DE102005046846A1 - Verfahren zur Differenzierung mesenchymaler Stammzellen und zur Verwendung der differenzierten Zellen - Google Patents
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Abstract
Bisher werden zur in vitro Differenzierung mesenchymale Stammzellen aus unterschiedlichen Geweben eingesetzt, so aus Fettgewebe isolierte Stromazellen, Stammzellen aus humanem Knochenmark oder aus Nabelvenenblut. Diese Verfahren erfordern jedoch mehrfach passagierte Zellen und beschränken sich entweder auf die Differenzierung der Stammzellen zu hepatozytenähnlichen Zellen in vitro oder auf die ausschließliche Differenzierung der Zellen in vivo nach Transplantation in eine Empfängerleber einer Maus oder Ratte. Nach dem neuen Verfahren sollen mesenchymale Stammzellen aus unterschiedlichen menschlichen Geweben zu Zellen differenziert werden, die typische Merkmale von hepatozytären Zellen aufweisen. DOLLAR A Aus menschlichen Geweben, wie beispielsweise Knochenmark, Fettgewebe oder Nabelvenenblut, werden mesenchymale Stammzellen aus der Fraktion der mononukleären Zellen isoliert und über Plastikadherenz selektioniert, anschließend in einem Expressionsmedium propagiert, für die Differenzierung in Leberzellen kultiviert und dann mit einem für humane Zellkulturen optimierten Medium behandelt. DOLLAR A Die aus mesenchymalen Stammzellen hergestellten Zellen mit hepatozytären Eigenschaften können als diagnostische Untersuchungsmodelle dienen sowie nach Transplantation in ein Tiermodell mit der Perspektive einer therapeutischen Anwendung beim Menschen funktionellen Gewebeersatz bilden.
Description
- Die Erfindung betrifft aus mesenchymalen Stammzellen hergestellte Zellen mit hepatozytären Eigenschaften, die sowohl als Organersatz als auch für diagnostische Untersuchungsmodelle benötigt werden.
- Vielfach steht aber Zellmaterial für diese Einsatzgebiete aus natürlichen Organen nicht oder nicht in ausreichender Menge zur Verfügung, so beispielsweise für die Gewinnung von hepatozytären Zellen aus embryonalen Stammzellen. Zudem weisen aus diesen differenzierte Zellen ein beträchtliches tumorigenes Potential auf. Bei Verwendung von hämatopoietischen Stammzellen ist dagegen die Vermehrungsmöglichkeit in vitro begrenzt. Daher wurden mesenchymale Stammzellen aus unterschiedlichen Geweben zur in vitro Differenzierung eingesetzt. So wurden aus Fettgewebe isolierte Stromazellen mit mesenchymalen Stammzelleigenschaften nach 3-5 Passagen in Gegenwart der Wachstumsfaktoren HGF und OSM zu Zellen differenziert, die die für Hepatozytenvorläuferzellen und Leberzelltumore typischen Proteine Albumin und Alpha-Fetoprotein exprimierten. Die Zellen nahmen LDL auf und produzierten Harnstoff, 2 lebertypische Funktionen. Nach Transplantation in mit CCl4 vergiftete immundefiziente Mäuse waren nach 10 Tagen kleine Cluster integrierter Zellen in der Leber sichtbar (1). Mesenchymale Stammzellen aus humanem Knochenmark wurden in die Lebern von mit Allylalkohol vergifteten Ratten injiziert. Nach 28 Tagen waren integrierte Zellen zu sehen, die die für Hepatozytenvorläuferzellen und Leberzelltumoren typischen Proteine Cytokeratin 19 und Alpha-Fetoprotein exprimierten. Daneben exprimierten die Zellen die leberzelltypischen Proteine Albumin, Cytokeratin 18 und Asialoglycoproteinrezeptor, nach 56 Tagen waren jedoch in den Lebern nur noch wenige injizierte Zellen sichtbar (2). Lee et al. (3) beschreiben die Differenzierung mesenchymaler Stammzellen aus Nabelvenenblut in Zellen mit Hepatozyteneigenschaften in vitro nach einem 2-Schrittprotokoll unter der Anwendung von zunächst HGF und bFGF mit nachfolgender Behandlung mit OSM. Vor dem Beginn der Differenzierung wurden die Zellen 5-13 mal passagiert.
- Alle genannten Verfahren erfordern jedoch mehrfach passagierte Zellen und beschränken sich entweder auf die Differenzierung der Stammzellen zu hepatozytenähnlichen Zellen in vitro oder auf die ausschließliche Differenzierung der Zellen in vivo nach Transplantation in eine Empfängerleber einer Maus oder Ratte.
- Der Erfindung liegt das Problem zugrunde, mesenchymale Stammzellen aus unterschiedlichen menschlichen Geweben zu Zellen zu differenzieren, die typische Merkmale von hepatozytären Zellen aufweisen und als diagnostische Untersuchungsmodelle dienen sowie nach Transplantation in ein Tiermodell mit der Perspektive einer therapeutischen Anwendung beim Menschen funktionellen Gewebeersatz bilden können.
- Dieses Problem wird gemäß Patentanspruch 1 gelöst, indem zunächst aus menschlichen Geweben, wie beispielsweise Knochenmark, Fettgewebe oder Nabelvenenblut, nach einer aus der Vielzahl bekannter Verfahren (4,5) ausgewählten Methode mesenchymale Stammzellen aus der Fraktion der mononukleären Zellen isoliert und über Plastikadherenz selektioniert werden, die ein klonales Wachstum und einen typischen Phänotyp aufweisen (CD34-, CD45-, CD14-, CD105+, CD166+, CD29+), frei von Kontaminationen mit hämatopoetischen Zellen sind sowie ein multipotentes Differenzierungspotential, z. B. zur osteogenen und adipogenen Differenzierung aufweisen. Diese Zellen werden anschließend in EMSZ als Expansionsmedium propagiert und für die Differenzierung in Leberzellen bis zur 90–100%-igen Konfluenz kultiviert, dann mit 5'-Azacytidin und mit HHMM als einem für humane Hepatozytenkulturen optimierten Medium (6), das die Wachstumsfaktoren HGF und EGF oder andere hepatotrope Wachstumsfaktoren und FCS enthält, behandelt.
- Die funktionelle, molekularbiologische und immuncytochemische Charakterisierung ergab, dass nach diesem Protokoll differenzierte mesenchymale Stammzellen die für Hepatozytenvorläuferzellen typischen Marker Alpha-Fetoprotein, Cytokeratin (CK) 19, CK7 und Connexin (CX) 43 sowie die für differenzierte Hepatozyten typischen Marker Albumin (ALB), Carbamylphosphat-Synthetase (CPS), CK18, CX32, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase 1 (PCK1), Transferrin (TFN), HepPar1 und Cytochrom P450 Typ 3A4 (CYP3A4) exprimierten. Weiterhin führten die differenzierten Zellen die leberspezifischen Stoffwechselleistungen der Harnstoffsynthese und Glycogenspeicherung aus und aktivierten den leberspezifischen Promotor der PCK1. Morphologisch glichen die differenzierten Stammzellen adulten Hepatozyten.
- Die Transplantation dieser Zellen erfolgte in Tiere, die zuvor mit Propanolol behandelt und einer partiellen Hepatektomie unterworfen wurden, um den Zellen einen Wachstumsvorteil gegenüber den Wirtszellen und einen Wachstumsreiz zu geben.
- Nach der Transplantation dieser hepatozytär differenzierten Stammzellen in die Milz von immundefizienten Pfp/Rag2-/- Mäusen, von wo aus die Zellen mit dem Blutstrom in die Leber transportiert werden, integrierten die transplantieren Zellen im Leberparenchym der Maus und exprimierten weiterhin leberspezifische Marker wie CX32, PCK1, ALB und HepPar1. Weiterhin speicherten sie Glycogen. Morphologisch waren die integrierten Zellen nicht von den sie umgebenden Wirtsleberzellen zu unterscheiden.
- Die so erhaltenen aus mesenchymalen Stammzellen differenzierten Zellen mit Hepatozyteneigenschaften eignen sich prinzipiell für die Verwendung:
- 1. in Transplantationsversuchen im Tiermodell mit der Perspektive der therapeutischen Anwendung beim Menschen zur Behandlung von Lebererkrankungen
- 2. in Zellkulturen zu Untersuchungen der Stoffwechselleistungen und deren Regulation
- 3. für pharmakologische und toxikologische Tests in der Zellkultur
- 4. in Bioreaktoren zur Vermehrung der Zellen.
- 5. zur weiteren Differenzierung in Zellen anderer Gewebe wie z.B. Gallengangsepithelzellen oder Inselzellen des Pankreas.
- Im Hinblick auf die klinische Verwendung hepatozytär differenzierter mesenchymalen Stammzellen zur Therapie bei Lebererkrankungen ist auf Grund der erzielten Ergebnisse von Transplantationen in Mäuse zu erwarten, dass in vitro hepatozytär vordifferenzierte Stammzellen eine höhere Persistenz (< 84 Tage), besseres Homing und bessere Differenzierungsfähigkeit in der Empfängerleber und verglichen mit der Verwendung embryonaler Stammzellen ein geringeres tumorigenes Potenzial aufweisen. Im Vergleich zu hämatopoietischen Stammzellen lassen sich mesenchymale Stammzellen in Kultur besser propagieren. Daraus resultiert insgesamt ein höherer therapeutischer Nutzen bei gleichzeitig niedrigerem Risiko bei der Verwendung hepatozytär differenzierter mesenchymaler Stammzellen zur Behandlung von Lebererkrankungen durch Zelltransplantation.
- Ausführungsbeispiele
- Beispiel 1
- Isolierung und Kultur mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Knochenmark
- Definitionen
- Mesenchymale Stammzellen proliferieren klonal und besitzen ein multipotentes Differenzierungspotential. Die Isolation erfolgt über Plastikadhärenz; die Charakterisierung als homogene Zellpopulation ohne Kontamination durch hämatopoetische Zellen (CD34-, CD45-, CD14-, CD105+, CD166+, CD29+) mittels Durchflusszytometrie (
1A ) und durch den Nachweis der Fähigkeit zur adipogenen und osteogenen Differenzierung (1B und C). Materialien und Lösungen - Durchführung
- Isolierung, Selektionierung und Propagierung mesenchymaler Stammzellen aus Knochenmark
- Alle Arbeitsschritte wurden unter sterilen Bedingungen ausgeführt.
- 20 ml humanes Zitrat-Knochenmark, entnommen durch Standardmethoden aus dem Beckenkamm, wurde 1:1 mit 1xPBS verdünnt und anschließend 10 min bei 500 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1xPBS resuspendiert und auf eine Biocoll-Schicht (4 ml Suspension/3 ml Biocoll) aufgetragen. Die Dichtegradientenzentrifugierung erfolgte 30 min bei 500 g.
- Die an der Grenzfläche angesammelten mononukleären Knochenmarkszellen wurden 2 × in PBS gespült und 5 min bei 500 g zentrifugiert, in Wachstumsmedium (EMSZ) resuspendiert und nochmals 5 min bei 500 g zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in einer Dichte von 1 × 105 Zellen/cm2 in Fibronectin-beschichteten Gewebekulturflaschen in EMSZ ausplattiert.
- Nach ca. 24 h wurden die flottierenden Zellen durch 3-maliges Spülen mit 1xPBS entfernt. Es verblieben 1–10 adhärente Zellen/cm2 in der Kulturflasche. Eventuell vereinzelt in der Kultur enthaltene Monozyten lösten sich innerhalb der nächsten 3–5 Tage von der Unterlage ab. Die verbleibenden adhärenten Zellen wurden weiter propagiert und bei 50%-iger Konfluenz mit 1xTrypsin/EDTA von der Unterlage gelöst. Durchschnittlich betrug die Gesamtkulturdauer 10–12 Tage. Die Kultivierung erfolgte im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2. Der Medienwechsel mit EMSZ erfolgte alle 4 Tage.
- Die geernteten Zellen wurden bis zur weiteren Verwendung in 90 % FCS + 10 % DMSO aufgenommen, mit Hilfe des Cryocontainers 1 °C/min. auf –80°C gekühlt und anschließend in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. zu 1) Wachstumsmedium EMSZ
- Das Wachstumsmedium EMSZ setzte sich wie folgt zusammen:
60 % DMEM, 40 % MCDB, 5 μg/ml apo-Transferrin, 5 ng/ml Selen, 5 μg/ml Linolsäure, 5 μg/ml Insulin (bovine), 100 μM L-Ascorbinsäure-2-Phosphate, 1 nM Dexamethason, 100 U/ml Penicillin, 10 μg/ml Streptomycin, 10 ng/ml PDGF-BB, 10 ng/ml EGF und 2 % FCS. - Zunächst wurden das DMEM- und MCDB-Medium jeweils nach Herstellervorschrift zubereitet. DMEM wurde zusätzlich 0,042 M NaHCO3 zugesetzt. Anschließend wurde der pH-Wert der Medien jeweils auf 7,2 eingestellt und zur separaten Aufbewahrung steril filtriert. Beide Medien wurden 60:40 gemischt.
- Nach Zugabe der restlichen Faktoren wurde das Medium erneut steril filtriert. Steriles FCS wurde dem Medium am Ende zugefügt. zu 2) Fibronectin-beschichtete Kulturflaschen
- Herstellung der Fibronectin-Gebrauchslösung
- Das pulverförmige Fibronectin wurde in PBS aufgenommen, so dass die Endkonzentration 100 μg/ml entsprach. Die Stocklösung wurde in entsprechende Aliquots (vorzugsweise 1 ml) aufgeteilt und bei –20 °C bis zum Verbrauch gelagert.
- Beschichtung der Kulturschalen
- Zum Beschichten der Kulturplatten wurde eine Fibronectinlösung von 0.5 μg/ml Medium benötigt. Hierzu wurde das entsprechende Volumen an Stocklösung in DMEM aufgenommen, steril filtriert und auf die Platten gegeben. Nach kurzem Schwenken (Platte gleichmäßig benetzen) wurde die Fibronectinlösung abgesaugt und die Platten 30 –60 min in der Sterilbank zum Trocknen gelagert. Die Platten waren damit gebrauchsfertig. Die abgesaugte Fibronectinlösung konnte nach erneutem Sterilfiltrieren einer weiteren Nutzung zugeführt wurden. Die Lagerung der gebrauchsfertigen Lösung erfolgte bei 4° C.
- Lagerung der beschichteten Kulturplatten
- Die Beschichtung der Platten erfolgte möglichst unmittelbar vor der Einsaat der Zellen. Bereits beschichtete Platten wurden maximal 24 Stunden bei 4° C aufbewahrt.
- Lagerung der diferenzierten Stammzellen
- Die differenzierten mesenchymalen Stammzellen wurden in flüssigem Stickstoff gelagert.
- Beispiel 2
- Differenzierung mesenchymaler Stammzellen aus humanem Knochenmark in Zellen mit hepatozytären Eigenschaften
- Materialien und Lösungen
- Durchführung
- Auftauen der isolierten, propagierten mesenchymalen Stammzellen
- Die in flüssigem Stickstoff gelagerten, humanen, mesenchymalen Stammzellen wurden bei Raumtemperatur aufgetaut, sofort in ca. 10 ml vorgewärmtes (37 °C) EM6F überführt und 5 min mit 1300 U/min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
- Einsaat der Zellen
- Die zentrifugierten Zellen wurden in EM6F-Medium aufgenommen und resuspendiert. Das zuzugebende Medienvolumen richtete sich nach der Anzahl und Größe der einzusäenden Kulturgefäße, wobei die Zelldichte 200 Zellen/cm2 betragen sollte. Die folgende Tabelle enthält eine Zusammenstellung der erforderlichen Zellzahl je Kulturgefäß.
-
- Zur Kultivierung der Zellen wurden ausschließlich Fibronectin-beschichtete Kulturgefäße (siehe Ausführungsbeispiel 1) verwendet. Bei der Einsaat wurde durch gleichmäßiges Schwenken eine Vereinzelung der Zellen angestrebt. Die Kultivierung erfolgte im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2.
- Propagierung und Ernte der Stammzellen
- Die Differenzierung der Stammzellen setzt eine Konfluenz der Kultur voraus. Deshalb war es erforderlich, die Zellen zunächst ca. 10–12 Tage (in Abhängigkeit von der Zellpräparation) zu propagieren. Der Medienwechsel mit EM6F erfolgte alle 4 Tage. Undifferenzierte Zellproben wurden bei 50 % Konfluenz mit 1xTrypsin geerntet.
- Differenzierung und Ernte der differenzierten Stammzellen
- Bei Vorliegen einer 90% konfluenten Zellkultur wurde die Differenzierung durch Zugabe von 5'-Azacytidin (Stocklösung 4 mM) zu jeder Kultur eingeleitet, so dass eine Konzentration von 20 μM in der Kultur vorlag (d.h. pro 10 ml Medium wurden 50 μl 4 mM 5'-Azacytidin zugegeben). Nach 24 Stunden wurde das Medium vollständig abgesaugt und durch humanes Hepatozytenmedium HHMM + 2 % FCS ersetzt. Der Medienwechsel erfolgte ebenfalls alle 4 Tage. Die Kultivierung der differenzierten Zellen wurde mindestens 21 Tage durchgeführt. zu 3) HHMMad 1 Liter Aqua dest. PulvermediumZugabe von NaHCO3 = MEM incompleteMischung aus D-MEM (+Glucose), D-MEM (–Glucose), MEM incomplete (500 ml/500 ml/1 l) herstellen. Zu diesen 2 l Mediengemisch wurden folgende Substanzen gegeben:Medium steril filtrieren (= HHMM incomplete)
- Vor Gebrauch wurden 500 ml HHMM incomplete mit folgenden Zusätzen komplettiert (= HHMM complete)
- Kurz vor Durchführung des Medienwechsels wurden die Wachstumsfaktoren EGF und HGF dem Medium zugesetzt.
-
- Beispiel 3
- Charakterisierung in vitro hepatozytär differenzierter. humaner mesenchymaler Stammzellen
- Die in der Zellkultur gemäß Beispiel 2 hergestellten hepatozytär differenzierten mesenchymale Stammzellen wurden hinsichtlich ihrer leberspezifischen Eigenschaften funktionell, molekularbiologisch und immuncytochemisch charakterisiert. Die Analyse durch RT-PCR (
2C ), Immuncytochemie und Western Blot (2B ) ergab, dass die differenzierten mesenchymalen Stammzellen die für Hepatozytenvorläuferzellen typischen Marker Alpha-Fetoprotein, Cytokeratin (CK) 19, CK7 und Connexin (CX) 43 sowie die für differenzierte Hepatozyten typischen Marker Albumin (ALB), Carbamylphosphat-Synthetase (CPS), CK18, CX32, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase 1 (PCK1), Transferrin (TFN), HepPar1 und Cytochrom P450 Typ 3A4 (CYP3A4) exprimieren. Morphologisch glichen die differenzierten Stammzellen adulten Hepatozyten (2A ). Weiterhin führten die differenzierten Zellen die leberspezifischen Stoffwechselleistungen der Harnstoffsynthese (3B ) und Glycogenspeicherung (3A ) aus und aktivierten den leberspezifischen Promotor der PCK1 (3C ). - Beispiel 4
- Transplantation in immundefiziente Pfp/Rag2-/--Mäuse
- Definitionen
- Die gemäß Beispiel 3 hergestellten, zu hepatozytenähnlichen Zellen differenzierten Stammzellen wurden in Mäuse transplantiert, um deren Fähigkeit, eine Empfängerleber zu besiedeln und ihre hepatozytären Eigenschaften in dieser Leber beizubehalten, nachzuweisen. Die Besiedelung einer Empfängerleber durch transplantierte Hepatozyten erfordert einen Proliferationsstimulus, der herkömmlich durch partielle Hepatektomie erreicht wurde, und einen selektiven Wachstumsvorteil für die transplantierten Hepatozyten gegenüber den Wirtshepatozyten, der durch eine Vorbehandlung mit Propranolol erzielt wurde.
- Durchführung
- Propranolol-Gabe
- Es wurden 20 mg Propranolol/kg Körpergewicht täglich verabreicht. Die Gabe erfolgte über das Trinkwasser (0,1 mg/ml) ab 3 Tage vor der Transplantation (bis zur OP).
- Partielle Hepatektomie
- Die Betäubung der nüchternen Tiere erfolgte anhand effektgesteuerter Inhalationsnarkose mit etwa 1.5% Isofluran und 2 l Sauerstoff pro Minute. Zur Darstellung der Abdominalmuskulatur wurde nach Rasur und Desinfektion eine etwa 2 cm lange Inzision in Medianlinie unterhalb des processus xiphoideus (unteres Brustbein) vorgenommen. Die Eröffnung der Bauchhöhle erfolgte durch eine etwa 1.5 cm lange Inzision entlang der linea alba, bis zum processus xiphoideus reichend. Durch vorsichtigen Druck auf Thorax und Flanken beidseits wurden der rechte und linke Mittellappen und der linke Lappen der Leber aus der Bauchhöhle manipuliert. Anschließend wurde eine scharte Durchtrennung bindegewebiger Strukturen und eine stumpfe Lösung etwaiger Adhäsionen zur vollständigen Mobilisierung der Leberlappen unter Schonung der Gefäße vorgenommen. Die proximate Ligatur der dargestellten Leberlappen erfolgte durch Nahtseide gefolgt von der Resektion der ligierten Lappen.
- Das Abdomen wurde durch eine die Muskulatur und die Haut umfassende Naht verschlossen und die Tiere bis zum Erwachen, ggf. unter Wärmezufuhr und unter Sauerstoffgabe überwacht.
- Transplantation von Hepatozyten oder aus Stammzellen differenzierten Hepatozyten
- Die Betäubung der nüchternen Tiere erfolgt anhand effektgesteuerter Inhalationsnarkose mit etwa 1.5% Isofluran und 2 l Sauerstoff pro Minute. Zur Eröffnung der Bauchhöhle und Darstellung der Milz wurde nach Rasur und Desinfektion eine 1 cm lange Inzision unterhalb des linken Rippenbogens etwa in vorderer Axillarlinie vorgenommen und der obere Milzpol mit Ligaturband umschlungen. Nach partieller Hepatektomie erfolgt die Injektion von 1 × 106 Zellen, suspendiert in 100 μl PBS (Phosphate Buffered Saline), nach Punktion des Milzpols und vorsichtigem Vorschieben der Kanüle parallel zur Milzachse. Mit dem Zurückziehen der Kanüle wurde gleichzeitig das Anziehen des Ligaturbandes vorgenommen und abschließend verknotet. Die Kontrolle eventueller Blutungen ist angezeigt bevor das Abdomen durch eine die Muskulatur und die Haut umfassende Naht verschlossen wurde. Die Tiere wurden bis zum Erwachen überwacht, ggf. unter Wärmezufuhr und unter Sauerstoffgabe.
- Die so transplantierten differenzierten Stammzellen besiedeltn die Leber einer Maus in topologisch korrekter Orientierung (periportal) (
4A ) und erfüllen in der Empfängerleber leberspezifische Funktionen wie die Expression der PCK1, HepPar1, CX32 und Albumin (4B ) und sind zur Glycogenspeicherung befähigt (4C ). - Die Figuren zeigen:
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1 Charakterisierung humaner mesenchymaler Stammzellen aus Knochenmark - (A) Analyse der Oberflächenantigene auf mesenchymalen Stammzellen mittels Durchflusszytometrie. Die Zellen exprimieren CD13, CD29, CD44, CD105 und CD166, nicht aber CD11c, CD14, CD45, CD34, Glycophorin-A and HLA-DR. (B) Nachweis der adipogenen oder osteogenen Differenzierung durch Öl-Rot-Färbung intrazellulärer Lipidtropfen bzw. extrazellulärer Kalziumablagerungen durch Alizarin-Färbung (pH4,0). (C) Durch RT-PCR-Analyse wurde in adipogen differenzierten Stammzellen (A) die für die adipogene Differenzierung typischen Transkripte der PPAR-γ2 und LPL sowie in osteogen differenzieren Zellen (O) das für die adipogene Differenzierung typische Transkript Osteocalcin nachgewiesen. In beiden Zellarten wurde Osteonectin nachgewiesen. GAPDH: Glycerolaldehydphosphat-Dehydrogenase als interne Kontrolle der initialen Menge an cDNA.
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2 Biochemische und molekularbiologische Charakterisierung humaner mesenchymaler Stammzellen nach hepatozytärer Differenzierung in vitro - (A) Hepatozytär differenzierte mesenchymale Stammzellen gleichen morphologisch adulten Hepatozyten. Die Analyse durch RT-PCR (C), Immuncytochemie und Western Blot (B) ergibt, dass die differenzierten mesenchymalen Stammzellen die für Hepatozytenvorläuferzellen typischen Marker Alpha-Fetoprotein, Cytokeratin (CK) 19, CK7 und Connexin (CX) 43 sowie die für differenzierte Hepatozyten typischen Marker Albumin (ALB), Carbamylphosphat-Synthetase (CPS), CK18, CX32, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase 1 (PCK1), Transferrin (TFN), HepPar1 und Cytochrom P450 Typ 3A4 (CYP3A4) exprimieren.
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3 Funktionelle Charakterisierung humaner mesenchymaler Stammzellen nach hepatozytärer Differenzierung in vitro - Hepatogen differenzierte mesenchymale Stammzellen führen die leberspezifischen Stoffwechselleistungen der Glycogenspeicherung (A) und Harnstoffsynthese (B) aus und aktivieren den leberspezifischen Promotor der PCK1 (C).
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4 Funktionelle Charakterisierung hepatozytär differenzierter mesenchymaler Stammzellen nach Transplantation in die Leber einer Immundefizienten Maus - Humane Zellen werden in der Mausleber durch die spezifische Expression von HepPar1 immunhistochemisch nachgewiesen. (A) Die transplantierten Zellen siedeln sich primär in periportalen Regionen der Leber an (I) wie durch die gleichzeitige Expression der periportal exprimierten PCK1 in einem Parallelschnitt angezeigt wird (II). (B) Mit der Expression von HepPar1 (II und IV) wurden in Parallelschnitten die PCK1 (III) und CX32 (V) co-lokalisiert. (I) Negativkontrolle ohne primären Antikörper. (C) Expression des humanspezifischen Albumins in transplantierten Zellen (III). (I) und (II) Mausleber- und Menschleberschnitt als Negativ- bzw. Positivkontrolle. (D) Gleichzeitiger Nachweis des humanspezifisch exprimierten HepPar1 (I) in transplantierten Zellen und von Glycogenspeicherpartikeln (II), nachgewiesen durch PAS-Färbung.
- Literaturübersicht
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- 1 Seo MJ, Suh SY, Bae YC, Jung JS. Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Mar 4;328(1):258-64.
- 2 Sato Y, Araki H, Kato J, Nakamura K, Kawano Y, Kobune M, Sato T, Miyanishi K, Takayama T, Takahashi M, Takimoto R, Iyama S, Matsunaga T, Ohtani S, Matsuura A, Hamada H, Niitsu Y. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion. Blood. 2005 Jul 15;106(2):756-63
- 3 Lee KD, Kuo TK, Whang-Peng J, Chung YF, Lin CT, Chou SH, Chen JR, Chen YP, Lee OK. vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells. Hepatology. 2004 Dec;40(6):1275-84.
- 4 Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999 Apr 2;284(5411):143-7.
- 5 Reyes M, Lund T, Lenvik T, Aguiar D, Koodie L, Verfaillie CM. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood. 2001 Nov 1;98(9):2615-25.
- 6 Runge D, Runge DM, Jager D, Lubecki KA, Beer Stolz D, Karathanasis S, Kietzmann T, Strom SC, Jungermann K, Fleig WE, Michalopoulos GK. Serumfree, long-term cultures of human hepatocytes: maintenance of cell morphology, transcription factors, and liver-specific functions. Biochem Biophys Res Commun. 2000 Mar 5;269(1):46-53.
Claims (7)
- Verfahren zur Differenzierung mesenchymaler Stammzellen zu Zellen mit hepatozytären Eigenschaften, gekennzeichnet dadurch, dass aus menschlichen Geweben mesenchymale Stammzellen, die ein klonales Wachstum zeigen, ein multipotentes Differenzierungspotential und einen charakteristischen Phänotyp aufweisen, gewonnen werden, in EMSZ als Expansionsmedium in vitro kultiviert und bei einer 90-100%-igen Konfluenz mit 5'-Azacytidin und in HHMM als Differenzierungsmedium unter Zusatz von hepatotropen Wachstumsfaktoren differenziert werden.
- Verwendung der differenzierten mesenchymalen Stammzellen gemäß Anspruch 1 zu Transplantationsversuchen im Tiermodell und zur therapeutischen Anwendung beim Menschen.
- Verwendung der differenzierten mesenchymalen Stammzellen gemäß Anspruch 1 zur Transplantation in die Milz von immundefizienten Pfp/Rag2-/-Mäusen, von wo aus die Zellen mit dem Blutstrom in die Leber transportiert werden, sich im Leberparenchym der Maus integrieren und weiterhin leberspezifische Marker wie CX32, PCK1, ALB und HepPar1 exprimieren sowie Glycogen speichern.
- Verwendung der differenzierten mesenchymalen Stammzellen gemäß Anspruch 1 als Zellkulturen zu Untersuchungen von deren Stoffwechselleistungen und deren Regulation.
- Verwendung der differenzierten mesenchymalen Stammzellen gemäß Anspruch 1 als Testsystem für pharmakologische und toxikologische Untersuchungen.
- Verwendung der differenzierten mesenchymalen Stammzellen gemäß Anspruch 1 in Bioreaktoren zu ihrer Vermehrung.
- Verwendung der differenzierten mesenchymalen Stammzellen gemäß Anspruch 1 zur weiteren Differenzierung in Zellen anderer Gewebe wie z.B. Gallengangsepithelzellen oder Inselzellen des Pankreas.
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