DE10229935B4

DE10229935B4 - Mikroskopschieber zur Einkopplung von Licht in ein Mikroskop

Info

Publication number: DE10229935B4
Application number: DE10229935.8A
Authority: DE
Inventors: Matthias Gonschor; Carsten Hoyer; Michael Brehm
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2002-07-04
Filing date: 2002-07-04
Publication date: 2018-02-08
Anticipated expiration: 2022-07-05
Also published as: JP2004038139A; US7042638B2; DE10229935A1; US20040047032A1

Abstract

Mikroskopschieber (3, 21) zur Einkopplung von Licht in einen Auflichtstrahlengang einer Standard-Auflichtbeleuchtung (13) eines Mikroskopes mit einem Objektiv (10) und einer Tubuslinse (9), wobei der Auflichtstrahlengang in der durch das Objektiv (10) des Mikroskopes definierten optischen Achse (20) des Mikroskops verläuft und die Standardauflichtbeleuchtung eine erste Lichtquelle aufweist, und der Mikroskopschieber (21) in einen im Mikroskop vorhandenen Zugang einschiebbar ist, wobei der Mikroskopschieber (3, 21) besteht aus: – einer Faseraufnahme (22) zur Halterung einer Lichtleitfaser (4, 15, 17), wobei die Lichtleitfaser (4, 15, 17) zur Weiterleitung des aus einer zweiten Lichtquelle in die Lichtleitfaser eingekoppelten Lichtes dient; – einem Kollimator (16), der das aus der Lichtleitfaser divergent austretende Lichtbündel über die Tubuslinse (9) des Mikroskopes in die Austrittspupille (12) des Objektivs (10) fokussiert; und – einem zumindest teilreflektierenden Element (14), das im eingeschobenen Zustand des Mikroskopschiebers (3, 21) mittig auf der optischen Achse (20) angeordnet ist.

Description

Die Erfindung betrifft einen Mikroskopschieber zur Einkopplung von Licht in den Auflichtstrahlengang eines Mikroskops. Sie ist insbesondere anwendbar bei der Realisierung des bekannten Mikroskopierverfahrens Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF), bei welchem Licht unter einem Winkel in das zu untersuchende Präparat eingestrahlt wird, welcher größer als der Winkel der Totalreflexion an der Grenzschicht Deckglas/Präparat ist. Durch die Totalreflexion wird das Präparat mit einem evaneszenten Feld beleuchtet, welches nur eine Eindringtiefe von 100–200 nm hat. Damit kann es nur in diesem Bereich zu Fluoreszenz-Anregung kommen und bei der Detektion des Fluoreszenzsignals lässt sich eine Verbesserung des Signal-zu-Rauschverhältnisses gegenüber herkömmlichen Verfahren erzielen.
Dies dient zum Beispiel zur Untersuchung von intra- und interzellulären Transportvorgängen, an Zellmembranen etc., die sich direkt auf der Deckglasfläche befinden. Die ersten Experimente wurden von Daniel Axelrod et al. beschrieben:

– Stout & Axelrod: Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy, Dez. 1989, Applied Optics, Vol. 28, No. 24, S. 5237
– Sund, Swanson & Axelrod: Cell Membrane Orientation Visualized by Polarized Total Internal Reflection Fluorescence, Oct. 1999, Biophysical Journal, Vol. 77 Weitere Literaturnachweise u. a.:
– Zenisek, Steyer & Almers: Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones, Aug. 2000, Nature, Vol. 406

Grundsätzlich gibt es 2 Möglichkeiten TIRF Mikroskopie durchzuführen: im Durchlicht und im Auflicht.

a) Bei der Durchlichtvariante muß der Kondensor ausgetauscht werden gegen ein Lasereinkopplungs-Prisma-System wie es z. B. aus DE 199 23 563 A1 vom 7.12.2000 bekannt ist. Diese Lösung weist eine Reihe von Nachteilen auf, sie ist für Inverse Mikroskope ungeeignet, da der dort benötigte Platz über dem Präparat durch das Prisma verdeckt wird, und damit kein Zugang zum Präparat mehr möglich ist, wie er für viele Experimente benötigt wird.
b) Die Auflichtvariante erfordert einerseits ein Objektiv mit ausreichend großer numerischer Apertur und andererseits eine Einkopplung des Lasers durch dieses Objektiv. Die Einkopplung des Lasers erfolgt bei bekannten Lösungen durch den Epi-Fluoreszenz Strahlengang und setzt den Austausch der Standard Auflichtbeleuchtung durch eine spezielle Version voraus oder es wird ein zur Standardauflichtbeleuchtung paralleler Strahlengang für eine TIRF-Lasereinkopplung verwendet. Eine solche Lösung wird von der Firma T. I. L. L. Photonics unter der Bezeichnung TILL-TIRF Modul hergestellt. Der Austausch der kompletten Auflichtbeleuchtung macht die Systeme teuer und inflexibel. Weitere Vorrichtungen zur Einkopplung von Licht in ein Mikroskop sind aus der JP 2002-031 762 A und der DE 36 10 692 A1 bekannt.

Aufgabe der Erfindung ist die Beseitigung der Nachteile des Standes der Technik und die Angabe einer einfachen und vielseitig anwendbaren Lichteinkopplung in den Auflichtstrahlengang eines Mikroskops. Diese Aufgabe wird durch einen Mikroskopschieber zur Einkopplung von Licht in ein Mikroskop durch die Merkmale des 1. Anspruchs gelöst. Bevorzugte Weiterentwicklungen sind in den Unteransprüchen angegeben. Der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen Lösung liegt darin, dass ein an den meisten Mikroskopen standardmäßig vorhandener und an sich zur Aufnahme von speziellen Einrichtungen zur Kontrastierung (z. B. DIC-Schieber) vorgesehener Zugang zur Einkopplung des Lichtes einer zweiten Lichtquelle, z. B. eines Lasers genutzt werden kann, ohne dass weitere Veränderungen am Beleuchtungsstrahlengang vorgenommen werden müssen. Durch die vorgesehene Neigungsmöglichkeit für den eingekoppelten Lichtstrahl gegen die optische Achse lässt sich in besonders einfacher Weise der Lichtstrahl auf den Randbereich der Austrittspupille eines hochaperturigen Objektiv richten und so das TIRF-Verfahren realisieren. Die voreingestellte Basisneigung des eingekoppelten Strahls gegen die optische Achse vereinfacht die zur Durchführung des TIRF-Verfahrens notwendige Justage in besonderer Art und Weise. In analoger Art lässt sich die Erfindung bei Einkopplung des Lichtes parallel zur optischen Achse auch zur Beleuchtung des Präparates mit einer Laserlichtquelle benutzen.
Die Erfindung wird im Folgenden an Hand der Ausführungsbeispiele in den 1 bis 3 näher erläutert. Es zeigen:
1 eine schematische Ansicht eines Mikroskops mit der erfindungsgemäßen Lichteinkopplung
2 den optischen Strahlengang der Lichteinkopplung
3 eine schematische Ansicht der Realisierung der Erfindung in Form eines Mikroskopschiebers
In 1 ist ein Mikroskop 1 (hier vom inversen Typ) schematisch dargestellt, welches eine Standardauflichtbeleuchtung 2 aufweist. Mittels eines erfindungsgemäßen Schiebers 3 wird Licht einer zweiten Lichtquelle (i. A. eines Lasers) über eine Lichtleitfaser 4 in den Auflichtstrahlengang eingekoppelt. In 2 ist der optische Strahlengang eines Mikroskops mit der erfindungsgemäßen Lichteinkopplung abgebildet. Eine Lichtquelle 5, z. B. eine Halogenlampe wird über einen Kollimator 6 und eine-Relaylinse 7 in die Leuchtfeldblendenebene 8 abgebildet. Diese wird über die Auflichttubuslinse 9 und das Objektiv 10 in die Objektebene 11 abgebildet. Dem Objektiv 10 ist eine Objektivausgangspupille 12 zugeordnet. Die Elemente Kollimator 6, Relaylinse 7 und Auflichttubuslinse 9 bilden zusammen die Standard-Auflichtbeleuchtung 13. In der Ebene der Leuchtfeldblende 8 ist ein reflektierendes Element 14 angeordnet, welches das von einer Lichtleitfaser 15 kommende Licht vorzugsweise eines Lasers in den Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskops einkoppelt. Ein achromatischer oder asphärischer Kollimator 16 fokussiert dabei das aus der Faser 15 divergent austretende Lichtbündel über die Tubuslinse 9 in die Austrittspupille 12 des Objektivs 10. Die Beleuchtungsachse 17 des kollimierten Laserlichtes ist gegenüber der Beleuchtungsachse 18 des Mikroskops um einen bestimmten Basiswinkel 19 geneigt. Diese Neigung bewirkt, dass der aufgeweitete Laserstrahl durch die Auflichttubuslinse 9 in den Randbereich der Objektivaustrittspupille 12 fokussiert wird. Dieser Neigungswinkel 19 ist von den jeweiligen optischen Verhältnissen (optische Länge des Strahlengangs, Brennweite der Tubuslinse) abhängig und beträgt beispielsweise beim Mikroskop „Axiovert 200” der Anmelderin ca. 2°. Dieser voreingestellte Neigungswinkel 19 hat den Vorteil, daß die laterale Feinjustierung des Laserfokusses in die Austrittspupille des Objektivs sehr einfach über eine geringfügige Kippbewegung der Beleuchtungsache von Kollimatoroptik 16 und Faser 15 erreicht werden kann. Bei Bedarf kann die Fokusslage des Laserspots noch über eine geringfügige Fokussierung der Kollimatoroptik 16 erreicht werden. Das reflektierende Element 14 ist als Farbteiler ausgeführt, dessen Reflexionseigenschaften so gewählt sind, dass das Laserlicht optimal reflektiert wird, das Licht der Standardlichtquelle 5 aber nahezu ungehindert hindurch gelassen wird. Der Farbteiler 14, der mittig auf der optischen Achse 20 der Auflichtbeleuchtung 13 angeordnet ist, wird auf diese Weise von dem Lichtbündel aus der Faser 17 zentral getroffen. Die eingestellte Basisneigung bewirkt, daß der Farbteiler 14 einen kleinen Durchmesser behalten kann, weil beim Kippen der Einheit aus Kollimator 16 und Faser 15 zur Winkeleinstellung praktisch kein seitlicher Versatz auftritt. Zur Feinjustierung des Winkels sind dann lediglich Kippungen im Minutenbereich notwendig, diese führen dann zu keiner Vignettierung. 3 zeigt die erfindungsgemäße Lichteinkopplung als Mikroskopschieber 21, in welchem Faseraufnahme 22, Kollimator 16 und Umlenkfarbteiler 14 montiert und ausgerichtet sind. Der Kollimator 16 mit der Faseraufnahme 22 kann, zusammengefasst in einer Einheit 25, zusätzlich zur Basisneigung 19 für die Feinjustierung und Winkelanpassung für das TIRF-Verfahren z. B. über ein Festkörpergelenk 23 mit Hilfe einer Mikrometerschraube 24 (schematisch dargestellt) gekippt werden. Die Realisierung der Erfindung ist nicht an das dargestellte Ausführungsbeispiel gebunden, so kann z. B. die Basisneigung 19 auch über eine voreingestellte Verkippung des Farbteilers 14 realisiert werden. Soll die Lichteinkopplung lediglich als Einkopplung einer zweiten (Laser-)Lichtquelle dienen ist ein Basiswinkel 19 von 0° zu wählen.

Claims

Mikroskopschieber (3, 21) zur Einkopplung von Licht in einen Auflichtstrahlengang einer Standard-Auflichtbeleuchtung (13) eines Mikroskopes mit einem Objektiv (10) und einer Tubuslinse (9), wobei der Auflichtstrahlengang in der durch das Objektiv (10) des Mikroskopes definierten optischen Achse (20) des Mikroskops verläuft und die Standardauflichtbeleuchtung eine erste Lichtquelle aufweist, und der Mikroskopschieber (21) in einen im Mikroskop vorhandenen Zugang einschiebbar ist, wobei der Mikroskopschieber (3, 21) besteht aus: – einer Faseraufnahme (22) zur Halterung einer Lichtleitfaser (4, 15, 17), wobei die Lichtleitfaser (4, 15, 17) zur Weiterleitung des aus einer zweiten Lichtquelle in die Lichtleitfaser eingekoppelten Lichtes dient; – einem Kollimator (16), der das aus der Lichtleitfaser divergent austretende Lichtbündel über die Tubuslinse (9) des Mikroskopes in die Austrittspupille (12) des Objektivs (10) fokussiert; und – einem zumindest teilreflektierenden Element (14), das im eingeschobenen Zustand des Mikroskopschiebers (3, 21) mittig auf der optischen Achse (20) angeordnet ist.
Mikroskopschieber (3, 21) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Faseraufnahme (22) und der Kollimator (16) in einer Einheit (25) zusammengefasst sind.
Mikroskopschieber (3, 21) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Einheit (25) zur Winkelanpassung gekippt werden kann.
Mikroskopschieber (21) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokuslage des Kollimators (16) einstellbar ist.