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DE10302405A1 - Verfahren zum Nachweis der Wirkung von Substanzen auf Funktion und Masse der Insulin produzierenden Betazellen - Google Patents

Verfahren zum Nachweis der Wirkung von Substanzen auf Funktion und Masse der Insulin produzierenden Betazellen Download PDF

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DE10302405A1
DE10302405A1 DE2003102405 DE10302405A DE10302405A1 DE 10302405 A1 DE10302405 A1 DE 10302405A1 DE 2003102405 DE2003102405 DE 2003102405 DE 10302405 A DE10302405 A DE 10302405A DE 10302405 A1 DE10302405 A1 DE 10302405A1
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rap
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Dieter Priv.-Doz. Dr.med. Hörsch
Jutta Trümper
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Philipps Universitaet Marburg
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Philipps Universitaet Marburg
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Nachweisverfahren, mit dem die Wirkung verschiedener Aktivierungseffektoren hinsichtlich Funktion und Masse der insulinproduzierenden beta-Zellen in späten Phasen des Diabetes mellitus Typ II getestet wird.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Nachweisverfahren zur Wirkung verschiedener Substanzen, die als Aktivierungseffektoren bekannt sind, auf die Funktion und Masse der insulinproduzierenden beta-Zellen in späten Phasen des Diabetes mellitus Typ II.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Beim Diabetes mellitus Typ II kommt es in späten Krankheitsphasen zu einer Verminderung der Masse und Funktion insulinproduzierender beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse. Ein neuer Therapieansatz ist daher die Verabreichung spezifischer Stoffe, die als Aktivierungseftektoren den Zelltod verhindern und eine Steigerung der Proliferation der beta-Zellen bewirken. Als Aktivierungseffektoren sind vor allem die Peptidhormone Insulin, Glucagon und gastrisches Peptid (GIP) bekannt, die in einem bislang noch nicht vollständig aufgeklärten, sehr komplexen Regulationsnetzwerk den Glucose-Metabolismus durch gegenseitige Beeinflussung regulieren. Es ist bekannt, dass das Glucagon-like-Peptid (GLP-1) die Insulinsekretion stimuliert (WO 9325579). Die DE 691 29 226 T2 und die DE 689 29 217 T2 beschreiben dazu verschiedene GLP-1- Analoga, die eine verbesserte Glucose-induzierte Insulinfreisetzung und eine Glucose-induzierte Hemmung der Glucagonsekretion auslösen sollen. Allerdings sind die Assays zum Nachweis dieser Eigenschaften sehr zeitaufwendig und mühsam und können auf Grund mangelnder Kenntnisse bezüglich des Regulationsnetzwerkes des Glucose-Metabolismus nicht unter idealen Bedingungen durchgeführt werden.
  • Allerdings gibt es noch kein standardisiertes Nachweisverfahren, um die Wirksamkeit dieser Substanzen auf Funktion und Masse der beta-Zellen unter zellnahen Bedingungen zu testen und ihre Wirkung besonders in den späten Phasen des Diabetes mellitus Typ II, also bei einem Versiegen der Insulinsekretion, zu überprüfen.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die beschriebenen Nachteile im Stand der Technik zu beseitigen und ein geeignetes Verfahren zum Nachweis der Wirkung verschiedener Substanzen auf Funktion und Masse der insulinproduzierenden beta-Zellen bereitzustellen.
  • Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 gelöst.
  • Im komplexen Regulationsnetzwerk des Glucose-Metabolismus gehören zu den Aktivierungseftektoren, die den Zelltod verhindern und eine Steigerung der Proliferation der beta-Zellen bewirken, auch die GTPasen ras und rap. Sie können in zwei biochemisch verschiedenen Zuständen vorkommen, in der GDP-gebundenen inaktiven Form und der GTP-gebundenen aktiven Form. Ras ist auch als starker Aktivator der mitogenen Signalkaskade bekannt, was sich tragischerweise darin zeigt, dass 15 % aller menschlichen Tumoren ras-Mutationen tragen. Rap ist ein Antagonist zu ras, da es dessen oncogene Signale über Hemmung des ras-Effektor raf-1 und MAPK (Mitogen activated protein kinase)-Aktivierung zu unterdrücken vermag.
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass ras und rap auf besondere Weise die Funktion und Masse der insulinproduzierenden beta-Zellen in der Bauchspeicheldrüse steuern. Sie werden in den beta-Zellen gemeinsam mit ihren downstream Kinasen raf-1 und B-raf exprimiert. Entscheidend ist, dass ihre Funktion bei der GLP-1-induzierten Steuerung der Insulinproduktion durch die beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse nicht starr festgelegt, sondern Glucose-abhängig geregelt ist. Bei Stimulation der beta-Zellen mit GLP-1 bei hohem Glucosegehalt (bis 15 mM Glucose) und in Gegenwart von GLP-1 zeigt sich eine Glucose-abhängige synergistische Aktivierung der Signalkaskade durch MAPK (mitogen activated protein kinase) und CREB (cAMP response element binder). Bei niedrigem Glucosegehalt (bis 2.5 mM Glucose) hat rap nur noch einen geringen Einfluss bei der Aktivierung der Signalkaskade durch MAPK (mitogen activated protein kinase) und CREB (cAMP response element binder) oder wirkt sogar als Inhibitor.
  • Folgende Ergebnisse aus Experimenten erläutern den Erfindungsgegenstand:
    • Ergebnis 1: MAPK und CREB-Signalkaskade werden synergistisch durch Glucose und GLP-1 in INS-1E-Zellen und humane Inselzellen aktiviert.
    • Ergebnis 2: rap und ras beeinflussen die Aktivierung von MAPK und CREB in INS-1 E-Zellen und humanen Inselzellen.
    • Ergebnis 3: rap und ras wirken auf die Aktivierung von MAPK und CREB in INS-1 E-Zellen.
    • Ergebnis 4: rap und ras haben Signalwirkung in INS-1 E-Zellen
    • Ergebnis 5: MAPK und CREB werden Glucose-abhängig durch PI3K und PKB nach Stimulation mit GLP-1 in INS-1 E-Zellen aktiviert.
  • Ergebnis 1 belegt, dass MAPK und CREB-Signalkaskade synergistisch durch Glucose und GLP-1 in INS-1E-Zellen und humanen Inselzellen aktiviert werden. Die INS-1E-Zellen werden mit elk-1 oder CREB Transaktivatorplasmid transfiziert und die Aktivierung von elk-1 oder CREB durch die Luziferaseaktivität des cotransfizierten Reporterplasmid (Firma Strategene) sichtbar. Die INS-1 E-Zellen werden 16 h mit verschiedenen Glucosekonzentrationen in Gegenwart von 10 nM GLP-1 stimuliert. Die gemessene Luziferase-Aktivität der INS-1 E-Zellen stimuliert mit 2.5 mM Glucose ohne GLP-1 wird als 1 gesetzt.
  • Die humanen Inselzellen werden in 2.5 mN oder 15 mM Glucose equilibriert und mit 10 nM GLP-1 für 10 Minuten stimuliert. Anschließend werden MAPK Assays mit 5 μg Zellysat und GST-EERK-2 und Myelin basic Protein (MBP) (Upstate Biotechnoloy, Waltham, MA) als Substrat durchgeführt. Die Phosphorylierung von GST-ERK-2 (New England Biolabs, Beverly, MA) und MBP wird durch Immunoblotting mit Phosphorylierungs-spezifischen Antikörpern (Upstate Biotechnoloy, Waltham, MA) nachgewiesen.
  • Die CREB Aktivierung erfolgt durch Glucose und GLP-1 in humanen Inselzellen. Gleiche Mengen an Inselzellen wie oben genannt werden stimuliert, die Zellen werden lysiert und 10 μg Protein wird auf einem SDS-PAGE elektrophoretisch getrennt und im Western-Verfahren geblottet. Die Menge an CREB-Phosphorylierung wird durch Aktivierungs-spezifische Antikörper für pCREB Ser133 (New England Biolabs, Beverly, MA) nachgewiesen.
  • Ergebnis 2 beweist den Einfluss von rap und ras auf die Aktivierung von MAPK und CREB in INS-1 E-Zellen und humanen Inselzellen. INS-1 E-Zellen werden mit elk-1 oder CREB Transaktivatorplasmiden transfiziert. Zusätzlich werden die INS-1 E-Zellen mit einem Kontrollplasmid oder verschiedenen Kombinationen von Expressionsvektoren, die für Wildtyp ras, rap, raf-1 und B-raf kodieren transfiziert (lacovelli L, Capobianco L, Salvatore L, Sallese M, D'Ancona GM und De Blasi A, Molecular Pharmacology 2001, 60: 924–33). Die INS-1E-Zellen werden für 16 h mit verschiedenen Glucose-Konzentrationen und 10 nM GLP-1 stimuliert. Die Aktivierung von elk-1 oder CREB ist durch Luziferaseaktivität eines cotransfizierten Reporterplasmid sichtbar. Die Luziferaseaktivität der mit einem Kontrollplasmid transfizierten INS-1 E-Zellen wird bei den verschiedenen Stimulationskonditionen als 1 gesetzt. Zur Aktivierung von MAPK in humanen Inselzellen werden humane Inselzellen in 2.5 mN oder 15 mM Glucose equilibriert und mit 10 nM GLP-1 für 10 Minuten stimuliert. Anschließend werden die Zellen lysiert und mit 10 mg Protein wird eine Immunpräzipitation mit Antikörpern für raf-1, B-raf H-ras und rap 1 durchgeführt (bezogen über Beckton Dickinson, Heidelberg und Santa Cruz, Biotechnology, CA). MAPK Assays werden mit GST-EERK-2 (beschrieben bei lacovelli L, Capobianco L, Salvatore L, Sallese M, D'Ancona GM und De Blasi A, Molecular Pharmacology 2001, 60: 924–33) und MBP als Substrate durchgeführt. Die Phosphorylierung von GST-ERK-2 und MBP wird durch Immunoblotting mit Phosphorylierungs-spezifischen Antikörpern (New England Biolabs) nachgewiesen. Zum Nachweis der Bindung von aktivem ras und rap an raf-1 und B-raf werden humane Inselzellen stimuliert, lysiert und die Zell-Lysate über Sepharose-beads, die das GST-Fusionsprotein raf-1-RBD (beschrieben bei lacovelli L, Capobianco L, Salvatore L, Sallese M, D'Ancona GM und De Blasi A, Molecular Pharmacology 2001, 60: 924–33) zur Detektion des aktiven ras und Ral-GDS-RBD für die Detektion von aktivem rap tragen, aufgereinigt. Die Proteine werden auf einem SDS-PAGE elektrophoretisch getrennt, und das GTP-gebundene aktive ras und rap wird durch Immunoblotting mit Antikörpern gegen ras und rap nachgewiesen. Als Kontrolle dienen Ansätze für rap und ras mit gleichen Mengen an Zell-Lysat. Die Aktivierung von MAPK und CREB durch ras und rap erfolgt bei verschiedenen Stimulationskonditionen.
  • Ergebnis 3 zeigt die Interaktion zwischen rap und ras auf die Aktivierung von MAPK und CREB in INS-1 E-Zellen. INS-1 E-Zellen werden mit elk-1 oder CREB Transaktivatorplasmiden transfiziert. Zusätzlich werden die INS-1 E-Zellen mit einem Kontrollplasmid oder verschiedenen Kombinationen von Expressionsvektoren, die für aktiviertes ras (H-rasQ61L), aktiviertes rap (H-rapG12V) oder negativ dominantes ras (H-rasS17N) oder rap (H-rapS17N) kodieren transfiziert. Die INS-1E-Zellen werden für 16 h mit verschiedenen Glucose-Konzentrationen und 10 nM GLP-1 stimuliert. Die Aktivierung von elk-1 oder CREB ist durch Luziferaseaktivität eines cotransfizierten Reporterplasmid sichtbar. Die Luziferaseaktivität der mit einem Kontrollplasmid transfizierten INS-1E-Zellen wird bei den verschiedenen Stimulationskonditionen als 1 gesetzt. Die Aktivierung von MAPK und CREB durch aktiviertes und negatives ras und rap erfolgt bei verschiedenen Stimulationsbedingungen.
  • Ergebnis 4 zeigt den Mechanismus der Signalwirkung von rap und ras in INS-1E-Zellen. Die Transfektion der INS-1 E-Zellen erfolgt mit elk-1 oder CREB Transaktivatorplasmiden. INS-1 E-Zellen werden mit aktiviertem ras und aktiviertem rap transfiziert. Die Zellen werden anschlie ßend mit Wortmannin behandelt oder cotransfiziert mit PKI, dominant negative GEFII (N. Ozaki. et al. Nat. Cell. Biol. 2, 805 (2000)) oder raf-1. Die INS-1 E-Zellen werden für 16 h mit verschiedenen Glucose-Konzentrationen und 10 nM GLP-1 stimuliert. Die Aktivierung von elk-1 oder CREB ist durch Luziferaseaktivität eines cotransfizierten Reporterplasmid sichtbar. Die Luziferaseaktivität der mit aktiviertem rap oder ras transfizierten INS-1 E-Zellen wird bei den verschiedenen Stimulationskonditionen als 1 gesetzt. Das Zusammenwirken von GEFII, PI3K, PKA und raf-1 im Fall von MAPK und CREB Aktivierung durch ras und rap erfolgt bei den verschiedenen Stimulationskonditionen.
  • Ergebnis 5 zeigt die Glucose-abhängige Aktivierung von MAPK und CREB durch PI3K und PKB nach Stimulation mit GLP-1 in INS-1 E-Zellen. INS-1 E-Zellen werden mit elk-1 (A) oder CREB (B) Transaktivatorplasmiden transfiziert. Zusätzlich werden die INS-1 E-Zellen mit einem Kontrollplasmid oder aktiviertem p110a (p110 aCAAX) oder PKBa (PKBmyr) (Upstate) transfiziert. Die INS-1 E-Zellen werden für 16 h mit verschiedenen Glucose-Konzentrationen und 10 nM GLP-1 stimuliert. Die Aktivierung von elk-1 oder CREB ist durch Luziferaseaktivität eines cotransfizierten Reporterplasmid sichtbar. Die Luziferaseaktivität der mit einem Kontrollplasmid transfizierten INS-1 E-Zellen wird bei den verschiedenen Stimulationskonditionen als 1 gesetzt.
  • Zusammenfassend belegen die Ausführungsbeispiele, dass Glucose und das Peptidhormon GLP-1 synergistisch die Insulinsekretion in den beta-Zellen stimulieren und eine Vielzahl der beta-Zellfunktionen, wie Wachstum, Insulinbiosynthese, Expression früher Gene, Aktivierung der mitogenen Signalkaskade durch MAPK, PKA, CREB, PKB koordinieren. Eine wichtige Funktion haben dabei die GTPasen ras und rap.
  • Ausführungsbeispiele
    • 1. Transfektion der Inselzellen INS-1 E Zellen (Asfari et al. vide sura; Passage 30–40) werden auf 96 well Zell-Kulturschalen übertragen und mit RPMI 1640 Medium (Gibco) mit 10% Kälberserum (Sigma, Deisenhofen, FRG) kultiviert. Die Methode wurde beschrieben in Trümper K, Trümper A, Trusheim N, Arnold R, Goke B und Hörsch D: Annals of the New York Academy of Sciences 2000, 921: 242–50. Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen und mit einem kommerziell erhältlichen Luciferase Reportergen (pFR-Luc) und entweder ELK1 (pFA-2-EIk1) oder CREB (pFA-CREB) Transactivatordomäne (Stratgene, La Jolla, CA) durch lipid-based Transfection (Invitrogen, Groningen, Niederlande) nach Herstellerangaben und Standardprotokoll für 8h in Medium ohne Serum transient transfiziert.
    • 2. Stimulation der Inselzellen Nach Kultivierung der Zellen und einer Fungerphase von 24h in RPMI 1640 ohne Kälberserum werden die INS·1 Zellen bei verschiedenen Glukosekonzentrationen (2,5 bis 20 mM in Gegenwart von GLP-1 (10 nM und 100 nM; Bachem, Bubendorf, C4) für 20 h stimuliert. In allen Experimenten wird ein Vektor mit Beta-Galactosidase Gen (pcDNA3.1lacz; Invitrogen) unter der Kontrolle des Cytomegalovirus Promotor cotransfiziert, um die Beta-Galactosidase-Aktivität im Zell-Lysat als interne Kontrolle für nicht-spezifische Transkription zu bestimmen.
    • 3. Messung der Luciferaseaktivität Die CREB und MAPK Aktivität als Maß der Zell-Proliferation wird durch die Luciferaseaktivität bestimmt. Nach 16 h Inkubation bei 37°C wird Luciferaseaktivität im ELISA-Reader gemessen.
    • 4. Analyse der Aktivierung Die Daten der Luciferaseaktivität werden zu einem Aktivierungsmuster verarbeitet und dargestellt. An diesem Aktivierungsmuster ist eine rap-Aktivierung direkt ablesbar. Die rap-Aktivität wird als prozentuale Relation im Vergleich zu einer Stimulation der Zellen mit 10 mM Glukose und 10% Kälberserum bestimmt.
    • 5. Kontrollversuche Die positiv bewerteten Zellen werden durch bekannte zellbiologische Methoden (RAL-GDS-RBD pulldown und rap1-Immunoblot; B-Raf IP und Rap1 Immunoblot, rap-IP und in vitro MAPK Assay) in INS-1 E Zellen, Ratteninselzellen und humanen Inselzellen kontrolliert.
    • 6. Immunoblotting Die Zellen werden nach Stimulation in eisgekühltem Lysis-Puffer (Trümper K, Trümper A, Trusheim N, Arnold R, Goke B und Hörsch D: Annals of the New York Academy of Sciences 2000, 921: 242–50) lysiert, auf einem 10 % SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt, in einem Western-Blot auf eine PVDF oder Nitrozellulose-Membran übertragen. Die Proteinbanden werden per Chemilumineszenz sichtbar.
    • 7. MAPK Assay MAPK-Assays werden wie bei Marais et al. 1997 durchgeführt (Marais R, Light Y, Paterson HF, Mason CS and Marshall CJ: Journal of Bioloical Chemistry 1997, 272: 4378–83), wobei Zell-Lysat oder immunpräzipitierte Proteine mit GST-MEK-1 und GST-ERK-2 (Upstate Biotechnology, Waltham, MA) für 30 min bei 30°C inkubiert werden. Die Aktivität von GST-ERK2 wird durch das Substrat MBP bestimmt oder durch Im munoblotting eines Aliquots mit Phospho-ERK1/2 Antikörper (Santa Cruz Biotechnologie, CA).
    • 8. Pull-down Assay zur Bestimmung von aktivem ras und rap Zell-Lysat wird auf Sepharose beads mit gebundenen GST Fusionsprotein raf-1-RBD für die Detektion von aktivem ras und Ral-GDS-RBD für die Detektion von aktivem rap (lacovelli L, Capobianco L, Salvatore L, Sallese M, D'Ancona GM und De Blasi A, Molecular Pharmacology 2001, 60: 924–33) aufgebracht. Nach waschen der Probe in Lyse-Puffer (Trümper K, Trümper A, Trusheim N, Arnold R, Goke B und Hörsch D: Annals of the New York Academy of Sciences 2000, 921: 242–50), werden die Proteine durch SDS-Page und GTP-gebundenem aktiven ras und rap durch Immunoblotting mit Antikörpern gegen ras und rap detektiert. Die vorliegenden Ausführungsbeispiele wurden für die Stimulation durch GLP-1 beschrieben. Das Nachweisverfahren zur Beeinflussung der Funktion und Masse der insulinproduzierenden beta-Zellen in späten Phasen des Diabetes mellitus Typ II ist aber ebenso für weitere bekannten Aktivierungseffektoren, wie GLP-1-Analoga und rap-Agonisten anwendbar und wird zur Analyse auf deren Wirksamkeit und Wirkmechanismus eingesetzt.

Claims (13)

  1. Verfahren zum Nachweis des Einfluss von Substanzen auf Funktion und Masse der insulinproduzierenden beta-Zellen, gekennzeichnet durch die Schritte a) Bereitstellen und Kultivierung von humanen Inselzellen b) Transfektion der Zellen mit Elk1 oder CREB Transaktivatordomäne und einem Reportergen c) Stimulation der Zellen mit Glucose und zu testender Substanz d) Messung der Aktivität des Reporterplasmides e) Durchführung von Immunoblotting f) Durchführung von MAPK Assay g) Durchführung von Pull-down-Assay h) Auswertung der Wirkung der zu testenden Substanz auf Funktion und Masse der insulinproduzierenden beta-Zellen durch Vergleich mit positiven und negativen Kontrollversuchen
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch dass das Reportergen ein Luciferase Reportergen ist
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass die Substanzen Aktivationseffektoren zur Stimulation der insulinproduzierenden beta-Zellen sind.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, dass die Substanzen aus Gemischen umfassend die bekannten Aktivationseffektoren zur Stimulation der insulinproduzierenden beta-Zellen, GLP-1, Analoga von GLP-1 und rap-Aktivatoren und deren Analoga, bestehen.
  5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, dass die Aktivationseffektoren zur Stimulation der insu linproduzierenden beta-Zellen in einer Konzentration von 1 μg-100 mM eingesetzt werden.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, dass die Glucosekonzentration zur Stimulation der insulinproduzierenden beta-Zellen im Bereich von 1–100 mM eingesetzt wird.
  7. Verwendung von Aktivationseffektoren ermittelt mit einem der vorher gehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels.
  8. Verwendung von Aktivationseffektoren gemäß einem der voran gegangenen Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulierung von Masse und Funktion Insulin-produzierender beta-Zellen.
  9. Verwendung von Aktivationseffektoren gemäß Anspruch 8 zur Herstellung eines Arzneimittels, das den Zelltod Insulinproduzierender beta-Zellen verringert und die Proliferation dieser Zellen erhöht.
  10. Verwendung von Aktivationseffektoren zur Herstellung eines Arzneimittels gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivationseffektoren ausgewählt werden aus der Gruppe GLP-1, Analoga von GLP-1, rap-Aktivatoren und Analoga von rap-Aktivatoren.
  11. Verwendung von Aktivationseffektoren zur Herstellung eines Arzneimittels gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zusätzlich zu einem der Aktivationseffektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 Zucker, bevorzugt Glucose, umfasst.
  12. Verwendung von Substanzgemischen umfassend mindestens eines oder mehrere der Substanzen GLP-1, GLP-1-Analoga, rap-Aktivatoren und / oder Analoga von rap-Aktivatoren, zur Herstellung eines Arzneimittels.
  13. Verwendung von Substanzgemischen zur Herstellung eines Arzneimittels gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich mindestens ein Aktivationseftektor verwendet wird, der mit Hilfe des Verfahrens gemäß Ansprüchen 1 bis 6 ermittelt wurde.
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US6207148B1 (en) * 1997-06-19 2001-03-27 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Disease associated protein kinases

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Title
BERNAL-MIZRACHI,Ernesto, et.al.: Activation of Elk-1, an Ets transcription factor, by glucose and EGF treatment of insulinoma cells. In: AM. J. Physiol Endocrinol. Metab. (2001) 281 (6) S.E1286-E1299 *
BERNAL-MIZRACHI,Ernesto, et.al.: Activation of Elk-1, an Ets transcription factor, by glucose and EGF treatment of insulinoma cells. In: AM. J. Physiol Endocrinol. Metab. (2001) 281 (6) S.E1286-E1299;
EHSES,Jan A., et.al.: Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide Activates the Raf-Mek 1/2-ERK1/2 Module via a Cyclic AMP/cAMP-dependent Protein Kinase/Rap1-mediated Pathway. In: The Journal Of Biological Chemistry, Vol.277, No.40, 2002, S.37088-37097 *
EHSES,Jan A., et.al.: Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide Activates the Raf-Mek 1/2-ERK1/2 Module via a Cyclic AMP/cAMP-dependent Protein Kinase/Rap1-mediated Pathway. In: The Journal Of Biological Chemistry, Vol.277, No.40, 2002, S.37088-37097;
KEMP,Daniel M., HABENER,Joel F.: Synergistic effect of dimethyl sulfoxide on glucagon-like peptide 1 (GLP-1)-stimulated insulin secretion and gene transcription in INS-1 cells: characterization and implications. In: Biochemical Pharmacology 64 (2002), S.689-697 *
KEMP,Daniel M., HABENER,Joel F.: Synergistic effect of dimethyl sulfoxide on glucagon-like peptide 1 (GLP-1)-stimulated insulin secretion and gene transcription in INS-1 cells: characterization and implications. In: Biochemical Pharmacology 64 (2002), S.689-697;
reichen? In: Mitteilungen der deutschen Patentanwälte, 2003, H.2, Jg.94, S.57-64;
WOLFRAM,Markus: "Reach-Through Claims" und "Reach-Through Licensing" - Wie weit kann Patentschutz auf biotechnologische Research Tools *

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