingesetzt wird und der Kompetitor (K) in Form einer bovinen TSH-Präparation eingesetzt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die porcine TSH-Rezeptor-Präparation in Form eines cruden Extrakts aus porcinen Schilddrüsenmembranen eingesetzt wird und die bovine TSH-Präparation ebenfalls in cruder Form eingesetzt wird.