DE1085873B - Verfahren zur Herstellung von 6-Methyl-17 ª‡, 21-dioxy-1, 4-pregnadien-3, 20-dionen und deren 21-Acylaten - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von 6-Methyl-17 a, 21-dioxy-1,4-pregnadien-3,20-dionen und deren 21-Acylaten Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 6-Methyl-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien-3,20-dionen und deren 21-Acylaten nach folgendem Reaktionsschema: in denen R eine ß-ständige Oxygruppe oder Ketosauerstoff und R' Wasserstoff oder einen Acylrest einer organischen Carbonsäure mit vorzugsweise 1 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet.
• Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein in 11-Stellung eine Sauerstoffurnktion tragendes 6-Methyl-17a,21-dioxy-4-pregnen-3,20-dion (das 6a- oder 6ß-Epimere) oder einen Ester dieser Verbindung (Formel I) in bekannter Weise der Fermentierung mit einem die 1(2)-Stellung eines 3-Keto-4-pregnens dehydrierenden Mikroorganismus unterwirft. Besonders geeignet hierfür sind Mikroorganismenstämme der Gattungen Calonectria, Altemaria, Collectotrichum, Cylindrocarpon, Ophiobolus, Septomyxa, Didymella, Corynebacterium, Fusarium, Listeria, Erysipelothrix, insbesondere Septomyxa affinis ATCC 6737 und Corynebacterium simplex.
• Die Veresterung der so erhaltenen Produkte kann ebenfalls nach üblichen Methoden erfolgen, z. B. durch Umsetzung mit einem acylicrenden Mittel, wie einem Keten, Isopropenylacylat, einem Anhydrid oder Halogenid einer organischen Carbonsäure mit vorzugsweise 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, bei Temperaturen zwischen 0 und 100°C, wobei Zimmertemperatur bevorzugt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung von 6-Methyl-l-dehydro-analogen des Cortisons, Hydrocortisons und von deren 21-Estem, d. h. des 1-Dehydro-6a-methylhydrocortisons und 1-Dehydro-6a-methylcortisons. Letztere stellen insbesondere in der 6a-epimeren Form hochaktive Nebennierenrindenhormone dar, deren glucocorticoide Wirkung größer ist als die des Hydrocortisons, Cortisons und deren 1-Dehydroanalogen, wie aus folgender Tabelle hervorgeht:

  Tabelle I

  Glucocorticoide Wirkung der erfindungsgemäß herstell-

  baren Steroidverbindungen (im Vergleich zu Hydro-

  cortison = 1)

  Glucocorticoide

  Steroid Wirkung

  oral 1subcutan

  Hydrocortison .................. 1 1

  1-Dehydrohydrocortison ......... 2,9

  1-Dehydro-6a-methylhydro-

  cortison ...................... 18 10,6

  Cortison ....................... 0,60

  1-Dehydrocortison .............. 3

  1-Dehydro-6a-methylcortison ..... 5,6

  Die neuen Verbindungen, 1-Dehydro-6a-methylcortison und 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison, besitzen außerdem den Vorteil einer geringen Salzretention und hoher antiphlogistischer Wirksamkeit, was sie speziell für die systemische und lokale äußerliche Anwendung geeignet macht. Die antiphlogistische (entzündungshemmende) Wirkung von 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison ist im Granulomtest sechs- bis siebenmal stärker als die des Hydrocortisons. Die 1-Dehydro-6a-methyl-epi-F-Verbindung, 6a-Methyl-11a,17a,21-trioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion, besitzt ebenfalls entzündungswidrige Wirkung. Sie kann z. B. durch Oxydation des Acylats mit Chromsäure leicht in 6a-Methyl-d l-cortison-ester umgewandelt werden.
• Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen lassen sich für die human- oder veterinärmedizinische Anwendung zu Präparaten mit verschiedenartigster Applizierbarkeit verarbeiten. So kann man aus ihnen mit festen, flüssigen oder salbenartigen Trägerstoffen Mittel zur oralen, parenteralen oder äußerlichen Applikation herstellen. In Kombination mit Aerosolen kann man auch Sprays für Inhalationszwecke herstellen. Gegebenenfalls lassen sie sich mit andern Wirkstoffen wie Antibiotika, Sulfonamiden, Acetylsalicylsäure und/oder Vitaminen kombinieren.
• Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet man ein in 11-Stellung eine Hydroxyl-oder Ketogruppe enthaltendes 6(a oder ß)-Methyl-17a, 21-dioxy-4-pregnen-3,20-dion oder dessen 21-Ester.
• Die fermentative Dehydrierung gemäß Erfindung kann unter den in der USA.-Patentschrift 2 602 769 beschriebenen Bedingungen erfolgen, unter Verwendung eines geeigneten Nährmediums, das assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor in entsprechender Form sowie andere Verbindungen (Vitamine, z. B. Thiamin, Thiaminthiazol, Pflanzenhormone, z. B. Auxine) und Mineralstoffe (z. B. Zink, Eisen, Kobalt, Kupfer, Kalium, Mangan usw.) enthält, die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sind. Die Luftzufuhr zur Fermentationsmischung kann durch gesteuerte Belüftung, Einschluß von Luft in Schüttelflaschen oder andere Maßnahmen erfolgen. Das zu dehydrierende Material wird vorzugsweise in Lösung oder Suspension zugesetzt, nachdem dem Mikroorganismus Zeit gelassen wurde, sich zu entwickeln. Es wurde gefunden, daß der Zusatz bestimmter Steroidverbindungen, -wie 3-Keto-bisnor-4-cholen-22-al, 3-Keto-bisnor-4-cholensäure, rohes llß,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on und Progesteron die Ausbeute an dehydriertem Produkt beträchtlich verbessert. Andere Verbindungen steroidaler oder nichtsteroidaler Natur können die Ausbeute ebenfalls günstig beeinflussen.
• Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Beispiel 1 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison (6a-Methyll lß,17a,21-trioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion) Sechsmal je 100 ccm Nährmedium aus 10/, Glukose, 20/, Maisquellwasser (600/, Feststoffe) und Leitungswasser wurden in Erlenmeyerkolben gefüllt, auf p$ 4,9 eingestellt, 45 Minuten bei einem Druck von etwa 1 kg/Cm2 sterilisiert und dann mit einer 1 bis 2 Tage alten Kultur von Septomyxa affinis ATCC 6737 geimpft. Die Kolben wurden bei einer Temperatur von etwa 24°C 3 Tage geschüttelt. Darauf wurden diese 600 ccm zur Beimpfung von 101 der obigen Nährlösung, die noch 10 ccm eines Antischaummittels (Specköl -E- Octadecanol) enthielten, verwendet. Das Gärgefäß wurde in ein auf 28°C gehaltenes Wasserbad gestellt und sein Inhalt gerührt (300 U/min) und belüftet (0,51 Luft je 10l Flüssigkeit). Nach 17stündiger Inkubation, nachdem sich ein gutes Wachstum entwickelt hatte und der pH-Wert auf 6,7 gestiegen war, wurden 2 g 6a-Methylhydrocortison und 1 g 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, in 115 ccm Dimethylformamid gelöst, zugesetzt und die Inkubation bei gleicher Temperatur und Belüftung 24 Stunden fortgesetzt (End-pH 7,9). Man filtrierte vom Mycel (56 g Trockengewicht) und extrahierte das Steroidmaterial mit Methylenchlorid. Die Extrakte wurden zur Trockne eingedampft und der Rückstand über eine Säule aus synthetischem Magnesiumsilikat (bekannt unter dem Handelsnamen »Florisil«) chromatographiert. Die Säule war mit 200 g »Florisih beschickt und wurde je fünfmal mit 400 ccm Fraktionen der folgenden Lösungsmittel eluiert; Methylenchlorid, Hexankohlenwasserstoffe (bekannt unter dem Handelsnamen »Skellysolve B«), Acetonmischungen 9:1, 8:2, 7:3, 1:1 und Methanol. Die mit »Skellysolve B«-Aceton (7:3) eluierte Fraktion wog 1,545 g und ergab beim Umkristallisieren aus Aceton, in drei Fraktionen, 928 mg eines bei 210 bis 235°C schmelzenden Produktes. Eine daraus hergestellte Analysenprobe schmolz bei 245 bis 247°C; [a]D + 83° in Dioxan. Infrarotabsorption in Nujol-Mineralölsuspension: O H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3430 3330 3180 cm-' 20-Keto .................. 1706 Konjugierte 3-Keto . . . . . . . . 1645 ,d"4-Doppelbindung ....... 1592 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-acetat Man stellte eine Mischung aus 500 mg 1-Deliydro-6a-methylhydrocortison in 500 ccm Pyridin und 5 ccm Essigsäureanhydrid her, hielt 6 Stunden auf Zimmertemperatur (22 bis 24°C), goß hernach in 100 ccm Eiswasser und extrahierte die wäßrige Mischung dreimal mit je 25 ccm Methylenchlorid. Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Nach dreimaligem Umkristallisieren des Rückstands aus Aceton-»Skellysolve B« erhielt man das reine 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-acetat (6-Methyl-11ß,17a-dioxy 21-acetoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion). Schmelzpunkt 204 bis 208° C. Infrarotabsorption in Nuljol-Mineralölsuspension: O H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3400 3280 cm-1 11-Keto und 20-Keto . . . . . . . . . . 1722 1700 Konjugierte 3-Keto . . . . . . . . . . . . 1655 d"4-Doppelbindung ........... 1611 1597 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-hemisuccinat Zu einer Lösung von 2,5 g Berüsteinsäureanhydrid in 25 ccm Pyridin wurden unter Rühren 2,0 g 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison gegeben und gerührt, bis alles 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison in Lösung gegangen war. Man ließ über Nacht stehen und goß dann langsam in eine kräftig gerührte Mischung aus 30 ccm konzentrierter Salzsäure, 102 ccm Wasser und 127 g Eis. Man rührte 1 Stunde weiter und sammelte das ausgeschiedene rohe 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-hemisuccinat auf einem Filter, wusch, bis das p$ der Waschlauge 4,0 betrug, trocknete und kristallisierte aus 45 ccm Methyläthylketon und 36 ccm »Skellysolve B<c um, worauf man das reine 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-hemisuccinat erhielt. Schmelzpunkt 254 bis 258°C.
• Natriumsalz des 1-Dehydro-6a-methylhydrocortisonhemisuccinats Zu einer Lösung von 2 g 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-hemisuccinat in 50 ccm Aceton wurde unter Rühren langsam 0,1 n-Natronlauge gegeben, bis das pg auf 7,4 gestiegen war. Gleichzeitig mit der Natronlauge wurden 100 ccm Wasser zugegeben.
• Die Lösung wurde im Vakuum bei 25°C vom Aceton befreit. Die verbleibende wäßrige Lösung des Salzes wurde filtriert, der Gefriertrocknung unterworfen und der Rückstand umkristallisiert, worauf man das reine Natriümsalz des 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-hemisuccinats erhielt. 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-(ß,ß-dimethylglutarat) Zu einer Lösung von 260 mg ß,ß-Dimethylglutarsäureanhydrid in 2 ccm Pyridin wurden 200 mg 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison gegeben. Die Mischung wurde gerührt, bis alles in Lösung gegangen war, und der Kolben mit Stickstoff ausgespült. Man ließ über Nacht (18 Stunden) stehen und goß dann unter Rühren langsam in eine kalte Lösung von 2,4 ccm konzentrierter Salzsäure in 18 ccm Wasser. Die Mischung wurde dreimal mit je 5 ccm Äthylacetat extrahiert, die vereinigten Extrakte mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 1,5 ccm eingedampft. Dazu gab man 1 ccm »SkeHysolve B«c und kühlte auf O' C ab. Nach 24 Stunden wurde filtriert, um das kristalline 1-Dehydro-6-methylhydrocortison-21-(ß,ß-dimethylglutarat) zu gewinnen. Schmelzpunkt 212 bis 215°C.
• Ein Metallsalz dieser Verbindung kann man, wie nachstehend beschrieben, herstellen. Natriumsalz des 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-(ß,ß-dimethylglutarats) Zu einer Lösung von 2 g 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-(ß,ß-dimethylglutarat) in 100 ccm Aceton gibt man langsam unter Rühren 0,1 n-Natronlauge, bis das p$ auf 7,4 gestiegen ist. Während des Zusatzes der Natronlauge werden gleichzeitig 100 ccm Wasser zugesetzt.
• Die Lösung wird im Vakuum bei 25°C vom Aceton befreit. Dann filtriert man die Lösung und unterwirft sie der Gefriertrocknung, um das Natriumsalz des 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-(ß,ß-dimethylglutarats) zu isolieren. Beispiel 2 1-Dehydro-6a-methylcortison In gleicher Weise, wie im Beispiel l beschrieben, wurde 6a-Methylcortison mit Septomyxa affinis im gleichen Nährmedium unter Verwendung von rohem llß,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on als Promotor fermentiert, wobei 1-Dehydro-6a-methylcortison vom Schmelzpunkt 230 bis 232°C erhalten, wurde.
• An Stelle von 3-Keto-bisnor-4-cholen-22-al kann man als Promotor auch llß,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on oder 3-Keto-bisnor-4-cholensäure verwenden.

Claims (4)

1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von 6-Methyl-17a, 21-dioxy-1,4-pregnadien-3,20-dionen und deren 21-Acylaten, dadurch gekennzeichnet, daß man ein 4-Pregnen der Formel in der R H, ß-0 H oder Ketosauerstoff und R' Wasserstoff oder den Acylrest einer organischen Carbonsäure mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet, in bekannter Weise in einem Nährmedium, das nichtsteroidalen Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor in assimilierbarer Form enthält, mit einem Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium, Didymella, Calonectria, Alternaria, Colletotrichum, Cylindrocarpon, Ophiobolus, Septomyxa, Fusarium, Listeria oder Erysipelothrix bebrütet und gegebenenfalls das erhaltene Produkt verestert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bebrütung in Gegenwart von 3-Keto-bisnor-4-cholen-22-al, llß,21-Dioxy-1,4, 17(20)-pregnatrien-3-on, 3-Keto-bisnor-4-cholensäure oder Progesteron durchführt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man 6-Methylhydrocortison oder 6-Methylcortison als Ausgangsstoffe verwendet.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bebrütung Septomyxa affinis verwendet. In Betracht gezogene Druckschriften: Journ. Amen Chem. Soc., 77, S. 4184 (1955) ; 75, S. 5764 (1953) ; Helv. Chim. Act., 38, S. 1502 (1955); 38, S. 835 (1955); Experientia, 9; S. 371 (l953).