DE1026266B

DE1026266B - Verfahren zur Erhaltung und Steigerung der Gaerleistung saeurebildender Pilze, insbesondere der Gattung Aspergillus

Info

Publication number: DE1026266B
Application number: DEB33532A
Authority: DE
Inventors: Dr Rer Nat Kurt Wendel
Original assignee: CH Boehringer Sohn AG and Co KG
Current assignee: CH Boehringer Sohn AG and Co KG
Priority date: 1954-11-25
Filing date: 1954-11-25
Publication date: 1958-03-20

Description

Verfahren zur Erhaltung und Steigerung der Gärleistung säurebildender Pilze, insbesondere der Gattung Aspergillus Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhaltung und Steigerung der Gärleistung säurebildender Pilze, wie insbesondere von Zitronensäure-, Gluconsäure- und Itaconsäurebildnern der Gattung Aspergillus.
Es ist bekannt, daß Schimmelpilze, die längere Zeit auf Agar-Nährböden gezüchtet werden, eine morphologische und physiologische Degeneration erleiden, die sowohl allmählich als auch spontan einsetzen kann. Auch ständige Überimpfung auf besonders nährstoffreiche Substrate können Degeneration verursachen. Solche biologische Wertminderungen sind vermutlich darauf zurückzuführen, daß mit den laufenden Abimpfungen auch Sporen geringerer Wertigkeit zur Weiterzucht gelangen.
Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Auswahl und Heranzüchtung säurebildender Pilze, insbesondere der Gattung Aspergillus, mit erhöhter Gärleistung unter Anwendung üblicher Auslese- und Aufspaltungsverfahren, wobei erfindungswesentlich ist, daß man einen Gärstamm in einer Passage auf melassehaltigem Nährsubstrat der Wirkung von Salzen aussetzt, die eine große präletale Phase und gleichzeitige Vitalisierung verursachen, wie chlorierte Phenole und insbesondere y-Hexachlorcyclohexan, und anschließend in bekannter Weise die Züchtung neuer Stämme vornimmt.
Es war bereits bekannt, zu Nährlösungen für säurebildende Schimmelpilze Giftstoffe, wie Chlorphenolqueck-Silber, Chinin und Zyankalium, als Atmungsgifte während der Gärung zuzusetzen.
Auch war bereits die antiseptische Wirkung von Chlorphenolen gegenüber säurebildenden Bakterien und die wachstumshemmende Wirkung von y-Hexachlorcyclohexan gegenüber Hefen und Bakterien bekannt.
Demgegenüber wird nach der vorliegenden Erfindung ein Pilzstamm vor der Säuregärung einer Vorbehandlung mit den wirksamen Substanzen, insbesondere y-Hexachlorcyclohexan, in einem Passageverfahren zur Heranbildung einer großen präletalen Phase und zur gleichzeitigen Vitalisierung ausgesetzt und anschließend in an sich bekannter Weise die Züchtung zu neuen Stämmen vorgenommen. Diese neuen festen Stämme werden erst dann in dem üblichen Gärverfahren zur Säurebildung eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Passageverfahren, nach dessen Durchführung die Grenze für die biologische Leistungsfähigkeit des Parietalstammes erreicht ist und dessen Zielsetzung die Abspaltung der einer möglichen Aufspaltung am leichtesten zugänglichen Varianten, verbunden mit einer Vitalisierung des ausgewählten Pilzstammes, darstellt, beruht erfindungsgemäß darauf, daß man den ausgewählten Gärstamm nach der Plattenmethode der Wirkung von Substanzen aussetzt, die eine große präletale Phase und gleichzeitige Vitalisierung verursachen, wie das z. B. bei chlorierten Phenolen der Fall ist. Die Anwendung des Hexachlorcyclohexan-y-isomeren wird hierbei als besonders vorteilhaft und zuverlässig gefunden, wodurch eine nochmalige Differenzierung des Filialstammes in Komponenten verschiedener Keimzeit, Mycelbildung, Mycelfarbe und Gärleistung bewerkstelligt werden kann. Die Konzentration der selektiv wirksamen Substanz, welche in der äußerlich homogenen Kultur des ausgewählten Pilzstammes die Demaskierung bestehender Varianten auslöst, ist in Reihenversuchen jeweils zu ermitteln und liegt im allgemeinen bei 0,8 mg y-Isomeres pro 10 ccm Melasse-Agar; die 0,8 mg an y-Isomerem sind dabei in 0,05 ccm reinem Äthylalkohol gelöst.
Zur Ausschaltung neuer, durch das selektivierende Agens möglicher Populationen werden erfindungsgemäß die zuerst feststellbaren reifen Sporen der überlebenden präexistierenden Varianten mittels des vorgenannten Verdünnungsverfahrens auf mit gleicher Substanz und in gleicher Konzentration versetzten Melasse-Agar übertragen und diese Passage insgesamt 3- bis 4mal wiederholt, bis das induzierende Agens, wie y-Hexachlorcyclohexan, nicht mehr selektiv wirksam ist. Hat sich die überlebende Variante des aus dem Einsporverfahren zuletzt gezüchteten Filialstammes manifestiert, so kommt die Passage in Wegfall, und die erhaltene, bezüglich der Sporung gegenüber dem Agens resistente, homogene Kultur wird der Anreicherung zugeführt.
Vor dem erfindungsgemäßen Passageverfahren ist es oft günstig, bereits einen differenzierten Stamm, der dann dem erfindungsgemäßen Passageverfahren ausgesetzt wird, durch das bekannte Einsporverfahren heranzubilden.
Das Einsporverfahren beruht auf der einfachsten Methode, dem sogenannten Verdünnungsverfahren, und erweist sich deshalb als besonders brauchbar, weil nach diesem Verfahren eine hohe Zahl von Einzelkulturen in einem Arbeitsgang erreichbar ist. Nach den vorliegenden Erfahrungen eignet sich hierbei ein melassehaltiges Anzuchtsubstrat deshalb, weil erstens mit diesem Substrat eine etwaige störende Guttation der sporenliefernden Kulturdecke in der Regel vermieden werden kann und zweitens die Adaption an die Substratkomponente Melasse dabei nicht verlorengeht.
Man geht dabei von einem Stamm bekannter Leistung aus, dem »Parietalstammcc, dessen Sporenmaterial trocken, jedoch nicht staubtrocken sein muß, in etwa 150 Einspor-Kulturen (Filialgeneration I) aufgespalten wird, aus welchen wiederum, nach physiologischer Prüfung, die leistungsfähigste Spore, der erste Filialstamm, ermittelt wird. Da dieser erste Filialstamm in eine weitere Filialgeneration mit etwa 150 Einspor-Kulturen aufgespalten werden muß, soll inzwischen seine Kulturfläche nicht über einen Radius von etwa 25 mm hinauswachsen; es wird dadurch das Hinzukommen eines neuen Streuungsbereiches vermieden. Die Aufspaltung, die nach dem schematisch wiedergegebenen Arbeitsverfahren vorgenommen wird, wird so lange fortgeführt, bis eine hinreichende Konstanz in der Höhe der Säurebildung innerhalb der einzelnen Einspor-Kulturen erzielt ist. Das ist erfahrungsgemäß in der dritten, spätestens aber in der fünften Filialgeneration erreicht. Arbeitsgang der laufenden Einspor-Selektion mit Wertbestimmung der Filialgenerationen

Beispiel 1 Der Parietalstamm 2597,00,07 mit einer mittleren Gärleistung von 62,8 °/o wird in möglichst rascher Aufeinanderfolge dem Einsporverfahren unterworfen, welches eine makroskopisch erkennbare Differenzierung der selektierten Einspor-Kulturen hinsichtlich deren Keimzeit, Mycelbildung, Mycelfarbe und Sporenfarbe auslöst und nach gärungsphysiologischer Bewertung den Filialstamm 2598,00,01 mit hellgelbem Mycel, hellbraunen Sporen und einer Gärleistung von 69,8 °/o Zitronensäure sowie den Filialstamm 2626,00,01 mit zitronengelbem Mycel, dunkelbrauner Sporenbildung und der gleichen Gärleistung als Endglieder der Filialgenerationen hinterläßt.
Der Filialstamm 2598,00,01 wird nun in ebenso rascher Aufeinanderfolge dem erfindungsgemäßen Passageverfahren unterworfen. Die erfindungsgemäß definierte Passage über drei bis fünf Generationen endigt in der makroskopisch und physiologisch einheitlichen Selektion 2598,00,10 mit einer Gärleistung von 75,5 °/o und stellt hiermit nicht allein die Regenerierung des Parietalstammes 2597,00,07, sondern ein auf y-hexachlorcyclohexanhaltigem Substrat in der biochemischen Leistung vitalisiertes Endglied der Züchtungsreihe dar, das sich in betrieblichem Einsatz außerdem durch seine Populationsfestigkeit auszeichnet. Beispiel 2 Der lange in Kultur gehaltene Parietalstamm 20,00,03 mit einer Gärleistung von 10,10/0 Zitronensäure pro 100 ccm Gärlösung wird dem kombinierten Einspor- und dem erfindungsgemäßen Passageverfahren unterworfen und nach Bewertung von drei Filialgenerationen als F IV - 20,18,01 selektiert. Die Gärleistung der aus der ersten bis dritten Filialgeneration isolierten Filialstämme wird mit jeder Filialgeneration fortlaufend gesteigert und beläuft sich

für F I - 20,02,01 auf 10,8 "/o

für F II - 20,11,01 auf 11,3 %

für F III - 20,15,01 auf 12,1 0/0.

Die Prozentangaben bedeuten hierbei g Zitronensäure pro 100 ccm vergorene Gärlösung. Die bis zur dritten Filialgeneration erlangte Steigerung in der Gärleistung kommt auch in drei weiteren Isolierungen der gleichen Filialgeneration zum Ausdruck und beläuft sich

für F III - 20,19,01 auf 12;05 °/o

für F III - 20,16,01 auf 12,18 °/o

für F III - 20;18,01 auf 12,27°/o.

Die Übernahme des Filialstammes F III - 20,18;01 der dritten Filialgeneration in eine nochmalige Gammapassage führt zur morpbologischen und physiologischen Homogenität des Filialstammes F IV - 20,18,00, der in seiner Sporenbildung keine Abhängigkeit mehr von der selektivierenden Substanz zeigt, und dessen Gärleistung bei 12,80 bis 12,85 °/o Zitronensäure pro 100 ccm vergorene Gärlösung liegt, was einer Ausbeute von 71,5 bis 72,0 °/o gleichkommt. Beispiel 3 Der aus dem betrieblichen Einsatz herausgenommene Parietalstamm 2598,00,10 zeigt eine sich im Verlaufe des betrieblichen Einsatzes eingestellte Degeneration in der Gesamtgärleistung, welche in der verschiedenen Leistungsfähigkeit seiner Einzelsporen ihre Ursache hat. Die nach dem beschriebenen Aufspaltungsverfahren selektierten und auf gleicher Ansatzbasis geprüften und bewerteten Einzelsporen zeigen eine Schwankung in der Ausbeute, welche zwischen 62,9 und 70,40/0 liegt. Die Anwendung des kombinierten Aufspaltungsverfahrens und Passageverfahrens auf die aus der ersten Filialgeneration selektierten Einspore F I - 2598,09,01 über zwei weitere Filialgenerationen erbringt durch Abspalten der populierten Varianten mit dem Stamm F III - 2598,03,00 eine vollkommene Regeneration der für den Stamm ursprünglich genannten Gärleistung von 75,5 l)/, und beweist die Zweckmäßigkeit des vorliegenden Verfahrens für das betriebliche Arbeiten.

Claims

PATENTANSPRACHE: 1. Verfahren zur Auswahl und Heranzüchtung säurebildender Pilze, insbesondere der Gattung Aspergillus, mit erhöhter Gärleistung unter Anwendung üblicher Auslese- und Aufspaltungsverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Gärstamm in einer Passage auf melassehaltigem Nährsubstrat der Wirkung von chlorierten Phenolen oder y-Hexachlorcyclohexan aussetzt und anschließend in an sich bekannter Weise die Züchtung neuer Stämme vornimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Passage auf melassehaltigem Nährsubstrat mit einem Zusatz von 0,8 mg y-Hexachlorcyclohexan in 0,05 ccm reinem Äthylalkohol bei 10 ccm Nährsubstrat vornimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Passage auf y-Hexachlorcyclohexan 3- bis 4mal auf mit gleicher Substanz und in gleicher Konzentration versetztem melassehaltigem Nährsubstrat wiederholt wird, bis das induzierende Agens nicht mehr selektiv wirksam ist. In Betracht gezogene Druckschriften: Deutsche Patentschriften Nr. 544 589, 587 819, 551930; österreichische Patentschriften Nr. 101009, 115 622; Chemisches Zentralblatt, 1954, S. 7440, Ss. A. Konowalow; Chemiker Zeitung, 78. Jahrg., Nr. 10 (1954), S. 323, linke Spalte, letzter Absatz; Die Pharmazie, 9. Beiheft, 1. Ergänzungsband »Zur Kenntnis der Kontakt-Insektizide IIa von Dr. Riemschneider (1950), Verlag Dr. Werner Sänger, Berlin, S. 772 und 774.