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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop zur Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie, mit mindestens einer Lichtquelle für die evaneszente Beleuchtung, ggf. einer Verstelleinheit für das Beleuchtungslicht und mit einem Objektiv, wobei sowohl Beleuchtungslicht als auch Detektionslicht über den Beleuchtungsstrahlengang durch das Objektiv geführt werden und wobei an der Grenzfläche zu einer Probe oder Probenabdeckung vorzugsweise totalreflektiertes Beleuchtungslicht (Reflexionslicht) in den Beleuchtungsstrahlengang zurückkehrt.
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Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie, wobei die evaneszente Beleuchtung über mindestens eine Lichtquelle bereitgestellt wird, wobei das Beleuchtungslicht ggf. über eine Verstelleinheit durch ein Objektiv zu einer Probe geführt wird, wobei sowohl das Beleuchtungslicht als auch Detektionslicht über den Beleuchtungsstrahlengang durch das Objektiv geführt werden und wobei an der Grenzfläche zu einer Probe oder Probenabdeckung vorzugsweise totalreflektiertes Beleuchtungslicht (Reflexionslicht) in den Beleuchtungsstrahlengang zurückgeführt wird, insbesondere zur Anwendung in einem erfindungsgemäßen Mikroskop.
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Bei der Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie wird das Brechungsverhalten von Licht beim Übergang von einem optisch dichteren in ein optisch dünneres Medium genutzt. So ergibt sich beispielsweise für den Übergang von Deckglas (n1 = 1,518) zu Wasser (n2 = 1,33) ein kritischer Winkel von 61°, der Winkel der Total-Reflexion. Unter den Bedingungen der Total-Reflexion (Winkel ≥ 61°) bildet sich im Medium mit geringerem Brechungsindex eine stehende evaneszente Welle. Die Intensität dieser Well fällt exponentiell mit dem Abstand zur Grenzfläche ab. Aufgrund dessen werden von der Grenzfläche weiter entfernte Fluorophore nicht angeregt. Die Hintergrundfluoreszenz wird erheblich reduziert. Der Bildkontrast wird dabei verbessert und die Auflösung wird gleichzeitig deutlich gesteigert. Voraussetzung für die Nutzung des voranstehend geschilderten Phänomens ist ein ausreichend großer Unterschied der Brechungsindizes von Deckglas und Medium.
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Aus der
US 2002/0097489 A1 ist ein Mikroskop mit evaneszenter Beleuchtung einer Probe bekannt. Das Mikroskop beinhaltet eine Weißlichtquelle, deren Licht über eine Schlitzblende durch das Mikroskopobjektiv hindurch in den eine Probe tragenden Objektträger zur evaneszenten Beleuchtung eingekoppelt wird. Das Beleuchtungslicht pflanzt sich in dem Objektträger durch totalinterne Reflektion fort, wobei die Beleuchtung der Probe nur im Bereich des aus dem Objektträger herausragenden evaneszenten Feldes erfolgt. Mikroskope dieser Art sind unter dem Begriff TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Mikroscope) bekannt. Die z-Auflösung von TIRF-Mikroskopen ist aufgrund des nur ca. 100 nm in die Probe ragenden evaneszenten Feldes außerordentlich gut.
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Aus der
DE 101 08 796 A1 ist ein hochaperturiges Objektiv, insbesondere für TIRF-Anwendungen, bekannt. Das Objektiv besteht aus einer ersten Linse mit einer positiven Brechkraft, einer zweiten Linse mit negativer Brechkraft, wobei das Brennweitenverhältnis zwischen den beiden Linsen im Bereich von –0,4 und –0,1 liegt und die Gesamtbrechkraft größer Null ist. Ferner beinhaltet das Objektiv zwei positive Linsen, deren Verhältnisdurchmesser zur Brennweite größer 0,3 und kleiner 0,6 ist. Ferner beinhaltet das Objektiv eine Negativlinse und einer Sammellinse, wobei die Negativlinse der Frontgruppe zugewandt ist und das Brennweitenverhältnis der Negativlinse und der Sammellinse zwischen –0,5 und –2 liegt.
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Aus der
DE 102 17 098 A1 ist eine Auflichtbeleuchtungsanordnung für die TIRF-Mikroskopie bekannt. Die Auflichtbeleuchtungsanordnung beinhaltet eine Beleuchtungsquelle, die im Betrieb ein polarisiertes Beleuchtungsstrahlenbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse propagiert und eine Umlenkeinrichtung, die das Beleuchtungsstrahlenbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt. Es ist bei dieser Auflichtbeleuchtungsanordnung vorgesehen, dass das von der Beleuchtungsquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlenbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer Phasendifferenz aufweist und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlenbündel x-mal reflektiert, wobei x = (n × 180° – d)/60°.
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Aus der
DE 101 43 481 A1 ist ein Mikroskop zur TIRM (Total Internal Reflection Microscopy) bekannt. Das Mikroskop weist ein Mikroskopgehäuse und ein Objektiv auf. Das von einer Beleuchtungseinrichtung ausgehende Beleuchtungslicht kann über einen in das Mikroskopgehäuse einschiebbaren Adapter eingekoppelt werden. In diesem Adapter wird das Beleuchtungslicht über ein seitlich zur optischen Achse des Objektivs versetzt angeordnetes Einkoppel-Prisma geführt. Das TIR-Reflexlicht wird separat über ein ebenfalls seitlich versetzt angeordnetes Auskoppel-Prisma ausgekoppelt. Dadurch wird ein zentral angeordneter Strahlteiler vermieden.
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Aus der
US 2004/0001253 A1 ist ein Mikroskop mit einem optischen Beleuchtungssystem, das ein einfaches Umschalten zwischen evaneszenter Beleuchtung und Reflektionsbeleuchtung ermöglicht. Das Beleuchtungssystem beinhaltet eine Laserlichtquelle, deren Licht in eine optische Faser eingekoppelt wird. Ferner ist eine Auskoppeloptik vorgesehen, die das aus der Faser austretende Licht in einen hinteren Brennpunkt des Mikroskopobjektivs fokussiert. Die optische Faser ist in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs verschiebbar.
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Aus der
DE 102 29 935 A1 ist eine Einrichtung zur Einkopplung von Licht in einem Mikroskop bekannt. Dort wird in der Leuchtfeldblendenebene durch eine als Schieber ausgeführte Lichtleitfaser-Einkopplung Laserlicht auf das Präparat gerichtet. Die Erfindung ist insbesondere für das TIRF-Verfahren geeignet.
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In der Rastermikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Detektionslicht, als Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahlenbündels wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Probenebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Detektionslichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet. Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahls in drei Dimensionen abgetastet.
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Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Diese Detektionsanordnung wird Descan-Anordnung genannt. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts mit dem Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündels zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.
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Bei denen aus dem Stand der Technik bekannten Mikroskopen erfolgt die Einkopplung der evaneszenten Beleuchtung regelmäßig im Rahmen zweidimensionaler Lösungen, wenngleich die dort realisierte Verstelleinheit stets eindimensional ausgeführt ist. So erfolgt die Einkopplung beispielsweise über einen sogenannten neutralen Teiler, d. h. über einen Spiegel, der in einem gewissen Umfange reflektiert und ansonsten transmittiert. Des Weiteren ist die Einkopplung über einen dichroitischen Teiler bekannt. Dabei handelt es sich um einen besonderen Spiegel, der bis auf eine bestimmte Wellenlänge alle anderen Wellenlängen reflektiert. Ebenso ist es auch bereits bekannt, die Einkopplung über einen Polarisationsteiler zu bewerkstelligen. Dabei werden die Laser für die evaneszente Beleuchtung (TIRF-Beleuchtung) und der Laser für die herkömmliche Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung orthogonal zueinander polarisiert und zusammengeführt. Als eindimensionale Möglichkeit zur Einkopplung der erforderlichen Strahlungsquelle ist es auch bereits bekannt, kleine zusätzliche Spiegel im Beleuchtungsstrahlengang für die Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung zu verwenden.
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Grundsätzlich wird im Stand der Technik zur Realisierung einer evaneszenten Beleuchtung (TIRF-Beleuchtung) das Beleuchtungslicht entweder objektivseitig oder kondensorseitig eingekoppelt. Die durch die evaneszente Beleuchtung entstehenden Rückreflexe werden wiederum ausgekoppelt und – üblicherweise – in eine Lichtfalle eingespiegelt, um Streulicht oder parasitäre Reflexe zu vermeiden. Das zurückkehrende Reflexionslicht ist bislang eher lästig und muß daher „entsorgt” werden.
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Aus der
DE 103 09 269 A1 ist es bereits für sich gesehen bekannt, das Beleuchtungslicht zum Zwecke des Laserschutzes zu nutzen. Dazu wird bei der Einkopplung des Beleuchtungslichts ein Teil der Lichtleistung ausgekoppelt und auf einen Detektor gespiegelt. Ebenso wird ein Teil der Lichtleistung im Rahmen der Auskopplung ausspiegelt und wiederum auf einen Detektor fokussiert. Unterscheidet das Intensitätsverhältnis einen bestimmten Wert, dann wird die Lichtquelle des eingekoppelten Beleuchtungslichts, meist das Beleuchtungslicht eines eingekoppelten Lasers, mit einer eigens dafür vorgesehenen Schutzvorrichtung abgeschaltet.
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Die aus dem Stand der Technik bekannten Mikroskope und Verfahren zur Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie sind insoweit nachteilig, als es nicht möglich ist, bei rotationssymmetrischer Strahlführung die zu erzielende Eindringtiefe des in der Probe entstehenden evaneszenten Feldes quantitativ zu bestimmen. Dies ist auf den üblicherweise unbekannten Brechungsindex der zu untersuchenden Probe zurückzuführen. Ist der Brechungsindex der Probe bekannt, lässt sich die Eindringtiefe aus dem bekannten Brechungsindex und dem Einfallswinkel des evaneszenten Beleuchtungslichtstrahls zur Probe in bekannter Weise berechnen. Bei der Untersuchung unterschiedlicher Proben ist man darüber hinaus mit unterschiedlichen Brechungsindizes konfrontiert, so dass es unmöglich ist, den Winkel der Total-Reflexion zu berechnen. Eine automatische Einstellung der evaneszenten Beleuchtung erscheint daher ausgeschlossen. bei nicht rotationssymmetrischer Strahlführung ist eine homogen rotationssymmetrische Einstrahlung der TIRF-Beleuchtung kaum möglich.
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Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop zur Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie und ein entsprechendes Verfahren anzugeben, wonach eine automatische Einstellung der evaneszenten Beleuchtung bei rotationssymmetrischer Strahlführung möglich ist.
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Das erfindungsgemäße Mikroskop löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist das gattungsbildende Mikroskop dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang Mittel zum zumindest teilweisen Auskoppeln des zurückkehrenden Reflexionslichts aus dem Beleuchtungsstrahlengang und Mittel zum Detektieren des ausgekoppelten Reflexionslichts vorgesehen sind und dass aus dem Strahlengang des ausgekoppelten Reflexionslichts quantifizierbare und/oder qualifizierbare Parameter der evaneszenten Beleuchtung und/oder des in der Probe entstehenden evaneszenten Feldes ableitbar sind, wobei
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Das erfindungsgemäße Verfahren löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 18. Danach ist das gattungsbildende Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang das zurückkehrende Reflexionslicht zumindest teilweise aus dem Beleuchtungsstrahlengang ausgekoppelt und detektiert wird und dass aus dem Strahlengang des ausgekoppelten Reflexionslichts quantifizierbare und/oder qualifizierbare Parameter der evaneszenten Beleuchtung und/oder des in der Probe entstehenden evaneszenten Feldes abgeleitet werden.
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Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass es zur automatischen Einstellung der evaneszenten Beleuchtung zwingend erforderlich ist, den Brechungsindex der Probe, des Probenglases und/oder der Probenabdeckung, d. h. des zu untersuchenden Objektes, zu kennen. Dabei sei angemerkt, dass eine automatisierte Einstellung der evaneszenten Beleuchtung auf eine quantifizierbare Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in der Probe abstellt. Insbesondere beim Präparatewechsel oder beim Nährlösungswechsel sollen reproduzierbare Einstellungen möglich sein, wozu die Kenntnis des Brechungsindexes erforderlich ist.
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In erfindungsgemäßer Weise umfasst das Mikroskop eine integrierte Vorrichtung, mit der es möglich ist, in einem üblichen TIRF-Aufbau den Brechungsindex der Probe festzustellen und daraus Informationen zu den erforderlichen Eigenschaften abzuleiten, wonach eine Automatisierung des Betriebs bzw. der Einstellung möglich ist.
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Des Weiteren ist in erfindungsgemäßer Weise erkannt worden, dass die quantitative Bestimmung der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes zum automatischen Betrieb ermittelbar und somit einstellbar sein muss. Ist der Brechungsindex der Probe bekannt, kann die Eindringtiefe aus dem Brechungsindex und dem Einfallswinkel des Beleuchtungslichtstrahls berechnet werden.
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Im Konkreten wird bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop das an sich störende Reflexionslicht aus dem Beleuchtungsstrahlengang ausgekoppelt, und zwar entweder insgesamt oder zumindest teilweise. Das ausgekoppelte Reflexionslicht wird Mitteln zum Detektieren zugeführt, wonach aus dem Strahlengang des ausgekoppelten Reflexionslichts quantifizierbare und/oder qualifizierbare Parameter der evaneszenten Beleuchtung und/oder des in der Probe entstehenden evaneszenten Feldes ableitbar sind.
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Die hier in Rede stehenden Parameter umfassen Informationen über die Position des Beleuchtungslichtstrahls in der Eintrittspupille des Objektivs. Darüber hinaus geben die Parameter Aufschluss über den Einfallswinkel des Beleuchtungslichtstrahls auf die Grenzfläche zur Probe. Wie bereits zuvor erwähnt, dienen die Parameter zur Berechnung des Brechungsindexes der Probe, woraus sich weitere Informationen ableiten lassen.
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Des Weiteren sei angemerkt, dass das ausgekoppelte Reflexionslicht in vorteilhafter Weise auf die Mittel zur Detektion fokussiert wird.
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Die Mittel zum Auskoppeln des Reflexionslichtes sind in ganz besonders vorteilhafter Weise der Ausprägung des Reflexionslichts angepasst, wobei diese im Konkreten einer zweidimensionalen Ausprägung des Reflexionslichts angepasst sein können. In konstruktiver Hinsicht ist es möglich, dass Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht vorhandene Bauteile umfassen, nämlich beispielsweise einen x-y-Scanner. Dieser x-y-Scanner dient dann über seine eigentliche Scannfunktion hinaus dazu, das an der optischen Achse gespiegelte Reflexionslicht in den Reflexionsstrahlengang abzulenken, so dass das Reflexionslicht vom einfallenden Beleuchtungslicht getrennt ist. Dort wird das ausgekoppelte Reflexionslicht den Mitteln zur Detektion zugeführt.
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Bei einfacher Bauweise umfassen die Mittel zum Auskoppeln des Reflexionslichts einen Spiegel.
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Die bereits zuvor erwähnten Mittel zum Detektieren des ausgekoppelten Reflexionslichts sind in vorteilhafter Weise mit einem Detektor mit Ortsauslösung ausgestattet, so dass es möglich ist, Informationen über die Position des Beleuchtungslichtstrahls in der Eintrittspupille des Objektivs zu erhalten. Der Detektor kann als CCD (Charge Coupled Device) ausgeführt sein. Ebenso ist es denkbar, dass der Detektor als ortsauflösende Fotodiode (PSD, Position Sensitive Device) ausgeführt ist. Alternativ ist es denkbar, dass die Mittel zum Detektieren des ausgekoppelten Reflexionslichts eine Kombination aus einem herkömmlichen Detektor und einem im Beleuchtungsstrahlengang angeordneten Sensor an der Verstelleinheit zur Positionierung der Lichtquelle umfassen, so dass sich ebenfalls quantitative Informationen und ortsspezifische Informationen ermitteln lassen. Der Detektor kann dabei als Fotodiode ausgeführt sein.
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Grundsätzlich ist es möglich, dass die Anordnung der Mittel für die Auskopplung und Detektion des Reflexionslichts asymmetrisch ausgebildet sind. Von Vorteil ist eine rotationssymmetrische Ausgestaltung um die optische Achse, zumal das eingekoppelte Beleuchtungslicht bzw. der eingekoppelte Beleuchtungslichtstrahl entsprechend dreht.
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In Bezug auf das evaneszente Beleuchtungslicht sei angemerkt, dass dieses auch im Wege der Kondensoreinkopplung oder der Prismeneinkopplung in den Beleuchtungsstrahlengang einkoppelbar ist. Jedwede Möglichkeiten der Einkopplung des evaneszenten Beleuchtungslichts sind denkbar.
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In Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren ist wesentlich, dass sich dieses in vorteilhafter Weise in einem erfindungsgemäßen Mikroskop anwenden lässt. Dazu wird im Beleuchtungsstrahlengang das zurückkehrende Reflexionslicht – entsprechend den voranstehenden Ausführungen – zumindest teilweise aus dem Beleuchtungsstrahlengang ausgekoppelt und wird in dem so entstehenden weiteren Strahlengang detektiert. Aus dem Strahlengang des ausgekoppelten Reflexionslichts werden quantifizierbare und/oder qualifizierbare Parameter der evaneszenten Beleuchtung und/oder des in der Probe entstehenden evaneszenten Feldes abgeleitet. Zur Vermeidung von Wiederholungen wird dazu auf die voranstehenden Ausführungen verwiesen.
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Des Weiteren ist wesentlich, dass vor der Ermittlung der Parameter die Verstelleinheit kalibriert werden kann. Zum Kalibrieren der Verstelleinheit wird eine Probe mit bekanntem Brechungsindex verwendet und entsprechend beleuchtet.
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Über die Verstelleinheit wird der Beleuchtungsstrahl von einer hohen numerischen Apertur in Richtung einer niedrigen numerischen Apertur bewegt, wobei dadurch die Intensitäten und Positionen des Reflexionslichts detektierbar sind. Kurz vor Erreichen des Winkels der totalen Reflexion beträgt die gemessene Intensität auf dem Detektor 100%. Kurz nach Überschreiten des Winkels der totalen Reflexion ist die Intensität auf 0% gefallen. Dies vorausgesetzt lässt sich die Position der totalen Reflexion bestimmen, nämlich durch den zuvor genanten Übergang.
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Wie bereits zuvor ausgeführt, lässt sich aus dem bekannten Brechungsindex der Probe der Winkel der totalen Reflexion berechnen. Bei kalibrierter Verstelleinheit wird aus der Position der totalen Reflexion der Einstellwinkel berechnet.
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Bei Proben mit bekanntem Brechungsindex lässt sich die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes quantitativ bestimmen. Folglich ist es bei Proben mit bekanntem Brechungsindex vorzugsweise im Hinblick auf eine gewünschte Eindringtiefe des evaneszenten Feldes möglich, die evaneszente Beleuchtung bewusst einzustellen, und zwar vorzugsweise auch zum automatischen Betrieb.
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Bei Proben mit unbekanntem Brechungsindex lässt sich dieser im Rahmen der voranstehenden Ausführungen ermitteln bzw. messen. Dazu wird die Probe beleuchtet und die Position der totalen Reflexion entsprechend den voranstehenden Ausführungen ermittelt. Bei kalibrierter Verstelleinheit lässt sich aus der Position der Winkel der totalen Reflexion und aus dem Winkel der Brechungsindex der Probe berechnen. Nach der Ermittlung des Brechungsindexes lässt sich insbesondere im Hinblick auf eine gewünschte Eindringtiefe des evaneszenten Feldes die Beleuchtung einstellen, und zwar insbesondere auch automatisch.
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Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die den Patentansprüchen 1 und 18 nachgeordneten Patentansprüchen und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigt die
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einzige Fig. in einer schematischen Ansicht den grundsätzlichen Aufbau eines erfindungsgemäßen Mikroskops zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei dort lediglich die in Bezug auf die Erfindung relevanten Merkmale gezeigt sind.
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So zeigt die einzige Figur den schematischen Aufbau eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit den wesentlichen Bausteinen zur Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie. Das Mikroskop umfasst eine Lichtquelle 1 für die evaneszente Beleuchtung. Dabei handelt es sich vorzugsweise um eine Laserlichtquelle.
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Des Weiteren ist ein Spiegel 2 mit einem Loch und eine Verstelleinheit 4 vorgesehen, wobei die Verstelleinheit 4, etwa ein x-y-Scanner, zum Ablenken des Beleuchtungslichtstrahls beispielsweise einen Schrittmotor umfassen kann. Das Loch im Spiegel ist etwa so groß, wie der Durchmesser des Beleuchtungslichtstrahls 5 an der Stelle des Spiegels 2. Der Spiegel 2 befindet sich in oder in der Nähe einer zur Ebene der Objektivpupille 11 konjugierten Ebene 3. Das Beleuchtungslicht gelangt über die Verstelleinheit 4 über den Beleuchtungsstrahlengang 5 zu einem Objektiv 6. Der Beleuchtungslichtstrahl wird derart durch das Objektiv 6 geleitet, dass er unter einem Winkel der Total-Reflexion auf das Objekt 8 auftritt das von einem transparenten Probenträger 7 gehalten auf der dem Objektiv gegenüberliegenden Seite gehalten ist. Unter den Bedingungen der Total-Reflexion bildet sich in der Probe eine stehende evaneszente Welle, deren Intensität exponentiell mit dem Abstand zur Grenzfläche abfällt. Die Probe strahlt Detektionslicht 13 ab. Vom Probenträger wird Reflexionslicht 8 reflektiert.
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Des Weiteren lässt die einzige Figur erkennen, dass sowohl Beleuchtungslicht 5 als auch Detektionslicht 13 über den Beleuchtungsstrahlengang 12 durch das Objektiv 6 geführt werden, wobei an der Grenzfläche zum Objekt 8 bzw. zur Probe oder zur Probenabdeckung totalreflektiertes Beleuchtungslicht, d. h. Reflexionslicht 9, in den Beleuchtungsstrahlengang 12 zurückkehrt und über die Verstelleinheit 4 geführt wird.
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Erfindungsgemäß sind im Beleuchtungsstrahlengang 12 ein Spiegel 2 mit einem Loch 14 zum Auskoppeln des zurückkehrenden Reflexionslichts 9 aus dem Beleuchtungsstrahlengang 12 vorgesehen. Durch Versetzung des Reflexionslichtes 9 bei der Totalreflexion trifft das Reflexionslicht nicht mehr den identischen Strahlgang des Beleuchtungslichtes zwischen Lichtquelle 1 und Verstelleinheit 4. Dadurch trifft das Reflexionslicht nicht das Loch im Spiegel sondern die dem Rückstrahlgang zugewandten Spiegelfläche des Spiegels 2 und wird zum Detektor 10 geleitet, so dass sich aus dem Reflexionslicht 9 quantifizierbare und/oder qualifizierbare Parameter der evaneszenten Beleuchtung und/oder des in der Probe entstehenden evaneszenten Feldes ableiten lassen. Dazu ist es erforderlich, dass der Detektor mit Ortsauflösung arbeitet oder das eine weitere Detektoreinrichtung der Verstelleinheit 4 zugeordnet ist.
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Unter Bezugnahme auf die einzige Figur ist anzumerken, dass es zur Erzeugung einer evaneszenten Beleuchtung, d. h. einer TIRF-Beleuchtung, erforderlich ist, zu der sonst üblichen Beleuchtungslichtquelle eine zusätzliche Lichtquelle in den Strahlungsgang einzukoppeln, nämlich die hier einzig dargestellte Lichtquelle 1 zur evaneszenten Beleuchtung. Mittels des Objektivs 6 wird dann eine evaneszente Beleuchtung zur Erzeugung eines evaneszenten Feldes in der Probe 5 generiert. Unter der Bedingung der Total-Reflexion an der Grenzfläche zur Probe 8 tritt an der zum Eintritt diametral gegenüberliegenden Stelle das Beleuchtungslicht 5 wieder aus und durchläuft den Strahlengang in entgegengesetzte Richtung leicht versetzt symmetrisch zur optischen Achse. Der als Reflexionslicht 9 bezeichnete rücklaufende Lichtstrahl wird teilweise oder insgesamt ausgespiegelt bzw. ausgekoppelt und auf den Detektor 10 fokussiert. Der gesamte Strahlengang ist dabei derart gestaltet, dass man eine Information über die Position des Beleuchtungslichtstrahls in der Eintrittspupille des Objekts 5 erhält und darüber den Einfallswinkel auf die Grenzfläche ableiten kann. Die dazu erforderliche Anordnung kann einen Detektor mit Ortsauflösung im ausgeblendeten Strahlengang umfassen, wie dies bereits zuvor ausführlich dargelegt worden ist. Ebenso kann eine Kombination aus einem Detektor, beispielsweise einer Fotodiode, und einem weiteren Sensor an der Verstelleinheit 4 zur Positionierung des Beleuchtungslichtstrahls realisiert sein.
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Der in der einzigen Figur gezeigte Aufbau kann rotationssymmetrisch um die optische Achse gestaltet sein, wenngleich auch nicht rotationssymmetrische Anordnungen denkbar und realisierbar sind.
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Des Weiteren ist wesentlich, dass die Methode zur Messung des Brechungsindexes auf jedwede Möglichkeiten zur Einkopplung der evaneszenten Beleuchtung anwendbar sind. Die Kondensoreinkopplung oder Prismeneinkopplung wurden bereits zuvor genannt.
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In Bezug auf die Ermittlungen der relevanten Parameter sei unter Bezugnahme auf die einzige Figur ausgeführt, dass in einem ersten Schritt die Verstelleinheit 4 kalibriert wird. Hierzu wird eine Probe 8 mit bekanntem Brechungsindex unter das Mikroskop gelegt bzw. beleuchtet. Danach wird mit Hilfe der vorzugsweise automatischen Verstelleinheit 4 das Beleuchtungslicht 5 ausgehend von einer hohen numerischen Apertur in Richtung einer niedrigen numerischen Apertur bewegt. Die jeweiligen Intensitäten und Positionen werden unter Zugrundelegung des zuvor erörterten Aufbaus, insbesondere unter Nutzung entsprechender Detektoren, ermittelt. Kurz vor Erreichen des Winkels der totalen Reflexion liegt die Intensität auf den Detektor noch bei 100%. Kurz nach Überschreiten des Winkels der totalen Reflexion liegt die Intensität bei 0%. Aus dem Übergang lässt sich die Position der totalen Reflexion bestimmen. Bei bekanntem Brechungsindex kann der Winkel der totalen Reflexion berechnet werden. Entsprechend lässt sich die Verstelleinheit 4 kalibrieren, und es lässt sich aus der Position auf den Einfallswinkel schließen.
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Bei Proben mit bekanntem Brechungsindex ist es daher möglich, die evaneszente Beleuchtung automatisch einzustellen, woraus sich die jeweilige Eindringtiefe des evaneszenten Feldes ergibt.
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Bei Proben mit unbekanntem Brechungsindex ist es erforderlich, diesen zuerst zu ermitteln bzw. zu messen. Hierzu wird die Probe 8 beleuchtet, wobei mittels der zuvor beschriebenen Messmethode die Position bei der totalen Reflexion ermittelbar ist. Unter Zugrundelegung einer kalibrierten Verstelleinheit 4 lässt sich direkt aus der Position der Winkel und aus dem Winkel der Brechungsindex berechnen. Unter Zugrundelegung des nun bekannten Brechungsindexes lässt sich bei den folgenden Proben der gleichen Art die evaneszente Beleuchtung automatisch einstellen und lässt sich die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes quantitativ bestimmen.
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In Bezug auf Merkmale, die sich der einzigen Figur nicht entnehmen lassen, sei zur Vermeidung von Wiederholungen auf die allgemeine Beschreibung und auf die Patentansprüche verwiesen.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Lichtquelle
- 2
- Spiegel
- 3
- konjugierte Objektivpupillenebene
- 4
- Verstelleinrichtung (etwa x-y-Scanner)
- 5
- Beleuchtungslicht
- 6
- Objektiv
- 7
- Probenträger
- 8
- Probe
- 9
- Reflexionslicht
- 10
- Detektor
- 11
- Ebene der Objektivpupille
- 12
- Beleuchtungsstrahlengang
- 13
- Detektionslicht
- 14
- Loch im Spiegel