CH334468A

CH334468A - Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums

Info

Publication number: CH334468A
Authority: CH
Inventors: Gaeumann Ernst Dr Prof; Prelog Vladimir Dr Prof
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1955-05-10
Filing date: 1955-05-10
Publication date: 1958-11-30

Description

Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen kri stallinen Antibiotikums, das im folgenden Foromacidin genannt wird.

Das Foromacidin, eine Base, bildet farb lose Kristalle, die bei 126-128 schmelzen. Bei der Elementaranalyse liefert es Werte, die für die Bruttoformel C"H37_3907N spre chen; [a]" = -56,2 in Chloroform (c = 0,51%). Im Ultraviolett weist es eine starke Bande bei 231 m,u auf (log e = 4,12; in Äthanol).

Im Infrarot-Spektrum, in Nujol suspendiert aufgenommen, zeigen sich Ban den unter anderem bei den Wellenlängen 2,88,u, 3,42y, 3,51,u, 5,68,u, 5,76,u, 5,91,u, 6,15,u, 6,80,u, 7,24,u, 8,54,u, 8,89,u, 9,46,u, 9,80,u, 10,02,u, 10,97,u und 11,79,

u. In Methylcellosolve-Wasser (80:20) gelöst weist Foromacidin einen pK-Wert von 7,02 auf.

Foromacidin bildet mit anorganischen oder organischen Säuren Salze, beispiels weise mit Salzsäure, den Schwefelsäuren, der Essig-, Propion-, Valerian-, Palmitin- oder Ölsäure, der Zitronensäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Die Salze lassen sich durch Einwirkung der ent sprechenden Säuren auf die freie Base oder durch doppelte Umsetzung von Salzen her stellen, beispielsweise von Foromacidinsulfat mit pantothensaurem Natrium.

Foromacidin besitzt hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Test- organismen in vitro. Verwendet man als Testmethode Verdünnungsreihen (Zehner potenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei37' bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Kon zentrationen
EMI0001.0040

Hemmende
<tb> Testorganismen <SEP> Konzentration
<tb> N.g/rnlStreptococcus <SEP> mitis <SEP> 0,01
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0,1
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 1
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 1
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var.

<SEP> aureus,
<tb> Penicillin-resistent <SEP> 10
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 1
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 1 Foromacidin ist nicht wirksam in einer Konzentration von 100 Ag/cm@ gegenüber folgenden Mikroorganismen Escherichia coli, Salmonella typhosa, Salmonella schottmuelleri, Shigella Bonnei, Psäudomonas aeruginosa, Klebsiella pneu- moniae (Typ A),

Pasteurella pestis, Vibrio comme (El Tor), Mycobacterium tuberculosis (H 37 Rv), Candida tropicalis, Candida albi- cans.

In vivo ist Foromacidin ebenfalls hoch, aktiv. Bei Applikation an mit Streptococcus pyogenes infizierten Mäusen s. c. werden mit 4 x 25 mg/kg oder 5 x 10 mg/kg 100% Über lebende und mit 5 X 1 mg/kg 75% Über lebende festgestellt.

Die Toxizität von Foromäcidin ist gering 100 mg/kg einmal subkutan injiziert werden von Mäusen ohne Anzeichen irgendeiner Schädigung ertragen. Höhere Dosen wurden bisher nicht geprüft.

In Gewebskulturen von Hühnerfibro- blasten zeigt Foromaeidin in Konzentra tionen bis zu 10 ,ug/cm0 eine gewisse cysto- statische Wirkung.

Penicillin-resistente Mikroorganismen sind foromacidinempfi,ndlich. Mit Pikro- mycin weist Foromacidin eine partiell ge kreuzte Resistenz auf, d. h. ein auf Resistenz gegen Pikromycin gezüchteter Stamm Micro- coccus pyogenes var. aureus wird nicht un empfindlich gegenüber Foromacidin, aber doch deutlich weniger empfindlich als sein Mutterstamm.

Das neue Antibiotikum wird erfindungs gemäss durch Kultivierung eines Strepto- myces-Stammes, der als Stamm A 8703 be zeichnet wird, hergestellt. Dieser Stamm wurde aus einer in Rom im Forum Romanum gesammelten Bodenprobe isoliert.

Der Orga nismus ist mit keiner - der in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology , 6. Aufl. oder in Actinomycetes and their Antibiotics von Waksman und Lechevalier 1953 aufgeführten Arten identisch. Er wird in unseren Laboratorien und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spe zielle Botanik, Zürich, unter der obigen Bezeichnung auf bewahrt.

Es handelt sich um einen Streptomyceten mit den für diese Gattung charakteristischen Konidienketten. Er bildet auf fast allen Nährmedien ein weiss gelbes bis goldgelbes Substratmycel ; das Luftmycel ist am Anfang weiss und wird später grau.

Zur weiteren Kennzeichnung wird im fol genden das Wachstum von A 8703 auf ver schiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1-8 sowie 12 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952) hergestellt. 1. Synthetischer Agar: Wachstum dünn, schleierartig, am Anfang graugelb, nachher hellgelb-rot und stellenweise dunkelbraun. Luftmycel weissgrau, nach 3 Tagen aschgrau. Bildet kein lösliches Pigment.

2. Synthetische Lösung: Fein punkt- förmiges Wachstum, milchweisse Flocken.

3. Glucosebrühe : Braune Flocken und oberflächliches Wachstum, pusteliges Luft- mycel bleigrau bis aschgrau. Bildet kein Pigment.

4. Glucoseagar : Substratmycel runzelig, , nach 3 Tagen goldgelb, nach 7 Tagen hell braun; Luftmycel sammetig, milchweiss nach 3 Tagen, aschgrau nach 7 Tagen. Bildet ein hellbraunes Pigment.

5. Glucose-Asparagin-Agar : Wachstum, schleierartig, weissgrau bis grünlichgrau; Luftmycel sammetig, grünlichgrau nach 3 Tagen, bräunlichgrau nach 7 Tagen, asch grau nach 13 Tagen. Keine Pigmentbildung.

6. Ca-malat-Agar : Wachstum dünn, weiss gelb bis grau, hellgelb nach 13 Tagen, Luft- mycel staubig, weissgrau, nach 7 Tagen asch grau in dem untern Teil des Schrägagar, über all grau nach 13 Tagen. Keine Pigment bildung.

7. Gelatinestich bei 1S : Oberflächliches Wachstum, braun bis bleigrau ; Luftmycel staubig, kreideweiss; Verflüssigung langsam (0,4 bis 0,5 cm) nach 21 Tagen, 0,7 bis 1,0 cm nach 37 Tagen. Substrat kaum ge färbt.

B. Stärkeplatte: Wachstum dünn, asch grau; Luftmycel sammetig aschgrau. Stärke schwach hydrolysiert (0,3 cm nach 4 Tagen).

9. Nähragar (hergestellt aus 10 g Fleisch extrakt, 10 g Pepton, 5 g NaCl, 17 g Agar; 1 1 Wasser, pH 7,2): Wachstum dünn, glatt, hellgelb, kein Luftmycel nach 13 Tagen. Substrat nicht gefärbt.

10. Kartoffel: Substratmycel flechten artig, hellgelb; Luftmycel zuerst spärlich, dann staubig bleigrau. Bildet kein deutliches Pigment.

11. Karotte: Wachstum sehr gut, dünn, schleierartig, weissgelb; Luftmycel sammetig, nach 3 Tagen schneeweiss, nach 7 Tagen aschgrau. Keine Exopigmentbildung.

12. Lackmusmilch (Difco Nr. B 107) : Ober flächliches Wachstum, mit aschgrauem Luft- mycel ; Gerinnung und Peptonisierung deut lich nach 7 Tagen, Lackmus schwach rot.

Der Stamm A 8703 weist einige Ähnlich keit mit Streptomyces griseoluteus Umezawa und Mitarbeiter auf, wächst aber gut auf Gelatine; ebenfalls gleicht er Streptomyces griseolus (Waksman) Waksman et Henrici, aber sein Luftmycel ist nicht von Anfang an grau, zeigt auch andere Reaktionen auf Milch.

Streptomyces flavogriseus (Duche) Waksman et Lechevalier unterscheidet sich vom neuen Stamm insbesondere durch sein Verhalten auf Nähragar und Milch, Strepto- myces bikiniensis Johnstone et Waksman bildet kein dunkelbraunes Pigment.

Stamm A 8703 wächst, nach der Methodik von T. G. Pridham und D. Gottlieb, J. Bac- teriology 56, 107 (1948), untersucht, bei Ver- ,Wendung verschiedener Kohlenstoffquellen wie folgt:

EMI0003.0032

L-xylose <SEP> D-Mannit <SEP> -f L-Arabinose <SEP> -f- <SEP> D-Sorbit <SEP> (-)
<tb> L-Rhamnose <SEP> -f- <SEP> Dulcit <SEP> D-Fruktose <SEP> + <SEP> Mesoinosit <SEP> (-E-)
<tb> D-Galaktose <SEP> + <SEP> Salicin
<tb> Saccharose <SEP> - <SEP> Natriumacetat <SEP> (-)
<tb> Maltose <SEP> Natriumcitrat <SEP> (-)
<tb> Lactose <SEP> -E- <SEP> Natriumsuccinat <SEP> (-)
<tb> Raffinose <SEP> - <SEP> Glyzerin <SEP> -f Inulin <SEP> -1- <SEP> Glukose <SEP> + :Dabei bedeutet gutes Wachstum, sichere Verwendung der betreffenden C-Quelle; schwaches Wachstum, Verwendung der betreffenden C-Quelle fraglich.

(-) Wachstum sehr schwach, Verwendung unwahrscheinlich; - kein Wachstum, keine Verwendung.

Es können auch Varianten dieses Stam mes verwendet werden, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senf- ölen, gewonnen werden.

Zur Erzeugung des Foromacidin wird der Pilz z. B. in wäBriger, anorganische Salze, stickstoffhaltige Verbindungen und gegebe nenfalls Kohlehydrate enthaltender Nähr lösung aeröb gezüchtet.

Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispielsweise Chloride, Nitrate, Car- bonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan. An stick stoffhaltigen Verbindungen und gegebenen falls zuzusetzenden Kohlehydraten und wachstumsfördernden Stoffen seien z. B.

genannt: Aminosäuren und ihre Gemische, Poptide und Proteine sowie ihre Hydrolysate, wie Popton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie von Mais und Weizen, von Destillations- rückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwoll- pflanze, ferner Glukose; Saccharose, Lactose, Stärke usw.

Die Züchtung erfolgt am besten aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächen kultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauer stoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Formentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 22 und 32 . Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 11/2-5 Tagen.

Zur Isolierung des Antibiotikums aus dem vom Mycel abgetrennten Kulturfiltrat kön nen z. B. folgende Verfahren dienen: Man extrahiert das Kulturfiltrat, vorteilhaft bei einem pH über 7,0, mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Estern niederer Fettsäuren, beispiels weise Äthylacetat oder Amylacetat, chlorier ten Kohlenwasserstoffon, z. B. Äthylenchlo- rid, Methylenchlorid oder Chloroform, Keto- nen, z.

B. . Methylpropylketon, Methylamyl- keton oder Diisobutylketon, Alkoholen, wie Butylalkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z. B. Äthyläther, Diisopropyläther, Dibutyl- äthern oder Glykoläthern und dergleichen.

Anstelle einer Lösungsmittel-Extraktion des Kulturfiltrates oder in Kombination mit einer solchen als weitere Reinigungsoperation, kann man das Antibiotikum auch durch Adsorption isolieren, beispielsweise an Aktiv kohle oder aktivierte Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschliessende Extraktion des Adsorbates z.

B. mit einer sauren wäss- rigen Lösung und/oder mit einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Isopropanöl, Butanol oder Methyläthylketon.

Ein gutes Reinigungsverfahren für das neue Antibiotikum stellt die Verteilung zwi schen einer sauren wässrigen Lösung, bei spielsweise einem 0,2molaren Citratpuffer, und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Chloroform oder Methylenchlorid, dar. Zweckmässig er folgt die Verteilung nach dem Gegenstrom verfahren in entsprechenden Apparaten. Auch Chromatographie ist zur Reinigung sehr geeignet. Die Gewinnung des reinen Anti biotikums in kristalliner Form nimmt man z.

B. aus organischen Lösungsmitteln, wie Äther-Petroläther-Gemischen, Benzol-Petrol- äther-Gemischen oder Aceton-Petroläther- Gemischen vor. Zur Umkristallisation kön nen dieselben Lösungsmittel oder auch wässrig-organische Lösungen, wie verdünnte Alkohole, verdünntes Aceton usw., dienen.

Das Foromacidin und seine Salze können als Heilmittel Verwendung finden. Man ver wendet gewöhnlich Präparate, welche die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeuti schen organischen oder anorganischen Trä germaterial enthalten. Hierfür kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbin dungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat,Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger.

Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cre- men, Suppositorien oder in flüssiger Form, als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Kon- servierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten..

Bei8piel Man bereitet eine Nährlösung der Zu sammensetzung: 10 g Rohglukose, 10 g des Handelsproduktes Distillers Solubles , 5 g Natriumchlorid, 1 g Natriumnitrat, 10 g Cal- ciumcarbonat und 11 Leitungswasser und stellt sie auf pH 7,8 ein.

Diese bzw. ein Viel faches derselben wird in 500-cm3-Erlen- meyern (mit je 100 cm3 Nährlösung) oder in 500-1-Fermentern (mit je 3001 Nährlösung) abgefüllt und 20-30 Minuten bei 1 atü sterili siert. Dann impft man mit bis zu 100/, einer teilweise sporulierenden, vegetativen Kultur des Stammes A 8703 an und inkubiert unter gutem Schütteln bzw.

Rühren und in den Fermentern unter Belüftung (mit etwa 1 Vol. steriler Luft pro Vol. Nährlösung pro Minute) bei27'. Nach 48 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen unter Zusatz eines Filter hilfsmittels durch eine Filterpresse oder ein rotierendes Filter und befreit so die anti- bioticumhaltige wässrige Lösung vom Mycel und andern festen Bestandteilen.

Je 1501 Kulturfiltrat werden bei p, 8,5 mit 901 Äthylacetat im Westfalia-Extraktor ausgezogen. Den Extrakt engt man in einem Dünnschichten-Eindampfer auf etwa 21 ein und schüttelt den Rückstand 8mal mit je 100 cm3 0,5 n.-wässriger Essigsäure, wobei die gesamte Aktivität in die wässrige Phase über geht. Der essigsaure Auszug wird mit konzen trierter Sodalösung alkalisch gestellt und 5mal mit je100 cm3 Essigester ausgeschüt telt.

Die Essigesterlösung wird gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und im Va kuum bei 40 zur Trockne verdampft. Es bleiben 1,48 g eines gelblichen amorphen Produktes.

1,18 g dieses Materials werden nach Craig über 90 Stufen im Lösungsmittelsystem i Chloroform und 0,2-n. Citratpuffer (p, 5,0) verteilt. Es bildeten sich drei Aktivitäts maxima aus in den Stufen 0 und 28 sowie 66. Die Fraktionen 58-75 mit der Hauptaktivität werden vereinigt, mit Soda alkalisiert und mehrmals mit Chloroform ausgezogen. Der organische Extrakt wird mit wenig Wasser gewaschen und eingedampft. Es werden 330 mg rohes Foromacidin als gelbes zäh flüssiges Öl erhalten.

Dieses Produkt verteilt man erneut im gleichen Lösungsmittelsystem über 5 2 Stu fen, wobei es sich als weitgehend einheitlich erweist. Die Aufarbeitung der aktiven Frak- tionen wird in drei Portionen durchgeführt, Fraktionen 33-39 (65 mg), Fraktionen 40-44 (120 mg) und Fraktionen 45-52 (46 mg). Die Fraktionen 40-44 kristallisieren aus Äther- Petroläther. Durch Animpfen mit diesem Material kristallisieren auch die Fraktionen 33-39 und 45-52. Insgesamt werden 164 mg Kristalle gewonnen. Die Umkristallisation erfolgt aus Benzol-Petroläther.

Das erhaltene Foromacidin bildet farb lose Kristalle vom F. = 126-128 . Die Ele mentaranalysen (nach 10stündigem Trock nen bei 80 im Hochvakuum) liefern folgende Werte
EMI0005.0017

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Foro- macidin, dadurch gekennzeichnet, dass man den Streptomyces-Stamm A 8703 kultiviert und das gebildete Foromacidin hierauf aus dem Kulturfiltrat isoliert. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man in wässriger, anorganische Salze, stickstoffhaltige Ver bindungen und eine Kohlenstoffquelle ent haltender Nährlösung unter aeroben Be dingungen, vorzugsweise submers, während 36-120 Stunden bei Temperaturen zwischen 22 und 32 züchtet. 2.

Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum aus dem Kulturfiltrat bei einem p. über 7,0 durch ein mit Wasser nicht mischbares, organisches Lösungsmittel extrahiert wird. 3. Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1 und 2, dadurch ge kennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Verteilung zwischen einer sauren wässrigen Lösung und einem mit Wasser nicht misch baren organischen Lösungsmittel gereinigt wird. 4. Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1-3, dadurch gekenn zeichnet, dass die Verteilung nach dem Gegen stromverfahren erfolgt. 5.

Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1-4, dadurch gekenn zeichnet, dass das Antibiotikum aus einem organischen Lösungsmittel kristallisiert wird.