DE1026266B

DE1026266B - Process for maintaining and increasing the fermentation performance of acid-forming fungi, in particular of the genus Aspergillus

Info

Publication number: DE1026266B
Application number: DEB33532A
Authority: DE
Inventors: Dr Rer Nat Kurt Wendel
Original assignee: CH Boehringer Sohn AG and Co KG
Current assignee: CH Boehringer Sohn AG and Co KG
Priority date: 1954-11-25
Filing date: 1954-11-25
Publication date: 1958-03-20

Description

Verfahren zur Erhaltung und Steigerung der Gärleistung säurebildender Pilze, insbesondere der Gattung Aspergillus Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhaltung und Steigerung der Gärleistung säurebildender Pilze, wie insbesondere von Zitronensäure-, Gluconsäure- und Itaconsäurebildnern der Gattung Aspergillus.Process for maintaining and increasing the fermentation performance of acid-forming Fungi, in particular of the genus Aspergillus. The invention relates to a method to maintain and increase the fermentation performance of acid-forming mushrooms, such as in particular of citric acid, gluconic acid and itaconic acid producers of the genus Aspergillus.

Es ist bekannt, daß Schimmelpilze, die längere Zeit auf Agar-Nährböden gezüchtet werden, eine morphologische und physiologische Degeneration erleiden, die sowohl allmählich als auch spontan einsetzen kann. Auch ständige Überimpfung auf besonders nährstoffreiche Substrate können Degeneration verursachen. Solche biologische Wertminderungen sind vermutlich darauf zurückzuführen, daß mit den laufenden Abimpfungen auch Sporen geringerer Wertigkeit zur Weiterzucht gelangen.It is known that molds that are left on agar media for a long time are bred, suffer a morphological and physiological degeneration, which can set in gradually as well as spontaneously. Also constant over-vaccination on particularly nutrient-rich substrates can cause degeneration. Such biological impairments are probably due to the fact that with the ongoing Vaccinations also get spores of lower value for further breeding.

Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Auswahl und Heranzüchtung säurebildender Pilze, insbesondere der Gattung Aspergillus, mit erhöhter Gärleistung unter Anwendung üblicher Auslese- und Aufspaltungsverfahren, wobei erfindungswesentlich ist, daß man einen Gärstamm in einer Passage auf melassehaltigem Nährsubstrat der Wirkung von Salzen aussetzt, die eine große präletale Phase und gleichzeitige Vitalisierung verursachen, wie chlorierte Phenole und insbesondere y-Hexachlorcyclohexan, und anschließend in bekannter Weise die Züchtung neuer Stämme vornimmt.The aim of the invention is a method for selection and cultivation Acid-forming fungi, especially of the Aspergillus genus, with increased fermentation performance using customary selection and splitting processes, which is essential to the invention is that you have a fermentation strain in a passage on molasses-containing nutrient substrate Effects of salts exposing a great preletal phase and simultaneous vitalization cause, such as chlorinated phenols and especially y-hexachlorocyclohexane, and then breeding new strains in a known manner.

Es war bereits bekannt, zu Nährlösungen für säurebildende Schimmelpilze Giftstoffe, wie Chlorphenolqueck-Silber, Chinin und Zyankalium, als Atmungsgifte während der Gärung zuzusetzen.It was already known about nutrient solutions for acid-forming molds Toxins such as chlorophenol mercury, quinine and potassium cyanide are respiratory toxins to add during fermentation.

Auch war bereits die antiseptische Wirkung von Chlorphenolen gegenüber säurebildenden Bakterien und die wachstumshemmende Wirkung von y-Hexachlorcyclohexan gegenüber Hefen und Bakterien bekannt.Also the antiseptic effect of chlorophenols was already opposite acid-forming bacteria and the growth-inhibiting effect of y-hexachlorocyclohexane known to yeast and bacteria.

Demgegenüber wird nach der vorliegenden Erfindung ein Pilzstamm vor der Säuregärung einer Vorbehandlung mit den wirksamen Substanzen, insbesondere y-Hexachlorcyclohexan, in einem Passageverfahren zur Heranbildung einer großen präletalen Phase und zur gleichzeitigen Vitalisierung ausgesetzt und anschließend in an sich bekannter Weise die Züchtung zu neuen Stämmen vorgenommen. Diese neuen festen Stämme werden erst dann in dem üblichen Gärverfahren zur Säurebildung eingesetzt.In contrast, according to the present invention, a fungus strain is presented the acid fermentation of a pretreatment with the active substances, in particular y-hexachlorocyclohexane, in a passage procedure for the formation of a great preletal phase and for the exposed to simultaneous vitalization and then in a manner known per se the breeding made into new strains. These new solid tribes are only just becoming then used in the usual fermentation process to generate acid.

Das erfindungsgemäße Passageverfahren, nach dessen Durchführung die Grenze für die biologische Leistungsfähigkeit des Parietalstammes erreicht ist und dessen Zielsetzung die Abspaltung der einer möglichen Aufspaltung am leichtesten zugänglichen Varianten, verbunden mit einer Vitalisierung des ausgewählten Pilzstammes, darstellt, beruht erfindungsgemäß darauf, daß man den ausgewählten Gärstamm nach der Plattenmethode der Wirkung von Substanzen aussetzt, die eine große präletale Phase und gleichzeitige Vitalisierung verursachen, wie das z. B. bei chlorierten Phenolen der Fall ist. Die Anwendung des Hexachlorcyclohexan-y-isomeren wird hierbei als besonders vorteilhaft und zuverlässig gefunden, wodurch eine nochmalige Differenzierung des Filialstammes in Komponenten verschiedener Keimzeit, Mycelbildung, Mycelfarbe und Gärleistung bewerkstelligt werden kann. Die Konzentration der selektiv wirksamen Substanz, welche in der äußerlich homogenen Kultur des ausgewählten Pilzstammes die Demaskierung bestehender Varianten auslöst, ist in Reihenversuchen jeweils zu ermitteln und liegt im allgemeinen bei 0,8 mg y-Isomeres pro 10 ccm Melasse-Agar; die 0,8 mg an y-Isomerem sind dabei in 0,05 ccm reinem Äthylalkohol gelöst.The passage method according to the invention, after its implementation the Limit for the biological performance of the parietal trunk is reached and whose objective is to split off the easiest of a possible split accessible variants, combined with a vitalization of the selected mushroom strain, represents, is based according to the invention on the fact that one after the selected fermentation strain the plate method exposes the action of substances that make a great preletal Cause phase and simultaneous vitalization, such as the z. B. with chlorinated Phenols is the case. The use of the hexachlorocyclohexane-γ isomer is here found to be particularly advantageous and reliable, resulting in a further differentiation of the branch line in components of different germination times, mycelium formation, mycelium color and fermentation performance can be achieved. The concentration of the selectively effective Substance found in the externally homogeneous culture of the selected fungal strain the unmasking of existing variants triggers, is in each case to in series tests determine and is generally 0.8 mg of y-isomer per 10 ccm of molasses agar; the 0.8 mg of y-isomer are dissolved in 0.05 ccm of pure ethyl alcohol.

Zur Ausschaltung neuer, durch das selektivierende Agens möglicher Populationen werden erfindungsgemäß die zuerst feststellbaren reifen Sporen der überlebenden präexistierenden Varianten mittels des vorgenannten Verdünnungsverfahrens auf mit gleicher Substanz und in gleicher Konzentration versetzten Melasse-Agar übertragen und diese Passage insgesamt 3- bis 4mal wiederholt, bis das induzierende Agens, wie y-Hexachlorcyclohexan, nicht mehr selektiv wirksam ist. Hat sich die überlebende Variante des aus dem Einsporverfahren zuletzt gezüchteten Filialstammes manifestiert, so kommt die Passage in Wegfall, und die erhaltene, bezüglich der Sporung gegenüber dem Agens resistente, homogene Kultur wird der Anreicherung zugeführt.To eliminate new ones, possible through the selectivating agent According to the invention, populations are the first detectable mature spores of the surviving pre-existing variants by means of the aforementioned dilution method on molasses agar mixed with the same substance and in the same concentration and this passage is repeated 3 to 4 times in total until the inducing Agent, such as γ-hexachlorocyclohexane, is no longer selectively effective. Has the surviving variant of the branch line last bred from the single sporage procedure manifests, the passage is omitted, and the received one, regarding the A homogeneous culture that is sporus resistant to the agent is fed to the enrichment process.

Vor dem erfindungsgemäßen Passageverfahren ist es oft günstig, bereits einen differenzierten Stamm, der dann dem erfindungsgemäßen Passageverfahren ausgesetzt wird, durch das bekannte Einsporverfahren heranzubilden.Before the passage method according to the invention, it is often advantageous to already do so a differentiated strain which is then subjected to the passage method of the invention will be trained by the well-known Einspor method.

Das Einsporverfahren beruht auf der einfachsten Methode, dem sogenannten Verdünnungsverfahren, und erweist sich deshalb als besonders brauchbar, weil nach diesem Verfahren eine hohe Zahl von Einzelkulturen in einem Arbeitsgang erreichbar ist. Nach den vorliegenden Erfahrungen eignet sich hierbei ein melassehaltiges Anzuchtsubstrat deshalb, weil erstens mit diesem Substrat eine etwaige störende Guttation der sporenliefernden Kulturdecke in der Regel vermieden werden kann und zweitens die Adaption an die Substratkomponente Melasse dabei nicht verlorengeht.The Einspor method is based on the simplest method, the so-called Dilution method, and therefore proves to be particularly useful because after With this method, a large number of individual cultures can be achieved in one operation is. According to our experience, a growing substrate containing molasses is suitable for this because, firstly, with this substrate any disturbing Guttation of the spore-producing cultivated cover can usually be avoided and Second, the adaptation to the substrate component molasses is not lost.

Man geht dabei von einem Stamm bekannter Leistung aus, dem »Parietalstammcc, dessen Sporenmaterial trocken, jedoch nicht staubtrocken sein muß, in etwa 150 Einspor-Kulturen (Filialgeneration I) aufgespalten wird, aus welchen wiederum, nach physiologischer Prüfung, die leistungsfähigste Spore, der erste Filialstamm, ermittelt wird. Da dieser erste Filialstamm in eine weitere Filialgeneration mit etwa 150 Einspor-Kulturen aufgespalten werden muß, soll inzwischen seine Kulturfläche nicht über einen Radius von etwa 25 mm hinauswachsen; es wird dadurch das Hinzukommen eines neuen Streuungsbereiches vermieden. Die Aufspaltung, die nach dem schematisch wiedergegebenen Arbeitsverfahren vorgenommen wird, wird so lange fortgeführt, bis eine hinreichende Konstanz in der Höhe der Säurebildung innerhalb der einzelnen Einspor-Kulturen erzielt ist. Das ist erfahrungsgemäß in der dritten, spätestens aber in der fünften Filialgeneration erreicht. Arbeitsgang der laufenden Einspor-Selektion mit Wertbestimmung der Filialgenerationen Beispiel 1 Der Parietalstamm 2597,00,07 mit einer mittleren Gärleistung von 62,8 °/o wird in möglichst rascher Aufeinanderfolge dem Einsporverfahren unterworfen, welches eine makroskopisch erkennbare Differenzierung der selektierten Einspor-Kulturen hinsichtlich deren Keimzeit, Mycelbildung, Mycelfarbe und Sporenfarbe auslöst und nach gärungsphysiologischer Bewertung den Filialstamm 2598,00,01 mit hellgelbem Mycel, hellbraunen Sporen und einer Gärleistung von 69,8 °/o Zitronensäure sowie den Filialstamm 2626,00,01 mit zitronengelbem Mycel, dunkelbrauner Sporenbildung und der gleichen Gärleistung als Endglieder der Filialgenerationen hinterläßt.It is based on a strain of known performance, the "parietal strain", whose spore material must be dry, but not dust-dry, is split into about 150 single-spore cultures (branch generation I), from which in turn, according to physiological testing, the most powerful spore, the first branch master is determined. Since this first branch trunk has to be split up into a further branch generation with about 150 single-spore cultures, its cultivated area should not grow beyond a radius of about 25 mm in the meantime; this avoids the addition of a new scatter range. The splitting, which is carried out according to the working procedure shown schematically, is continued until a sufficient constancy in the level of acid formation within the individual single-pore cultures is achieved. Experience has shown that this is achieved in the third, but at the latest in the fifth generation of branches. Operation of the ongoing Einspor selection with value determination of the branch generations Example 1 The parietal strain 2597.00.07 with an average fermentation rate of 62.8% is subjected to the single-spore process in as quick succession as possible, which triggers a macroscopically recognizable differentiation of the selected single-spore cultures with regard to their germination time, mycelium formation, mycelium color and spore color According to the fermentation physiological evaluation, the branch line 2598.00.01 with light yellow mycelium, light brown spores and a fermentation capacity of 69.8% citric acid as well as the branch line 2626.00.01 with lemon yellow mycelium, dark brown spore formation and the same fermentation capacity as the end members of the branch generations .

Der Filialstamm 2598,00,01 wird nun in ebenso rascher Aufeinanderfolge dem erfindungsgemäßen Passageverfahren unterworfen. Die erfindungsgemäß definierte Passage über drei bis fünf Generationen endigt in der makroskopisch und physiologisch einheitlichen Selektion 2598,00,10 mit einer Gärleistung von 75,5 °/o und stellt hiermit nicht allein die Regenerierung des Parietalstammes 2597,00,07, sondern ein auf y-hexachlorcyclohexanhaltigem Substrat in der biochemischen Leistung vitalisiertes Endglied der Züchtungsreihe dar, das sich in betrieblichem Einsatz außerdem durch seine Populationsfestigkeit auszeichnet. Beispiel 2 Der lange in Kultur gehaltene Parietalstamm 20,00,03 mit einer Gärleistung von 10,10/0 Zitronensäure pro 100 ccm Gärlösung wird dem kombinierten Einspor- und dem erfindungsgemäßen Passageverfahren unterworfen und nach Bewertung von drei Filialgenerationen als F IV - 20,18,01 selektiert. Die Gärleistung der aus der ersten bis dritten Filialgeneration isolierten Filialstämme wird mit jeder Filialgeneration fortlaufend gesteigert und beläuft sich für F I - 20,02,01 auf 10,8 "/o für F II - 20,11,01 auf 11,3 % für F III - 20,15,01 auf 12,1 0/0. Die Prozentangaben bedeuten hierbei g Zitronensäure pro 100 ccm vergorene Gärlösung. Die bis zur dritten Filialgeneration erlangte Steigerung in der Gärleistung kommt auch in drei weiteren Isolierungen der gleichen Filialgeneration zum Ausdruck und beläuft sich für F III - 20,19,01 auf 12;05 °/o für F III - 20,16,01 auf 12,18 °/o für F III - 20;18,01 auf 12,27°/o. Die Übernahme des Filialstammes F III - 20,18;01 der dritten Filialgeneration in eine nochmalige Gammapassage führt zur morpbologischen und physiologischen Homogenität des Filialstammes F IV - 20,18,00, der in seiner Sporenbildung keine Abhängigkeit mehr von der selektivierenden Substanz zeigt, und dessen Gärleistung bei 12,80 bis 12,85 °/o Zitronensäure pro 100 ccm vergorene Gärlösung liegt, was einer Ausbeute von 71,5 bis 72,0 °/o gleichkommt. Beispiel 3 Der aus dem betrieblichen Einsatz herausgenommene Parietalstamm 2598,00,10 zeigt eine sich im Verlaufe des betrieblichen Einsatzes eingestellte Degeneration in der Gesamtgärleistung, welche in der verschiedenen Leistungsfähigkeit seiner Einzelsporen ihre Ursache hat. Die nach dem beschriebenen Aufspaltungsverfahren selektierten und auf gleicher Ansatzbasis geprüften und bewerteten Einzelsporen zeigen eine Schwankung in der Ausbeute, welche zwischen 62,9 und 70,40/0 liegt. Die Anwendung des kombinierten Aufspaltungsverfahrens und Passageverfahrens auf die aus der ersten Filialgeneration selektierten Einspore F I - 2598,09,01 über zwei weitere Filialgenerationen erbringt durch Abspalten der populierten Varianten mit dem Stamm F III - 2598,03,00 eine vollkommene Regeneration der für den Stamm ursprünglich genannten Gärleistung von 75,5 l)/, und beweist die Zweckmäßigkeit des vorliegenden Verfahrens für das betriebliche Arbeiten.The branch line 2598,00,01 is now subjected to the passage method according to the invention in just as rapid succession. The passage defined according to the invention over three to five generations ends in the macroscopically and physiologically uniform selection 2598.00.10 with a fermentation performance of 75.5% and hereby not only represents the regeneration of the parietal trunk 2597.00.07, but also one y-hexachlorocyclohexane-containing substrate is a vitalized end member of the breeding series in terms of biochemical performance, which is also characterized by its population stability in operational use. EXAMPLE 2 The parietal strain 20.00.03, kept in culture for a long time, with a fermentation capacity of 10.10 / 0 citric acid per 100 ccm fermentation solution is subjected to the combined Einspor and the passage method according to the invention and after evaluation of three branch generations as F IV - 20.18 , 01 selected. The fermentation performance of the branch strains isolated from the first to third branch generation is continuously increased with each branch generation and amounts to for FI - 20.02.01 to 10.8 "/ o for F II - 20.11.01 to 11.3% for F III - 20.15.01 to 12.1 0/0. The percentages here mean g citric acid per 100 ccm fermented fermentation solution. The increase in fermentation performance achieved up to the third generation of branches is also reflected in three further isolations from the same generation of branches and amounts to a total of for F III - 20.19.01 to 12.05% for F III - 20.16.01 to 12.18% for F III - 20; 18.01 to 12.27%. The takeover of the branch line F III - 20,18; 01 of the third branch generation in another gamma passage leads to the morphological and physiological homogeneity of the branch line F IV - 20,18.00, which no longer shows any dependence on the selectivating substance in its spore formation, and Its fermentation capacity is 12.80 to 12.85 per cent of citric acid per 100 cc of fermented fermentation solution, which equates to a yield of 71.5 to 72.0 per cent. Example 3 The parietal trunk 2598, 00, 10 removed from operational use shows a degeneration in the total fermentation capacity which has set in in the course of operational use, which is due to the different efficiency of its individual spores. The individual spores selected according to the splitting process described and tested and assessed on the same basis show a fluctuation in the yield which is between 62.9 and 70.40 / 0. The application of the combined splitting process and passage process to the Einspore FI - 2598.09.01 selected from the first branch generation over two further branch generations results in a complete regeneration of the strains for the strain by splitting off the popular variants with the strain F III - 2598.03.00 originally mentioned fermentation capacity of 75.5 l) /, and proves the usefulness of the present process for operational work.

Claims

PATENT APPEAL: 1. Process for the selection and cultivation of acid-forming fungi, in particular of the genus Aspergillus, with increased fermentation performance using conventional selection and splitting processes, characterized in that a fermentation strain is produced in one passage on a molasses-containing nutrient substrate with the effect of chlorinated phenols or y-hexachlorocyclohexane exposing and then breeding new strains in a manner known per se.

2. The method according to claim 1, characterized in that the passage on molasses-containing nutrient substrate with an addition of 0.8 mg of γ-hexachlorocyclohexane in 0.05 ccm of pure ethyl alcohol at 10 cc nutrient medium.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the passage on y-hexachlorocyclohexane is repeated 3 to 4 times on molasses-containing nutrient substrate mixed with the same substance and in the same concentration until the inducing agent is no longer selectively effective. Considered publications: German Patent Specifications Nos. 544 589, 587 819, 551930; Austrian patent specifications No. 101009, 115 622; Chemisches Zentralblatt, 1954, p. 7440, p. A. Konovalov; Chemiker Zeitung, 78th year, No. 10 (1954), p. 323, left column, last paragraph; Die Pharmazie, 9th Supplement, 1st Supplementary Volume »For Knowledge of Contact Insecticides IIa by Dr. Riemschneider (1950), Verlag Dr. Werner Singer, Berlin, pp. 772 and 774.