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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung eines Analyten in
einer Probe unter Anwendung einer Lumineszenzreaktion. Die Vorrichtung
weist eine Basisplatte, einen Meßchip und einen optischen Detektor
für das Erfassen
von Lichtsignalen von dem Meßchip
auf. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung einen Meßchip für eine solche
Vorrichtung.
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Meßgeräte der genannten Art werden
vor allem in der chemischen, biochemischen, klinischen und umwelttechnischen
Analytik eingesetzt, und zwar insbesondere für Untersuchungen, bei denen eine
hohe Empfindlichkeit und Selektivität für die nachzuweisenden Substanzen
erwünscht
ist. Der Nachweis von Analyten beruht auf der Detektion von Licht,
das durch Chemilumineszenz oder Fluoreszenz in Abhängigkeit
von der Menge an vorhandenem Analyten erzeugt wurde. Eine häufig verwendete
Chemilumineszenzreaktion ist die Reaktion von Luminol und Wasserstoffperoxid
mit dem Enzym Peroxidase, vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase. Die Peroxidase
ist je nach Art des Messverfahrens mit einem gegen den Analyten
gerichteten Antikörper
oder mit einem Derivat des Analyten kovalent verbunden. Man spricht
von einem Enzymtracer.
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Beispiele für Analyten, die sich für eine Detektion
mit einer Vorrichtung nach der Erfindung eignen, sind Kontaminationen
von TNT (Trinitrotoluol) oder Atrazin in Böden und Gewässern. Eine kontami vierte Probe
wird mit spezifischen immobilisierten Antikörpern gegen den Analyten in
Kontakt gebracht, und der in der Probe enthaltene Analyt wird dann
von den Antikörpern
gebunden. Im nächsten
Schritt wird die Probe durch Waschen mit einem Puffer von den immobilisierten
Antikörpern
getrennt. Ein Enzymtracer, z. B. ein mit Meerrettich-Peroxidase
gekoppeltes Derivat des Analyten, wird auf die Antikörper aufgebracht,
wobei der Enzymtracer von den noch nicht belegten Bindungsstellen
der Antikörper
gebunden wird. Nach erneutem Waschen mit Puffer wird in einem weiteren
Schritt die Lumineszenzreaktion durchgeführt. Im Falle von Meerrettich-Peroxidase
als an den Tracer gekoppeltes Enzym wird eine Mischung aus Luminol
und Wasserstoffperoxid (H2O2)
auf die Antikörper
aufgebracht. Das bei der stattfindenden Chemilumineszenreaktion
emittierte Licht wird mit dem optischen Detektor erfaßt, und
aus der detektierten Lichtmenge werden Rückschlüsse auf die Analytmenge gezogen.
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Da die beteiligten chemischen Substanzen im
allgemeinen in flüssiger
Form vorliegen, ist die Handhabung der Chemikalien sehr aufwendig.
Darüber
hinaus sind die für
den Nachweis verwendeten Chemikalien zumindest teilweise verderblich,
so daß bei
den bekannten Meßgeräten nach
der Benutzung eine intensive Reinigung erfolgen muß, die außerhalb
des Labors nicht zu bewerkstelligen ist. Es sind daher bereits vereinzelt
Meßgeräte vorgeschlagen worden,
bei denen die Probe, ein Tracer und ein geeignetes Reaktionsmittel
nacheinander auf eine ebene Reaktionsfläche, z.B. ein Objektträger, auf
der Antikörper
immobilisiert worden sind, aufgebracht werden. Dadurch wird zwar
die Handhabung der chemischen Reaktion, insbesondere die Trennung
der Antikörper
von den Substanzen, deutlich vereinfacht, die Genauigkeit dieser
Meßgeräte ist jedoch
aufgrund der geringen Dichte der Antikörper auf der ebenen Meßfläche nur
sehr gering. Um die bei diesen Meßgeräten emittierte Strahlung überhaupt
mit akzeptabler Genauigkeit zu detektieren, ist ein sehr empfindliches
Lichtdetektionssystem erforderlich, das aufgrund der notwendigen
hochpräzisen
Justage nicht transportierbar ist, so daß die Verwendung dieses Verfahrens
bei mobilen Meßgeräten ausscheidet.
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Die bekannten Meßgeräte sind des weiteren auch im
allgemeinen nur für
die Detektion eines ganz bestimmten Analyten geeignet. Wenn mit
demselben Meßgerät ein anderer
Analyt nachgewiesen werden soll, müssen zumindest die Antikörper und
der Tracer ausgetauscht werden, was einen aufwendigen Umbau des
Meßgeräts erfordert.
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Es ist daher Aufgabe der Erfindung,
eine Vorrichtung und einen Meßchip
der eingangs genannten Art zur Verfügung zu stellen, die eine leichte
Handhabung der für
die Reaktion notwendigen Flüssigkeiten erlauben,
kleine Ausmaße
haben und bei denen die emittierte Lichtintensität sehr groß ist, so daß die emittierte
Lichtmenge leicht mit hoher Genauigkeit erfaßt werden kann.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch eine
Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer
Probe unter Anwendung einer Lumineszenzreaktion gelöst, die
eine Basisplatte, einen Meßchip
und einen optischen Detektor für
das Erfassen von Lichtsignalen von dem Meßchip aufweist, wobei der Meßchip eine
von Fluid überströmbare Reaktionsfläche aufweist,
die für
die Durchführung
der Lumineszenzreaktion auf der Fläche ausgelegt ist und zumindest
eine Erhöhung
oder eine Vertiefung aufweist.
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Durch solch eine Erhöhung oder
eine Vertiefung, die in beliebiger Art und Weise ausgebildet sein kann,
wird die Reaktionsfläche
bei gleichbleibender Grundfläche
vergrößert. Dies
hat zur Folge, daß auf der
selben Grundfläche
eine größerer Anzahl
von beispielsweise Antikörpern
aufgebracht werden kann, was wiederum zur Folge hat, daß die Lichtintensität, das heißt die Anzahl
der bei der lumineszenten Reaktion abgestrahlten Photonen je Grundfläche erhöht wird.
Durch die erfindungsgemäße Ausgestaltung
der Reaktionsfläche
wird daher die Lichtintesität des
emittierten Lichtes erhöht,
wodurch die Lichtdetektion einfacher erfolgen kann und die Vorrichtung sogar
als portables Gerät
ausgestaltet werden kann.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung weist die Reaktionsfläche eine Mehrzahl von Erhöhungen und/oder
Vertiefungen mit im wesentlichen gleicher Form auf, die vorzugsweise
periodisch angeordnet sind. Mit anderen Worten kann die Fläche des
Meßeinsatzes
beispielsweise noppenartig oder geriffelt aufgebaut sein. Prinzipiell
sind alle möglichen
Arten von Erhöhungen
und/oder Vertiefungen möglich.
Durch die Vielzahl von Erhöhungen und/oder
Vertiefungen der Reaktionsfläche
wird, wie dies auch schon bei einer Erhöhung oder einer Vertiefung
der Fall ist, wird die Oberfläche
bei gleichbleibender Grundfläche
stark vergrößert, so
daß eine
höhere
Lichtintensität
erzielt wird.
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Bei zahlreichen Versuchen hat sich
herausgestellt, daß die
Erhöhung
oder die Vertiefung mit Vorteil die Erhöhungen (36) oder Vertiefungen
polyederfömig
und am besten pyramidenförmig,
pyramidenstumpftörmig,
tetraederförmig,
keilförmig,
obeliskförmig,
kegelförmig
oder kegelstumpftörmig
sind, da dann eine sehr hohe Lichtausbeute erzielt werden kann.
Grundsätzlich
sind alle Polyedertormen möglich.
Bevorzugt sind aber konische bzw. zumindest abschnittweise spitz
zulaufende Formen, da diese einfacher hergestellt werden können. Außerdem haben
diese Formen und insbesondere die Pyramidenform den zusätzlichen
Vorteil, daß ein
größerer Anteil der
durch die Lumineszenzreaktion erzeugten Photonen in Richtung des
Detektors abgestrahlt wird.
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In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform
weist die Reaktionsfläche
mehrere Reihen von pyramidenförmigen
Erhöhungen
oder Vertiefungen auf. Mit anderen Worten besteht die Reaktionsfläche aus
einer Vielzahl von direkt nebeneinander angeordneten pyramidenförmigen Erhöhungen.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
sind die Erhöhungen
pyramidenförmig
mit quadratischer Grundfläche.
Das Verhältnis
der Höhe zur
Seitenlänge
der Grundfläche
(Aspektverhältnis) beträgt mehr
als 0,25 und liegt vorzugsweise zwischen 0,5 und 3 und besonders
bevorzugt zwischen 1,75 und 2,5 Durch das relativ große Aspektverhältnis wird
die Oberfläche
bei gleichbleibender Grundfläche
des Meßeinsatzes
weiter erhöht,
so daß es
zu einer verstärkten
Lichtintensität
kommt. Darüber
hinaus hat sich bei dieser Anordnung gezeigt, daß ein größerer Anteil der erzeugten
Photonen bzw. Lichtsignale in Richtung des Detektors abgestrahlt
wird. Die Oberflächenstruktur
der Reaktionsfläche
wirkt daher wie ein optischer Trichter, so daß ein Großteil der durch die Lumineszenzreaktion
erzeugten Photonen direkt in Richtung des Detektors abgestrahlt
werden.
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Da es bei der Herstellung der pyramidenförmigen Konstruktion
oftmals zu Gratbildungen kommt, wird für eine alternative Ausführungsform
erfindungsgemäß vorgeschlagen,
daß an
Stelle von pyramidenförmigen
Erhöhungen
die Form von Pyramidenstümpfen
verwendet wird.
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In einer besonders zweckmäßigen Ausführungsform
sind die Seiten der rechteckigen, vorzugsweise quadratischen Grundfläche der
pyramidenförmigen
Erhöhungen
derart orientiert, daß sie
mit der Hauptströmungsrichtung
des Fluids über
die Reaktionsfläche
einen Winkel zwischen 1° und
89°, vorzugsweise
zwischen 30° und
60°, besonders
bevorzugt zwischen 40° und
50° einschließen.
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Es hat sich nämlich gezeigt, daß die Genauigkeit
der Meßvorrichtung
noch erhöht
werden kann, wenn dafür
Sorge getragen wird, daß die
Probe und die für
den Nachweis des Analyten notwendigen chemischen Flüssigkeiten
möglichst
gleichmäßig über die
gesamte Reaktionsfläche
geleitet werden. Überraschenderweise
hat sich dabei herausgestellt, daß die pyramidenförmige Ausgestaltung
der Meßeinsatzfläche die
gleichmäßige Überströmung des
Meßeinsatzes
begünstigt.
Besonders günstig
ist es, wenn die Pyramiden gerade nicht derart angeordnet sind, daß die sich
zwischen zwei benachbarten Pyramidenreihen bildenden „Täler" in Richtung der
Hauptströmungsrichtung
des Fluids ausgerichtet sind, so daß das Fluid direkt entlang
dieser „Täler" fließen kann.
Die „Täler" sind daher mit Vorteil
schräg
und besonders bevorzugt diagonal, d.h. mit einem Winkel von etwa
45°, zu
der Hauptströmungsrichtung
angeordnet, so daß eine
möglichst
gleichmäßige Umspülung der
pyramidenförmigen
Erhebungen sichergestellt ist.
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Besonders bevorzugt ist die Reaktionsfläche auf
einem Grundkörper
ausgebildet ist, der aus einem Polymer, vorzugsweise aus Polymethylvinyl
und besonders bevorzugt aus Polymethylmethacrylat (PMMA) besteht.
Mit Vorteil wird die Reaktionsfläche zumindest
abschnittsweise mit einem Metall, vorzugsweise mit Gold, beschichtet.
Gegebenenfalls kann mit Vorteil zwischen der Goldschicht und dem Meßeinsatz
Chrom oder Titan, vorzugsweise Titan, als Haftvermittler eingesetzt
werden. Die Goldschicht unterstützt
nicht nur die Immobilisierung der Antikörper auf der Reaktionsfläche, sondern
sorgt darüber hinaus
auch für
eine Reflexion der durch die Lumineszenzreaktion emittierten Photonen,
so daß der Anteil
der emittierten Photonen, die zu dem optischen Detektor gelangen,
erhöht
wird. Die Reaktionsfläche stellt
daher quasi einen optischen Trichter für die durch die Lumineszenzreaktion
erzeugten Photonen dar.
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Eine weitere besonders bevorzugte
Ausführungsform
sieht vor, daß in
Fluidströmungsnchtung vor
und hinter der Reaktionsfläche
ein Fluidzuleitungskanal bzw. ein Fluidableitungskanal vorgesehen
ist. Dies hat unter anderem den Vorteil, daß der Meßchip leicht austauschbar ist
und z.B. als Einwegmeßchip
ausgestaltet werden kann. Der Meßchip kann nach Beendigung
der Messung samt der mit verderblichen Antikörpern behafteten pyramidenförmigen Meßeinsatzschicht
aus der Vorrichtung entnommen werden und durch einen anderen Meßchip ersetzt
werden. Eine aufwendige Reinigung, wie sie im Stand der Technik
notwendig ist, entfällt
somit.
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In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform
weist der Meßchip
eine Probenvorratskammer auf. Weiterhin kann vorgesehen sein, daß der Meßchip eine
Vorratskammer für
einen Tracer, z.B. einen Enzymtracer, aufweist, die vorzugsweise
einen Zuleitungs- und einen AbleitungskanaI besitzt. Insbesondere
das Vorsehen der Vorratskammer für
einen Tracer, das im allgemeinen ebenfalls leicht verderblich ist,
ist von großem
Vorteil. Durch Austausch des Meßchips
werden nämlich
in diesem Fall gleichzeitig alle Tracerreste mit ausgetauscht, so daß die Reinigung
der Vorrichtung nach einer Messung weiter vereinfacht wird.
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Da der Tracer möglicherweise in einer nicht leicht
fließfähigen Form
vorliegt, ist vorzugsweise ein Zuleitungs- und ein Ableitungskanal
vorgesehen. So könnte
beispielsweise eine Pufferlösung über den Zuleitungskanal
in die Tracer-Vorratskammer eingebracht werden, die den Tracer über den
Ableitungskanal aus der Vorratskammer herausspült. Der Tracer kann dann zusammen
mit der Pufferlösung über die
Meßeinsatzfläche geleitet
werden.
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Versuche haben gezeigt, daß die Vorratskammer
für den
Tracer mit Vorteil einen mäanderförmigen Abschnitt
aufweist, da dann ein optimales Ausspülen des Tracers aus der Vorratskammer
möglich ist.
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Mit Vorteil ist die Vorratskammer
für den
Tracer derart bemessen, daß sie
im wesentlichen exakt diejenige Tracermenge aufnehmen kann, die
für eine einzige
quantitative Bestimmung eines Analyten notwendig ist.
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Um den Meßchip vor der Messung mit der Tracermenge
und gegebenenfalls mit dem Probenmaterial zu befüllen, wird erfindungsgemäß vorgeschlagen,
daß zumindest
ein Zuleitungs- oder zumindest ein Ableitungskanal mit Hilfe einer
Dichtung, vorzugsweise einer Silikondichtung oder einem Septum, verschlossen
ist. Es ist daher leicht möglich,
den Tracer mit einer Spritze in die entspre chende Vorratskammer
einzubringen. Da die Vorratskammer aufgrund der Dichtung gut verschlossen
ist, wird eine hohe Haltbarkeit des leicht verderblichen Tracers
gewährleistet.
Das Tracermitel kommt erst unmittelbar vor Einsatz des chemischen
Nachweisverfahrens mit anderen Chemikalien in Berührung und
wird unmittelbar im Anschluß an
die chemische Nachweisreaktion samt Meßchip aus der Vorrichtung entfernt.
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Erfindungsgemäß ist der Meßchip vorzugsweise
von der Basisplatte abnehmbar und austauschbar. Durch die erfindungsgemäße Anordnung der
Vorratskammer für
den Tracer und der Reaktionsfläche,
auf der beispielsweise gegen den zu bestimmenden Analyten gerichtete
Antikörper
immobilisiert sind, kann der Meßchip
auch einfach gegen einen Meßchip
mit einer Reaktionsfläche,
die gegen einen anderen zu bestimmenden Analyten gerichtete Antikörper enthält, und
einer mit einem anderen Tracer befüllte Vorratskammer ausgetauscht
werden. So kann mit derselben Vorrichtung nur durch Austausch des
Chips eine Mehrzahl von Analyten zügig nachgewiesen werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
hat die Basisplatte Vorratsbehälter
und/oder Anschlüsse für Reagenzien
und Pufferlösungen.
Z. B. könnte
ein Vorratsbehälter
oder ein Zuführungsanschluß sowohl für Lumirol
als auch für
Wasserstoffperoxid und eine Pufferlösung vorgesehen sein. Durch
entsprechende Steuerung kann dann je nach Bedarf aus den verschiedenen
Vorratsbehältern
die entsprechende Chemikalie zu dem Meßchip übertragen werden.
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Es hat sich gezeigt, daß mit Vorteil
ein Mischer auf der Basisplatte angeordnet ist. Dies hat den Vorteil,
daß Reagenzien
unmittelbar vor der Zugabe auf die Reaktionsfläche gemischt werden können. Eine
optimale Durchmischung sowie eine genaue Dosierung der Menge des
Gemischs ist dadurch möglich,
was insbesondere bei Mischungen, die verderblich sind oder bei denen
nach einer gewissen Zeit eine Phasentrennung einsetzt, von Vorteil.
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Als optischer Detektor kommt vorzugsweise ein
Photomultiplier zum Einsatz.
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Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten
der vorliegenden Erfindung werden deutlich anhand der folgenden
Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform sowie der dazugehörigen Figuren.
Es zeigen:
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1 und 2 jeweils eine Explosionsansicht
einer Ausführungsform
der Erfindung,
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3 eine
vergrößerte Darstellung
der Basisplatte der in den 1 und 2 gezeigten Ausführungsform
der Erfindung in einer Explosionsansicht,
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4 eine
vergrößerte Darstellung
des Meßchips
der in den 1 und 2 gezeigten Ausführungsform
der Erfindung in einer Explosionsansicht,
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5 eine
vergrößerte Ansicht
des Meßchips
mit angehobener Abdeckplatte,
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6 eine
perspektivische Schnittansicht des Meßchips,
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7 eine
Schnittansicht des Meßchips,
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8 eine
Detailvergrößerung der
Meßzelle bzw.
des Meßeinsatzes,
und
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9-13 schematische Darstellungen
des Fluidflusses in der Vorrichtung für verschiedene Betriebszustände.
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In den 1 und 2 ist jeweils eine Explosionsansicht
einer Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
für die
Atrazin-Detektion gezeigt. Die wesentlichen Elemente der Vorrichtung
sind die Basisplatte 3 zur Fluidverteilung, die mit Mikromagnetventilen 45 ausgestattet
ist, der Meßchip 2 und der
Detektor 4 mit der Detektorabschirmung 5, 6, 7, 8.
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Der Detektor 4 ist bei der
gezeigten Ausführungsform
ein miniaturisierter Photomultiplier. Ausführliche Messungen haben gezeigt,
daß handelsübliche einfache
Detektoren, wie sie für
Chemilumineszenzmessungen angeboten werden, für die vorliegende Meßaufgabe
nicht empfindlich genug sind. Der verwendete hochempfindliche Photomultiplier 4 muß jedoch
lichtdicht gekapselt werden, da er durch Tageslichteinfluß geschädigt wird.
Zu diesem Zweck wird der Detektor 4 innerhalb eines Kastens
angeordnet, der durch die Seitenteile 5, 6, 7, 8 und
die Basisplatte 3 gebildet wird.
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Die gesamte Vorrichtung ist kompakt
ausgeführt
und daher tragbar. Der Meßchip 2 ist
als Einwegchip ausgeführt,
der die empfindlichsten und verderblichen Komponenten, das heißt die biologisch aktiven
Substanzen, wie z. B. die Antikörper
und einen Enzymtracer, bereits in definierten Mengen für jeweils
eine Messung dicht verschlossen und damit lagerfähig enthält.
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Die Basisplatte 3 ist in 3 vergrößert in einer Explosionsansicht
dargestellt. Die Basisplatte 3 besteht aus zwei Teilen 8, 9.
Der obere Teil 8 der Basisplatte ist aus transparentem
PMMA gefertigt, der untere Teil 9 aus schwarzem PMMA. Dies
hat den Vorteil, daß Laserschweißen für die Verbindung
der beiden Platten und zum Abdichten der Fluidkanäle verwendet
werden kann. In dem oberen Teil 8 der Basisplatte 3 ist
eine Ausnehmung 10 zur Aufnahme des Meßchips 2 dargestellt.
Weiterhin ist ein Durchgang 11 für den Detektor vorgesehen.
Auf dem unteren Teil 9 der Basisplatte 3 sind
verschiedene Fluidkanäle
eingefräst,
deren Funktion noch erläutert
wird. Weiterhin trägt
die Basisplatte die Bohrungen 22 für die Montage der Mikroventile 45.
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Das Reaktionsmittel – auch Substrat
genannt -, das bei diesem Verfahren zum Einsatz kommt, besteht aus
zwei Flüssigkeiten
(Luminol und eine wäßrige Wasserstoffperoxidlösung). Diese
müssen
unmittelbar vor der Nachweisreaktion gemischt werden, da die Haltbarkeit
der Mischung nur sehr begrenzt ist. Um dies zu ermöglichen
und eine optimale Vermischung der beiden Komponenten zu gewährleisten,
ist ein Mikromischer 16 auf der Basisplatte 3 aufgenommen.
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In 4 ist
der als Einwegchip ausgestaltete Meßchip 2 gezeigt. Wie
bereits erwähnt,
sind die empfindlichsten Komponenten, nämlich die verderblichen biologisch
aktiven Komponenten, bereits in definierten Mengen für jeweils
eine Messung dicht verschlossen und damit lagerfähig in dem Meßchip aufgenommen.
Der Meßchip 2 besteht
aus einem Basisteil 23, einer oberen transparenten Abdeckplatte 27 und
einer unteren Abdeckplatte 34 zum Verschließen der
Probenvorratskammer.
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Die wesentlichen Komponenten des
Meßchips 2 sind
das Probenvorratsvolumen 35, das von der Rückseite
befüllt
wird und mit der unteren Abdeckplatte 34 verschlossen wird,
die Mäanderstruktur 26,
in der der Enzymtracer gelagert wird, sowie die Meßzelle,
die ihrerseits aus der Reaktionsfläche 24, die auf einem
Grundkörper 47 angeordnet
ist und auf der Antikörper
immobilisiert sind, und dem fluidischen Zu- und Abführsystem 31, 32 besteht.
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Im montierten Zustand liegt die obere
Abdeckplatte 27 des Meßchips 2 auf
der Oberfläche
der Ausnehmung 10 der Basisplatte 3 auf. Dadurch
wird einerseits der Vorratsraum für den Tracer verschlossen und
andererseits wird dadurch oberhalb der Reaktionsfläche 24 ein
Reaktionsraum gebildet, durch den während des Nachweisverfahrens
die verschiedenen Fluide fließen.
Die Abdeckplatte 27 ist transparent ausgeführt, damit
die auf der Reaktionsfläche 24 emittierten
Lichtsignale den Reaktionsraum bzw. den Meßchip in Richtung des optischen
Detektors 4 verlassen können.
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Die Probenvorratskammer 35,
der Mäander 26 für den Enzymtracer
und die Meßzelle
werden mittels laserverschweißter
Abdeckplatten verschlossen. Die Probenvorratskammer 35 ist
konisch geformt, um eine vollständige
Entleerung zu ermöglichen.
Alle Fluidein- und -ausgänge 28, 29, 30, 31, 32 sind
durch spezielle Silikondichtungsscheiben 25 verschlossen, die
eine einfache und luftfreie Befüllung
des Enzymtracer-Vorratsraumes 26 und der Meßzelle mittels Nadelspritzen
erlauben. Der Chip 2 wird dann mittels Paßstiften
an die Basisplatte 3 montiert. Die fluidischen Verbindungen
werden über
Injektionsnadeln, die in der Basisplatte montiert sind, hergestellt.
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5 zeigt
eine perspektivische Ansicht des Meßchips 2, wobei der
Grundkörper 47 mit
der Reaktionsfläche 24 und
die Dichtungen 25 bereits eingesetzt sind. Zur Verdeutlichung
des genauen Aufbaus des Meßchips 2 sind
in den 6 und 7 eine perspektivische Schnittansicht
bzw. eine Schnittansicht durch den Meßchip 2 gezeigt. Hier
ist deutlich der Vorratsraum 35 für die Probe zu erkennen, die
durch die untere Abdeckplatte 34 verschlossen ist. Die
Probe kann durch den Durchgang 28, der über die Dichtung 25 verschlossen
ist, entnommen werden. Der mäanderförmige Vorratsraum 26 für den Enzymtracer
weist einen Eingang 29 und einen Ausgang 30 auf.
Soll der Enzymtracer aus dem Vorratsraum 26 entnommen werden,
so kann über
den Eingang 29 beispielsweise eine Pufferlösung zugeführt werden, die
durch den mäanderförmigen Vorratsraum 26 fließt und an
dem Ausgang 30 wieder entnommen wird.
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In gleicher Weise besteht die sogenannte Meßzelle aus
dem Grundkörper 47 mit
der Reaktionsfläche 24 und
einem Zuführungskanal 31 sowie einem
Abführungskanal 32.
Die beiden Kanäle 31, 32 sind
jeweils durch eine Dichtung 25 verschlossen. Ein gewünschtes
Fluid kann über
die Reaktionsfläche 24 geleitet
werden, indem eine Injektionsnadel durch die Dichtung 25 des
Eingangs 31 der Meßzelle dringt
und das Fluid abgibt, wobei gleichzeitig über eine weitere Injektionsnadel,
die durch die Bohrung in der Abdeckplatte 27 und durch
die Dichtung 25 in den Ablaßkanal 32 dringt,
das Fluid wieder abfließen kann.
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In der 8 ist
eine vergrößerte Darstellung der
Meßzelle
einschließlich
des Grundkörpers 47 mit der
Reaktionsfläche 24 gezeigt.
Die Reaktionsfläche 24 hat
eine quadratische Grundfläche,
die derart ausgewählt
wurde, daß sie
exakt dem optischen Eingang des Photomultipliers 4 entspricht.
Die Reaktionsfläche 24 weist
eine Vielzahl von in Reihen angeordneten Pyramiden 36 mit
quadratischer Grundfläche
auf. Diese Reihen sind nicht in Richtung der Haupttließrichtung 38 der
Meßzelle
angeordnet, sondern diagonal hierzu. Mit anderen Worten sind die
Seiten der quadratischen Grundfläche
der einzelnen Pyramiden derart orientiert, daß sie mit der Hauptströmungsrichtung 38 des
Fluids über
der mit Antikörpern
beladenen Fläche
einen Winkel einschließen
und zwar vorzugsweise zwischen 30° und
60°, besonders
bevorzugt zwischen 40° und
50°.
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Außerdem sind in der Fluidzuführung drei Strömungsbrecher 39 angeordnet,
die einen trapezförmigen
Querschnitt haben und der gleichmäßigen Verteilung des Fluids
dienen.
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In der bevorzugten Ausführungsform
haben die Pyramiden ein Aspektverhältnis von etwa 2, das heißt, die
Höhe der
Pyramide ist etwa doppelt so groß wie die Länge der Seiten der quadratischen
Basisfläche.
Es hat sich gezeigt, daß dieses
Aspektverhältnis
zu einem maximalen Wert der Lichtemission führt. Dies liegt im wesentlichen
an der deutlich vergrößerten Oberfläche bezogen
auf die konstante Grundfläche.
Zum anderen liegt dies jedoch auch daran, daß Pyramiden mit einem Aspektverhältnis von 2
geeignet geneigte Seitenflächen
haben, so daß diese
dazu beitragen, daß das
Lumineszenzlicht an den reflektierend beschichteten Seitenflächen der
Pyramiden zum überwiegenden
Teil in Richtung des optischen Detektors reflektiert werden.
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Der genaue Ablauf des Verfahrens
wird deutlich anhand der schematischen Ablaufdiagramme in den 9 bis 13. Die in den 9 bis 13 gezeigte Anordnung
entspricht dem Verlauf der Fluidkanäle in der Basisplatte 3,
der in 3 gezeigt ist.
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In 9 ist
eine erste mögliche
Einstellung gezeigt, in der die Fluidkanäle in der Basisplatte 3 mit Pufferlösung gespült werden
können.
Dazu werden die Ventile 40, 42, 43 und 44 geschlossen,
während die
Ventile 41 und 45 geöffnet werden. Dies hat zur Folge,
daß über den
Fluideingang für
Puf fer 14 Pufferlösung
durch das Ventil 14 zu dem Ventil 45 und zu dem
Abwasserausgang 15 fließen kann.
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Nachdem die Fluidkanäle entsprechend
vorgereinigt wurden, kann das eigentliche Meßverfahren beginnen. Dazu werden
die Ventile 41 und 45 geschlossen und kurz darauf
die Ventile 42 und 44 geöffnet. Dies hat zur Folge,
daß die
fluide Probe aus dem Probenvorratsraum 35 über das
Ventil 42 und das Ventil 44 durch die Meßzelle und
insbesondere über
die Reaktionsfläche 24 in
Richtung des Abwasserausgangs 15 fließt. Da die Reaktionsfläche in dieser
Ausführungsform
immobilisierte Antikörpern
aufweist, wird sich der zu detektierende Analyt an den Antikörpern binden.
Diese Situation ist in 10 dargestellt.
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Nach einer gewissen Zeit wird, wie
dies in 11 gezeigt ist,
das Ventil 42 geschlossen und die Ventile 41, 43 und 44 werden
gegebenenfalls nach einem nochmaligen Spülvorgang, wie er in 9 gezeigt ist, geöffnet. Dies
bewirkt, daß die
Pufferlösung über das
Ventil 41 und das Ventil 43 in den mäanderförmigen Vorratsraum
des Enzymtracers eindringt, diesen aus dem Vorratsraum herausspült und über das
Ventil 44 in die Meßzelle
und dort über
die Reaktionsfläche 24 leitet,
bevor der Enzymtracer in Richtung des Abwasserausgangs 15 geleitet
wird. Der Enzymtracer bindet dabei an den noch ungebundenen Antikörpern, die
auf der Reaktionsfläche 24 immobilisiert
sind.
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Im nächsten Schritt, den 12 veranschaulicht, werden
die Ventile 41 und 43 wieder geschlossen und das
Ventil 40 wird geöffnet.
Dies hat zur Folge, daß die
beiden Reaktionsmittel, die in der gezeigten Ausführungsform
aus Luminol und Wasserstoffperoxid bestehen, über die beiden Eingänge 12 und 13 in
den Mikromischer 16 fließen, dort geeignet vermischt
werden und die resultierende Mischung dann über das Ventil 40 und
das Ventil 44 in die Meßzelle geleitet wird. Dort
fließt
die Mischung über
die Reaktionsfläche 24 und
verläßt die Meßzelle dann
in Richtung Abwasserauslaß 15.
Sollte sich Enzymtracer an den Antikörpern auf der Reaktionsfläche 24 gebunden
haben, so kommt es zu einer Chemilumineszenreaktion zwischen dem
Luminol und dem Enzymtracer. D. h. es werden Lichtsignale erzeugt,
die die Reaktionsfläche 24 durch
die transparente Abdeckplatte 27 und durch das Durchgangsloch 11 in
der Basisplatte 3 in Richtung des Detektors 4 verlassen
und dort detektiert werden. Die erfaßte Lichtmenge ist direkt proportional
zu der Anzahl der Antikörper,
an denen kein Analyt gebunden ist.
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Nach Ablauf der Reaktion kann ein
gegebenenfalls noch in der Probenkammer 34 verbleibender Probenrest
durch Schließen
der Ventile 40 und 44 sowie Öffnen der Ventile 42 und 45 über den
Abwasserauslaß 15 ausgegeben
werden (13).
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Durch die ertindungsgemäße Vorrichtung wird
ein stark miniaturisiertes, einfach und kostengünstig herzustellendes portables
Meßgerät zur Verfügung gestellt.
Insbesondere durch Verwenden einer Reaktionsfläche 24 mit Vertiefungen
und/oder Erhöhungen,
wird die Meßempfindlichkeit
deutlich erhöht.
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Darüber hinaus ist ein wesentlicher
Aspekt der Erfindung, den Meßchip
als Einwegchip auszugestalten, wobei diejenigen chemischen Komponenten,
die empfindlich, das heißt
verderblich, sind, bereits in der entsprechend vordosierten Menge
in dem Meßchip
aufgenommen sind.
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Es versteht sich daher, daß die erfindungsgemäße Ausbildung
des Meßchips
als Einwegchip, d.h. mit einer Vorratskammer für einen Tracer und/oder mit
einer Reaktionsfläche,
die für
eine Immobilisierung von Antikörpern
ausgelegt bzw. vorbereitet ist oder auf der bereits gegen den zu
bestimmenden Analyten gerichtete Antikörper immoblisiert sind, auch
mit Vorteil in Vorrichtungen eingesetzt werden kann, die keine Reaktionsfläche mit
mindestens einer Erhöhung
bzw. Vertiefung aufweisen, sondern z.B. eine ebene Reaktionsfläche besitzen.
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- 1
- Meßgerät
- 2
- Meßchip
- 3
- Basisplatte
- 4
- optischer
Detektor
- 5,
6, 7, 46
- Detektorabschirmung
- 8
- oberer
Teil der Basisplatte
- 9
- unterer
Teil der Basisplatte
- 10
- Ausnehmung
- 11
- Durchgang
für den
Detektor
- 12–13
- Reaktionsmitteleingänge in dem
Mikromischer
- 14
- Fluideingang
für Puffer
- 15
- Abwasserausgang
- 16
- Mikromischer
- 22
- Bohrungen
- 23
- Basisteil
des Meßchips
- 24
- Meßeinsatz
- 25
- Silikondichtungsscheiben
- 26
- mäanderförmiger Tracer-Vorratsraum
- 27
- transparente
Abdeckplatte
- 28
- Probenkammerausgang
- 29
- Eingang
des Tracer-Vorratsraums
- 30
- Ausgang
des Tracer-Vorratsraums
- 31
- Eingang
der Meßzelle
- 32
- Ausgang
der Meßzelle
- 28–32
- fluidisches
Zu- und Abführsystem
- 33
- Ausnehmung
für Meßeinsatz
- 34
- untere
Abdeckplatte
- 35
- Probenvorratsvolumen
- 36
- pyramidenförmige Erhöhungen
- 38
- FEaupttließrichtung
der Meßzelle
- 39
- Strömungsbrecher
- 40–45
- Ventile
- 47
- Grundkörper